Budowa i ocena mysiego modelu osteolizy kalwarycznej poprzez ekspozycję na cząstki CoCrMo w aseptycznym rozluźnianiu
17 lutego 2018
Ten manuskrypt opisuje model osteolizy kalwarii mysiej poprzez ekspozycję na cząsteczki CoCrMo, który stanowi idealny model zwierzęcy do oceny interakcji między cząstkami zużycia a różnymi komórkami w aseptycznym rozluźnieniu.
Ogólnym celem tej procedury jest skonstruowanie i ocena modelu mysiej osteolizy kalwarii poprzez ekspozycję na nanocząstki kobaltu, chromu i molibdenu. Osteoliza wywołana cząstkami zużycia jest główną przyczyną aseptycznego poluzowania w niepowodzeniu endoprotezoplastyki, ale podstawowa mechanika tego jest niejasna. Ze względu na długi czas obserwacji i sporadyczne występowanie, trudno jest zbadać partogenezę aseptycznego rozluźnienia w przypadkach klinicznych.
W związku z tym do dalszych badań niezbędny jest model zwierzęcy. W naszym laboratorium model osteolizy kości łośniowej zbudowany z cząstki stopu kobaltu jest skutecznym modelem do badania partogenezy aseptycznego rozluźnienia. Osiąga się to poprzez najpierw wygenerowanie nanoskalowych cząstek kobaltu i chromu i molibdenu z protezy ze stopu kobaltu i ponowne zawieszenie ich w roztworze soli fizjologicznej w buforze fosforanowym o stężeniu 15 miligramów na mililitr.
Następnym krokiem jest określenie miejsca nacięcia na linii między dwoma punktami środkowymi odpowiednio między dwojgiem oczu i uszami. Następnie usuń okostną czaszki z kalwarii przez rozwarstwienie szokowe. Następnie weź 50 mikrolitrów nanocząstek ze stopu kobaltu i umieść je w środkowym szwie kalwarii.
Po dwóch tygodniach konserwacji poświęć kilka myszy i zbierz kalwarię do oceny osteolizy. Osteoliza jest oczywista u myszy traktowanych nanocząstkami stopu kobaltu, zarówno w obrazach mikro-CT, jak i barwienia H i E. Uzyskaj stop kobaltowo-chromowo-molibdenowy z protezy ze stopu kobaltu, otrzymując cząstki kobaltowo-chromowo-molibdenowe ze stopu kobaltu i chromu molibdenu za pomocą wytworzonego prądu stałego z trzema elektrodami o wysokiej próżni
.Aby określić ilościowo średnią średnicę cząstek kobaltowo-chromowo-molibdenowych, należy wziąć jeden miligram cząstek do 1,5 mililitra bezwodnego etanolu i zawiesić je przez wytrząsanie ultradźwiękowe. Nanieść jedną kroplę, około 20 mikrolitrów, zawiesiny na obiektywną tabelę transmisyjnej mikroskopii elektronowej i uzyskać serię obrazów. Użyj dostarczonego oprogramowania, aby obliczyć średnią średnicę i rozkład wielkości cząstek na obrazach TEM.
Oto reprezentatywne obrazy TEM na lewym panelu, prawy pokazuje rozkład wielkości nanocząstek stopu kobaltu, chromu i molibdenu, obliczony przez nasze komercyjne oprogramowanie. Średnia średnica wynosi około 50 nanometrów. Autoklawuj cząsteczki przez 15 minut, aby usunąć endotoksyny.
Następnie zawiesić je ponownie w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem w stężeniu 15 miligramów na mililitr w postaci roztworu podstawowego. Kolejnym etapem jest budowa modelu osteolizy kalwaryjnej. Wybierz i znieczul sześciotygodniowe myszy: sześć myszy na grupę.
Umieść zwierzęta w pierwszej pozycji. Usuń sierść i zdezynfekuj skórę na czaszce 75 procentami etanolu. W przypadku nacięcia zidentyfikuj dwa punkty środkowe odpowiednio między dwoma oczami i uszami i naciąć skórę wzdłuż łączącej je linii.
Ostrożnie i całkowicie usuń okostną czaszki z kalwarii poprzez rozwarstwienie szokowe. Wyraźne rozwarstwienie okostnej intensyfikuje interakcje między cząstkami w kalwarii. Szew wykonuje się ostrożnie na obu końcach nacięcia w prostym szwie przerywanym.
Zwykle do pełnego szwu potrzebne są trzy szwy. W ostatnim etapie przełóż linię szwu przez nacięcie bez węzła, trzymając oba końce linii szwu. Weź 15 mikrolitrów nanocząstek roztworu podstawowego ze stopu kobaltu i umieść je w środkowym szwie kalwarii.
Ostatni ścieg zawiąż w prostym przerywanym szwie. Utrzymuj myszy przez kolejne dwa tygodnie. Dwa tygodnie później złóż zwierzę w ofierze i zbierz kalwarię.
