Name: Charakterystyka biochemiczna i strukturalna białka wiążącego substrat transportu węglowodanów SP0092 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj metodę charakteryzacji biochemicznej i strukturalnej białka wiążącego substrat SP0092 z Streptococcus pneumoniae. Protokół obejmuje optymalizację buforów, analizę oligomeryzacji SEC-MALS oraz krystalografię rentgenowską.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy OPPF-UK za pomoc w klonowaniu, Gemmie Harris za SEC-MALLS oraz naukowcom z linii badawczych I03 i I04 w Diamond Light Source.

UWAGA: Sekwencja kodująca, dla której usunięto peptyd sygnałowy, jest klonowana w wektorze pOPINF zgodnie ze standardowym protokołem infuzji; białko natywne jest wyrażone jako fuzja znacznika Hisa w komórkach Escherichia coli BL21 Rosetta28,29. Wariant znakowany selenometioniną jest wyrażany zgodnie ze standardowymi metodami zgodnie z manufacturer30. Rekombinowany SBP jest oczyszczany zgodnie z wcześniejszym opisem31,32.
1. Charakterystyka biochemiczna
<ol>
	<li>Test przesunięcia termicznego
	<ol>
		<li>Przygotować 48 roztworów buforowych o pH w zakresie od 4,0 do 9,5 i stężeniu NaCl od 0 do 0,5 M i dozować 40 μl do płytki 96-dołkowej, jak opisano w Tabeli 133.</li>
		<li>Dodać do każdej studzienki 5 μl roztworu SBP o stężeniu 1 - 2 mg/ml.</li>
		<li>Dodać do każdej studzienki 5 μl 20-krotnego barwnika fluorescencyjnego na białka (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Wymieszać roztwory pipetując, uszczelnić płytkę przezroczystą folią samoprzylepną i wirować przez 2 minuty w temperaturze 112 x g w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przeprowadź eksperyment na maszynie czasu rzeczywistego: ustaw rampę temperatury 3 °C/min od 4 do 99 °C z czasem podtrzymania 10 s i odczytuj fluorescencję co 0,5 °C ze wzbudzeniem przy 483 nm i emisją przy 568 nm.</li>
		<li>Przeanalizować krzywe emisji fluorescencji dla każdego stanu buforowego, określając temperaturę topnienia (Tm) jako minimum pochodnej. 
		UWAGA: Ta procedura daje dobre wskazanie najlepszego roztworu buforowego, który pomaga w poprawie stabilności białka. Wybierz zakres pH i stężenie soli w oparciu o stan buforowy o najwyższym Tm i dodaj 2,5% (v/v) glicerolu i 0,5 mM tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP), aby określić roztwór buforowy dla kolejnych etapów (bufor SEC).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MALS i analityczna SEC
	<ol>
		<li>Przeprowadzić dwukolumnowe płukanie objętościowe wstępnie wypełnionej żelowej kolumny filtracyjnej odgazowaną przefiltrowaną wodą (użyć kolumny o masie cząsteczkowej 24 ml w szerokim zakresie).</li>
		<li>Podłączyć kolumnę do detektora rozpraszania światła i zrównoważyć kolumnę z wyznaczonym buforem SEC z testu przesunięcia termicznego.</li>
		<li>Wstrzyknąć 100 μl oczyszczonego SBP w stężeniu 5 mg/ml do zrównoważonej kolumny SEC i przelać jedną objętość buforu SEC w jednej kolumnie.</li>
		<li>Sprawdzić chromatogram elucji pod kątem pojedynczych lub wielokrotnych pików i zbadać dane dotyczące rozpraszania za pomocą oprogramowania analitycznego, uzyskując masę molową i wskaźnik polidyspersyjności dla wszystkich gatunków. 
		UWAGA: Dla każdego piku odpowiadającego gatunkowi oligomerycznemu korzystne jest sprawdzenie wskaźnika polidyspersyjności obliczonego jako masa molowa ważona masą/masa molowa ważona liczbą cząsteczek (Mw/Mn). Wartość polidyspersyjności bliska 1 wskazuje na pik monorozproszony. 
		UWAGA: Po zdefiniowaniu wszystkich gatunków oligomeryzacji przydatne jest zbadanie ich zależności od stężenia białka, ponieważ wyższe stężenia mogą sprzyjać tworzeniu się większych oligomerów.</li>
		<li>Wykonaj wiele analitycznych serii SEC; wstrzyknij 100 μl oczyszczonego SBP o rosnących stężeniach (0,1 - 10 mg / ml) do zrównoważonej kolumny filtracyjnej żelu (użyj kolumny o masie cząsteczkowej 5 ml o szerokim zakresie) i za każdym razem przepływaj jedną objętość buforu SEC w jednej kolumnie.</li>
		<li>Sprawdzić chromatogram elucji pod kątem pojedynczych lub wielokrotnych pików i przeanalizować intensywności absorbancji przy 280 nm krzywych odpowiadających różnym stężeniom białka wyjściowego. Jeśli względne intensywności różnych pików pozostają stałe, to nie występuje wzajemna konwersja między gatunkami oligomerycznymi. Zmienność względnej intensywności przy różnych stężeniach wskazuje na wzajemną konwersję między różnymi gatunkami oligomerycznymi, która jest zależna od stężenia białka. 
		UWAGA: Ten etap charakterystyki ma zasadnicze znaczenie dla określenia, które gatunki są bardziej odpowiednie do krystalizacji. Rzeczywiście, odrębne gatunki monorozproszone są bardziej podatne na krystalizację, jeśli znajdują się w stałym stanie oligomerycznym w określonym stężeniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie i krystalizacja białek
<ol>
	<li>Przygotowawczy SEC
	<ol>
		<li>Po przepłukaniu objętością jednej kolumny odgazowaną przefiltrowaną wodą, zrównoważyć buforem SEC preparatywną, wstępnie wypełnioną żelową kolumnę filtracyjną (kolumna o szerokim zakresie masy cząsteczkowej 120 ml).</li>
		<li>Wstrzyknąć 1 - 5 ml oczyszczonego SBP w stężeniu 5-50 mg/ml do zrównoważonej żelowej kolumny filtracyjnej i przepuścić jedną objętość buforu SEC w jednej kolumnie.</li>
		<li>Zebrać przepływ z kolumny we frakcjach o objętości 1 ml.</li>
		<li>Zebrać frakcje odpowiadające pojedynczemu pikowi monodyspersji; odwirować próbkę w 15 ml filtrów wirowych o stężeniu 1 500 g i określić ilościowo stężenie, aż do osiągnięcia pożądanego stężenia (zazwyczaj 50 - 100 mg/ml dla SP0092).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>krystalizacja
	<ol>
		<li>Określić optymalny zakres stężeń dla eksperymentu krystalizacji za pomocą testu przed krystalizacją zgodnie z opisem producenta:
		<ol>
			<li>Dozować 0,5 - 1,0 ml każdego z czterech roztworów do badania krystalizacji do innego zbiornika 24-dołkowej płytki krystalizacyjnej z siedzącą kroplą.</li>
			<li>Przygotować krople krystalizacji, mieszając 1 μl roztworu białkowego z 1 μl roztworu rezerwuarowego, uszczelnić płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez nie mniej niż 1 godzinę (bardziej wiarygodne wyniki uzyskuje się po inkubacji przez noc).</li>
			<li>Sprawdź jakość kropli dla każdego stężenia za pomocą mikroskopu z 10-krotnym powiększeniem. 
			UWAGA: Przetestuj co najmniej trzy różne stężenia białka: (I) większość kropli pozostających przezroczystych wskazuje, że białko jest zbyt rozcieńczone do krystalizacji; (II) obecność ciężkiego osadu w większości kropli oznacza zbyt wysokie stężenie; oraz (III) zrównoważone występowanie zarówno klarownych kropli, jak i osadu (lepiej w przypadku światła) jest dobrym wskaźnikiem, że badane stężenie jest korzystne dla krystalizacji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj 96-dołkowe płytki krystalizacyjne z kroplą do siedzenia; dozuj 100 μl różnych dostępnych na rynku roztworów krystalizacji do każdej studzienki zbiornika34,35,36,37.</li>
