Name: Mikroskopia przyżyciowa naprowadzania monocytów i angiogenezy związanej z nowotworem w mysim modelu choroby tętnic obwodowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Odkryj mikroskopię przyżyciową do badania naprowadzania monocytów i angiogenezy związanej z nowotworem w mysim modelu choroby tętnic obwodowych. Ta metoda pozwala wizualizować komórki w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez ELSE-Kröner-Stiftung i DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Niemiecka Fundacja Badawcza) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, wspólne centrum badawcze). Specjalne podziękowania dla Hansa-Holgera Gärtnera, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke University Magdeburg, Magdeburg, Niemcy, za wsparcie techniczne.

Nasze badanie zostało przeprowadzone za zgodą stanu Saksonii-Anhalt, Landesverwaltungsamt Halle, zgodnie z sekcją 8 niemieckiej ustawy o ochronie zwierząt. (§ 8, ustęp 1 niemieckiej ustawy o ochronie zwierząt z dnia 18.05.2016 - BGBI. I S. 1206, 1313, § 31 TierSchVersV z dnia 13.08.2013).

UWAGA: W przedstawionych eksperymentach wykorzystano samce myszy BALB/c w wieku od 8 do 12 tygodni oraz ludzkie monocyty od dawców krwi do wizualizacji monocytów za pomocą mikroskopii wewnątrzorganizmowej.
1. Przygotowanie komórek
UWAGA: W celu izolacji monocytów prosimy o zapoznanie się z instrukcjami w naszym wcześniej opublikowanym filmie w JoVE: „Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes” autorstwa Wagner et al.4
UWAGA: Podczas pracy z komórkami wszystkie etapy muszą być wykonywane w warunkach sterylnych, aby uniknąć kontaminacji.
<ol>
	<li>Barwienie komórek za pomocą nadchloranu 3,3'-dioctadecylo-oksakarbacyjaniny
	<ol>
		<li>Resuspender komórki w medium hodowlanym bezserumowym przy gęstości 1 x 106 komórek/ml 
		UWAGA: Tylko pożywka bezsurowicza umożliwia efektywne barwienie, ponieważ w przeciwnym razie lipofilowy barwnik zostałby związany przez lipofilowe składniki surowicy.</li>
		<li>Dodaj 5 µL do 1 ml zawiesiny komórkowej dodać 1 mM nadchloranu 3,3'-dioctadecylo-oksakarbocyjaniny w dimetyloformamidzie i ostrożnie resuspenderować.</li>
		<li>Inkubować roztwór komórek w temperaturze 37 °C przez 20 min.</li>
		<li>Odwiruj komórki przy 37 °C or 500 x g przez 5 min.</li>
		<li>Odpiąć supernatant i resuspendować komórki w 37 °C podłoże uzupełnione o ogrzaną płtkową surowicę cielęcą.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.1.4 i 1.1.5 dwukrotnie.</li>
		<li>Policz komórki, korzystając z następującego wzoru: 
		<img alt="Wzór na stężenie komórek; komórki/ml = (liczba komórek/4) × rozcieńczenie (10) × 10 0; schemat obliczeń." src="/files/ftp_upload/56290/56290eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"></li>
		<li>Resuspender komórki w 150 µL sterylny 0,9% roztwór NaCl.</li>
		<li>Wstrzyknij komórki do żyły ogonowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Znieczulenie
<ol>
	<li>Anestezja wziewna
	<ol>
		<li>Odparuj izofluran za pomocą waporyzatora, stosując stężenie 5% w zamkniętym pojemniku pod wyciągiem chemicznym.</li>
		<li>Ostrożnie chwyć mysz i umieść ją w pojemniku.</li>
		<li>Chwyć zwierzę za skórę karku po ustaniu wszelkich ruchów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulenie wewnątrzbrzuszne 
	UWAGA: W celu wykonania iniekcji doszpikowej należy zastosować znieczulenie izofluranem, opisane w kroku 2.1. Dzięki szybkiej regeneracji i krótkotrwałemu działaniu narkotycznemu znieczulenia izofluranem, łatwiejsza jest obsługa myszy oraz podanie znieczulenia wewnątrzbrzuszniego.
	<ol>
		<li>Do iniekcji doszpryznowej należy użyć roztworu składającego się z 2,4 ml ketaminy (10%), 0,8 ml ksylazyny (2%) oraz 6,8 ml NaCl (0,9%).</li>
		<li>Zważ zwierzę przed podaniem środka anestetycznego. 
		UWAGA: Skład środka znieczulającego to: 
		<img alt="Wzór na dawkę środka znieczulającego, waga(g)×10−50=objętość w µL, równanie do obliczeń medycznych." src="/files/ftp_upload/56290/56290eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"></li>
		<li>Użyj strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml z igłą 30 G, aby wstrzyknąć roztwór w lewą stronę podbrzusza.</li>
		<li>Umieść mysz w klatce i poczekaj na wystąpienie działania narkotycznego. 
