Name: Budowa i ocena mysiego modelu osteolizy kalwarycznej poprzez ekspozycję na cząstki CoCrMo w aseptycznym rozluźnianiu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Poznaj metodę budowy mysiego modelu osteolizy kalwarycznej z użyciem nanocząstek CoCrMo. Model ten pozwala badać interakcje cząstek zużycia z komórkami w aseptycznym rozluźnianiu endoprotez.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81572111), Fundację Projektu Klinicznego Nauki i Technologii Prowincji Jiangsu (BL2012002), Projekt Badań Naukowych w Nankinie (201402007), Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Jiangsu (BK20161385) oraz Fundację Specjalną Stowarzyszenia Chińskich Lekarzy (2015COS0810).

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu w Nankinie.
1. Przygotowanie cząstek CoCrMo
<ol>
	<li>Otrzymaj cząstki CoCrMo za pomocą wyprodukowanego trzyelektrodowego prądu stałego o wysokiej próżni4. Umieść stop CoCrMo w przyrządzie pod próżnią 10-3 Pa, argonem i wodorem 0.04 MPa 3:2 (v/v) i prądem katodowym 650 A.</li>
	<li>Zmierz średnice cząstek CoCrMo.
	<ol>
		<li>Dodać 1 mg cząstek CoCrMo do 1,5 ml bezwodnego etanolu.</li>
		<li>Zawiesić cząstki CoCrMo w bezwodnym etanolu za pomocą wytrząsania ultradźwiękowego o częstotliwości 28 kHz i mocy 600 W przez 5 minut.</li>
		<li>Nanieść jedną kroplę (około 20 μl) powstałej zawiesiny na stół obiektywowy transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM). Wykonaj serię zdjęć TEM przy napięciu przyspieszenia 200 kV i rozdzielczości 0,24 nm.</li>
		<li>Użyj dostarczonego oprogramowania, aby obliczyć średnią średnicę i rozkład wielkości cząstek w mikrofotografiach TEM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odkażanie endotoksyn
	<ol>
		<li>Autoklawować 50 g cząstek przez 15 minut w temperaturze 121 °C i 15 psi.</li>
		<li>Wykryj endotoksyny za pomocą ilościowego testu lizatu amebocytów limulusa (LAL) (<0,25% EU/ml uznano za wskazujące na brak endotoksyny)5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawiesić cząstki w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) o stężeniu 50 mg/ml jako roztwór podstawowy6.</li>
</ol>
2. Budowa modelu osteolizy kalwarii
<ol>
	<li>Znieczulenie 6-tygodniowych myszy C57BL/J6 (sześć myszy na grupę) pentobarbitalem (50 mg/kg). Użyj testu szczypania, aby ocenić poziom znieczulenia. Zapobiegaj wysuszeniu oczu zwykłą solą fizjologiczną.</li>
	<li>Umieść myszy w pozycji leżącej. Usuń sierść z czaszki za pomocą golarki i zdezynfekuj skórę za pomocą wacików medycznych zawierających 75% etanolu.</li>
	<li>W przypadku lokalizacji punktów zidentyfikuj dwa punkty, w tym punkty środkowe odpowiednio między oczami i uszami. Następnie wyznacz linię między dwoma powyższymi punktami i naciąć skórę wzdłuż powyższej linii nożyczkami (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Usuń okostną czaszki z kalwarii za pomocą skalpela (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B)6.</li>
	<li>Zszyj skórę na obu końcach za pomocą prostego przerywanego szwu.</li>
	<li>Wykonaj linię szwu przez środek nacięcia bez zawiązywania węzłów. Przytrzymaj dwa końce linii szwów.</li>
	<li>Osadź 50 μl zawiesiny cząstek CoCrMo (50 mg/ml, w PBS) w środku kalwarii (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C)<klasa sup="xref">2.</li>
	<li>Zawiąż ostatni ścieg w prostym przerywanym szwie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Utrzymuj myszy przez kolejne 2 tygodnie.</li>
</ol>
3. Ocena modelu osteolizy kości kalwarycznej za pomocą mikrotomografii komputerowej
<ol>
	<li>Poświęć myszy dwutlenkiem węgla. Odetnij głowę myszy w płaszczyźnie poziomej. Usuń tkankę mózgową wewnątrz, a skórę i sierść na zewnątrz. Zbierz kalwarię do dalszych eksperymentów.</li>
	<li>Delikatnie oczyść całą tkankę miękką na kalwarii za pomocą pęsety. Oczyszczone kalwarie utrwalić w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Zanurz kalwarię w PBS 24 godziny przed badaniem mikrotomografią komputerową.</li>
	<li>Analizuj kalwarie myszy za pomocą mikrotomografii komputerowej o wysokiej rozdzielczości w rozdzielczości izometrycznej 18 μm i ustawieniach energii promieniowania rentgenowskiego 45 kV i 550 mA.</li>
	<li>Przeprowadzanie trójwymiarowej rekonstrukcji danych z mikrotomografii komputerowej za pomocą oprogramowania.</li>
	<li>Analiza jakościowa i ilościowa.
	<ol>
		<li>Najpierw wybierz kwadratowy obszar wokół szwu środkowego jako obszar zainteresowania.</li>
		<li>Po drugie, zmierz gęstość mineralną kości (BMD), objętość kości/objętość całkowitą (BV/TV), liczbę beleczkową (Tb.N), grubość beleczka (Tb.Th), separację/odstępy beleczkowania (Tb.Sp) oraz procent całkowitej porowatości za pomocą dostarczonego oprogramowania do mikro-CT.</li>
		<li>Po trzecie, porównaj trzy grupy dla różnych pomiarów za pomocą jednoczynnikowej ANOVA. Do analizy wariancji post hoc należy zastosować metodę Bonferroniego2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ocena modelu osteolizy kalwarii za pomocą barwienia H&E
<ol>
	<li>Odwapnić próbki kalwarii w 15% kwasie etylenodiaminotetraoctowym (EDTA)-PBS w temperaturze 4 °C. Zmieniaj roztwór odwapniający codziennie przez 3 tygodnie.</li>
	<li>Odwapnione próbki zanurzyć w parafinie w celu uzyskania sześcianu o wymiarach 2 cm x 1 cm x 1 cm i pokroić je na odcinki o wymiarach 2 μm w obszarze osadzania się cząstek.</li>
	<li>Wybarwić skrawki hematoksyliną i eozyną, jak opisano wcześniej7.</li>
	<li>Uchwyć mikrofotografie ogólnego patomorfizmu za pomocą mikroskopii świetlnej.</li>
</ol>