		<li>Dozować 100 nL próbki białka o wcześniej zdefiniowanym stężeniu (krok 1.1.6) do wszystkich studzienek kroplowych do krystalizacji za pomocą zrobotyzowanego systemu krystalizacji.</li>
		<li>Dozować 100 nl różnych roztworów zbiornikowych do odpowiednich studzienek kroplowych do krystalizacji w celu wymieszania z białkiem dozowanym w kroku 2.2.3. Uszczelnij płytkę krystalizacyjną, aby uniknąć parowania i umożliwić zrównoważenie kropli krystalizacji ze zbiornikiem.</li>
		<li>Sprawdzaj krople okresowo (początkowo co 1-2 dni, później co tydzień) za pomocą mikroskopu z 10-krotnym (co najmniej) powiększeniem, aby ocenić tworzenie się i wzrost kryształów. 
		UWAGA: Zautomatyzowany system obrazowania do krystalizacji białek może być używany do wizualizacji i wychwytywania kropli.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Charakterystyka kryształów i zbieranie danych rentgenowskich
<ol>
	<li>Montaż kryształowy
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór krioprotektantu, dodając 25% (v/v) glicerolu (stężenie końcowe) do stanu krystalizacji (zastępując w ten sposób 25% wody w początkowej mieszaninie)38.</li>
		<li>Napełnij piankę Dewara ciekłym azotem i umieść próbkę część obudowy uni-krążka w dewarze. Pozwól mu ostygnąć do temperatury ciekłego azotu.</li>
		<li>Wytnij i usuń taśmę uszczelniającą z płytki krystalizacyjnej nad kroplą, w której tworzą się kryształy.</li>
		<li>Umieść kroplę 1 μl roztworu krioprotektantu na szkiełku nakrywkowym umieszczonym w bliskiej odległości od docelowej kropli.</li>
		<li>Przenieś wybrany kryształ z pierwotnej kropli do kropli roztworu krioprotektantu za pomocą nylonowej pętli kriograficznej na standardowej podstawie SPINE zamontowanej na różdżce magnetycznej39,40.</li>
		<li>Szybko przenieś kryształ z kropli krioprotektantu na ciekły azot, umieszczając pętlę w pierwszej pustej pozycji uchwytu na próbki uni-puck.</li>
		<li>Powtarzać tę czynność (od etapu cięcia taśmy uszczelniającej), aż wszystkie pożądane kryształy zostaną zebrane i przechowywane w uchwycie na próbki uni-puck.</li>
		<li>Umieść podstawę uni-puck na uni-puck za pomocą różdżki krążka i przenieś krążek na linię badawczą (w warunkach ciekłego azotu). 
		UWAGA: Ekstremalnie niska temperatura!</li>
		<li>Użyj szczypiec kriogenicznych i narzędzia do ładowania krążka Dewara, aby załadować krążek uni-puck(s) do robota dewara do zmieniacza próbek linii badawczej. Uchwyt na próbkę uni-puck odczepia się od pokrywy podstawy, pozostawiając uchwyty pętli próbki pionowo w robocie dewara do próbek, a tym samym wystawiony na działanie ciekłego azotu i dostępny dla robota zmieniającego próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Charakterystyka kryształów 
	UWAGA: Zebrane kryształy można następnie przebadać pod kątem jakości dyfrakcyjnej przy użyciu laboratoryjnego źródła promieniowania rentgenowskiego lub źródła promieniowania rentgenowskiego synchrotronowego (SR). Linie badawcze krystalografii makromolekularnej (MX) zapewniają przestrajalne źródło energii do wykorzystania anomalnej dyfrakcji w celu rozwiązania struktury. W poniższej sekcji zaproponowano szereg instrukcji roboczych zgodnych z możliwościami eksperymentalnymi linii badawczych MX Diamond Light Source, ale wytyczne te mogą być również dostosowane do linii badawczych MX w innych synchrotronach na całym świecie.
	<ol>
		<li>W pierwszym kroku warto potwierdzić lub zidentyfikować anomalne rozpraszacze w krysztale. Można to wygodnie osiągnąć, mierząc widmo fluorescencji promieniowania rentgenowskiego od kryształu. Najpierw upewnij się, że energia promieniowania rentgenowskiego linii badawczej jest wystarczająco wysoka, aby wzbudzić wszystkie pierwiastki zwykle oczekiwane dla kryształów wielkocząsteczkowych (14 keV lub więcej).</li>
		<li>Użyj oprogramowania sterującego linią badawczą, aby wybrać próbkę, która ma być zamontowana przez robota zmieniacza próbek; pętla zostanie automatycznie wyśrodkowana w wiązce promieniowania rentgenowskiego, a centrowanie kryształów można potwierdzić ręcznie za pomocą oprogramowania sterującego linią.</li>
		<li>Rejestruj widmo fluorescencji promieniowania rentgenowskiego za pomocą oprogramowania sterującego linią badawczą: użytkownik wybiera czas ekspozycji i inicjuje pomiar (Fluorescencja/Ustawienie widma fluorescencji, → Run, <silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Oprogramowanie sterujące linią automatycznie ustawia detektor fluorescencji rentgenowskiej w miejscu i określa minimalny strumień padającego promieniowania rentgenowskiego, aby uzyskać czytelny sygnał na detektorze fluorescencji. Pozyskane widmo jest następnie analizowane w sposób zautomatyzowany z pikami emisji dopasowanymi do naturalnie występujących elementów biologicznych. Procedury te są dostępne w graficznym interfejsie użytkownika (GUI) oprogramowania sterującego linią badawczą - GDA (www.opengda.org) w naszej firmie oraz w synchrotronach w całej Europie41,42.</li>
		<li>Jeśli zostaną zidentyfikowane odpowiednie pierwiastki, które można wykorzystać do eksperymentu dyfrakcji anomalnej, należy wykonać skanowanie energii krawędzi absorpcji promieniowania rentgenowskiego w celu określenia optymalnej długości fali do zbierania anomalnych danych dyfrakcyjnych z kryształu: w oprogramowaniu sterującym linią badawczą wybierz element i rozpocznij skanowanie (Fluorescence/Fluorescence Scan Setting, → Nazwa atomu, → Run, <silna klasa="xfig">Rysunek 2B). 
		UWAGA: W przypadku pojedynczego eksperymentu z dyfrakcją anomalną, szczyt krawędzi absorpcyjnej jest używany do maksymalizacji anomalnego rozpraszania. Rozważania eksperymentalne dotyczące przeprowadzenia eksperymentu dyfrakcji anomalnej na wielu długościach fal zostały wcześniej szczegółowo opisane43.</li>
		<li>Aby określić parametry komórki krystalicznej, symetrię i granicę dyfrakcji, zmierz trzy wzorce dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego w odstępach 45° przy użyciu metody oscylacji (Data Collection/Screening → Run current, Rysunek 2C). Oprogramowanie sterujące linią zapewnia użytkownikowi wybór kąta oscylacji i czasu naświetlania oraz możliwość ustawienia procentowej transmisji wiązki promieniowania rentgenowskiego. W przypadku standardowego ekranowania kryształów zalecany jest kąt oscylacji 0,5°, czas ekspozycji 0,5 s i 5% transmisja wiązki promieniowania rentgenowskiego. Zmierzone obrazy dyfrakcyjne są automatycznie analizowane przez potok EDNA i zwracają zestaw strategii do zbierania kompletnego zestawu danych22.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gromadzenie danych rentgenowskich 
