Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie transkryptów RNA w komórkach i tkankach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórkowej i rozwojowej, takie jak to, gdzie wewnątrz komórki, tkanki lub zarodka znajduje się RNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykrywa ona rozkłady przestrzenne RNA zarówno z wysoką rozdzielczością i czułością, jak i przy niskich kosztach w porównaniu z innymi metodami.

Początkowo opracowaliśmy ten protokół, aby zbadać subkomórkowe rozmieszczenie jak największej liczby RNA Drosophila. Miało to na celu określenie zakresu i różnorodności dystrybucji subkomórkowej. Rozpoczęliśmy projekt od pracy z zarodkiem, ale później dostosowaliśmy i zoptymalizowaliśmy protokół, dzięki czemu mogliśmy pracować z dużą wydajnością z tkankami wypreparowanymi z larw i muszek.

Najtrudniejszym aspektem procedury jest liczba kroków i wynikający z nich potencjał błędu, a także konieczność zapewnienia braku RNA podczas produkcji sondy. Aby zwiększyć przepustowość i opłacalność, procedury przedstawione w tym filmie wykorzystują 96-dołkowe płytki do mikromiareczkowania na wszystkich etapach. Łatwo jest również dostosować tę metodę do mniejszych elementów próbki, przecinając płytki na ośmio- lub 12-dołkowe paski.

Zacznij od rozcieńczenia 10 mikrolitrów nocnej kultury bakteryjnej w 90 mikrolitrach autoklawowanej podwójnie destylowanej wody w każdym dołku nowej 96-dołkowej płytki PCR. Denaturacja DNA w temperaturze 95 stopni Celsjusza w termocyklerze przez pięć minut. Natychmiast umieść talerz na lodzie na co najmniej pięć minut.

Ustaw reakcje PCR na nowej 96-dołkowej płytce PCR. Użyj odpowiednich uniwersalnych starterów i podajcie 48 mikrolitrów głównej mieszanki PCR do każdej studzienki. Dodaj dwa mikrolitry każdej zdenaturowanej matrycy DNA plazmidu na studzienkę.

Wykonaj amplifikację w 96-dołkowej maszynie do PCR. Po zakończeniu amplifikacji wytrącić produkt PCR mieszaniną etanolu octanu sodu. Próbki należy przechowywać przez 30 minut w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Odwirować 96-dołkową płytkę w temperaturze 2 250 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 45 do 60 minut. Używając ośmiokanałowej pipety próżniowej z kolektorem próżniowym, która ma konstrukcję zapobiegającą przedostawaniu się końcówek na dno studzienek podczas zasysania granulek, ostrożnie usuń supernatant. Umyj raz 160 mikrolitrami zimnego 70% etanolu.

Wirować przy 2 250 g w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Delikatnie odwróć 96-dołkową płytkę na ręczniku papierowym, aby usunąć ostatnie krople płynu z każdej studzienki i wysusz granulki DNA na powietrzu w temperaturze pokojowej przez godzinę. Ponownie zawiesić wytrącone DNA w 25 mikrolitrach wody wolnej od RNaz.

Sprawdź wielkość i wydajność produktów PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Ustaw reakcje transkrypcji in vitro, dodając odpowiednie składniki do każdej studzienki na nowej 96-dołkowej płytce PCR. Dodaj 7,5 mikrolitra matrycy DNA do każdej odpowiedniej studzienki.

Przykryj płytkę taśmą uszczelniającą. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 3-1/2 do czterech godzin. Następnie dodaj do każdej studzienki mieszankę wzorcową składającą się z podwójnie destylowanej wody uzdatnionej DEPC, 100% etanolu i trzech molowych octanów sodu.

Przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez 30 minut. Odwirować płytkę i umyć studzienki, jak pokazano wcześniej. Ponownie zawiesić wytrąconą sondę w 25 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody uzdatnionej DEPC.

Nowo zsyntetyzowane antysensowne sondy RNA przeprowadzono na 1% żelu agarozowym, aby sprawdzić integralność i wydajność. W zależności od intensywności pasma, plon można scharakteryzować jako niski plon, typowy plon lub wysoki plon. Po użyciu pięciu mikrolitrów każdej sondy do elektroforezy w żelu agarozowym, wymieszaj pozostałe 20 mikrolitrów ze 100 mikrolitrami roztworu hybrydyzacyjnego i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu, gdy będą potrzebne.

Aby rozpocząć tę procedurę, umieść od 20 do 30 larw na szalce Petriego zawierającej zimny PBS w roztworze fix one i schładzaj na lodzie przez dwie minuty, aby zmniejszyć ruchliwość larw. Wypreparuj larwy pod lunetą preparacyjną. Użyj pary ostrych kleszczy, aby ostrożnie otworzyć przednią część i ścisnąć tkanki od tyłu do przodu.

Po maksymalnie 15 minutach przenieś wycięte tkanki do 1,5 mililitrowej probówki w celu utrwalenia i umieść na lodzie. Usuń PBS i dodaj 800 mikrolitrów roztworu fix one. Inkubować na mikserze stołowym przez 30 minut wraz z innymi wcześniej zebranymi tkankami utrwalającymi.

Opłucz chusteczki raz 800 mikrolitrami PBTT i trzymaj probówkę na lodzie, podczas gdy dodatkowe tkanki są zbierane i naprawiane. Zbierz wszystkie wypreparowane tkanki w jednej 15-mililitrowej plastikowej tubie zawierającej siatkę w pokrywie tuby. Odessać nadmiar płynu przez siatkę w pokrywie.