		UWAGA: Działanie narkotyczne pojawia się zazwyczaj w ciągu 5 minut, jeśli iniekcja została wykonana pomyślnie. Prawidłową głębokość znieczulenia można stwierdzić na podstawie braku odruchu mrugania powiek lub braku reakcji na uciskanie palców stopy, a także regularnej, kontrolowanej częstości oddechów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Implantacja macierzy przypominającej błonę podstawną
UWAGA: Metoda ta jest stosowana przez nasz zespół do badania angiogenezy nowotworowej po wstrzyknięciu monocytów. W zależności od przeprowadzanych eksperymentów, do macierzy przypominającej błonę podstawną można dodać czynniki wzrostu. Przed wstrzyknięciem guza w bok myszy wykonaliśmy podwiązanie tętnicy udowej. Macierz podczas wstrzykiwania musi mieć temperaturę 4 °C. W tej temperaturze macierz jest płynna; żel twardnieje i przybiera formę stałą w temperaturze ciała (37 °C). Aby zapewnić lepszą widoczność podskórnej wkładki z macierzy, należy ogolić skórę myszy w miejscu wstrzyknięcia.
Uwaga: Opcjonalnie: w warunkach sterylnych dodać 10 ng podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów, 30 ng czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego oraz 26 I.U. heparyny do macierzy przypominającej błonę podstawną.
<ol>
	<li>Napiąć 1 mL matrycy do strzykawki insulinowej 30 G i przechowywać w lodzie do momentu użycia.</li>
	<li>Położyć zwierzę na stole i odciągnąć skórę myszy obok miejsca wstrzyknięcia w obrębie boku.</li>
	<li>Wstrzyknąć 50 µL matrycy przypominającej błonę podstawną podskórnie. 
	UWAGA: Ze względów praktycznych konieczne jest zwarte wstrzyknięcie matrycy przypominającej błonę podstawną w jednym miejscu, aby uniknąć jej rozproszenia w tkance podskórnej. Ułatwi to oddzielenie sztucznego guza od tkanki po uśmierceniu myszy na koniec eksperymentu.</li>
</ol>
4. Iniekcja do żyły ogonowej
UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentów należy przećwiczyć wstrzyknięcia do żyły ogonowej z użyciem roztworu NaCl na zwierzętach testowych. Jeśli monocyty nie zostaną prawidłowo wstrzyknięte do żyły ogonowej, nie wystąpi efekt systemowy w zakresie kolateralizacji. W niniejszym protokole wstrzyknęliśmy 2,5 miliona monocytów. Należy dążyć do wstrzyknięcia nie więcej niż 5 µL/g masy ciała.
<ol>
	<li>Użyć roztworu monocytów przygotowanego w kroku 1.1.8, zawierającego 2,5 miliona monocytów.</li>
	<li>Do iniekcji użyć igły 30 G oraz strzykawki insulinowej o pojemności 1 mL.</li>
	<li>Ostrożnie obchodzić się z myszą, unieruchomić zwierzę w ograniczniku i upewnić się, że mysz nie ucierpiała i ma odpowiednią przestrzeń do oddychania.</li>
	<li>Umieścić ogranicznik na podkładce grzewczej w taki sposób, aby ogon miał kontakt z płytą.</li>
	<li>Zlokalizować żyły ogonowe, które znajdują się po bocznej stronie ogona.</li>
	<li>Obrócić ogon o 90°, tak aby żyła ogonowa znajdowała się po górnej stronie ogona.</li>
	<li>Zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia przed podaniem monocytów.</li>
	<li>Wstrzyknąć roztwór monocytów pod kątem płaskim, z otworem igły skierowanym do góry. 
	UWAGA: Przerwać iniekcję, jeśli pojawi się pęcherzyk, co jest oznaką niepowodzenia zabiegu. Powtórzyć procedurę bardziej proksymalnie.</li>
	<li>Zatrzymać krwawienie w miejscu wstrzyknięcia, wywierając delikatny nacisk na ogon przez około 60s.</li>
	<li>Obserwować zwierzę przez 30 min w celu monitorowania systemowych efektów ubocznych, a po całkowitym powrocie zwierzęcia do sprawności umieścić mysz w klatce.</li>
</ol>
5. Mikroskopia intravitalna
<ol>
	<li>Przygotowanie
	<ol>
		<li>Umieść znieczuloną mysz na podkładce grzewczej (37 °C), aby utrzymać stałą temperaturę, i przymocuj łapy taśmą klejącą.</li>
		<li>Zdezynfekuj skórę w miejscu nogi lub boku, który będzie wykorzystywany do mikroskopii.</li>
		<li>Ogól obszar zainteresowania, aby ułatwić manipulację i uniknąć zakłóceń spowodowanych przez włosy.</li>
		<li>Wycinięty skalpelem sterylnym i delikatną pęsetą fragment skóry o kształcie kwadratu o wymiarach 0,5 x 0,5 cm. 
		UWAGA: Ważne jest utrzymanie obszaru zainteresowania w stanie wilgotnym; w przeciwnym razie ucierpi jakość obrazów i tkanki. Do nawilżania obszaru można użyć roztworu NaCl.</li>
		<li>Umieść nogę pomiędzy dwiema regulowanymi podpórkami i ułoż papkę na ich szczycie.</li>
		<li>Upewnij się, że tkanka jest wilgotna i styka się ze szkłem.</li>
		<li>Wstrzyknij 50 µL dekstranu rodaminowego drogą retrobulbarną do układu żylnego w celu lepszej wizualizacji naczyń.</li>