	UWAGA: Użytkownik może wybrać zbieranie danych w standardowym trybie oscylacji lub w trybie wiązki odwróconej, co umożliwia rejestrowanie wiązań Friedela w bliskim czasie i dawce promieniowania rentgenowskiego oraz przy mniej więcej takim samym zachowaniu absorpcji, co pozwala na dokładniejszy pomiar różnic anomalnych. To ostatnie jest przydatne zwłaszcza wtedy, gdy spodziewane są niewielkie różnice anomalne i/lub próbki są wrażliwe na promieniowanie podczas przeprowadzania eksperymentu dyfrakcji anomalnej. Rozważania na temat najlepszych strategii zbierania danych zostały kompleksowo przeanalizowane22,23,44,45,46,47.
	<ol>
		<li>Za pomocą oprogramowania sterującego linią zaimportuj parametry zbierania danych zgodnie z sugestiami programu strategicznego, który dostarczy: 
		ja. Pozycja początkowa osi obrotu ω 
		ii. Szerokość oscylacji kąta obrotu osi ω dla każdego obrazu dyfrakcyjnego 
		iii. Czas naświetlania dla każdego obrazu dyfrakcyjnego 
		iv. Liczba obrazów w kompletnym zbiorze danych (pośrednio określająca całkowity kąt obrotu osi ω dla całego zbioru danych) 
		v. Procent tłumienia wiązki promieniowania rentgenowskiego w celu uniknięcia nadmiernej ekspozycji i uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem 
		UWAGA: W naszej instytucji, do prowadzenia zbierania danych, rurociągi oprogramowania do automatycznego przetwarzania zebranych danych są dobrze ugruntowane: (i) Dane dyfrakcyjne są redukowane (indeksowane, integrowane i skalowane) przez potok xia2, który generuje pliki odbicia mtz dla użytkownika jako dane wejściowe do fazowania i struktury rozwiązanie/udoskonalenie48. (ii) Gdy podczas analizy danych zostanie wykryty znaczący sygnał anomalny, pierwszy szybki potok rozwiązań do zautomatyzowanej struktury (fast_ep) przy użyciu SHELX próbuje rozwiązać podstrukturę ciężkich atomów poprzez eksperymentalne fazowanie, dostarczając fazową mapę gęstości elektronów tam, gdzie jest to możliwe. Drugi, bardziej kompleksowy potok rozwiązań strukturalnych automatycznie podejmuje próby rozwiązania i zbudowania struktury przy użyciu niezależnych pakietów oprogramowania49,50,51,52; W przypadkach, gdy to się powiedzie, użytkownik otrzyma wstępny model i mapę gęstości elektronów. Stanowi to podstawę dla użytkownika do całkowitego udoskonalenia i walidacji modelu za pomocą wybranych pakietów oprogramowania krystalograficznego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule opisujemy i walidujemy zintegrowany protokół biochemicznej i strukturalnej charakterystyki węglowodanowych SBP ze szczególnym naciskiem na białka z S. pneumoniae. Niemniej jednak może to być stosowane jako standardowa procedura do analizy innych SBP z różnych organizmów, a nawet innych niepowiązanych rozpuszczalnych białek.
Pierwsza część protokołu koncentruje się na dostarczeniu informacji biochemicznych na temat stabilności białek i struktury czwartorzędowej, które mogą być wykorzystane w przygotowaniu próbek białek do krystalizacji. W sekcji dotyczącej testów przesunięcia termicznego opisujemy tylko zmiany stężenia pH i NaCl, aby zachować ogólny charakter tej procedury. Mimo to wiele innych warunków buforowych może być testowanych w podobny sposób, na przykład, w tym każdy związek chemiczny stosowany jako dodatek stabilizujący: w szczególności rzeczywiste ligandy (ligandy), które wiążą się z określonym SBP, są niezwykle skuteczne w zwiększaniu Tm o kilka stopni Celsjusza31. W niektórych przypadkach krzywe denaturacji mogą być słabo zdefiniowane z powodu słabego sygnału lub wysokiej fluorescencji tła, co jest spowodowane agregacją białek lub częściowym rozwijaniem. Aby tego uniknąć, można przeprowadzić miareczkowanie białko-barwnik w celu optymalizacji niejasnych krzywych denaturacji. Jeśli nie zostanie uzyskana poprawa, zaleca się badania przesiewowe różnych dodatków, które mogą poprawić stabilność białka, a odpowiednie badania przesiewowe zostały wcześniej opisane54.
Zazwyczaj większość SBP jest monomeryczna w swoim naturalnym środowisku, ale jak pokazano tutaj, multimeryzacja może zachodzić przy wyższych stężeniach stosowanych w eksperymentach krystalizacji, dlatego charakterystyka zachowania oligomeryzacji zapewniona przez MALS i SEC jest niezbędna do oceny najkorzystniejszego stabilnego stanu oligomeryzacji monodyspersji dla krystalizacji. Niemniej jednak trudno jest przewidzieć wpływ różnych substancji chemicznych zawartych w warunku krystalizacji na zachowanie oligomeryzacji białek. Jeśli badanie SEC i MALS wykaże rozległą agregację próbki białka, zalecamy następujące działania, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wystąpienia takiej sytuacji: użyć świeżej próbki białka (nie zamrożonej i rozmrożonej) i rozszerzyć analizę stabilizacji wykonaną za pomocą testów przesunięcia termicznego, testując możliwe dodatki i łagodne detergenty jako ostatni środek, aby zminimalizować agregację. W tym artykule przedstawiamy podstawowe wytyczne dotyczące krystalizacji przy użyciu wysokoprzepustowego komercyjnego badania przesiewowego krystalizacji z rzadkimi matrycami, aby zachować ogólny charakter tego protokołu. Jednak uzyskanie kryształów białek dyfrakcyjnych promieniowania rentgenowskiego o wysokiej rozdzielczości może wymagać iteracyjnego dostrajania w celu optymalizacji warunków krystalizacji w odniesieniu do stężenia strącacza, pH, dodatku dodatków chemicznych, różnych temperatur i innych czynników zmieniających dynamikę równowagi między kroplą kryształu a zbiornikiem 16,17.
Druga część protokołu opisuje charakterystykę kryształów białkowych w celu zdefiniowania optymalnej strategii zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej, ze szczególnym naciskiem na pozyskiwanie anomalnych danych dla fazowania SAD. Nawet jeśli SBP utrzymują podobną ogólną architekturę (i istnieje wiele zdeponowanych struktur 3D, które mogą być potencjalnie użyteczne jako modele wyjściowe), fazowanie tych białek metodą zastępowania molekularnego nie zawsze jest proste ze względu na zmienność drugorzędowych elementów struktury i wewnętrzną elastyczność tych białek. W związku z tym proponujemy metodę SAD i podkreślamy, że białka te mogą już mieć wewnętrznie związane metale lub rzeczywiście niespecyficzne wiązanie metali z warunków bufora krystalizacji, co może dostarczyć szereg anomalnych elementów dyfrakcyjnych jako standardowy krok w naszym ogólnym protokole.
Podsumowując, protokół ten definiuje standardowy sterowany przepływ procedur umożliwiający szczegółowy opis biochemicznych i strukturalnych cech SBP, które można wykorzystać do zwiększenia wskaźnika powodzenia określania struktury, a także przyspieszenia ogólnej charakterystyki strukturalnej SBP.