<ol><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+oligonucleotide+targeting+TNF-alpha+can+suppress+Co-Cr-Mo+particle-induced+osteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis.</a> J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).</li>
<li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIRT1+protects+osteoblasts+against+particle-induced+inflammatory+responses+and+apoptosis+in+aseptic+prosthesis+loosening%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening.</a> Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).</li>
<li>Langlois, J., Hamadouche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+animal+models+of+wear-particle+osteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Orthop%22%5BJournal%5D)">New animal models of wear-particle osteolysis.</a> Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).</li>
<li>Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/287666498_Preparation_of_ultrafine_silver_powders_by_DC_arc_plasma">Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method.</a> Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fibroblast+expression+of+RANKL+in+CoCrMo-particle-induced+osteolysis+is+mediated+by+ER+stress+and+XBP1s%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s.</a> Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+mediated+CoCrMo+particle-induced+peri-implant+osteolysis+by+promoting+osteoblast+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis.</a> Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-induced+osteolysis+mediated+by+endoplasmic+reticulum+stress+in+prosthesis+loosening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening.</a> Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).</li>
<li>Yang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-mediated+osteoprotegerin+gene+transfer+protects+against+particulate+polyethylene-induced+osteolysis+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model.</a> Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).</li>
<li>Liu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+mediated+TiAl%286%29V%284%29+particle-induced+peri-implant+osteolysis+by+promoting+expression+of+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha.</a> Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+Stress+Mediates+TiAl6V4+Particle-Induced+Peri-Implant+Osteolysis+by+Promoting+RANKL+Expression+in+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts.</a> PLoS One. 10 (9), e0137774(2015).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TiAl6V4+particles+promote+osteoclast+formation+via+autophagy-mediated+downregulation+of+interferon-beta+in+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes.</a> Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lycorine+suppresses+RANKL-induced+osteoclastogenesis+in+vitro+and+prevents+ovariectomy-induced+osteoporosis+and+titanium+particle-induced+osteolysis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo.</a> Sci Rep. 5, 12853(2015).</li>
<li>Neuerburg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+calcitonin+receptor+signalling+in+polyethylene+particle-induced+osteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis.</a> Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).</li>
<li>Catelas, I., Jacobs, J. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20415362">Biologic activity of wear particles.</a> Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).</li>
<li>Liu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+response+to+nanometre-sized+polymer+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">The biological response to nanometre-sized polymer particles.</a> Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieją dwie główne metody osteolizy wywołanej cząstkami zużycia u myszy: model torebki powietrznej i model osteolizy kalwaryjnej. W modelu air-pouch najpierw ustala się podskórnie generowaną torebkę powietrzną, a następnie wprowadza się cząstki ścierne i implantuje się w tkance kostnej8. Ścianka torebki naśladuje okostną w aseptycznym rozluźnieniu. Jednak implantacja kości jest nienaczyniowa i nie ma aktywności biologicznej, co utrudnia ocenę bezpośrednich interakcji między cząstkami a tkanką ko...