		<li>Uruchom mikroskopię i w razie potrzeby skoryguj położenie nogi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawienia mikroskopii intravitalnej
	<ol>
		<li>Włącz mikroskop, komputer, interfejsy elektroniczne i lasery.</li>
		<li>Włącz jednostkę grzewczą komory inkubacyjnej i/lub stół grzewczy (płytę/podkładkę) i ustaw temperaturę na 37 °C.</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie do akwizycji. Jeśli mikroskop jest wyposażony w skaner rezonansowy, wybierz ten tryb szybkiego skanowania.</li>
		<li>Odczekaj, aż temperatura osiągnie stały poziom (35 - 37 °C). 
		UWAGA: Stabilna temperatura jest istotna dla: (a) myszy, która pod wpływem znieczulenia nie kontroluje temperatury ciała oraz (b) uniknięcia lub przynajmniej zminimalizowania dryftu ogniskowego. Może to zająć od 1 h do kilku godzin, w zależności od warunków otoczenia (np. systemu klimatyzacji i liczby źródeł ciepła w pomieszczeniu, w tym ludzi). W przypadku użycia obiektywów imersyjnych typowym źródłem niestabilności jest strefa kontaktu między soczewką a szkiełkiem nakrywkowym (lub tkanką). Pomocne może być ogrzewanie soczewki za pomocą grzałki obiektywu; alternatywnie wysoce zaleca się użycie mikroskopu z systemem autofokusu.</li>
		<li>Wybierz obiektyw powiększający o wysokiej aperturze numerycznej, który spełnia wymagania rozdzielczości eksperymentu (patrz uwaga na końcu tej sekcji).</li>
		<li>Zoptymalizuj ustawienia mikroskopu pod kątem wzmocnienia, ustawień kanałów, prędkości skanowania, rozdzielczości pikseli, objętości głębokości, wielkości kroku i uśredniania przed umieszczeniem zwierzęcia doświadczalnego na stole.</li>
		<li>Skanuj dwukierunkowo, aby skrócić czas akwizycji.</li>
		<li>Umieść znieczuloną mysz na wstępnie podgrzanym stole mikroskopowym po tym, jak mikroskop osiągnie stabilne warunki, a ustawienia zostaną przetestowane na modelu zastępczym.</li>
		<li>Ustaw ostrość na obszar zainteresowania w obrębie macierzy przypominającej błonę podstawną, korzystając z oświetlenia światłem jasnym, a następnie krótko obejrzyj kapilary światłem ultrafioletowym przy odpowiednich ustawieniach filtrów dla zastosowanych fluoroforów.</li>
		<li>Przełącz w tryb skanowania; rozpocznij skanowanie w trybie niskiej rozdzielczości 256 x 256 i zwiększaj wzmocnienie oraz moc lasera, aż na monitorze pojawi się sygnał.</li>
		<li>Skup się na interesującej strukturze. Powiększ obraz, aż wszystkie szczegóły będą widoczne.</li>
		<li>Zdefiniuj pozycje „początkową” i „końcową” w kierunku osiowym.</li>
		<li>Zatrzymaj skanowanie.</li>
		<li>Zdefiniuj wielkość kroku (np. 0,5 µm) i liczbę płaszczyzn ogniskowych (np. 10 - 20).</li>
		<li>Przełącz na końcową rozdzielczość pikseli (512 x 512 lub 1 024 x 1 024) w zależności od prędkości przemieszczania się struktur subkomórkowych lub komórek i wybierz prędkość skanowania (częstotliwość skanowania), która najlepiej odpowiada tym ruchom. Zaleca się skanowanie dwukierunkowe, aby przyspieszyć akwizycję stosów obrazów. 
		UWAGA: Wybierz najwyższą prędkość skanowania, która zapewnia wystarczającą jakość obrazu. Typowe skanery punktowe zapewniają prędkości od 40 Hz do 1,4 kHz. Skanery rezonansowe zapewniają dodatkowo 8 kHz lub 12 kHz. Poprzez zmniejszenie liczby linii w kierunku y można dalej zwiększyć prędkość skanowania (typowe wartości rozdzielczości to 512 x 512, 512 x 256 lub 512 x 20 pikseli). W zależności od stosunku sygnału do szumu można spróbować poprawić jakość obrazu, dodając uśrednianie linii w zakresie od 2 do 4. Zazwyczaj ustawienie 512 x 20 bez uśredniania skutkuje czasem akwizycji klatki wynoszącym 18 ms w trybie dwukierunkowym ze skanerem rezonansowym 8 kHz; przy 512 x 20 i 4-krotnym uśrednianiu czas ten wydłuża się do 56 ms na klatkę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. WHO | The top 10 causes of death. World Health Organization. , 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/.">http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/.</a> (2017).</li>
<li>Volz, K. S., Miljan, E., Khoo, A., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+pluripotent+stem+cells+for+vascular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Development of pluripotent stem cells for vascular therapy.</a> Vascular pharmacology. 56 (5-6), 288-296 (2012).</li>