S. pneumoniae (pneumokoki) to bakteria Gram-dodatnia występująca bezobjawowo w górnych drogach oddechowych człowieka ze zdolnością migracji do normalnie sterylnych nisz, powodując zapalenie ucha, zapalenie płuc, sepsę, posocznicę i zapalenie opon mózgowych1,2. Co więcej, zakażenie pneumokokowe jest główną przyczyną pozaszpitalnego zapalenia płuc, które przyczynia się do obciążenia klinicznego i ekonomicznego na całym świecie3,4. Oporne na antybiotyki szczepy S. pneumoniae rozprzestrzeniły się na całym świecie i chociaż siedmiowalentna i trzynastowalentna szczepionka skoniugowana z białkiem pneumokokowym pomogły zmniejszyć wskaźnik oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, pojawiły się szczepy zastępcze po zastosowaniu szczepionek, co doprowadziło do zwiększonego zapotrzebowania na badania nad opracowaniem nowych metod leczenia choroby pneumokokowej5,6, 7,8.
Pneumokoki są zależne od cukrów importowanych od gospodarza jako źródło węgla9,10; rzeczywiście poświęca 30% swojej maszynerii importowej na transport 32 różnych węglowodanów11,12,13. Wśród tych importerów znajduje się co najmniej osiem ABC-transporters13. W transporterach ABC zewnątrzkomórkowe SBP odgrywają zasadniczą rolę w określaniu swoistości liganda i przedstawianiu go integralnemu transporterowi błonowemu w celu wychwytu w komórce. SBP stanowią ważne cele dla projektowania nowych szczepionek i środków przeciwdrobnoustrojowych, ponieważ są białkami powierzchniowymi i odgrywają kluczową rolę w procesach komórkowych.
Charakterystyka docelowego białka i szczegółowy opis cech strukturalnych, takich jak kieszenie ligandowe i elastyczność międzydomenowa, stanowią użyteczne narzędzie do projektowania leków w oparciu o strukturę14,15. Krystalografia rentgenowska jest metodą z wyboru do charakterystyki strukturalnej białek w rozdzielczości bliskiej atomowej, ale proces krystalizacji jest nieprzewidywalny, czasochłonny i nie zawsze zakończony sukcesem. Systematyczne metody poprawiły wskaźnik sukcesu, a ważnymi czynnikami są jakość i stabilność próbki. Na wskaźnik powodzenia krystalizacji mają wpływ właściwości chemiczne białka i metodologia przygotowania próbki. Ich wpływ można ocenić i poinformować za pomocą charakterystyki biochemicznej16,17.
Kolejną komplikacją dla projektowania opartego na strukturze jest problem fazy krystalograficznej, który musi zostać rozwiązany. Ponieważ dostępnych jest coraz więcej struktur białkowych, wiele struktur można rozwiązać za pomocą metody zastępowania molekularnego, która wymaga struktury homologicznej18. Ponieważ SBP mają elastyczną strukturę domeny, wymiana molekularna może również okazać się wyzwaniem19. Jeśli model strukturalny, który jest wystarczająco podobny do białka docelowego, nie jest dostępny, można zastosować szereg technik w celu uzyskania eksperymentalnego phasing20. Wśród nich metoda anomalnej dyspersji na jednej długości fali (SAD) stała się podstawową techniką i jest szeroko stosowana do rozwiązywania problemu fazowego21. Wykorzystanie metody SAD zostało jeszcze bardziej rozwinięte dzięki ulepszeniom w sprzęcie i oprogramowaniu, a także strategiom gromadzenia danych, aby umożliwić wykrywanie i wykorzystywanie słabych sygnałów anomalnych do fazowania22,23,24. Co więcej, postęp w bezpośrednich metodach rozwiązywania struktur makromolekuł, które w przeszłości wymagały danych dyfrakcyjnych do rozdzielczości atomowej, może być teraz wykorzystany poprzez połączenie na przykład wiedzy stereochemicznej, jak zaimplementowano w programie ARCIMOLDO25. Przydatny przegląd metod rozwiązywania problemu fazowego w krystalografii znajduje się w Taylor26.
Tutaj prezentujemy zracjonalizowany protokół charakterystyki transportu węglowodanów SBP, SP0092 S. pneumoniae, integrujący techniki biochemiczne i strukturalne (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Ten protokół krok po kroku stanowi użyteczny przykład przypadku testowego strategii mających na celu poprawę wskaźnika sukcesu badań strukturalnych nad SBP w ogóle, które można znaleźć we wszystkich królestwach życia. W szczególności protokół podkreśla znaczenie scharakteryzowania najbardziej stabilnego stanu oligomerycznego białka w roztworze w szybki i skuteczny sposób oraz umożliwia identyfikację najlepszych gatunków do dalszych działań w eksperymentach krystalizacji. Chociaż w Banku Danych Białek zgłoszono ponad 500 struktur SBP27, wymiana molekularna może być trudna ze względu na nieodłączną elastyczną naturę dwóch domen α/β, które są połączone regionem zawiasowym19. Tak więc druga część protokołu opisuje zastosowanie metody SAD do fazowania ze związanych jonów metali, która jest powszechna w SBP, a także włączenie selenometioniny i zastosowanie selenu (Se) w fazowaniu SAD.