Aseptyczne rozluźnienie jest najczęstszą przyczyną niepowodzenia całkowitej endoprotezoplastyki stawu biodrowego (THA) i całkowitej endoprotezoplastyki stawu kolanowego (TKA), co wymaga operacji rewizyjnej1. Jednak podstawowy mechanizm pozostaje niejasny2. Wymagana jest długa obserwacja, aby wykryć osteolizę wywołaną cząstkami, której występowanie jest rzadkie; Dlatego trudno jest zbadać jego patogenezę w przypadkach klinicznych. W związku z tym dalsze badania koncentrujące się na złożonych mechanizmach komórkowych i tkankowych wymagają zarówno eksperymentów in vivo w modelach osteolizy indukowanej cząstkami zużycia, jak i testów in vitro w komórkach związanych z homeostazą kości3. Prawidłowy model zwierzęcy jest ważny w ujawnianiu wpływu cząstek zużycia na utratę masy kostnej, dostarczając dowodów do dalszych testów komórkowych. 
Model mysiej osteolizy kalwarycznej skonstruowany przez ekspozycję na cząsteczki CoCrMo jest skuteczną i ważną metodą oceny interakcji między cząstkami a różnymi komórkami w aseptycznym rozluźnieniu. W tym modelu cząsteczki CoCrMo powodują osteolizę kalwarii poprzez indukcję cytokin zapalnych w makrofagach, aktywację osteoklastów, hamowanie proliferacji osteoblastów i promowanie apoptozy osteoblastów.
Stworzenie tego modelu zajmuje tylko dwa tygodnie. Osteolizę można uwidocznić i określić ilościowo za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz mikrotomografii komputerowej (mikro-CT)<klasa sup='xref'>2. Ponadto model ten ma stosunkowo niski koszt, a transgeniczne i nokautujące modele myszy mogą być używane do badania przesiewowego dużej liczby związków w różnych dawkach3.
Procedura tworzenia i oceny tego modelu jest prosta. Najpierw cząstki CoCrMo uzyskano za pomocą wysokopróżniowego prądu stałego z trzema elektrodami i ponownie zawieszono w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w stężeniu 50 mg/ml. Następnie 50 μl powstałej zawiesiny nałożono na środek mysiej kalwarii po oddzieleniu okostnej czaszki przez ostre rozwarstwienie. Myszy zostały złożone w ofierze po dwóch tygodniach i pobrano próbki z kalwarii; Przeprowadzono analizy jakościowe i ilościowe za pomocą barwienia H&E oraz mikrotomografii komputerowej. 
Model mysiej osteolizy kalwaryjnej skonstruowany przez ekspozycję na cząsteczki CoCrMo jest idealnym narzędziem do oceny interakcji między cząstkami CoCrMo a różnymi komórkami, takimi jak makrofagi, fibroblasty, osteoblasty i osteoklasty, podczas aseptycznego rozluźniania.