Umyć 10 mililitrami PBTT i spłukać 10 mililitrami PBS. Aby ugasić endogenną aktywność peroksydazy chrzanu, dodaj pięć mililitrów 0,3% nadtlenku wodoru do PBS i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Umyć dwukrotnie 10 mililitrami PBTT.

Przepuszczalność tkanek poprzez dodanie 10 mililitrów wstępnie schłodzonego 80% acetonu i inkubację w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 10 minut. Umyj dwukrotnie 10 mililitrami PBTT, aby nawodnić tkanki. Po umyciu tkanek zgodnie z opisem w protokole tekstowym przechowywać w roztworze hybrydyzacyjnym w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Jeśli nie zostanie wykorzystany do następnego dnia, zespół filtra należy wymienić na zwykłą nasadkę. Podaniec około 20 mikrolitrów tkanek na basenie 96-dołkową płytkę PCR na lodzie. Za pomocą ośmiokanałowej pipety kolektorowej usuń roztwór hybrydyzacyjny z tkanek.

Dodaj 100 mikrolitrów świeżo denaturowanego roztworu hybrydyzacyjnego do każdej studzienki i przykryj taśmą uszczelniającą. Wstępnie zhybrydyzuj tkanki w temperaturze 56 stopni Celsjusza za pomocą urządzenia grzewczego do suchej kąpieli zawierającego metalowe kulki przez co najmniej 2-1/2 do trzech godzin. Denaturować 100 mikrolitrów przygotowanej sondy na 96-dołkowej płytce PCR w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Natychmiast schłodzić na lodzie przez pięć minut. Usuń roztwór przed hybrydyzacją z tkanek i dodaj zdenaturowane sondy specyficzne dla genu do każdej próbki. Przykryj aluminiową taśmą uszczelniającą i hybrydyzuj w temperaturze 56 stopni Celsjusza pod metalowymi kulkami w urządzeniu grzewczym do suchej kąpieli przez 16 do 18 godzin przez noc.

Przed rozpoczęciem procedury wykrywania sondy należy wstępnie podgrzać wszystkie wymagane roztwory w urządzeniu grzewczym o temperaturze 56 stopni Celsjusza. Ostrożnie przenieś zhybrydyzowane tkanki na 96-dołkową płytkę, która pasuje do wielodołkowego kolektora próżniowego. Studzienki tych płyt mają dno membranowe, które umożliwia usuwanie zawartości pod próżnią.

Wyjąć sondy z płytki 96-dołkowej i umyć próbki mieszaninami roztworu hybrydyzacyjnego i PBTT zgodnie z krokami wskazanymi w tej tabeli w urządzeniu grzewczym o temperaturze 56 stopni Celsjusza. Po trzecim przemyciu PBTT wyjąć 96-dołkową płytkę z urządzenia grzewczego, usunąć roztwór PBTT i zablokować tkanki PBTTB na mikserze stołowym w temperaturze pokojowej na 20 minut. Dodać 100 mikrolitrów roztworu przeciwciał do dołka i inkubować przez dwie godziny w stołowym mikserze do pobierania próbek.

Po spłukaniu PBTTB zgodnie z opisem w protokole tekstowym, dodać 100 mikrolitrów roztworu peroksydazy chrzanu Streptawidyny na dołek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1-1/2 godziny. Umyj dwukrotnie PBTTB przez pięć minut na pranie. Następnie inkubować tkanki z roztworem DAPI zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Rozpocznij tę procedurę od inkubacji próbek w roztworze tyramidu i inkubuj próbki przez dwie godziny w mieszalniku stołowym w ciemności. Usunąć roztwór tyramidu z tkanek po zakończeniu inkubacji. Po umyciu PBT i PBS zgodnie z opisem w protokole tekstowym, dodać 150 mikrolitrów pożywki montażowej zapobiegającej blaknięciu do studzienki.

Próbki należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby tkanki mogły opaść na dno studzienki lub probówki. Następnego dnia umieścić próbki na szkiełku mikroskopowym i uszczelnić szkiełkiem nakrywkowym. Na koniec zobrazuj próbki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Przedstawiono przykłady wyników uzyskanych przy użyciu tej procedury dla wczesnych zarodków Drosophila i późnych zarodków Drosophila z sygnałami w amnioserosie, mięśniach i ośrodkowym układzie nerwowym. Nazwa genu, z którym sonda została zhybrydyzowana, jest wyświetlana w każdym panelu. Dalej znajdują się przykłady z tkanek larwalnych trzeciego stadium rozwojowego, kanalików malpighiego, jelita środkowego, gruczołu ślinowego i mięśni.

Na koniec pokazano reprezentatywne obrazy z dorosłego jajnika i dorosłych jąder. Po opanowaniu i skutecznym wykonaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu zaledwie dwóch dni. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o pracy na stole bez RNaz z końcówkami, rurkami, płytkami i roztworami wolnymi od RNaz oraz o używaniu rękawiczek.

Jeśli pracujesz z dużą liczbą próbek lub sond, nie spiesz się z procedurą. Dobrym pomysłem jest również wymyślenie sztuczek, aby nie zapomnieć, gdzie jesteś. Postępując zgodnie z tą procedurą, możesz również połączyć ją z innymi metodami, takimi jak wykrywanie wielu sond, sond z białkami lub markerami komórkowymi.

Dzięki nim możesz odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak względne wzorce ekspresji, tożsamość komórek i przedziałów subkomórkowych oraz efekty w różnych tłach genetycznych lub chorobach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić większość rodzajów hybrydyzacji in situ w dowolnym typie tkanki lub zarodka. Nie zapominaj, że praca z odczynnikami takimi jak formaldehyd, nadtlenek wodoru i formamid może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania zabiegu należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak właściwe obchodzenie się i usuwanie.