<table><tbody><tr><td>SelenoMethionine Medium Complete</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD12-500</td><td>Oparty na syntetycznym minimalnym pożywce M9 uzupełnionej glukozą, witaminami i aminokwasami z wyjątkiem L-metioniny. Inne równoważne produkty są dostępne na rynku przez inne firmy.</td></tr><tr><td>Płytka optyczna 96-dołkowa MicroAmp</td><td>Applied Biosystems</td><td>4306737</td><td>Optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna z kodem kreskowym firmy Applied Biosystems MicroAmp jest zoptymalizowana, aby zapewnić niezrównaną dokładność i jednorodność temperatury w celu szybkiej i wydajnej amplifikacji PCR. Płytka ta, wykonana z pojedynczego sztywnego kawałka polipropylenu w formacie 96-dołkowym, jest kompatybilna z Applied Biosystems&reg; 96-dołkowe systemy PCR w czasie rzeczywistym i termocyklery.</td></tr><tr><td>SYPRO Orange</td><td>Molecular Probes</td><td>S6651</td><td>SYPRO Orange Protein Gel Stain to czuły, gotowy do użycia barwnik fluorescencyjny do białek w żelach 1D. Dość uniwersalny i ugruntowany barwnik białkowy do regionów hydrofobowych.</td></tr><tr><td>Optyczna folia samoprzylepna MicroAmp</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311971</td><td>Optyczna folia samoprzylepna MicroAmp firmy Applied Biosystems zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia i odparowania próbki po nałożeniu na mikropłytkę. Idealnie nadaje się do pomiaru optycznego, ponieważ daje niskie tło.</td></tr><tr><td>7500 Szybki system PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Applied Biosystems</td><td>4362143</td><td>Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System umożliwia standardowy, 96-dołkowy szybki cykl termiczny, znacznie skracając czas pracy w przypadku ilościowych aplikacji PCR w czasie rzeczywistym, dostarczając wyniki w około 30 minut. Zestaw aktualizacyjny jest dostępny w celu uaktualnienia standardowego systemu 7500 Real-Time PCR do szybkiej konfiguracji poprzez instalację w terenie. Można użyć innej maszyny RT-PCR. Eksport danych nie jest łatwy dla starego oprogramowania do analizy danych.</td></tr><tr><td>Kolumna Superdex 200 increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL to wszechstronna, fabrycznie wypełniona kolumna do chromatografii wykluczającej wielkość w oczyszczaniu preparatywnym na małą skalę (mg), a także do charakterystyki i analizy białek o masie cząsteczkowej od 10 000 do 600 000, takich jak przeciwciała. Optymalna separacja, idealna dla technik biofizycznych o wysokiej rozdzielczości.</td></tr><tr><td>DAWN HELEOS II</td><td>Wyatt</td><td></td><td>DAWN HELEOS II to wiodący detektor wielokątowego statycznego rozpraszania światła (MALS) do absolutnej charakterystyki masy molowej i wielkości makrocząsteczek i nanocząstek w roztworze. DAWN oferuje najwyższą czułość, najszerszy zakres masy cząsteczkowej, wielkości i stężenia, a także największy wybór konfiguracji i opcjonalnych modułów zwiększających możliwości. Inne systemy wykrywania MALS innych firm poza Wyatt nie zostały przetestowane, więc nie można udzielić dodatkowych informacji zwrotnych.</td></tr><tr><td>Superdex 200 5/150 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28906561</td><td>Superdex 200 to fabrycznie upakowane kolumny chromatograficzne do ekstrakcji biomolekuł o wysokiej rozdzielczości, preparatywnych i analitycznych na małą skalę. Superdex 200 ma zakres separacji dla cząsteczek o masie cząsteczkowej od 10 000 do 600 000. Separacja pików nie jest tak optymalna, jak w przypadku wersji "wzrostowej", ale ten model jest idealny do standardowego codziennego użytkowania.</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade to fabrycznie upakowane kolumny XK przeznaczone do wysokorozdzielczej preparatywnej chromatografii filtracyjnej żelowej.</td></tr><tr><td>24-dołkowa "duża" płytka krystalizacyjna z siedzącą kroplą</td><td>MiTeGen</td><td>XQ-P-24S-A</td><td>24-dołkowa "duża" płytka krystalizacyjna jest używana głównie do przesiewania kryształów białek za pomocą technik dyfuzji pary w pozycji siedzącej oraz do optymalizacji warunków krystalizacji. Ma dość dużą studnię zbiornika i pojemnik na próbki, które sprzyjają ręcznej obsłudze i wzrostowi dużych kryształów białka. Ponadto jego płaskie powierzchnie można łatwo uszczelnić przezroczystą taśmą lub szkiełkami nakrywkowymi.</td></tr><tr><td>Test wstępnej krystalizacji PCT</td><td>Hampton</td><td>HR2-140</td><td>Test wstępnej krystalizacji PCT służy do określenia odpowiedniego stężenia białka do badania przesiewowego krystalizacji.</td></tr><tr><td>96 dołków CrystalQuick</td><td>Greiner bio-one</td><td>6098xx</td><td>Płytki kwadratowe posiadają trzy dołki krystalizacyjne na zbiornik, co umożliwia badanie 288 próbek na płytkę. Zazwyczaj używane tylko do wstępnego przesiewania, ponieważ ich kwadratowa krawędź utrudnia łowienie kryształów.</td></tr><tr><td>Uni-Puck</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-601</td><td>Universal V1-Puck (Uni-puck) to pojemnik do przechowywania i transportu próbek do użytku z większością zautomatyzowanych systemów mocowania próbek na całym świecie - obejmuje między innymi systemy ACTOR, SAM i CATS (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI i w całym USA)</td></tr><tr><td>Standardowa pianka Dewar</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-35</td><td>Średnica 5,7" i głębokość 2,8" Pojemność 800 ml.</td></tr><tr><td>Zamontowany CryoLoop - 20 mikronów</td><td>Hampton</td><td>HR4-955</td><td>Zamontowane pętle CryoLoop z nylonem o średnicy 20 mikronów. Te nylonowe pętle są połączone z pustymi mikrorurkami ze stali nierdzewnej i handlem; które są używane do montażu, zamrażania i zabezpieczania kryształu podczas procedur kriokrystalograficznych i zbierania danych rentgenowskich. Istnieją różne rozmiary i można je dostosować pod względem długości. Są to dość wszechstronne narzędzia.</td></tr><tr><td>CryoWand</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-411</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie do ładowania Puck Dewar</td><td>Wymiary molekularne</td><td>MD7-607</td><td>To narzędzie służy do oddzielania krążków uni-pucks w celu załadowania ich do robota dewara. Składa się z dwóch części: części rurki teflonowej i części z metalowego pręta.</td></tr></tbody></table>

