Name: Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Poznaj fluorescencyjną hybrydyzację in situ z wzmocnieniem tyramidowym do detekcji RNA w zarodkach i tkankach Drosophila. Ta metoda zapewnia wysoką rozdzielczość i czułość przy niskich kosztach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie finansowe dla tego projektu zostało zapewnione przez grant dla HMK od Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (grant MOP 133473).

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li>
<li>Hughes, S. C., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+labeling+with+fluorescence+in+situ+hybridization+in+Drosophila+whole-mount+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos.</a> Biotechniques. 24, 530-532 (1998).</li>
<li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li>
<li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li>
<li>Raap, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-sensitive+FISH+using+peroxidase-mediated+deposition+of+biotin-+or+fluorochrome+tyramides%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides.</a> Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).</li>
<li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).</li>
<li>Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilk%2C+R+%22Current+Protocols+Essential+Laboratory+Techniques%22">Current Protocols Essential Laboratory Techniques</a>. , Wiley Online Library. Vol. 9.3.1-9.3.24 1-9 (2010).</li>
<li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+mRNA+Localization+in+Animal+Cells+and+Why+It+Matters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li>
<li>Martin, K. C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+Localization%3A+Gene+Expression+in+the+Spatial+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension.</a> Cell. , 719-730 (2009).</li>
<li>Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+and+pervasive+subcellular+distributions+for+both+coding+and+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs.</a> Genes Dev. 30, 594-609 (2016).</li>
<li>Zhou, X. L., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+kidney+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules.</a> Dev Biol. 271, 322-338 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisany protokół zapewnia wysoce powtarzalną, czułą i ekonomiczną metodę wykrywania większości RNA w utrwalonych zarodkach lub tkankach Drosophila. Chociaż jest nieco bardziej skomplikowana niż bardziej tradycyjnie stosowana metoda wykrywania sondy za pomocą fosfatazy alkalicznej, rozdzielczość uzyskana przez FISH jest znacznie większa, a czułość porównywalna lub lepsza 7,8. Dzięki zastosowaniu całych lub częściowych płytek mikromiareczkowych, protokoły mogą być wykorzystywane do analiz genów na dużą skalę lub w ograniczonym zakresie. Należy zauważyć, że wygenerowane sondy mogą wykrywać wszystkie lub wiele form splicingu transkryptu, chyba że sondy są bardziej szczegółowo zaprojektowane (tj. Pojedyncze eksony). Chociaż testowaliśmy sondy tak małe, jak 200 nukleotydów z rozsądnym powodzeniem, mniejsze sondy są zwykle mniej skuteczne i mogą być mniej specyficzne. Oczywiste jest, że protokół ten nie jest odpowiedni do wykrywania małych intronów, eksonów lub przetworzonych mikroRNA.
Chociaż podejście to wykorzystuje etap enzymatyczny w celu zwiększenia siły sygnałów, intensywność sygnału wydaje się być proporcjonalna do ekspresji genu docelowego w stosunkowo liniowym i szerokim zakresie poziomów ekspresji. Przy większym powiększeniu sygnał jest postrzegany jako puncta lub plamki w komórkach i tkankach. W przypadku stosunkowo rzadkich transkryptów widocznych jest tylko kilka maleńkich puncta. Wraz ze wzrostem obfitości transkryptów rosną one pod względem liczby i wielkości. Podobnie jak w przypadku jednocząsteczkowych FISH (smFISH), pojedyncze małe puncta mogą również odpowiadać pojedynczym RNA i powinny być również łatwo oznaczone ilościowo za pomocą oprogramowania do obrazowania i informatyki. Porównania opublikowanych obrazów uzyskanych za pomocą smFISH z obrazami, które wyselekcjonowaliśmy dla tych samych celów, sugerują, że ogólna, czułość i rozdzielczość obu metod są stosunkowo podobne, chociaż powinno to zostać przetestowane za pomocą bardziej rygorystycznych porównań. Biorąc pod uwagę znacznie wyższy koszt smFISH, przedstawiona tutaj metoda powinna dać podobne wyniki za ułamek kosztów. Jeśli jednak celem jest wykrycie małych transkryptów lub odrębnych części transkryptów, zaleca się smFISH.
Ze względu na mniejszy rozmiar niektórych sond FISH, metoda ta może być również lepsza w penetracji tkanek, które są duże lub mają znaczne bariery. Jednak wydaje się, że nasze użycie wyższych poziomów detergentów oraz poprawki utrwalania tkanek i przepuszczalności rozwiązały ten problem. Wreszcie, chociaż opracowane dla tkanek Drosophila , opisane tutaj o wysokiej zawartości detergentów dla wypreparowanych tkanek powinny również działać w przypadku zarodków Drosophila , a także większości innych organizmów i tkanek.