<table><tbody><tr><td>Stop CoCrMo z protezy</td><td>Waldemar Link GmbH & Co</td><td>GEMINI MK II</td><td>Surowiec do otrzymywania nanocząstek CoCrMo</td></tr><tr><td>Wytworzony trzyelektrodowy prąd stały o wysokiej próżni</td><td>College of Materials Science & Inżynieria, Uniwersytet Techniczny</td><td></td> w Nankinie <td>Samodzielnie zaprojektowana maszyna</td></tr><tr><td>6-tygodniowy samiec myszy C57BL / 6J</td><td>Model centrum badań nad zwierzętami Uniwersytetu w Nankinie</td><td>N000013</td><td></td></tr><tr><td>100% etanolu</td><td>Nanjing Odczynnik</td><td>C0691514023</td><td>Rozpuszczalnik nanocząstek CoCrMo do skanowania transmisyjnego mikroskopu elektronowego</td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki do mikrowirówek</td><td>Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD</td><td>W603</td><td></td></tr><tr><td>Waga mikroanalityczna</td><td>Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD</td><td>EX125DZH</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka ultradźwiękowa</td><td>Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD</td><td>YH-200DH</td><td>Aby zawiesić nanocząstki CoCrMo</td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>FEI</td><td>Tecnai G20</td><td></td></tr><tr><td>SimplePCI oprogramowanie</td><td>Compix Inc.</td><td>Wersja 6.6</td><td>Do obliczania średniej średnicy i rozkładu wielkości cząstek.</td></tr><tr><td>Wysoka patelnia do sterylizacji</td><td>QIULONGYIQI</td><td>KYQL-100DS</td><td>Do odkażania endotoksyny</td></tr><tr><td>Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Test</td><td>Charles River</td><td>R13025</td><td>W celu wykrycia endotoksyny&nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml probówki do mikrowirówek</td><td>Taizhou Suyi Medical</td><td>B122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Boster Biological Technology</td><td>AR0030</td><td>Rozpuszczalnik roztworu podstawowego nanocząstek CoCrMo</td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodium</td><td>Sigma</td><td>P3761</td><td>Do znieczulania myszy</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna normalna</td><td>SACKLER</td><td>SR8572EP-15</td><td>Aby zapobiec wysuszeniu oczu myszy</td></tr><tr><td>75% etanolu</td><td>Nanjing Odczynnik</td><td>C0691560275</td><td>Dezynfekcja</td></tr><tr><td>Bawełna medyczna</td><td>Shuitao</td><td>1278298933</td><td>Golarka do dezynfekcji</td></tr><tr><td></td><td>Kemei</td><td>KM-3018</td><td>Do golenia futra</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>RWD LIFE SCIENCE</td><td>S12005-10</td><td>Do nacinania skóry</td></tr><tr><td>Szew</td><td>RWD LIFE SCIENCE</td><td>F34001-01</td><td>Do zszywania skóry</td></tr><tr><td>Uchwyt igły</td><td>RWD LIFE SCIENCE</td><td>F33001-01</td><td>Do szycia skóry</td></tr><tr><td>Igła</td><td>RWD LIFE SCIENCE</td><td>R14003-12</td><td>Do szycia skóry</td></tr><tr><td>Kleszcze do naczyń</td><td>RWD LIFE SCIENCE</td><td>F22003-09</td><td>Do szycia skóry</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>RWD LIFE SCIENCE</td><td>S31010-01</td><td>Do zbioru kalwarii</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>RWD LIFE SCIENCE</td><td>F12006-10</td><td>Do zbioru calvaria</td></tr><tr><td>100 &mikro; Pipety L</td><td>Eppendorf</td><td>3120000240</td><td>Do osadzania zawiesiny cząstek w calvatias</td></tr><tr><td>100 &micro; L końcówki do pipet</td><td>AXYGEN</td><td>T-200-Y</td><td>Do osadzania zawiesiny cząstek w calvatias</td></tr><tr><td>5 ml Mikroprobówki</td><td>Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD</td><td>W621</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Servicebio</td><td>G1101</td><td>Utrwalenie</td></tr><tr><td>Mikro tomografia komputerowa&nbsp;</td><td>SkyScan</td><td>SkyScan1176</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Servicebio</td><td>G1105</td><td>Odwapnianie</td></tr><tr><td>Parafina</td><td></td> <td>Servicebio#0001</td><td></td></tr><tr><td>Krajalnica do parafiny</td><td>Leica</td><td>RM2125RTS</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko szklane</td><td>Servicebio</td><td>G6004</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe</td><td>Servicebio</td><td>200</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia HE</td><td>Servicebio</td><td>#1-5</td><td>Mikroskop świetlny do barwienia HE</td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>E200</td><td></td></tr></tbody></table>

budowa i ocena mysiego modelu osteolizy kalwarycznej poprzez ekspozycję na cząstki cocrmo w aseptycznym rozluźnianiu