<li>Henry, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VIVA+trial%3A+Vascular+endothelial+growth+factor+in+Ischemia+for+Vascular+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">The VIVA trial: Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis.</a> Circulation. 107 (10), 1359-1365 (2003).</li>
<li>Wagner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+intravenous+injection+of+murine+bone+marrow+derived+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and intravenous injection of murine bone marrow derived monocytes.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (94), (2014).</li>
<li>Herold, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+monocytes%3A+a+novel+strategy+for+in+vivo+augmentation+of+collateral+vessel+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Human+gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth.</a> Human gene therapy. 15 (1), 1-12 (2004).</li>
<li>Ito, W. D., Arras, M., Scholz, D., Winkler, B., Htun, P., Schaper, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+but+not+collateral+growth+is+associated+with+ischemia+after+femoral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis but not collateral growth is associated with ischemia after femoral artery occlusion.</a> The American journal of physiology. 273 (3 Pt 2), H1255-H1265 (1997).</li>
<li>Herold, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetanus+toxoid-pulsed+monocyte+vaccination+for+augmentation+of+collateral+vessel+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611(2014).</li>
<li>Matrigel Matrix. , 
 <a target="_blank" href="https://www.corning.com/au/en/products/life-sciences/products/surfaces/matrigel-matrix.html">https://www.corning.com/au/en/products/life-sciences/products/surfaces/matrigel-matrix.html</a> (2017).</li>
<li>Eubank, T. D., Galloway, M., Montague, C. M., Waldman, W. J., Marsh, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+induces+vascular+endothelial+growth+factor+production+and+angiogenic+activity+from+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+Md.+1950%29%22%5BJournal%5D)">M-CSF induces vascular endothelial growth factor production and angiogenic activity from human monocytes.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md. 1950). 171 (5), 2637-2643 (2003).</li>
<li>Fridman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+tumor+growth+of+both+primary+and+established+human+and+murine+tumor+cells+in+athymic+mice+after+coinjection+with+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel.</a> Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).</li>
<li>Woodman, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin-1+knockout+mice+show+an+impaired+angiogenic+response+to+exogenous+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Caveolin-1 knockout mice show an impaired angiogenic response to exogenous stimuli.</a> The American journal of pathology. 162 (6), 2059-2068 (2003).</li>
<li>Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+bone+marrow+derived+monocytes%3A+a+novel+approach+for+augmentation+of+arteriogenesis+in+a+murine+model+of+femoral+artery+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+translational+research%22%5BJournal%5D)">Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation.</a> American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).</li>
<li>Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. oA., Brouckaert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+isolation+and+purification+of+mouse+peripheral+blood+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes.</a> J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).</li>
<li>Berthold, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+monocytes+by+Ficoll+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Blut%22%5BJournal%5D)">Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation.</a> Blut. 43 (6), 367-371 (1981).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisana tu metoda rzuca światło na rozwój tętnic pobocznych, zachowanie monocytów w tych naczyniach oraz proces arteriogenezy. Kroki stosowania tego protokołu są łatwe do nauczenia się i mogą być wykorzystywane w innych dziedzinach nauki. Pomimo tych zalet istnieją pewne wady. Na przykład do wykonania opisanych technik wymagany jest mikroskopijny sprzęt. Pozyskanie sprzętu do jednego eksperymentu jest nie do utrzymania, dlatego ważne jest, aby współpracować z innymi instytucjami w celu udostępnienia urządzeń.
<p clas...