Nowe metody wykrywania RNA w całym genomie, takie jak sekwencja RNA, znacznie poszerzyły naszą wiedzę na temat tego, kiedy i gdzie geny są wyrażane oraz na jakich poziomach1. Zapewniają one jednak stosunkowo słabą rozdzielczość czasową i przestrzenną. Hybrydyzacja RNA in situ pozwala na wizualną obserwację przestrzennego rozkładu transkryptów w utrwalonych tkankach, ujawniając w ten sposób szczegóły lokalizacji komórkowej i subkomórkowej2. Zastosowanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) pozwala na jeszcze większą rozdzielczość przestrzenną, ponieważ pozwala na użycie potężnych technik mikroskopowych, takich jak mikroskopia konfokalna i mikroskopia arkuszowa3. Markery fluorescencyjne, takie jak DAPI, mogą być również używane do ustanawiania relacji subkomórkowych4. FISH ułatwia również obserwację wielu RNA i białek jednocześnie, z wyraźnymi wskazaniami na nakładanie się na poziomie subkomórkowym. Unikalne odczynniki i kroki wymagane do podwójnego znakowania można znaleźć w następujących odnośnikach3,5.
Opisane tutaj procedury wykorzystują 96-dołkowe płytki mikromiareczkowe do wszystkich etapów, w tym produkcji matrycy cDNA (PCR kolonii), produkcji sondy RNA (przy użyciu zależnej od polimerazy T7, T3 lub SP6 transkrypcji odpływowej), hybrydyzacji in situ i rozwoju sygnału fluorescencyjnego. Do każdego dołka z 96-dołkowej płytki dodaje się wystarczającą liczbę zarodków lub tkanek, aby umożliwić ocenę konsystencji i zmienności. Każda studnia otrzymuje następnie inną sondę. Po opracowaniu sygnału, zarodki lub tkanki z każdej studzienki są umieszczane na indywidualnych szkiełkach mikroskopowych w celu analizy mikroskopowej.
Użycie tyramide signal amplification (TSA) do wykrywania sondy daje solidne sygnały o wyjątkowej rozdzielczości subkomórkowej 5,6,7,8. Subkomórkowa lokalizacja RNA jest ważnym mechanizmem regulacyjnym 9, który wydaje się występować w przypadku praktycznie wszystkich RNA 4,10,11. Analizy te wykazały również, że wiele transkryptów, które nie są wykrywane przez sekwencję RNA, jest łatwo wykrywanych przez FISH 8. Adaptacja hybrydyzacji RNA in situ do płytek 96-dołkowych umożliwia analizę do 96 genów jednocześnie (więcej, jeśli stosuje się dodatkowe płytki), umożliwiając analizę dużych zbiorów danych. Dzięki cięciu płytek na mniejsze sekcje, metodę można również łatwo dostosować do zaledwie kilku próbek. Dostarczony protokół jest odpowiedni do analizy rozkładu RNA w większości typów tkanek. Chociaż nie pokazano, można go również przystosować do tkanek innych niż Drosophila.