Construction and Evaluation of a Murine Calvarial Osteolysis Model by Exposure to CoCrMo Particles in Aseptic Loosening

Osteoliza wywołana cząstkami jest główną przyczyną aseptycznego rozluźnienia w przypadku niepowodzenia endoprotezoplastyki, ale podstawowy mechanizm pozostaje niejasny. Ze względu na długie okresy obserwacji niezbędne do wykrycia i sporadyczne występowanie, ocena patogenezy osteolizy indukowanej cząstkami w przypadkach klinicznych jest trudna. W związku z tym do dalszych badań potrzebne są optymalne modele zwierzęce. Mysi model osteolizy kalwaryjnej ustalony przez ekspozycję na cząstki CoCrMo jest skutecznym i ważnym narzędziem do oceny interakcji między cząstkami a różnymi komórkami w aseptycznym rozluźnieniu. W tym modelu cząstki CoCrMo zostały najpierw uzyskane za pomocą wysokopróżniowego prądu stałego z trzema elektrodami i ponownie zawieszone w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami w stężeniu 50 mg/ml. Następnie 50 μl powstałej zawiesiny nałożono na środek mysiej kalwarii po oddzieleniu okostnej czaszki przez ostre rozwarstwienie. Po dwóch tygodniach myszy zostały złożone w ofierze i zebrano okazy kalwarii; Oceny jakościowe i ilościowe przeprowadzono za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną oraz mikrotomografii komputerowej. Mocne strony tego modelu to prostota procedury, ilościowa ocena utraty masy kostnej, szybkość rozwoju osteolizy, potencjalne zastosowanie modeli transgenicznych lub knockout oraz stosunkowo niski koszt. Model ten nie może być jednak używany do oceny siły mechanicznej i przewlekłych skutków cząstek podczas aseptycznego poluzowywania. Mysi model osteolizy kalwarycznej generowany przez ekspozycję na cząstki CoCrMo jest idealnym narzędziem do oceny interakcji między cząstkami zużywającymi się a różnymi komórkami, np. makrofagami, fibroblastami, osteoblastami i osteoklastami, w aseptycznym rozluźnieniu.

Wytworzone wewnętrznie nanocząstki CoCrMo miały średnicę około 50 nm (błąd standardowy 3,56), co określono za pomocą TEM (Rysunek 2). Po wystawieniu sklepień czaszkowych myszy na działanie cząsteczek CoCrMo, zwierzęta (n=6 na grupę) utrzymywano przez kolejne dwa tygodnie. W ciągu tych dwóch tygodni nacięcie sklepień czaszkowych całkowicie się zagoiło, a szwy mogły odpaść. Jakakolwiek miejscowa infekcja lub brak zrostu mogły wpłynąć na ocenę ubytku kostnego. P...

Ten manuskrypt opisuje model osteolizy kalwarii mysiej poprzez ekspozycję na cząsteczki CoCrMo, który stanowi idealny model zwierzęcy do oceny interakcji między cząstkami zużycia a różnymi komórkami w aseptycznym rozluźnieniu.

Budowa i ocena mysiego modelu osteolizy kalwarycznej poprzez ekspozycję na cząstki CoCrMo w aseptycznym rozluźnianiu

