Charakterystyka biochemiczna i strukturalna białka wiążącego substrat transportu węglowodanów SP0092
2 października 2017
Przedstawiono uproszczony protokół do przeprowadzenia obszernej charakterystyki biochemicznej i strukturalnej białka wiążącego substrat węglowodanowy ze Streptococcus pneumoniae.
Ogólnym celem tej procedury jest biochemiczna i strukturalna charakterystyka białka wiążącego substrat węglowodanowy z Streptococcus pneumoniae. Metoda ta może pomóc w dostarczeniu kluczowych danych pomocnych w badaniach instruktażowych białek wiążących substrat, takich jak identyfikacja profili stabilności bufora, stanów oligomeryzacji i struktur atomowych. Zaletą tej procedury jest to, że dostarcza ona danych, które mogą zwiększyć wskaźnik sukcesu krystalizacji i roztworu strukturalnego dla białek wiążących substrat w solidny i prosty sposób.
Najpierw przygotuj 48 roztworów buforowych o pH w zakresie od 4,0 do 9,5 i stężeniach chlorku sodu w zakresie od zera do 0,5 mola. Dozować 40 mikrolitrów każdego roztworu do 96-dołkowej płytki. Otrzymać oczyszczony roztwór wybranego białka wiążącego substrat.
Dodaj pięć mikrolitrów roztworu SBP do każdej studzienki, aby uzyskać stężenie od jednego do dwóch miligramów na mililitr. Następnie dodaj pięć mikrolitrów 20-krotnie stężonej plamy fluorescencyjnej do każdej studzienki. Wymieszać roztwory, pipetując w górę i w dół.
Uszczelnij płytkę przezroczystą folią samoprzylepną. Odwirować płytkę w temperaturze pokojowej 112 razy G przez dwie minuty. Skonfiguruj system PCR w czasie rzeczywistym, aby zwiększać temperaturę od czterech do 99 stopni Celsjusza z szybkością trzech stopni na minutę z 10-sekundowym czasem wstrzymania.
Ustaw system tak, aby dokonywał odczytów fluorescencji co pół stopnia. Ustaw ustawienie filtra fluorescencyjnego. i przypisz próbki.
Uruchom eksperyment i zidentyfikuj stan bufora z najwyższą temperaturą topnienia. Następnie należy przygotować bufor o wybranym pH i stężeniu chlorku sodu, który zawiera 2,5% objętości glicerolu i stężenie TCEP 0,5 milimola. Scharakteryzować oczyszczony SBP za pomocą analitycznej chromatografii wykluczającej wielkość z wielokątowym rozpraszaniem światła.
Zidentyfikuj najbardziej stabilne gatunki odpowiednie do krystalizacji i użyj przygotowawczego SEC, aby uzyskać czyste frakcje tych gatunków. Wykonaj testy wstępnej krystalizacji, aby określić optymalne stężenie białka do krystalizacji. Użyj zrobotyzowanego systemu krystalizacji, aby dozować pożądane komercyjne roztwory krystalizacji do zbiorników roztworów optycznej 96-dołkowej płytki kroplowej.
Następnie użyj systemu, aby dozować 100 nanolitrów roztworu białka do każdej kropli krystalizacji. Przenieś 100 nanolitrów każdego roztworu krystalizacyjnego ze studzienek zbiornika do odpowiednich kropli studzienki. Uszczelnij płytkę optyczną folią samoprzylepną.
Użyj mikroskopu lub zautomatyzowanego systemu obrazowania, aby ocenić tworzenie się i wzrost kryształów co jeden do dwóch dni przez dwa tygodnie, a następnie raz w tygodniu. Gdy uformują się wystarczająco duże i dobrze ukształtowane kryształy, należy przygotować partię roztworu krystalizacyjnego z dodatkowymi 25% objętości glicerolu, aby służyła jako krioprotektant. Następnie napełnij piankę dewara ciekłym azotem.
Zanurzyć komorę na próbkę unipuck w ciekłym azocie i pozostawić komorę do ostygnięcia. Następnie wytnij film na kropli zawierającej interesujący nas kryształ. Umieść 0,5 mikrolitra krioprotektantu na szkiełku przykrywającym w pobliżu kropli lub w pustej komorze kroplowej o tym samym stanie, jeśli jest dostępna.