Choroby układu krążenia, w tym choroba niedokrwienna serca lub choroba tętnic obwodowych, są najczęstszymi przyczynami zgonów na całym świecie1. Terapia komórkowa jest obiecującym podejściem do leczenia chorób sercowo-naczyniowych, szczególnie u osób, które nie są w stanie poddać się zabiegom chirurgicznym. Istnieje kilka podejść do wykorzystania komórek lub wydzielanych przez nie substancji jako narzędzia terapeutycznego2,3, z ogólnym celem poprawy perfuzji i utrzymania funkcji niedokrwionej i niedokrwionej tkanki. Jedną z prób osiągnięcia tego celu jest poprawa arteriogenezy, która wzmaga rozwój tętnic pobocznych. Monocyty są ważnym typem komórek związanym z kolateryzacją. Nasza grupa skupiła się na badaniu wpływu monocytów na obszary zapalne4,5, w szczególności wykorzystując model niedokrwienia kończyn tylnych do wywoływania niedokrwienia i następującego po nim stanu zapalnego6. Monocyty są domem dla obszarów stanu zapalnego i powodują złożone reakcje ogólnoustrojowe, które prowadzą do rozwoju kolateralizacji7.
Za pomocą mikroskopii przyżyciowej możemy badać zachowanie tych komórek in vivo i obserwować naprowadzanie wstrzykniętych monocytów na obszary zapalne. Większość wcześniejszych badań opisuje jedynie analizy pośmiertne, które mają wady, takie jak wprowadzenie artefaktów histologicznych i duża liczba zwierząt potrzebnych do przygotowania. Dzięki naszemu podejściu możemy badać procesy immunologiczne i powstawanie zabezpieczeń poprzez obrazowanie na żywo w wielu punktach czasowych.
Oprócz rozwoju tętnic pobocznych w obszarach niedokrwiennych, monocyty wpływają również na wzrost guza. Aby zbadać te procesy, wstrzykujemy macierz przypominającą błonę podstawną wyekstrahowaną z mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm, guza bogatego w białka macierzy zewnątrzkomórkowej8, i analizujemy za pomocą mikroskopii przyżyciowej. Matryca ta służy do badań przesiewowych cząsteczek testowych pod kątem tworzenia sieci komórkowej śródbłonka lub terapii przeciwnowotworowych poprzez hamowanie angiogenne; W tym przypadku ocenimy potencjał angiogenny guza monocytów do terapii komórkowej9,10,11.
Celem tego protokołu jest zademonstrowanie łatwego i skutecznego sposobu badania procesów immunologicznych spowodowanych niedokrwieniem w modelu in vivo. Możemy wygenerować bardziej realistyczne środowisko testowe w porównaniu z badaniem histologicznym pośmiertnej tkanki mięśniowej.