Wear particle-induced osteolysis is a major cause of aseptic loosening in arthroplasty failure, but the underlying mechanism remains unclear. Due to long ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie i ocena mysiego modelu osteolizy sklepienia czaszki poprzez ekspozycję na nanocząsteczki kobaltu, chromu i molibdenu. Osteoliza indukowana cząstkami zużycia jest główną przyczyną aseptycznego poluzowania w przypadkach niepowodzenia artroplastyki, jednak mechanizmy leżące u podstaw tego procesu pozostają niejasne. Ze względu na długi czas obserwacji oraz sporadyczne występowanie, badanie patogenezy aseptycznego poluzowania w przypadkach klinicznych jest utrudnione.W związku z tym, do dalszych badań niezbędny jest zwierzęcy model zużycia. W naszym laboratorium model osteolizy sklepienia czaszki myszy, wywołany cząsteczkami stopu kobaltu, jest skutecznym modelem do badania patogenezy aseptycznego poluzowania. Osiąga się to poprzez wstępne wytworzenie nanocząsteczek kobaltu, chromu i molibdenu z protezy ze stopu kobaltu, a następnie ich resuspensję w roztworze soli fosforanowych w stężeniu 15 mg/ml.Kolejnym krokiem jest wyznaczenie miejsca nacięcia w linii łączącej dwa punkty środkowe odpowiednio między oczami i uszami. Następnie, za pomocą dyssekcji szokowej, należy usunąć okostną czaszki z kalwarii. W kolejnym etapie należy pobrać 50 µL roztworu zapasowego nanocząsteczek stopu kobaltu i wprowadzić je w szew środkowy kalwarii.Po dwóch tygodniach utrzymania, uśmierć część myszy i pobierz sklepienia czaszki w celu oceny osteolizy. Osteoliza jest wyraźna u myszy traktowanych nanocząsteczkami stopu kobaltu, zarówno w obrazach mikro-CT, jak i w barwieniu H and E. Uzyskaj stop kobalt-chrom-molibden z protezy ze stopu kobaltu, otrzymując cząsteczki kobalt-chrom-molibdenu ze stopu kobalt-chrom-molibdenu za pomocą wytworzonego prądu stałego tródelektrodowego w wysokiej próżni.Aby określić średnicę średnią cząsteczek kobaltu, chromu i molibdenu, należy odważyć 1 mg cząsteczek, przenieść je do 1,5 ml bezwodnego etanolu i zawiesić za pomocą wstrząsania ultradźwiękowego. Jedną kroplę zawiesiny, o objętości około 20 µL, należy nanieść na stolik przedmiotowy mikroskopu elektronowego transmissyjnego i wykonać serię obrazów. Należy użyć dostarczonego oprogramowania, aby obliczyć średnicę średnią oraz rozkład wielkości cząsteczek na obrazach TEM.Po lewej stronie przedstawiono reprezentatywne obrazy TEM, natomiast po prawej rozkład wielkości nanocząsteczek stopu kobaltu, chromu i molibdenu obliczony przez nasze komercyjne oprogramowanie. Średnica średnia wynosi około 50 nanometrów. Poddaj cząsteczki autoklawowaniu przez 15 minut w celu usunięcia endotoksyn.Następnie resuspendować je w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo do stężenia 15 mg/mL w celu przygotowania roztworu zapasowego. Kolejnym etapem jest stworzenie modelu osteolizy sklepienia czaszki. Wybrać i znieczulić sześciotygodniowe myszy: po sześć myszy na grupę.Ustaw zwierzęta w pozycji pierwotnej. Usuń futro i zdezynfekuj skórę na czaszce 75% etanolem. W celu wykonania nacięcia wyznacz dwa punkty środkowe odpowiednio między oczami oraz uszami, a następnie nacinaj skórę wzdłuż linii je łączącej.Starannie i całkowicie usuń okostną czaszki z kalwarii metodą dyssekcji szokowej. Dokładna dyssekcja okostnej nasila oddziaływania między cząsteczkami w kalwarii. Szew wykonuje się ostrożnie na obu końcach nacięcia, stosując szew prosty przerywany.Zazwyczaj do pełnego zszycia potrzeba trzech szwów. W ostatnim etapie przeciągnij nić chirurgiczną przez nacięcie bez wiązania, trzymając oba końce nici. Pobierz 15 µL roztworu zapasowego nanocząstek stopu kobaltu i wprowadź je w środek szwu na sklepieniu czaszki.Zwiąż ostatni szew w szwie