Przymocuj do różdżki magnetycznej kriopętlę zamontowaną na standardowej podstawie SPINE. Użyj kriopętli, aby przenieść interesujący kryształ do kropli krioprotektantu. Następnie za pomocą kriopętli przenieś kryształ z krioprotektantu do pierwszej pustej pozycji zanurzonej obudowy próbki unipuck.
Powtórz ten proces, aby zebrać dodatkowe kryształy. Po załadowaniu wszystkich interesujących kryształów do obudowy próbki, użyj różdżki krążkowej, aby umieścić płytę podstawy unipuck na obudowie. Przetransportować krążek w ciekłym azocie na linię badawczą.
Użyj szczypiec kriogenicznych i narzędzia do ładowania krążka Dewara, aby załadować krążek do zmieniacza próbek Dewara na linii badawczej i odłączyć obudowę próbki. Następnie wybieramy próbkę w oprogramowaniu linii badawczej, aby załadować i automatycznie wyśrodkować próbkę w wiązce promieniowania rentgenowskiego. Uzyskaj widmo fluorescencji rentgenowskiej i zidentyfikuj wszelkie pierwiastki, które można wykorzystać w eksperymencie dyfrakcji anomalnej.
Określ optymalną długość fali do zbierania anomalnych danych dyfrakcyjnych, wykonując skanowanie energii krawędzi absorpcji promieniowania rentgenowskiego. Następnie uzyskaj trzy wzory dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego w odstępach 45 stopni w standardowym trybie oscylacji, aby automatycznie określić parametry komórki cząsteczkowej kryształu, symetrię i granicę dyfrakcji. Zaimportuj zalecane parametry zbierania danych do oprogramowania linii badawczej i uruchom eksperyment dyfrakcji anomalnej na jednej lub wielu długościach fali, w zależności od potrzeb.
Oceniono stabilność białka wiążącego substrat SP0092 w różnych soli w celu zidentyfikowania optymalnego roztworu buforowego. Najwyższe temperatury topnienia stwierdzono dla o pH 6,5 i stężeniach chlorku sodu w zakresie od zera do 0,2 mola. Do zabiegu wybrano bufor o pH 6,5 i stężeniu chlorku sodu 0,2 mola.
Różne stany oligomeryzacji SP0092 zostały zidentyfikowane i oddzielone za pomocą SEC-MALS. Analiza profilu SEC przy różnych stężeniach białek wykazała, że zwiększone stężenie białka wyzwala oligomeryzację, co sugeruje, że większe oligomery są bardziej stabilne przy wysokich stężeniach. Zgodnie z tym, duże oligomery wytwarzały kryształy w próbach krystalizacji, podczas gdy monomer nie.
Fluorescencja rentgenowska zarówno natywnych, jak i znakowanych selenometioniną kryształów SP0092 wykazała związany z białkiem w obu formach. Anomalny sygnał został zmaksymalizowany poprzez dostrojenie padającej długości fali promieniowania rentgenowskiego do krawędzi absorpcji promieniowania rentgenowskiego lub selenu. Następnie uzyskano kompletny zestaw danych anomalnych, a automatyczna analiza wywołana obecnością anomalnego sygnału wygenerowała wstępne mapy struktur białkowych.
Modele wbudowane w te początkowe mapy zostały następnie dopracowane i zweryfikowane w celu uzyskania ostatecznych modeli. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić kompleksową charakterystykę strukturalną białka wiążącego substrat lub dowolnego potencjalnego celu białkowego. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku opracowania nowych metod leczenia choroby mirokokowej, ponieważ dostarcza ona fundamentalnych informacji na temat projektowania inhibitorów dla tej klasy białek w oparciu o strukturę.
Metody te mogą być również stosowane do białek wiążących substraty z innych organizmów i potencjalnie mogą być stosowane do każdego rodzaju białka.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia uproszczony protokół do biochemicznej i strukturalnej charakteryzacji białka wiązania substratów węglowodanowych pochodzącego z Streptococcus pneumoniae. Metoda ma na celu dostarczenie kluczowych danych do badań nad białkami wiązania substratów, poprawiając sukces krystalizacji i rozwiązania struktury.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Biologia strukturalna
- Charakteryzacja białek
Tło
- Białka wiązania substratów węglowodanowych odgrywają kluczową rolę w metabolizmie bakterii.
- Zrozumienie ich struktury może pomóc w projektowaniu leków i interwencjach terapeutycznych.