Delikatnie oczyść całą tkankę miękką z próbek kalwarii za pomocą pęsety i przymocuj tkankę do czteroprocentowego paraformaldehydu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W celu oceny osteolizy w modelu indukowanym nanocząstkami kobaltowo-chromowo-molibdenowymi należy wykonać mikrotomografię komputerową o wysokiej rozdzielczości na 24 godziny przed skanowaniem mikro-CT. Przenieść próbki kalwarii w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z paraformaldehydu.
W dniu badania mikrotomografią komputerową należy pobrać próbki kalwarii z soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i przymocować je do uchwytu dołączonego do instrumentu. Skanuj kalwarię za pomocą instrumentu mikro-CT. Przeprowadź trójwymiarową rekonstrukcję za pomocą różnorodnego oprogramowania.
Barwienie H i E jest kolejnym narzędziem do oceny osteolizy w modelu indukowanym nanocząstkami. Odwapnić próbki kalwarii w buforowanym fosforanem roztworze soli fizjologicznej, zawierającym 15 procent ehylenodiaminotetraoctanu przez trzy tygodnie w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odwapnioną kalwarię zanurzyć w parafinie i pokroić na dwie sekcje mikrometryczne w obszarze osadzania cząstek.
Wybarwić skrawki hematoksyliną i eozyną. Obserwuj ogólny morfizm przejścia przez morfizm i mikroskopię świetlną oraz uzyskaj mikrofotografie. Oto reprezentatywne obrazy mikrotomografii komputerowej.
Trójwymiarowe obrazy rekonstrukcji danych z mikrotomografii komputerowej są pokazane w lewym panelu. Obrazy przekrojów poprzecznych z myszy, operacji pozorowanej i myszy traktowanych nanocząstkami są pokazane w prawym panelu. Osteoliza jest oczywista w grupie leczonej nanocząsteczkami.
Poniżej znajduje się analiza ilościowa zdjęć mikro-CT za pomocą oprogramowania powiązanego z instrumentami. Pomiary obejmują gęstość mineralną kości, objętość kości lub stosunek objętości całkowitej, procent całkowitej porowatości, liczbę beleczkowatą, grubość beleczkowa oraz separację lub odstępy między beleczkami. Myszy leczone nanocząstkami stopu kobaltu wykazują znacznie niższą gęstość mineralną i objętość kości, z wyższym procentem całkowitej porowatości w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi.
Oto reprezentatywne obrazy barwienia H i E dla próbek kalwarii od myszy kontrolnych, pozorowanych i myszy traktowanych nanocząsteczkami. Osteoliza jest również oczywista w grupie leczonej nanocząsteczkami. Mysi model osteolizy kalwaryjnej zbudowany z nanocząstek stopu kobaltu ma wysoki wskaźnik sukcesu w modelowaniu osteolizy wywołanej cząstkami zużycia.
Poniżej przedstawiono kilka kluczowych czynników. Po pierwsze, nanocząstki stopu kobaltu zwiększają interakcję między cząstkami zużycia a kalwarią. Po drugie, odpowiednia ekspozycja kalwarii i wyraźne rozwarstwienie okostnej sprawia, że interakcja między cząstkami a kalwarią jest bardziej intensywna.
Po trzecie, ilościowe pomiary ubytku masy kostnej za pomocą mikrotomografii komputerowej ułatwiają dostęp do różnic w ubytku masy kostnej między różnymi metodami leczenia, dostarczając nam solidnych dowodów na osteolizę w porównaniu z tradycyjną histomorfometrią kości. Model osteolizy kalwarii Wear zbudowany z cząstek stopu kobaltu jest idealnym modelem do badania interakcji między cząstkami zużycia a różnymi komórkami w aseptycznym rozluźnieniu. Takich jak mikrofagi, fibroblasty, osteoklasty i osteoblasty.
Mamy nadzieję, że nasz model będzie pomocny w badaniach nad aseptycznym rozluźnianiem w przyszłości.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy manuskrypt opisuje mysi model osteolizy sklepienia czaszki wywołanej ekspozycją na nanocząsteczki kobaltu, chromu i molibdenu, który stanowi idealny model zwierzęcy do oceny interakcji między cząstkami zużycia a różnymi komórkami w procesie aseptycznego poluzowania. Model ten jest kluczowy dla zrozumienia patogenezy osteolizy związanej z niepowodzeniem artroplastyki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Ortopedia
Wstęp
- Osteoliza indukowana cząsteczkami zużycia jest istotną przyczyną aseptycznego obluzowania endoprotez stawów.
- Mechanizmy leżące u podstaw tego procesu pozostają niejasne.
- Badania kliniczne napotykają trudności ze względu na długi czas obserwacji i sporadyczne występowanie tego zjawiska.
- Niezawodny model zwierzęcy jest niezbędny do dalszych badań.