<table><tbody><tr><td>15 ml Polipropylenowe stożkowe probówki</td><td>wirówkowe Frogga Bio</td><td>TB15-500</td><td>Certyfikat bez DNaz i RNaz</td></tr><tr><td>2x PCR Master Mix z barwnikiem (Ambiogen)</td> <td>Biomart (Kanada)</td> <td>141106-1K</td><td>Certyfikowany bez DNaz i RNaz</td></tr><tr><td>50 ml Polipropylenowe stożkowe probówki</td> wirówkowe <td>Frogga Bio</td><td>TB50-500</td> Certyfikowana 96-dołkowa płytka filtracyjna <td>bez DNaz i RNaz</td></tr><tr><td>(1,2 μm, hydrofilowa PVDF membrana</td><td>EMD MILLIPORE</td><td>MSBVS1210</td><td>Służy do usuwania języczka z dna płytki za pomocą tkanek flotujących</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do PCR (200 &mu; l)</td> <td>Denville</td><td>C18096-10</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Acrodisc (0,2 u)</td> <td>PALL</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Acrodisc (0,45 u)</td> <td>PALL</td><td>PN4614</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA002.500</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do przechowywania testów AXYGEN 96-well</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P96-450V-C</td><td>Do przechowywania zapasów glicerolu bakteryjnego</td></tr><tr><td>AXYGEN Aluminium Uszczelki płytowe</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-PCR-AS-200</td><td>Do uszczelniania płyt</td></tr><tr><td>AXYGEN Końcówki o szerokim otworze (200 ul)</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-T205-WB-C</td><td>Do przenoszenia próbek</td></tr><tr><td>Biotin-SP (long spacer) Frakcja IgG Monoklonalna mysia anty-digoksyna</td><td>Jackson ImmunoResearch Lab</td><td>200062156</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe do in situ (stężenie zapasowe 1 mg/ml, stężenie robocze 2,5 &mu; g/ml lub rozcieńczenie 1:400.</td></tr><tr><td>MARKA 8-kanałowa kolektor (autoklawowalna)</td><td>BrandTech Scientific Inc.</td><td>704526</td><td>Aby usunąć płyny z wierzchu 96-dołkowych płytek PCR</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C1919</td><td>Stężenie podstawowe 34 mg / ml rozpuszczone i 0,2&mu; m przefiltrowany w 100 % EtOH (stosować jako 1/1000)</td></tr><tr><td>Cyjanina 3 Tyramid (Cy3-TSA)</td><td>Domowa produkcja</td><td></td><td>Można zamówić w Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA</td></tr><tr><td>DABCO (1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktan)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D2522</td><td>Odczynnik zapobiegający blaknięciu w podłożu montażowym</td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-urydyno-5'-trifosforan</td><td>Roche</td><td>11-209-256-910</td><td></td></tr><tr><td>Klatka do pobierania zarodków</td><td>Strona główna wykonane</td><td>Nie dotyczy</td><td>Rozmiar: 75 cm X 75 cm X 75 cm wykonane z Wirówka z polimetakrylanu metylu</td></tr><tr><td>Eppendorf 5804</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5804</td><td>Wirówka do płytek 96-dołkowych na wirniku A-Z-DWP Formamid</td></tr><tr><td></td><td>Bioshop</td><td>FOR001.500</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY002.4</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Bioshop</td><td>GLN001.500</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784-250MG</td><td>Zapas: 50 mg / ml. Stężenie robocze 1 mg / ml w roztworze hybrydyzacyjnym</td></tr><tr><td>Lab Armor Beads</td><td>DiaMed</td><td>LAA42370-001</td><td>Wypełnij jednostkę grzewczą</td></tr><tr><td>Labnet Gyro M Mini mikser nutacyjny Fisher</td><td>Scientific</td><td>50-998-347</td><td>Mieszanie próbek</td></tr><tr><td>Siatka - 100 mikrokonów</td><td>FlyStuff</td><td>57-103</td><td>Do pobierania zarodków</td></tr><tr><td>Siatka - 800 mikronów</td><td>SEFAR - Nytex</td><td>06-780/53</td><td>Do wyłapywania luźnych tkanek / może być stosowany do specjalnej rurki na rysunku 4.</td></tr><tr><td>Okulary Micro Cover</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>Rozmiar: 22 X 22 mm</td></tr><tr><td>Mikroszkiełka, frstd</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>Rozmiar: 25 X 75 mm</td></tr><tr><td>Multi-Well Plate Vacuum Manifold</td><td>Pall Corporation</td><td>P/N 5017</td><td>Usuń płyn z dna 96-dołkowej płytki filtracyjnej</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Bioshop</td><td>PAR070.500</td><td>Maszyna do PCR do utrwalania</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>Model: Silnik DNA PTC-200</td><td>96-dołkowa płytka PCR i denaturacja sondy</td></tr><tr><td>Roztwór kwasu pikrynowego</td><td>Sigma-aldrich</td><td>80456</td><td>Do utrwalania tkanek I roztwór</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCL)</td><td>Bioshop</td><td>POC308</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywka PP do płytek 96-dołkowych, 100 sztuk w opakowaniu</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P-LID-PP</td><td>Pokrywka do przechowywania płytek</td></tr><tr><td>Jednorazowe zbiorniki na odczynniki Progene (50 ml, sterylne)</td><td>UltiDent Scientific</td><td>825-1-50-5S</td><td>Obsługa cieczy</td></tr><tr><td>Folia aluminiowa do przekłuwania progenów</td><td>UltiDent Scientific</td><td>87-CFILM-AL</td><td>Seal 96-dołkowa płytka, proteinaza wolna od DNaz i RNaz</td></tr><tr><td>K</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P2308-5MG</td><td>Permeabilizacja zarodków</td></tr><tr><td>Inhibitor rybonukleazy RiboLock</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>40 Unit/ul</td></tr><tr><td>Zestaw trifosforanu rybonukleozydu (NTP)</td><td>Roche</td><td>11277057001</td><td>Syteza sondy RNA</td></tr><tr><td>Woda wolna od RNaz</td><td>GIBCO</td><td>10977015-500ml</td><td>Synteza sondy</td></tr><tr><td>RNA RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td>Usuń zanieczyszczenie RNazą</td></tr><tr><td>Jednoniciowe DNA z jąder łososia</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D9156</td><td>Do roztworu hybrydyzacyjnego</td></tr><tr><td>Mleko odtłuszczone (beztłuszczowe)</td><td>Bioshop</td><td>SKI400.500</td><td>Stężenie robocze wynosi 1 % w 1 X PBT lub PBTT jako odczynnik blokujący</td></tr><tr><td>Octan sodu (NaOAc) 3 M, pH = 5,2 (bez RNazy)</td><td>Bioshop</td><td>SAA333</td><td>Stężenie robocze wynosi 10 % (v/v) dla wytrącania DNA lub RNA</td></tr><tr><td>SP6 Polimeraza RNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0131</td><td>20 Jednostka/ul</td></tr><tr><td>Śrut ze stali nierdzewnej do kąpieli piaskowej</td><td>VWR</td><td>13259-274.</td><td>Aby napełnić urządzenie grzewcze</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy i źródło światła na gęsiej szyi</td> Model <td>Leica</td><td>: MZ6</td><td>Sekcja i montaż tkanek</td></tr><tr><td>Streptawidyna, koniugat peroksydazy chrzanowej (HRP)</td><td>Sondy molekularne</td><td>S911</td><td>Zapas przeciwciał drugorzędowych: 1 mg / ml, użyj rozcieńczenia 1/1000 (1 &mu; g/ml) dla in situ.</td></tr><tr><td>Polimeraza RNA T3</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0101</td><td>20 Jednostka/ul</td></tr><tr><td>Polimeraza RNA T7</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td>20 Jednostka/ul</td></tr><tr><td>Stacja końcówek (10 ul)</td><td>Axygen</td><td>T-300-STK-S</td> Certyfikowana stacja końcówek <td>wolna od DNaz i RNaz</td></tr><tr><td>(200 ul)</td><td>Certyfikat Sorbio</td><td>27770T</td><td>Końcówki wolne od DNaz i RNaz</td></tr><tr><td>(1 ml)</td><td>Certyfikat Sorbio</td><td>10200</td><td> Bez DNaz i RNaz</td></tr><tr><td>TRITON X-100</td><td>Bioshop</td><td>TRX506</td><td>Stężenie robocze wynosi 0,3% w 1 X PBT dla tkanek in situ</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop</td><td>TWN510</td><td>Stężenie robocze wynosi 0,1% w 1 X PBT dla zarodków in situ</td></tr><tr><td>Jakościowa bibuła filtracyjna Whatman, klasa 3</td><td>Sigma-aldrich</td><td>WHA1003917</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company </td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td>Preparat</td></tr><tr><td>DABCO (1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktan) glicerol antyblakowy nośnik montażowy</td><td></td><td></td><td>DABCO (1,25 g), glicerol (35 ml lub v/v 70 %) i 1 X PBS (15 ml lub v/v 30 %). Trzymaj ciemność i skały w chłodnym pomieszczeniu. Przechowywać w temperaturze -20 & C</td></tr><tr><td>1 X PBT (1L)</td><td></td><td></td><td>1 X PBS z 1 ml Tween 20 (0,1 %)</td></tr><tr><td>1 X PBTT (1L)</td><td></td><td></td><td>1 X PBS z 1 ml Tween 20 (0,1 %) i 3 ml Triton-X-100 (0,3 %)</td></tr><tr><td>1 X PBTB (1L)</td><td></td><td></td><td>1 % Mleko odtłuszczone w 1 X PBT</td></tr><tr><td>1 X PBTTB (1L)</td><td></td><td></td><td>1 % Mleko odtłuszczone w 1 X PBTT</td></tr></tbody></table>

fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

W naszych wysiłkach zmierzających do określenia wzorców ekspresji i lokalizacji subkomórkowej RNA Drosophila na podstawie całego genomu oraz w różnych tkankach, opracowaliśmy liczne modyfikacje i ulepszenia do naszego oryginalnego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Aby zwiększyć przepustowość i efektywność kosztową, wszystkie etapy, od generowania sondy po wykrywanie sygnału, są wykonywane przy użyciu 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych. Antysensowne sondy RNA znakowane digoksygeniną (DIG) są produkowane przy użyciu klonów cDNA lub genomowego DNA jako matryc. Po utrwaleniu tkanki i przepuszczalności, sondy są hybrydyzowane z interesującymi transkryptami, a następnie wykrywane za pomocą szeregu przeciwciał anty-DIG sprzężonych z biotyną, streptawidyny sprzężonej z peroksydazą chrzanową (HRP) i fluorescencyjnie sprzężonego tyramidu, który w obecności HRP wytwarza wysoce reaktywny półprodukt, który wiąże się z gęstymi elektronowo regionami bezpośrednio sąsiadujących białek. Te etapy amplifikacji i lokalizacji wytwarzają solidny i wysoce zlokalizowany sygnał, który ułatwia lokalizację transkryptu zarówno komórkowego, jak i subkomórkowego. Dostarczone protokoły zostały zoptymalizowane pod kątem wytwarzania wysoce specyficznych sygnałów w różnych tkankach i na różnych etapach rozwoju. Podano również odniesienia do dodatkowych wariantów, które umożliwiają jednoczesne wykrywanie wielu transkryptów lub transkryptów i białek w tym samym czasie.