<table><tbody><tr><td>10% płodowa surowica cielęca (FCS)</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% penicylina/streptomycyna</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml strzykawka insulinowa Omnifix -F</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 50 ml&nbsp;</td><td>Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Niemcy</td><td></td><td>Injectomat- strzykawka 50 ml z kanulą</td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki o bardzo niskim stopniu przylegania</td><td>Corning Incorporated, NY, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-12 tygodniowe, męskie, C57BL/6, myszy BalbC&nbsp;</td><td>Charles River, Sulzfeld, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taśma klejąca</td><td>TESA SE, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji</td><td>Leica, Wetzlar, Niemcy&nbsp;</td><td></td><td>Pakiet Leica Application Suite Zaawansowana fluorescencja (LAS AF); Wersja: 2.7.3.9723</td></tr><tr><td>Canules</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Niemcy</td><td></td><td>29G, 30G</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td><td>Wyprodukowana przez naszą grupę z pojedynczych składników</td><td></td><td>Pożywka199, 10% Surowica cielęca płodu, 1% Antybiotyk (penicylina/streptomycyna)</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Niemcy</td><td></td><td>Wirówka Allegra X-15R</td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>Veet, Mannheim, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DiO</td><td>Invitrogen Eugene, Oregon, Stany</td> Zjednoczone <td></td><td></td></tr><tr><td>Środek do dezynfekcji</td><td>Sch&uuml; lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skalpel jednorazowy nr 10&nbsp;</td><td>Maszynka do golenia z piór Co.Ltd, Osaka, Japonia&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolba Erlenmeyera</td><td>GVB, Herzogenrath, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbr&uuml; cken, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica na łydki płodu</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine Kleszczy</td><td>Rubis, Stabio, Szwajcaria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flurophor/Rhodamindextran</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td><td>Katalognummer: D-1819</td><td></td></tr><tr><td>Rękawiczki</td><td>R&ouml; sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza&nbsp;</td><td>Labotect GmbH, G&ouml; ttingen, Niemcy&nbsp;</td><td></td><td>Hot Plate 062</td></tr><tr><td>Ludzki czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Niemcy</td><td>SRP3110&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Humanitarne filtry leukocytarne</td><td>Inkubator do konserwacji</td><td></td><td></td>krwi</tr><tr><td></td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter Deutschland GmbH, Unterschlei&szlig; heim, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (10%)</td><td>Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki do separacji leukocytów (probówki z filtrem)&nbsp;</td><td>Bio one GmbH, Frickenhausen, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny&nbsp;</td><td>Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Niemcy</td><td></td> Pożywka do separacji limfocytów <td>Axiovert 40 C</td></tr><tr><td>LSM1077</td><td>GE Healthcare, Pasching, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Średni M199&nbsp;</td><td>PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrobiologiczny stół warsztatowy</td><td>Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Niemcy</td><td></td><td>Hera safe</td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>Art. Nr. 1879</td><td></td></tr><tr><td>Statyw mikroskopowy z inkubatorem i urządzeniem grzewczym</td><td>&nbsp; Leica DMI 6000, Pecon, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor do płukania monocytów</td><td>Wyprodukowany przez naszą grupę z pojedynczych komponentów</td><td></td><td>PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA</td></tr><tr><td>Ogranicznik myszy</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskopy wielofotonowe&nbsp;</td><td>Leica, Wetzlar, Niemcy&nbsp;</td><td></td><td>Mikroskop konfokalny Leica SP5, Cameleon, Koherent</td></tr><tr><td>NaCl (0,9%)</td><td>Berlin Chemie AG, Berlin, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora licząca Neubauer&nbsp;</td><td>Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-K&ouml; nigshofen, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective</td><td>Leica, Wetzlar, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td>Leica HC PL APO 10x/0.4 CS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life technologies GmbH, Darmstadt, Niemcy</td><td></td><td>ph 7,4 sterylna</td></tr><tr><td>penicylina/streptomycyna</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Wyprodukowane przez naszą grupę z pojedynczych komponentów</td><td></td><td>90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, &rho;= 1,064 g cm-3</td></tr><tr><td>Roztwór Percoll</td><td>GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Szwecja</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td>10&micro; L/100 i mikro; L/200&mikro; L/1000&mikro; L</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy</td><td></td><td>&nbsp; Cellstar2ml, 5ml, 10ml</td></tr><tr><td>Głowice pipetujące</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetus</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurka polistyrolowa</td><td>Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyce</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waga</td><td>Gama METTLER PM4800 Delta, Mettler-Toledo GmbH, Gie&szlig; en, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednostka ssąca</td><td>Integra bioscience, Fernwald, Niemcy</td><td></td><td>Vacusafe comfort</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego 0,4 %</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki z nakrętką</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy</td><td></td><td>15ml, 50ml Cellstar</td></tr><tr><td>Ksylazyna (2 %)</td><td>Ceva Tiergesundheit GmbH, D&uuml; sseldorf, Niemcy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikroskopia przyżyciowa naprowadzania monocytów i angiogenezy związanej z nowotworem w mysim modelu choroby tętnic obwodowych