przerywanym. Utrzymuj myszy przez kolejne dwa tygodnie. Po dwóch tygodniach utnij zwierzę i pobierz sklepienia czaszki.Delikatnie usuń pęsetą wszystkie tkanki miękkie z próbek sklepień czaszki, a następnie utrwal tkanki w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C. W celu oceny osteolizy w modelu indukowanym nanocząsteczkami kobaltu, chromu i molibdenu, wykonaj mikro-CT o wysokiej rozdzielczości na 24 godziny przed skanowaniem mikro-CT. Przenieś próbki sklepień czaszki z paraformaldehydu do soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS).W dniu skanowania mikro-tomografią komputerową (micro-CT), należy wyjąć preparaty kalwariów z roztworu soli fosforanowo-buforowanej i zamocować je w uchwycie dołączonym do urządzenia. Następnie wykonuje się skanowanie kalwariów przy użyciu mikro-tomografu komputerowego. Rekonstrukcję trójwymiarową przeprowadza się za pomocą odpowiedniego oprogramowania.Barwienie H&amp;E jest kolejnym narzędziem do oceny osteolizy w modelu indukowanym nanocząsteczkami. Próbki sklepień czaszkowych należy odwapnić w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym, zawierającej 15% kwasu etylenodiaminotetraoctowego, przez trzy tygodnie w temperaturze 4 °C. Odwapnione sklepienia czaszkowe należy zalać w parafinie i pociąć na sekcje o grubości 2 µm w obszarze depozycji cząsteczek.Przebarw skrawki hematoksyliną i eozyną. Oceń ogólną morfologię za pomocą mikroskopii świetlnej i wykonaj mikrofotografie. Poniżej przedstawiono reprezentatywne obrazy mikro-CT.Obrazy rekonstrukcji trójwymiarowej danych z mikro-CT przedstawiono w lewym panelu. Obrazy przekrojów poprzecznych myszy z grupy kontrolnej, grupy po operacji pozorowanej oraz grupy leczonej nanocząsteczkami przedstawiono w prawym panelu. Osteoliza jest wyraźna w grupie leczonej nanocząsteczkami.Poniżej przedstawiono analizę ilościową zdjęć z mikro-CT wykonaną za pomocą oprogramowania powiązanego z urządzeniem. Pomiary obejmują gęstość mineralną kości, objętość kości lub stosunek objętości całkowitej, procent całkowitej porowatości, liczbę beleczek kostnych, grubość beleczek kostnych oraz separację lub odstępy między beleczkami kostnymi. Myszy traktowane nanocząsteczkami stopu kobaltu wykazują znacznie niższą gęstość mineralną kości i objętość kości, a także wyższy procent całkowitej porowatości w porównaniu z zwierzętami z grupy kontrolnej.Poniżej przedstawiono reprezentatywne obrazy barwienia H i E dla próbek sklepienia czaszki pobranych od myszy z grupy kontrolnej, grupy operacji pozorowanej oraz grupy leczonej nanocząsteczkami. Osteoliza jest również wyraźna w grupie leczonej nanocząsteczkami. Mysi model osteolizy sklepienia czaszki wywołanej nanocząsteczkami stopu kobaltu charakteryzuje się wysokim wskaźnikiem sukcesu w modelowaniu osteolizy indukowanej cząstkami zużycia.Poniżej przedstawiono kilka kluczowych czynników. Po pierwsze, nanocząsteczki stopu kobaltu wzmacniają oddziaływanie między cząsteczkami ścierania a sklepieniem czaszki. Po drugie, odpowiednia ekspozycja sklepienia czaszki oraz dokładna dyssekcja okostnej sprawiają, że oddziaływanie między cząsteczkami a sklepieniem czaszki jest bardziej intensywne.Po trzecie, ilościowe pomiary ubytku kostnego za pomocą mikro-CT ułatwiają ocenę różnic w utracie kości pomiędzy różnymi metodami leczenia, dostarczając nam solidnych dowodów na osteolizę w porównaniu z tradycyjną histomorfometrią kości. Model osteolizy sklepienia czaszki indukowany cząsteczkami stopu kobaltu jest idealnym modelem do badania interakcji między cząsteczkami zużycia a różnymi komórkami w procesie aseptycznego poluzowania, takimi jak makrofagi, fibroblasty, osteoklasty i osteoblasty.Mamy nadzieję, że nasz model okaże się pomocny w przyszłych badaniach nad aseptycznym obluzowaniem.