Rysunek 6 przedstawia przykłady wyników uzyskanych przy użyciu tej procedury. Górne 3 panele pokazują przykłady wczesnych embrionów Drosophila (Rysunek 6, panele A-C), kolejne 3 panele przedstawiają przykłady późnych embrionów Drosophila z sygnałami w różnych tkankach (odpowiednio: amnioserosa, mięśnie i ośrodkowy układ nerwowy (Rysunek 6, panele D-F). Następnie zaprezentowano przykłady z tkanek larw trzeciego stadium (Rysunek 6, panele G-J). Panele K i L przedstawiają reprezentatywne obrazy z gonad osobników dorosłych (odpowiednio jajnika i jądra). Setki obrazów zostały przesłane i opisane w naszej przeszukiwalnej „bazie danych fluorescencyjnej in situ muszki owocowej” (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
<img alt="Schemat przedstawiający RNA FISH u *Drosophila*; diagram procesu hybrydyzacji in situ." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) oraz kluczowy sprzęt. (A) Amplifikacja cDNA metodą PCR. (B) Transkrypcja in vitro w celu wytworzenia specyficznych dla genu sond RNA antysensownych znakowanych DIG na płytce 96-dołkowej (na zdjęciu b pokazano płytkę). (C) oraz (D): Dorosłe muchy (stosunek samic do samców 2:1, 300-400 much na butelkę) są pozostawiane do kopulacji przez 3-4 dni. Zarodki zebrane przez noc na standardowej pożywce kukurydzianej w temperaturze 25 °C są przenoszone do dobrze wentylowanego plastikowego pudełka (1 L pożywki kukurydzianej w pojemniku o wymiarach 8" x 8" x 3" DłxSzerxWys) lub do nowych butelek z zachowaniem odpowiedniej gęstości larw. W celu pobrania tkanek, 24 lub 48 h po złożeniu jaj (AEL), na wierzch pożywki należy posypać aktywny proszek drożdżowy. (E do H): Eksperymenty fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ przeprowadzone w ciągu 3 kolejnych dni. W przypadku zarodków lub tkanek, które nie pływają, należy użyć płytki PCR 96-dołkowej, jak pokazano na zdjęciu b, z aspiratorem 8-kanałowym (zdjęcie c). W przypadku tkanek pływających, takich jak większość tkanek larwalnych, należy użyć płytki z filtrem na dnie (zdjęcie w d) i usunąć ciecz z dna za pomocą aspiratora wielokanałowego przy niskim ciśnieniu (zdjęcie w e). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat elektroforezy żelowej, analiza sond DNA-RNA, separacja molekularna, markery wielkości prążków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Wyznaczenie wydajności sondy RNA. Nowo zsyntetyzowane antysensowne sondy RNA obserwowane na żelu agarozowym 1 % (5 µL/ścieżka). Wydajność można sklasyfikować (na podstawie intensywności prążka) jako „niską” w ścieżkach 3 i 10, „typową” w ścieżkach 1, 4, 5, 6 i 8 lub „wysoką” w ścieżkach 2, 7, 9, 11 i 12. W przypadku próbek o „typowym wydajności”, należy użyć 10-15 µL sondy rozcieńczonej w 100 µL roztworu do hybrydyzacji dla każdego eksperymentu in situ. Próbki o „wysokiej wydajności” sondy należy rozcieńczyć dodatkowym roztworem do hybrydyzacji, zależnie od intensywności prążka w stosunku do intensywności „typowej sondy”. Należy dążyć do uzyskania w przybliżeniu równych końcowych stężeń sondy w każdym dołku. Strzałka wskazuje jedną z „sond RNA”, wyższy prążek na każdej ścieżce to oryginalna matryca DNA. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu przetwarzania embrionów przedstawiający kolejne etapy: pobieranie, dechorionację, płukanie, utrwalanie i dewitellinizację." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Główne etapy masowego pobierania i utrwalania embrionów. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Przygotowanie probówki do wirowania do przetwarzania próbek, zawierające lejek i podziałkę pomiarową." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Samodzielnie wykonana probówka do usuwania cieczy z tkanek larwalnych lub pływających. Niektóre tkanki larwalne i dorosłe pływają w roztworze podczas fiksacji. To proste narzędzie składa się z nylonowej siatki utrzymywanej przez odciętą końcówkę o pojemności 200 µL, a następnie końcówkę o pojemności 1 mL służącą jako adapter do połączenia z aspiratorem. Ciecz można bezpiecznie usunąć bez utraty tkanki. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces hybrydyzacji RNA, schemat koniugatu HRP, TSA z fluoroforem, oddziaływania polipeptydowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Wzmocnienie sygnału tyramidowego (TSA). (1) Sonda RNA antysensowna znakowana DIG hybrydyzuje z endogennym RNA sensownym. (2) Wiązanie immunoafinitywne pomiędzy przeciwciałem pierwszorzędowym koniugowanym z biotyną a DIG-UTP. (3) Streptawidyna koniugowana z HRP wiąże biotynę. (4) HRP katalizuje reakcję cyjaniny 3-tyramidu i nadtlenku wodoru, tworząc krótkotrwałe rodniki cyjaniny 3-tyramidu. (5) Rodniki cyjaniny 3-tyramidu wiążą się z resztami tyrozyny w pobliskich białkach. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig5large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający ekspresję genów z oznakowanymi jądrami w różnych kontekstach komórkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Reprezentatywne obrazy hybrydyzacji in situ. Każdy panel przedstawia przykład innego RNA (kolor cyjan) oraz jądra zabarwione DAPI (kolor czerwony). (A-C) Przykłady wczesnych embrionów Drosophila. (D, F) Przykłady późnych embrionów Drosophila. (G-J) Przykłady tkanek larwalnych Drosophila trzeciego przyrzutu (odpowiednio cewki Malpighiego, jelito środkowe, gruczoł ślinowy i mięsień). (K) Jajnik dorosłej osobniczki. (L) Jądro dorosłego osobnika. Każdy panel zawiera nazwę genu, z którym hybrydyzuje sonda. Paski skali = 10 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Opisany protokół hybrydyzacji RNA in situ pozwala na wykrycie RNA w całych zarodkach Drosophila lub wypreparowanych tkankach. Korzystając z 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych i wzmocnienia sygnału tyramidu, transkrypty mogą być wykrywane z wysoką rozdzielczością, czułością i przepustowością oraz przy stosunkowo niskich kosztach.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest detekcja transkryptów RNA in situ w komórkach i tkankach. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki i biologii rozwoju, takie jak lokalizacja RNA wewnątrz komórki, tkanki lub zarodka. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona wykrywanie przestrzennej dystrybucji RNA z wysoką rozdzielczością i czułością, przy niskim koszcie w porównaniu z innymi metodami.Początkowo opracowaliśmy ten protokół, aby zbadać rozmieszczenie wewnątrzkomórkowe jak największej liczby RNA Drosophila. Celem było określenie zakresu i różnorodności rozkładów wewnątrzkomórkowych. Projekt rozpoczęliśmy od pracy z embrionami, lecz później dostosowaliśmy i zoptymalizowaliśmy protokół w taki sposób, aby umożliwić wysokoprzepustowe badania tkanek wypreparowanych z larw i much.Najtrudniejszym aspektem procedury jest liczba etapów i wynikająca z niej potencjalna możliwość popełnienia błędu, a także konieczność zapewnienia braku RNA podczas produkcji sond. Aby zwiększyć przepustowość i efektywność kosztową, procedury zaprezentowane w tym filmie wykorzystują 96-dołkowe płytki mikrotitracyjne na wszystkich etapach. Metodę tę można łatwo dostosować do mniejszej liczby próbek poprzez pocięcie płytek na paski 8- lub 12-dołkowe.Zacznij od rozcieńczenia 10 µL nocnej hodowli bakterii w 90 µL autoklawowanej podwójnie destylowanej wody w każdym dołku nowej 96-dołkowej płytki PCR. Denaturuj DNA w temperaturze 95 °C w termocyklerze przez pięć minut. Natychmiast umieść płytkę na lodzie na co najmniej pięć minut.Przygotuj reakcje PCR w nowej 96-dołkowej płytce PCR. Użyj odpowiednich starterów uniwersalnych i odmierz 48 µL mieszanki PCR (master mix) do każdego dołka. Dodaj po 2 µL zdenaturowanego matrycowego DNA plazmidowego do każdego dołka.Przeprowadź amplifikację w 96-dołkowym termocyklerze. Po zakończeniu amplifikacji wytrąć produkt PCR za pomocą mieszaniny etanolu i octanu sodu. Przechowuj próbki przez 30 minut w temperaturze -80 °C.Odwiruj płytkę 96-dołkową z prędkością 2 250 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 45 do 60 minut. Używając ośmiokanałowej pipety z manifoldem próżniowym, której konstrukcja zapobiega dotarciu końcówek do dna dołków podczas odsysania osadów, ostrożnie usuń nadmiar cieczy. Przepłucz raz 160 µL zimnego 70% etanolu.Wirować przy 2 250 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Delikatnie odwrócić płytkę 96-dołkową na ręczniku papierowym, aby usunąć ostatnie krople cieczy z każdego dołka, a następnie suszyć osady DNA na powietrzu w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Resuspendować wytrącone DNA w 25 µL wody wolnej od RNaz.Sprawdź rozmiar i wydajność produktów PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Przygotuj reakcje transkrypcji in vitro, dodając odpowiednie składniki do każdej studzienki w nowej 96-dołkowej płytce PCR. Dodaj 7,5 µL matrycy DNA do każdej odpowiedniej studzienki.Przykryć płytkę taśmą uszczelniającą. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 3,5 do 4 godzin. Następnie do każdej studzienki dodać master mix składający się z podwójnie destylowanej wody traktowanej DEPC, 100% etanolu oraz 3 M octanu sodu.Przechowywać w temperaturze -80 °C przez 30 minut. Odwirować płytkę i przemyć studnia zgodnie z wcześniej opisananą procedurą. Resuspender osadzoną sondę w 25 µL podwójnie destylowanej wody traktowanej DEPC.Nowo zsyntetyzowane sondy antysensowne RNA poddano elektroforezie na 1% żelu agarozowym w celu sprawdzenia ich integralności i wydajności. Na podstawie intensywności prążka wydajność można określić jako niską, typową lub wysoką. Po wykorzystaniu 5 µL każdej sondy do elektroforezy w żelu agarozowym, pozostałe 20 µL należy zmieszać ze 100 µL roztworu hybrydyzacyjnego i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.Aby rozpocząć tę procedurę, umieść od 20 do 30 larw w szalce Petri zawierającej zimny PBS w roztworze utrwalającym i schładzaj na lodzie przez dwie minuty w celu zmniejszenia ruchliwości larw. Przeprowadź sekcję larw pod mikroskopem stereoskopowym. Używając pary ostrych pincet, ostrożnie otwórz przednią część ciała i wyciśnij tkanki w kierunku od końca tylnego do przedniego.Po maksymalnie 15 minutach przenieść wypreparowane tkanki do probówki o pojemności 1,5 ml w celu utrwalenia i umieścić na lodzie. Usunąć PBS i dodać 800 µl roztworu fix one. Inkubować na mieszalniku laboratoryjnym przez 30 minut wraz z innymi, wcześniej zebranymi tkankami poddanymi utrwalaniu.Przepłucz tkanki raz 800 µL PBTT i przechowuj probówkę w lodzie podczas zbierania i utrwalania kolejnych tkanek. Przenieś wszystkie