- Metody charakteryzacji są niezbędne do określania warunków stabilności i krystalizacji.
- To badanie koncentruje się na określonym białku, SP0092, pochodzącym z Streptococcus pneumoniae.
Cel badania
- Charakteryzowanie właściwości biochemicznych SP0092.
- Identyfikowanie optymalnych warunków buforowych dla stabilności i krystalizacji.
- Ocenianie stanów oligomeryzacji i ich wpływu na krystalizację.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworów buforowych o różnym pH i stężeniu soli.
- Testy stabilności oparte na fluorescencji w celu określenia temperatur topnienia.
- Chromatografia wykluczania rozmiarowego z wielokątnym rozpraszaniem światła (SEC-MALS) do analizy oligomeryzacji.
- Kristalografia rentgenowska do określenia struktury kryształów białka.
Główne wyniki
- Optymalne warunki buforowe zidentyfikowane przy pH 6,5 i stężeniu chlorku sodu 0,2 molarnego.
- Wzmożone stężenie białka prowadziło do oligomeryzacji, poprawiając sukces krystalizacji.
- Fluorescencja rentgenowska wskazywała na wiązanie cynku zarówno w kryształach SP0092 natywnych, jak i oznaczonych selenometioniną.
- Automatyczna analiza danych dyfrakcyjnych dostarczyła początkowych map struktury białka.
Wnioski
- Badanie z powodzeniem nakreśliło protokół charakteryzacji SP0092.
- Identyfikowanie optymalnych warunków może znacząco poprawić wyniki krystalizacji.
- Wyniki wnoszą do lepszego zrozumienia białek wiązania substratów w bakteriach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables structure-based design of inhibitors targeting carbohydrate substrate binding proteins in Streptococcus pneumoniae, a priority for antimicrobial and vaccine development against resistant strains. By establishing optimal buffer conditions and characterizing oligomerization states, the method de-risks early-stage target validation and supports predictive confidence in downstream inhibitor screening. The approach provides a reusable framework for evaluating extracellular proteins central to pathogen metabolism, informing portfolio prioritization in antibacterial discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by defining buffer stability profiles and oligomerization states critical for target engagement.
- Operational Value: Provides quantitative thermal shift and SEC-MALS data to assess target homogeneity and reduce false positives in assay development.
- Predictive Value: Identifies conditions favoring crystallization-competent oligomers, increasing success rates for structure-guided inhibitor design.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated, homogeneous protein preparations suitable for biochemical and biophysical assay formats.
- Operational Value: Establishes standardized buffer conditions (pH 6.5, 0.2 M NaCl) ensuring reproducibility across screening campaigns.
- Scalability Value: Uses robotic crystallization and SEC-MALS platforms adaptable to medium-throughput target characterization workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Links structural insights to pneumococcal carbohydrate import pathways, supporting mechanism-based inhibitor design.
- Preclinical Value: Enables evaluation of inhibitor binding to zinc-bound SP0092 structures, informing selectivity and resistance profiling.
- Continuity Value: Provides a transferable method for characterizing homologous SBPs across bacterial strains, supporting broad-spectrum target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, progressing from target validation through structural characterization to enable lead identification efforts for antimicrobial programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via biochemical profiling of substrate binding and oligomerization states under physiologically relevant conditions.
- Screening: Delivers assay-ready protein samples with defined stability and monodispersity for reliable compound screening.
- Analytics: Provides SEC-MALS oligomerization data and thermal shift metrics to compare protein states and buffer effects.
- Translational Research: Connects structural data to carbohydrate transport mechanisms, informing target validation in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized pipeline for SBP characterization applicable to multiple targets and pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validity by resolving atomic structures and ligand-binding sites.
- Operational Value: Enhances reproducibility through defined buffer conditions and automated crystallization tracking.
- Strategic Value: Reduces attrition risk by enabling early go/no-go decisions based on structural druggability assessments.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets with validated structural tractability and metabolic relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, thermal shift assays, and SEC-MALS operation.
- Dependent on access to size-exclusion chromatography, multi-angle light scattering, and synchrotron beamline facilities.
- Necessitates cross-team standardization of buffer formulations and protein concentration ranges.
- Involves adaptation considerations for different SBP subclasses and oligomerization tendencies.
- Limited by the need for crystallization-competent protein states, which may require extensive condition screening.