construction-evaluation-murine-calvarial-osteolysis-model-exposure-to

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy protokół opisuje izolację komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej z aspiratu tłuszczowego oraz stworzenie krytycznego ubytku w kalwaru o rozmiarze 4 mm w celu oceny regeneracji szkieletu.

Naprawa modelu krytycznego ubytku kalwarii z wykorzystaniem stromalnych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej pozyskanych z lipoaspiratu

Chociaż modele mysie są nieocenionymi narzędziami do inżynierii tkanki kostnej, modele długich wad kostnych są rzadkie. Ta potrzeba zmotywowała do opracowania obecnego protokołu, który wykorzystuje płytkę blokującą z czterema i dedykowanym przyrządem do wykonania i ustabilizowania powtarzalnego ubytku udowego o krytycznej wielkości przy niskiej zachorowalności.

Ustalenie segmentalnego modelu ubytku krytycznej wielkości kości udowej u myszy stabilizowanych przez osteosyntezę płytkową

Komórki zrębu pochodzące z tkanki tłuszczowej mogą być przydatne do inżynierii nowej tkanki z własnych komórek pacjenta. Przedstawiamy protokół izolacji subpopulacji ludzkich komórek zrębu pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) o zwiększonym potencjale osteogennym, a następnie zastosowania komórek w teście gojenia kalwaryjnego in vivo.

Szybka izolacja komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej BMPR-IB+ do zastosowania w modelu gojenia ubytków nazębnych

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji tworzenia naczyń krwionośnych in vivo i w czasie rzeczywistym na rusztowaniach 3D za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Angiogenezę w genetycznie zmodyfikowanych rusztowaniach badano w mysim modelu krytycznego ubytku kości kalwarycznej. W grupie leczonej wykryto więcej nowych naczyń krwionośnych niż w grupie kontrolnej.

Wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3D-PLGA/nHAp do naprawy krytycznego ubytku kości calowej

Hodowla ex vivo eksplantatów kostnych może być cennym narzędziem do badania fizjologii kości i potencjalnej oceny leków w przebudowie kości i chorobach kości. Prezentowany protokół opisuje przygotowanie i hodowlę kalwarii wyizolowanych z czaszek nowonarodzonych myszy, a także jej zastosowania.

Pomiar przebudowy kości i odtworzenie mikrośrodowiska guz-kość przy użyciu kokultury kalwarii i histomorfometrii

Tutaj prezentujemy protokół chirurgiczny u królików, którego celem jest ocena materiałów zastępczych kości pod kątem zdolności do regeneracji kości. Za pomocą cylindrów PEEK przymocowanych do czaszek królików, osteokondukcja, osteoindukcja, osteogeneza i waskulogeneza wywołane przez materiały mogą być oceniane zarówno na żywych, jak i uśpionych zwierzętach.

Kalwaryjny model augmentacji kości u królika do oceny wzrostu kości i neowaskularyzacji w materiałach kościozastępczych

Ten protokół opisuje wykrywanie migracji komórek macierzystych okostnej szkieletu za pośrednictwem CCL5 w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii intravital żywych zwierząt.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym indukowanej przez CCL5 migracji komórek macierzystych okostnej kostnej u myszy

Tutaj prezentujemy protokół jatrogennego złamania trzonu kości udowej szczurów albinosów Wistar i śledzenia rozwoju modzela. Ten model osteotomii kości udowej może pomóc naukowcom ocenić proces gojenia się złamań i zbadać, w jaki sposób lek może wpływać na gojenie złamań.

Protokół opracowania modelu osteotomii kości udowej u szczurów albinosów Wistar

Ten protokół krok po kroku pokazuje, jak wydobyć pierwszy ząb trzonowy żuchwy u myszy. Stanowi alternatywną metodę dla badaczy zajmujących się gojeniem i regeneracją kości szczęki.

Opracowanie modelu gojenia zębodołu po ekstrakcji zębów trzonowych żuchwy u myszy

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia defektu w tkance trzonu kości udowej szczura. Model ten może oceniać wydajność biomateriału pod wpływem stresu biomechanicznego i badać mechanizmy regeneracji kości związane z osteogenezą błoniastą.

Tworzenie modelu ubytku ubytku ubytku w kości korowej kości udowej szczura

Model uszkodzenia szpiku kostnego u myszy jest użytecznym narzędziem do badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste. Ten uproszczony protokół chirurgiczny opisuje procedurę ablacji szpiku kostnego w celu dalszej oceny tworzenia się nowej kości i odpowiedzi komórkowych po urazie.

Ulepszona metodologia badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste w mysim modelu uszkodzenia szpiku kostnego

Poznaj metodę budowy mysiego modelu osteolizy kalwarycznej z użyciem nanocząstek CoCrMo. Model ten pozwala badać interakcje cząstek zużycia z komórkami w aseptycznym rozluźnianiu endoprotez.

Budowa i ocena mysiego modelu osteolizy kalwarycznej poprzez ekspozycję na cząstki CoCrMo w aseptycznym rozluźnianiu

Przeglądaj więcej filmów