wypreparowane tkanki do jednej plastikowej probówki o pojemności 15 mL z siatką w zakrętce. Odessa nadmiar cieczy przez siatkę w zakrętce.Przemyj 10 mililitrami PBTT, a następnie opłucz 10 mililitrami PBS. Aby zneutralizować endogenną aktywność peroksydazy chrzanowej, dodaj pięć mililitrów 0,3% nadtlenku wodoru w PBS i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Przemyj dwukrotnie 10 mililitrami PBTT.Przeprowadź permeabilizację tkanek, dodając 10 mililitrów schłodzonej 80% acetonu i inkubując w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 10 minut. Przemyj dwa razy 10 mililitrami PBTT, aby nawodnić tkanki. Po przemyciu tkanek zgodnie z opisem w protokole tekstowym, przechowuj je w roztworze hybrydyzacyjnym w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Jeśli zestaw filtracyjny nie zostanie użyty następnego dnia, należy go zastąpić zwykłą zatyczką. Przenieść do 96-dołkowej płytki PCR na lodzie aliquoty tkanek w ilości około 20 µL na dołek. Za pomocą ośmiokanałowej pipety wielokanałowej usunąć roztwór hybrydyzacyjny z tkanek.Do każdej studzienki dodaj 100 µL świeżo zdenaturowanego roztworu do hybrydyzacji i zakryj taśmą uszczelniającą. Przeprowadź prehybrydyzację tkanek w temperaturze 56 °C w bloku grzewczym z kulkami metalowymi przez minimum 2,5 do 3 godzin. Zdenaturuj 100 µL przygotowanej sondy w płytce PCR 96-dołkowej w temperaturze 80 °C przez pięć minut.Natychmiast schłodzić na lodzie przez pięć minut. Usunąć roztwór do prehybrydyzacji z tkanek i dodać zdenaturowane sondy specyficzne dla genu do każdej próbki. Przykryć aluminiową taśmą uszczelniającą i przeprowadzić hybrydyzację w temperaturze 56 °C pod metalowymi kuleczkami w suchym bloku grzewczym przez 16 do 18 godzin w ciągu nocy.Przed rozpoczęciem procedury detekcji sond należy podgrzać wszystkie wymagane roztwory w urządzeniu grzewczym ustawionym na 56 °C. Ostrożnie przenieść zhybrydyzowane tkanki do płytki 96-dołkowej dopasowanej do próżniowego kolektora do płytek wielodołkowych. Dołki tych płytek posiadają membrany na dnie, które umożliwiają usunięcie zawartości pod próżnią.Wyjmij sondy z płytki 96-dołkowej i przemyj próbki mieszaninami roztworu hybrydyzacyjnego oraz PBTT zgodnie z krokami wskazanymi w tej tabeli, korzystając z bloku grzewczego ustawionego na 56 °C. Po trzecim płukaniu roztworem PBTT wyjmij płytkę 96-dołkową z bloku grzewczego, odlej roztwór PBTT i zablokuj tkanki za pomocą PBTTB na mieszalniku laboratoryjnym w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Dodaj 100 µL roztworu przeciwciał do każdego dołka i inkubuj przez dwie godziny na mieszalniku do próbek.Po przepłukaniu roztworem PBTTB zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy dodać 100 µL roztworu streptawidyny z peroksydazą chrzanową do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny. Płukać dwukrotnie roztworem PBTTB przez pięć minut podczas każdego płukania. Następnie inkubować tkanki z roztworem DAPI zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Rozpocznij tę procedurę od inkubacji próbek z roztworem tyramidu przez dwie godziny na mieszalniku laboratoryjnym w ciemności. Po zakończeniu inkubacji usuń roztwór tyramidu z tkanek. Po przemyciu za pomocą PBT i PBS zgodnie z opisem w protokole tekstowym, dodaj 150 µL medium montażowego przeciw płowieniu do każdej studzienki.Przechowywać próbki w temperaturze 4°C przez noc, aby tkanki opadły na dno studzienki lub probówki. Następnego dnia osadzić próbki na szkiełku przedmiotowym i przykryć szkiełkiem cover slip. Na koniec wykonać obrazowanie próbek przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.Przedstawiono przykłady wyników uzyskanych za pomocą tej procedury dla wczesnych embrionów *Drosophila* oraz późnych embrionów *Drosophila* z sygnałami w amnioserosie, mięśniach i ośrodkowym układzie nerwowym. Nazwa genu, z którym zhybrydyzowała się sonda, jest wyświetlana w każdym panelu. Następnie zaprezentowano przykłady z tkanek larw trzeciego stadium: cewek malpighiego, jelita środkowego, gruczołów ślinowych i mięśni.Na koniec przedstawiono reprezentatywne obrazy jajnika i jąder dorosłych osobników. Po opanowaniu metody i przy zachowaniu wysokiej efektywności, technikę tę można przeprowadzić w zaledwie dwa dni. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pracować na stanowisku wolnym od RNaz, używać wolnych od RNaz końcówek, probówek, płytek i roztworów oraz stosować rękawiczki.Jeśli pracują Państwo z dużą liczbą próbek lub sond, należy nie spieszyć się podczas wykonywania procedury. Warto również opracować system oznaczeń, aby nie pomylić etapów pracy. Postępując zgodnie z tą procedurą, można ją łączyć z innymi metodami, takimi jak detekcja wielu sond, sond z białkami lub markerami komórkowymi.Dzięki tym metodom można odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wzorce ekspresji względnej, tożsamość komórek i przedziałów subkomórkowych oraz efekty w różnych tłach genetycznych lub chorobach. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania większości rodzajów hybrydyzacji in situ w dowolnym typie tkanki lub embrionu. Należy pamiętać, że praca z odczynnikami takimi jak formaldehyd, nadtlenek wodoru i formamid może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak właściwa obsługa i utylizacja.