charakterystyka biochemiczna i strukturalna białka wiążącego substrat transportu węglowodanów sp0092

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Opracowanie nowych środków przeciwdrobnoustrojowych i szczepionek przeciwko Streptococcus pneumoniae (pneumokokom) jest konieczne, aby zatrzymać szybki wzrost liczby wielu opornych szczepów. Białka wiążące substraty węglowodanowe (SBP) stanowią realne cele dla rozwoju szczepionek opartych na białkach i nowych środków przeciwdrobnoustrojowych ze względu na ich lokalizację zewnątrzkomórkową i kluczowe znaczenie importu węglowodanów dla metabolizmu pneumokoków. Opisano tutaj zracjonalizowany, zintegrowany protokół do przeprowadzenia kompleksowej charakterystyki SP0092, który można rozszerzyć na inne węglowodany SBP z pneumokoków i innych bakterii. Procedura ta może pomóc w projektowaniu inhibitorów tej klasy białek w oparciu o strukturę. W pierwszej części tego manuskryptu przedstawiono protokoły analizy biochemicznej za pomocą testu przesunięcia termicznego, wielokątowego rozpraszania światła (MALS) i chromatografii wykluczania wielkości (SEC), które optymalizują stabilność i jednorodność próbki kierowanej do prób krystalizacji, a tym samym zwiększają prawdopodobieństwo sukcesu. Druga część tej procedury opisuje charakterystykę kryształów SBP przy użyciu synchrotronowej linii badawczej o anomalnej dyfrakcji o regulowanej długości fali oraz protokoły gromadzenia danych do pomiaru danych, które można wykorzystać do rozdzielenia skrystalizowanej struktury białka.

Udowodniono, że ten zintegrowany protokół przyniósł sukces w przypadku czterech (dwóch opublikowanych i dwóch nieopublikowanych struktur) z sześciu analizowanych do tej pory białek wiążących węglowodany pochodzących z pneumokoków32,53. W tej sekcji przedstawiamy charakterystykę biochemiczną i strukturalną SP0092 jako reprezentatywny wynik, który ma służyć za wskazówkę w badaniach strukturalnych białek SBP w ogóle.
Po ekspresji i oczyszczeniu białka SBP SP0092 zgodnie z wcześniej opisaną procedurą32, oczyszczone białko poddano analizie stabilności buforowej przy użyciu testu przesunięcia termicznego: SP0092 wykazuje zwiększoną wartość Tm przy pH 6.5 i w obecności NaCl w zakresie stężeń 0 - 0.2 M (Rysunek 3A). W związku z tym, jako roztwór buforowy do kolejnych etapów określono: 0.02 M MES pH 6.5, 0.2 M NaCl, 2.5% (v/v) glicerolu, 0.5 mM TCEP. Bezwzględna masa molowa różnych stanów oligomeryzacji SP0092 została zmierzona za pomocą MALS sprzężonego z SEC, co pozwoliło wyznaczyć masy cząsteczkowe wynoszące odpowiednio 187.2, 140.8, 97.0 i 49.4 kDa, co odpowiada formom tetramerycznej, trymerycznej, dimerycznej i monomerycznej (Rysunek 3B). Analiza profilu SEC przy różnych rozcieńczeniach białka wykazała, że oligomeryzacja jest indukowana przez zwiększenie stężenia białka, co sugeruje, że większe oligomery są bardziej stabilne przy stężeniach wyższych niż te zazwyczaj stosowane w krystalizacji. Rzeczywiście, oczyszczone większe formy oligomeryczne poddane próbom krystalizacji z powodzeniem doprowadziły do powstania kryształów białka, podczas gdy forma monomeryczna nie wykazała takiej zdolności.
Zoptymalizowane kryształy uzyskane z natywnych oraz znakowanych Se-metioniną form SP0092 poddano charakterystyce metodą dyfrakcji rentgenowskiej. Pomiar fluorescencji rentgenowskiej tych kryształów wykazał w obu przypadkach piki emisyjne dla Zn związanego z białkiem, natomiast Se wykryto jedynie w kryształach z Se-metioniną, zgodnie z oczekiwaniami. Następnie przeprowadzono skanowania absorpcji promieniowania rentgenowskiego na krawędziach Se i Zn, co dostarczyło bezpośrednich danych eksperymentalnych do dostrojenia długości fali promieniowania rentgenowskiego do odpowiednich krawędzi absorpcji Zn lub Se obecnych w kryształach, aby zmaksymalizować sygnał anomalny uzyskiwany z wynikowych danych (Rysunek 4A-B).
Po zmierzeniu trzech obrazów dyfrakcyjnych przy niskiej transmisji, kompletny zestaw danych anomalnych uzyskano, stosując strategię zbierania danych zasugerowaną przez EDNA (Rysunek 4C). Obecny sygnał anomalny uruchamia zautomatyzowany potok fazowania w linii wiązki w celu wyznaczenia podstruktury, a następnie, w oparciu o otrzymane wstępne fazy eksperymentalne, generuje wstępne mapy i modele, które mogą być następnie rafinowane i walidowane (Rysunek 4D).
Podsumowując, potencjalne problemy związane z tą techniką koncentrują się przede wszystkim na dostępności i jakości kryształów. Optymalizacja składu buforu w celu poprawy stabilności białka, a także identyfikacja najodpowiedniejszego stanu oligomerycznego białka do wykorzystania (w przypadku wykrycia w roztworze więcej niż jednego oligomeru), mogą zmniejszyć ryzyko niepowodzenia na etapie krystalizacji. Wykorzystanie związanych jonów metali zidentyfikowanych na wczesnym etapie może przyspieszyć rozwiązanie struktury i pozwolić uniknąć niepotrzebnej produkcji białka znakowanego selenometioniną w sytuacji, gdy metody wymiany molekularnej okażą się nieskuteczne.
<img alt="Schemat charakterystyki biochemicznej i strukturalnej; analiza przesunięcia termicznego, SEC-MALS, analiza rentgenowska." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat procedury charakterystyki biochemicznej i strukturalnej węglowodanowych białek wiążących (SBP). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat układu spektroskopii fluorescencyjnej przedstawiający interfejs sterowania skanowaniem widma i gromadzeniem danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Charakterystyka kryształu w GDA. (A) Zrzut ekranu karty sterowania fluorescencją rentgenowską w oprogramowaniu sterującym linią wiązki GDA. (B) Zrzut ekranu karty sterowania skanowaniem krawędzi energii promieniowania rentgenowskiego w GDA. (C) Zrzut ekranu karty przesiewania kryształów do gromadzenia danych w GDA. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres 3D stabilności Thermofluor i chromatogram SEC; analiza wiązania liganda białka, wpływ pH." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Charakterystyka biochemiczna SP009239-491. (A) Wykres powierzchni 3D przedstawiający temperaturę topnienia SP009239-491 jako funkcję pH i stężenia NaCl w roztworze buforowym. (B) Wyniki SEC i MALS dla SP009239-491. Absorpcyjne przy 280 nm zaznaczono kolorem niebieskim. Masy molowe różnych stanów oligomeryzacji zaznaczono kolorem czerwonym. Panel (B) został zmodyfikowany na podstawie literatury32. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Widma fluorescencji rentgenowskiej i dane krystalograficzne struktury białka SP0092 z oznakowaniem atomami Zn i Se." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Charakterystyka strukturalna SP009239-491. (A) i (B) Skan energii absorpcji promieniowania rentgenowskiego przy krawędzi Zn i Se dla kryształów SP009239-491. Zmierzona fluorescencja z kryształów zawierających Zn i Se jest przedstawiona kolorem niebieskim i cyjanowym, a obliczone frakcje rozpraszania anomalnego f' i f" odpowiednio kolorem zielonym i czerwonym. (C) Przykłady dyfraktogramów rentgenowskich zebranych z kryształów SP009239-491. (D) Schematyczna reprezentacja struktury dimeru SP009239-491. Jeden protomer jest zabarwiony na biało, a drugi na purpurowo (pozostałości 39 - 366) i fioletowo (pozostałości 367 - 491), natomiast atomy rozpraszania anomalnego są przedstawione jako niebieskie i cyjanowe kule dla Zn i Se, odpowiednio. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >0.1 M kwas cytrynowy pH 4.0</td >
			<td >0.1 M kwas cytrynowy pH 4.5</td >
			<td >0.1 M bufor fosforanowy pH 5.0</td >
			<td >0.1 M cytrynian pH 5.5</td >
			<td >0.1 M Bis-tris pH 6</td >
			<td >0.1 M ADA pH 6.5</td >
			<td >0.1 M MOPS pH 7</td >
			<td >0.1 M HEPES pH 7.5</td >
			<td >0.1 M imidazol pH 8.0</td >
			<td >0.1 M Tris pH 8.5</td >
			<td >0.1 M CHES pH 9</td >
			<td >0.1 M CHES pH 9.5</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >NaCl 0 M</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >NaCl 0.1 M</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >NaCl 0.2 M</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >NaCl 0.5 M</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
			<td >40 μL</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1. Skład buforu dla analizy przesunięcia termicznego.