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

Celem terapeutycznym choroby tętnic obwodowych i choroby niedokrwiennej serca jest zwiększenie przepływu krwi do obszarów niedokrwiennych spowodowanych zwężeniem hemodynamicznym. Chirurgia naczyniowa jest realną opcją w wybranych przypadkach, ale dla pacjentów bez wskazań do operacji, takich jak progresja do bólu spoczynkowego, krytyczne niedokrwienie kończyn lub poważne zakłócenia życia lub pracy, istnieje niewiele możliwości złagodzenia ich choroby. Terapia komórkowa poprzez perfuzję wzmocnioną monocytami poprzez stymulację tworzenia się obocznego jest jedną z niewielu nieinwazyjnych opcji.
Nasza grupa bada arteriogenezę po przeszczepie monocytów myszom za pomocą modelu niedokrwienia kończyn tylnych. Wcześniej wykazaliśmy poprawę w zakresie perfuzji kończyn tylnych przy użyciu stymulowanego tężcem przeszczepu monocytów syngenecznych. Oprócz wpływu na powstawanie oboczne, terapia ta może również wpływać na wzrost guza. Aby zbadać te efekty, używamy mysiego modelu macierzy przypominającej błonę podstawną, wstrzykując macierz zewnątrzkomórkową mięsaka Engelbretha-Holma-Swarma do boku myszy, po zamknięciu tętnicy udowej.
Po badaniach nad sztucznym nowotworem, używamy mikroskopii przyżyciowej do badania in vivo angiogenezy guza i naprowadzania monocytów w tętnicach pobocznych. Wcześniejsze badania opisywały badanie histologiczne modeli zwierzęcych, które zakłada późniejszą analizę artefaktów pośmiertnych. Nasze podejście wizualizuje naprowadzanie monocytów na obszary kolateralizacji w sekwencjach w czasie rzeczywistym, jest łatwe do wykonania i bada proces arteriogenezy i angiogenezy guza in vivo.

Mikroskopia witalna służąca do badania wzrostu guza oraz naczyń pobocznych indukowanego przez monocyty może pomóc w odkryciu nowych aspektów molekularnych mechanizmów angiogenezy i arteriogenezy nowotworowej. Komórki muszą być przygotowane i wstrzyknięte starannie, zgodnie z krokami opisanymi w protokole. Rozbieżności w wykonaniu mogą prowadzić do różnic między pojedynczymi eksperymentami. Monocyty muszą być wstrzykiwane do układu żylnego (Rysunek 1), aby zac...

Monocyty są ważnymi mediatorami arteriogenezy w kontekście choroby tętnic obwodowych. Wykorzystując macierz przypominającą błonę podstawną i mikroskopię przyżyciową, protokół ten bada naprowadzanie monocytów i angiogenezę związaną z nowotworem po wstrzyknięciu monocytów w mysim modelu podwiązania tętnicy udowej.

Mikroskopia przyżyciowa naprowadzania monocytów i angiogenezy związanej z nowotworem w mysim modelu choroby tętnic obwodowych

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Witam, nazywam się Christian Deffge. Jestem lekarzem w szpitalu uniwersyteckim w Magdeburgu i pracuję w grupie badawczej kardiologicznej dr Herolda i profesora Braun-Dullaeusa. Badamy zjawisko zwiększania wzrostu naczyń obocznych.W związku z tym stosujemy obrazowanie. W tym filmie chcemy wyjaśnić nasze metody. Resuspenduj komórki w bezserwatkowym medium hodowlanym do uzyskania gęstości 1 × 10⁶ komórek/ml.Do 1 mL zawiesiny komórkowej dodać 5 µL 1 mM DIO w dimetyloformamidzie i ostrożnie resuspender. Inkubować roztwór komórek w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Wirować komórki z prędkością 500 g przez 5 minut.Odlej supernatant i resuspenduj komórki w pożywce z dodatkiem FCS, ogrzanej do 37 °C. Powtórz ten krok dwukrotnie. Policz komórki przy użyciu komory Neubauera i mikroskopu świetlnego.Resuspenduj komórki w roztworze chlorku sodu. Wstrzyknij komórki do żyły ogonowej. Matryca Matrigel jest preparatem zrekonstytuowanej błony podstawnej ekstrahowanej z mięsaka płaskonabłonkowego.Służy do przesiewania cząsteczek testowych pod kątem tworzenia sieci komórek śródbłonka lub terapii antynowotworowych opartych na hamowaniu angiogenezy. Pozwala na ponowną ocenę potencjału angiogennego guza

intravital-microscopy-monocyte-homing-tumor-related-angiogenesis

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

W tym filmie demonstrujemy wizualizację interakcji krwinek i śródbłonka w żyłach krezkowych w modelu myszy, któremu wstrzyknięto dootrzewnowo lipopolisacharyd.