high-resolution-fluorescent-situ-hybridization-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Hybrydyzacja in situ w preparatach całych jest jedną z najszerzej stosowanych technik w biologii rozwoju. Przedstawiamy tutaj protokół podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości, służący do analizy precyzyjnego wzorca ekspresji pojedynczego genu oraz określania nakładania się domen ekspresji dwóch genów. Włączyliśmy barwienie jąder jodkiem propidyny w celu uwydatnienia organizacji tkanki.

Wysokorozdzielcza podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całych embrionach ryby danio-ostrobłysku

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna działa poza limitami penetracji charakterystycznymi dla fluorescencyjnej mikroskopii sekcji tkanek. Technika ta opiera się na oświetleniu wieloprojekcyjnym oraz opisie transportu fotonów. Demonstrujemy wizualizację 3D całego organizmu in-vivo podczas morfogenezy wyobraźników skrzydeł wykazujących ekspresję GFP u Drosophila melanogaster.

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in-vivo rozwijających się Drosophila

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Opisujemy wielozadaniową procedurę chromogenicznej hybrydyzacji in situ (MC-WISH) w nienaruszonych zarodkach Drosophila, pozwalającą na jednoczesne i specyficzne wykrywanie trzech różnych wzorców dystrybucji mRNA poprzez kontrastujące kolorowe osady.

Wielozadaniowa chromogenna hybrydyzacja in situ w całości do porównania domen ekspresji genów w zarodkach Drosophila

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych jest najcenniejszym narzędziem w biologii rozwoju. Głównym problemem w badaniach porównawczych jest wariancja otoczenia. Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu próbek i dlatego aktywnie rozwiązuje ten problem.

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Tutaj przedstawiono protokół implementacji mikroskopii ekspansywnej we wczesnych zarodkach Drosophila w celu uzyskania obrazowania w superrozdzielczości przy użyciu konwencjonalnego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego.

Wykorzystanie mikroskopii ekspansywnej do fizycznego powiększenia całych zarodków Drosophila w celu obrazowania w superrozdzielczości

Ten protokół opisuje spersonalizowane znakowanie fluorescencyjne oparte na przeciwciałach i wstrzykiwanie do wczesnych zarodków Drosophila, aby umożliwić obrazowanie na żywo białek o niskiej obfitości lub modyfikacji potranslacyjnych, które są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod GFP/mCherry-tag.

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Iteracyjna hybrydyzacja in situ wspomagana ekspansją (EASI-FISH) to solidna technika, która łączy mikroskopię ekspansywną z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu wykrycia ekspresji wielu genów w grubej tkance. Protokół ten przedstawia ostatnie postępy w metodzie i jej adaptacji do znakowania nienaruszonego ośrodkowego układu nerwowego Drosophila.

Multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją

Oogeneza Drosophila nadal jest wyjątkowo przydatna w badaniach nad proliferacją i dziedziczeniem mitochondriów. Manuskrypt ten opisuje szczegółowy protokół używany do oznaczania replikującego się mitochondrialnego DNA (mtDNA) w dorosłych jajnikach Drosophila za pomocą 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU), co ułatwia odkrycie mechanizmów związanych z dziedziczeniem mitochondriów, które wcześniej były dyskusyjne.

In Situ Znakowanie replikacji mitochondrialnego DNA w dorosłych jajnikach Drosophila za pomocą barwienia EdU

Poznaj fluorescencyjną hybrydyzację in situ z wzmocnieniem tyramidowym do detekcji RNA w zarodkach i tkankach Drosophila. Ta metoda zapewnia wysoką rozdzielczość i czułość przy niskich kosztach.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego (Wideo) | JoVE Journal

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

Przeglądaj więcej filmów