Przedstawiono uproszczony protokół do przeprowadzenia obszernej charakterystyki biochemicznej i strukturalnej białka wiążącego substrat węglowodanowy ze Streptococcus pneumoniae.

Charakterystyka biochemiczna i strukturalna białka wiążącego substrat transportu węglowodanów SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Ogólnym celem tej procedury jest biochemiczna i strukturalna charakterystyka białka wiążącego substrat węglowodanowy z Streptococcus pneumoniae. Metoda ta może pomóc w dostarczeniu kluczowych danych pomocnych w badaniach instruktażowych białek wiążących substrat, takich jak identyfikacja profili stabilności bufora, stanów oligomeryzacji i struktur atomowych. Zaletą tej procedury jest to, że dostarcza ona danych, które mogą zwiększyć wskaźnik sukcesu krystalizacji i roztworu strukturalnego dla białek wiążących substrat w solidny i prosty sposób.Najpierw przygotuj 48 roztworów buforowych o pH w zakresie od 4,0 do 9,5 i stężeniach chlorku sodu w zakresie od zera do 0,5 mola. Dozować 40 mikrolitrów każdego roztworu do 96-dołkowej płytki. Otrzymać oczyszczony roztwór wybranego białka wiążącego substrat.Dodaj pięć mikrolitrów roztworu SBP do każdej studzienki, aby uzyskać stężenie od jednego do dwóch miligramów na mililitr. Następnie dodaj pięć mikrolitrów 20-krotnie stężonej plamy fluorescencyjnej do każdej studzienki. Wymieszać roztwory, pipetując w górę i w dół.Uszczelnij płytkę przezroczystą folią samoprzylepną. Odwirować płytkę w temperaturze pokojowej 112 razy G przez dwie minuty. Skonfiguruj system PCR w czasie rzeczywistym, aby zwiększać temperaturę od czterech do 99 stopni Celsjusza z szybkością trzech stopni na minutę z 10-sekundowym czasem wstrzymania.Ustaw system tak, aby dokonywał odczytów fluorescencji co pół stopnia. Ustaw ustawienie filtra fluorescencyjnego. i przypisz próbki.Uruchom eksperyment i zidentyfikuj stan bufora z najwyższą temperaturą topnienia. Następnie należy przygotować bufor o wybranym pH i stężeniu chlorku sodu, który zawiera 2,5% objętości glicerolu i stężenie TCEP 0,5 milimola. Scharakteryzować oczyszczony SBP za pomocą analitycznej chromatografii wykluczającej wielkość z wielokątowym rozpraszaniem światła.Zidentyfikuj najbardziej stabilne gatunki odpowiednie do krystalizacji i użyj przygotowawczego SEC, aby uzyskać czyste frakcje tych gatunków. Wykonaj testy wstępnej krystalizacji, aby określić optymalne stężenie białka do krystalizacji. Użyj zrobotyzowanego systemu krystalizacji, aby dozować pożądane komercyjne roztwory krystalizacji do zbiorników roztworów optycznej 96-dołkowej płytki kroplowej.Następnie użyj systemu, aby dozować 100 nanolitrów roztworu białka do każdej kropli krystalizacji. Przenieś 100 nanolitrów każdego roztworu krystalizacyjnego ze studzienek zbiornika do odpowiednich kropli studzienki. Uszczelnij płytkę optyczną folią samoprzylepną.Użyj mikroskopu lub zautomatyzowanego systemu obrazowania, aby ocenić tworzenie się i wzrost kryształów co jeden do dwóch dni przez dwa tygodnie, a następnie raz w tygodniu. Gdy uformują się wystarczająco duże i dobrze ukształtowane kryształy, należy przygotować partię roztworu krystalizacyjnego z dodatkowymi 25% objętości glicerolu, aby służyła jako krioprotektant. Następnie napełnij piankę dewara ciekłym azotem.Zanurzyć komorę na próbkę unipuck w ciekłym azocie i pozostawić komorę do ostygnięcia. Następnie wytnij film na kropli zawierającej interesujący nas kryształ. Umieść 0,5 mikrolitra krioprotektantu na szkiełku przykrywającym w pobliżu kropli lub w pustej komorze kroplowej o tym samym stanie, jeśli jest dostępna.Przymocuj do różdżki magnetycznej kriopętlę zamontowaną na standardowej podstawie SPINE. Użyj kriopętli, aby przenieść interesujący kryształ do kropli krioprotektantu. Następnie za pomocą kriopętli przenieś kryształ z krioprotektantu do pierwszej pustej pozycji zanurzonej obudowy próbki unipuck.Powtórz ten proces, aby zebrać dodatkowe kryształy. Po załadowaniu wszystkich interesujących kryształów do obudowy próbki, użyj różdżki krążkowej, aby umieścić płytę podstawy unipuck na obudowie. Przetransportować krążek w ciekłym azocie na linię badawczą.Użyj szczypiec kriogenicznych i narzędzia do ładowania krążka Dewara, aby załadować krążek do zmieniacza próbek Dewara na linii badawczej i odłączyć obudowę próbki. Następnie wybieramy próbkę w oprogramowaniu linii badawczej, aby załadować i automatycznie wyśrodkować próbkę w wiązce promieniowania rentgenowskiego. Uzyskaj widmo fluorescencji rentgenowskiej i zidentyfikuj wszelkie pierwiastki, które można wykorzystać w eksperymencie dyfrakcji anomalnej.Określ optymalną długość fali do zbierania anomalnych danych dyfrakcyjnych, wykonując skanowanie energii krawędzi absorpcji promieniowania rentgenowskiego. Następnie uzyskaj trzy wzory dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego w odstępach 45 stopni w standardowym trybie oscylacji, aby automatycznie określić parametry komórki cząsteczkowej kryształu, symetrię i granicę dyfrakcji. Zaimportuj zalecane parametry zbierania danych do oprogramowania linii badawczej i uruchom eksperyment dyfrakcji anomalnej na jednej lub wielu długościach fali, w zależności od potrzeb.Oceniono stabilność białka wiążącego substrat SP0092 w różnych soli w celu zidentyfikowania optymalnego roztworu buforowego. Najwyższe temperatury topnienia stwierdzono dla o pH 6,5 i stężeniach chlorku sodu w zakresie od zera do 0,2 mola. Do zabiegu wybrano bufor o pH 6,5 i stężeniu chlorku sodu 0,2 mola.Różne stany oligomeryzacji SP0092 zostały zidentyfikowane i oddzielone za pomocą SEC-MALS. Analiza profilu SEC przy różnych stężeniach białek wykazała, że zwiększone stężenie białka wyzwala oligomeryzację, co sugeruje, że większe oligomery są bardziej stabilne przy wysokich stężeniach. Zgodnie z tym, duże oligomery wytwarzały kryształy w próbach krystalizacji, podczas gdy monomer nie.Fluorescencja rentgenowska zarówno natywnych, jak i znakowanych selenometioniną kryształów SP0092 wykazała związany z białkiem w obu formach. Anomalny sygnał został zmaksymalizowany poprzez dostrojenie padającej długości fali promieniowania rentgenowskiego do krawędzi absorpcji promieniowania rentgenowskiego lub selenu. Następnie uzyskano kompletny zestaw danych anomalnych, a automatyczna analiza wywołana obecnością anomalnego sygnału wygenerowała wstępne mapy struktur białkowych.Modele wbudowane w te początkowe mapy zostały następnie dopracowane i zweryfikowane w celu uzyskania ostatecznych modeli. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić kompleksową charakterystykę strukturalną białka wiążącego substrat lub dowolnego potencjalnego celu białkowego. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku opracowania nowych metod leczenia choroby mirokokowej, ponieważ dostarcza ona fundamentalnych informacji na temat projektowania inhibitorów dla tej klasy białek w oparciu o strukturę.Metody te mogą być również stosowane do białek wiążących substraty z innych organizmów i potencjalnie mogą być stosowane do każdego rodzaju białka.