Mikroskopia przyżyciowa do analizy interakcji komórka-śródbłonek krwi w mysim modelu zapalenia

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Używając transgenicznych myszy reporterowych i wstrzykiwanych znaczników fluorescencyjnych, długoterminowa mikroskopia konfokalna z wirującym dyskiem umożliwia bezpośrednią wizualizację zachowania komórek szpikowych w gruczolaku jelitowym w modelu raka jelita grubego ApcMin/+.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki komórek szpikowych w guzach jelita ApcMin/+ za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem

To uproszczone zastosowanie mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych u myszy może być używane w różnych modelach zapalenia do obserwacji interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów.

Mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Ten protokół opisuje obrazowanie intrażyciowe transgenicznych myszy wykazujących ekspresję specyficznych dla komórek markerów fluorescencyjnych. Obrazowanie przyżyciowe zapewnia nieinwazyjną metodę obserwacji w wysokiej rozdzielczości u żywych zwierząt za pomocą wszczepialnych okien, przez które możliwa jest mikroskopowa wizualizacja procesów. Ta metoda jest szczególnie przydatna do badania procesów podłużnych.

Mikroskopia przyżyciowa naczyń krwionośnych związanych z nowotworem przy użyciu zaawansowanych komór okiennych grzbietowych fałdów skórnych na transgenicznych myszach fluorescencyjnych

Ten manuskrypt opisuje zastosowanie transgenicznych myszy reporterowych i różnych dróg podawania barwników fluorescencyjnych w nadciśnieniu wywołanym angiotensyną II za pomocą przyżyciowej mikroskopii wideo naczyń krwionośnych do oceny aktywacji komórek odpornościowych i ich zdolności do zwijania się i przylegania do śródbłonka.

Wizualizacja wałowania i adhezji leukocytów u myszy z infuzją angiotensyny II: techniki i pułapki

Opisujemy dwie metody oceny przejściowej przepuszczalności naczyń krwionośnych związanych z funkcją wejścia do mikrośrodowiska guza (TMEM) i wewnątrznaczynieniem komórek rakowych za pomocą dożylnego wstrzyknięcia dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej (155 kDa) u myszy. Metody te obejmują obrazowanie przyżyciowe u żywych zwierząt oraz analizę tkanek utrwalonych za pomocą immunofluorescencji.

Ocena mikrośrodowiska guza przepuszczalności naczyniowej za pośrednictwem drzwi z przerzutami związanych z rozsiewaniem komórek rakowych za pomocą obrazowania przyżyciowego i analizy tkanek stałych

Rekrutacja leukocytów i płytek krwi stanowi niezbędny składnik niezbędny do efektywnego wzrostu tętnic pobocznych podczas arteriogenezy. Mikroskopia wielofotonowa jest skutecznym narzędziem do śledzenia dynamiki komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną in vivo i mniejszą fototoksycznością do badania rekrutacji i wynaczynienia leukocytów podczas arteriogenezy.

Wielofotonowe obrazowanie przyżyciowe do monitorowania rekrutacji leukocytów podczas arterogenezy w mysim modelu kończyn tylnych

Obecny protokół opisuje unikalny, klinicznie istotny model choroby tętnic obwodowych, który łączy elektrokoagulację tętnicy udowej i żyły z podawaniem inhibitora syntazy tlenku azotu w celu wywołania zgorzeli kończyn tylnych u myszy FVB. Perfuzja DiI dosercowa jest następnie wykorzystywana do trójwymiarowego obrazowania naczyń krwionośnych opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości.

Trójwymiarowe obrazowanie unaczynienia opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości w mysim modelu zgorzeli kończyn tylnych

Odkryj mikroskopię przyżyciową do badania naprowadzania monocytów i angiogenezy związanej z nowotworem w mysim modelu choroby tętnic obwodowych. Ta metoda pozwala wizualizować komórki w czasie rzeczywistym.

Mikroskopia przyżyciowa naprowadzania monocytów i angiogenezy związanej z nowotworem w mysim modelu choroby tętnic obwodowych

Przeglądaj więcej filmów