Cel badania
- W celu opracowania i oceny mysiego modelu osteolizy sklepienia czaszki.
- W celu zbadania oddziaływań między cząsteczkami kobaltowo-chromowo-molibdenowymi a różnymi typami komórek.
- W celu pogłębienia wiedzy na temat patogenezy aseptycznego poluzowania.
Zastosowane metody
- Generowanie nanocząsteczek kobaltowo-chromowo-molibdenowych z protezy z kobaltowego stopu.
- Resuspensja cząsteczek w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym w stężeniu 15 mg/mL.
- Ekspozycja tkanki sklepienia czaszki myszy na działanie cząsteczek.
- Ocena oddziaływań komórkowych i odpowiedzi osteolitycznych.
Główne wyniki
- Model mysi skutecznie naśladuje osteolizę indukowaną cząsteczkami zużycia.
- Interakcje między cząsteczkami a komórkami zostały pomyślnie ocenione.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia mechanizmów aseptycznego poluzowania.
- Model ten może być wykorzystany w przyszłych badaniach nad niepowodzeniem artroplastyki.
Wnioski
- Myszie model osteolizy sklepienia czaszki jest cennym narzędziem badawczym.
- Pozwala on na lepsze zrozumienie patogenezy osteolizy.
- Model ten może pomóc w opracowaniu strategii ograniczających aseptyczne poluzowanie protez.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Osteoliza indukowana cząsteczkami zużycia pozostaje główną przyczyną aseptycznego poluzowania w przypadku niepowodzenia endoprotezoplastyki stawów, jednak zrozumienie mechanizmów tego procesu jest ograniczone przez rygory badań klinicznych. Mysi model sklepienia czaszki zapewnia szybki i mierzalny system oceny oddziaływań między cząsteczkami a komórkami, co umożliwia przedkliniczną redukcję ryzyka w przypadku biomateriałów i konstrukcji implantów. Wspiera to walidację celów oraz zwiększa pewność prognostyczną w wczesnych etapach potoków badawczo-rozwojowych w ortopedii.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących oddziaływań cząstek zużycia z makrofagami, fibroblastami, osteoblastami i osteoklastami.
- Wartość operacyjna: Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka poprzez ilościową ocenę ubytku kostnego za pomocą mikro-TK i histomorfometrii.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez modelowanie odpowiedzi osteolitycznych w celu optymalnego doboru materiałów do implantów.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje standaryzowane wyniki biologiczne (gęstość mineralna kości, parametry beleczkowe) do oceny związków lub powłok.
- Powtarzalność: Wysoki wskaźnik sukcesu i niska zmienność umożliwiają skalowalne przesiewanie modyfikacji cząsteczek.
- Użyteczność platformy: Kompatybilność z modelami transgenicznymi/knockout w celu analizy szlaków mechanistycznych w osteolizie.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie kliniczne: Modelowanie patogenezy aseptycznego poluzowania w celu powiązania odkryć naukowych z walidacją przedkliniczną.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnienie komórkowych i molekularnych szlaków prowadzących do osteolizy w celu priorytetyzacji celów terapeutycznych.
- Ciągłość translacyjna: Dostarczenie ilościowych punktów końcowych (objętość kości, porowatość), które pozwalają przewidzieć funkcjonowanie implantu in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając testowanie hipotez we wczesnej fazie odkrywania, opracowywanie testów do screeningu oraz ocenę mechanistyczną przed identyfikacją związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących indukowanych cząsteczkami ścieżek zapalnych i osteolitycznych.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, zestandaryzowanych odczytów (metryki kostne mikro-CT) w celu wiarygodnej oceny związków lub biomateriałów.
- Analityka: Generuje mierzalne wyniki (gęstość mineralna kości, grubość beleczek, porowatość) do porównywania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy ekspozycję na cząsteczki z efektami osteolitycznymi, dostarczając informacji dla decyzji dotyczących rozwoju przedklinicznego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny różnorodnych cząsteczek zużycia i powłok implantów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w osteolizie indukowanej cząsteczkami.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zdefiniowanej ekspozycji na cząsteczki i protokołom ilościowej oceny.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez zapewnienie wczesnej oceny ryzyka biologicznego materiałów implantacyjnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację biomateriałów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie ich potencjału osteolitycznego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w chirurgii myszy, obchodzeniu się z cząstkami oraz obrazowaniu mikro-CT.
- Zależne od aparatury do generowania cząstek (elektroda DC wysokiej próżni), przygotowania zawiesiny oraz kwantyfikacji osteolizy.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie dawkowania cząstek, techniki chirurgicznej oraz przepływów analizy.
- Kwestie adaptacyjne obejmują przydatność modelu do oceny przewlekłości oraz badań obciążeń mechanicznych.
- Ograniczenie praktyczne: zgodnie z materiałem źródłowym nie można oceniać efektów sił mechanicznych ani długotrwałej przewlekłej ekspozycji na cząstki.