biochemical-structural-characterization-carbohydrate-transport

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano podejście biochemiczne do identyfikacji in vivo interakcji białko-białko (PPI) białek błonowych. Metoda łączy w sobie sieciowanie białek, oczyszczanie powinowactwa i spektrometrię mas i można ją dostosować do prawie każdego typu komórki lub organizmu. Dzięki takiemu podejściu możliwa staje się nawet identyfikacja przejściowych IPP.

Membrane-SPINE: narzędzie biochemiczne do identyfikacji interakcji białko-białko białek błonowych in vivo

Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) to bezznacznikowa metoda wykrywania interakcji biomolekularnych w czasie rzeczywistym. W niniejszym artykule opisano protokół eksperymentu interakcji białko błona / receptor, omawiając jednocześnie zalety i wady tej techniki.

Pomiary w czasie rzeczywistym interakcji białko-receptor błonowy przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)

Prezentujemy zautomatyzowaną, modułową, wysokoprzepustową metodę identyfikacji i charakterystyki mikrobiologicznych egzopolisacharydów w małej skali. Metoda ta łączy szybką preselekcję w celu analizy całkowitej ilości wydzielanych polisacharydów ze szczegółowym odciskiem palca węglowodanów, aby umożliwić szybkie badanie przesiewowe nowo wyizolowanych szczepów bakteryjnych lub całych kolekcji szczepów.

Zautomatyzowana, modułowa, wysokowydajna platforma przesiewowa egzopolisacharydów w połączeniu z bardzo czułą analizą odcisków palców węglowodanów

Prezentujemy podejścia do biofizycznej i strukturalnej charakterystyki glikoprotein z fałdowaniem immunoglobulin za pomocą interferometrii biowarstwowej, izotermicznej kalorymetrii miareczkowej i krystalografii rentgenowskiej.

Charakterystyka glikoprotein z fałdem immunoglobulinowym za pomocą krystalografii rentgenowskiej i technik biofizycznych

Opisujemy metodę charakterystyki transporterów błonowych napędzanych protonami w preparatach pęcherzyków błonowych wytwarzanych przez heterologiczną ekspresję w E. coli i lizę komórek za pomocą prasy francuskiej.

Charakterystyka transporterów błonowych przez ekspresję heterologiczną u E. coli i wytwarzanie pęcherzyków błonowych

Przedstawiony tutaj protokół ma na celu zademonstrowanie występowania heterologicznych interakcji między białkami błonowymi typu III rezydującymi w Golgiego z cytoplazmatycznie eksponowanymi N- i/lub C-końcami w żywych komórkach ssaków przy użyciu najnowszego wariantu testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy.

Demonstracja kompleksów heterologicznych utworzonych przez białka błonowe typu III rezydujące w Golgiego przy użyciu testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy

Otwarte wyszukiwanie umożliwia identyfikację glikopeptydów ozdobionych nieznanymi wcześniej kompozycjami glikanów. W tym artykule przedstawiono uproszczone podejście do podejmowania otwartych poszukiwań i późniejszych poszukiwań glikopeptydów skoncentrowanych na glikanie dla próbek bakteryjnych na przykładzie Acinetobacter baumannii.

Zastosowanie otwartych podejść opartych na poszukiwaniach do identyfikacji glikopeptydów Acinetobacter baumannii sprzężonych z O

Obecny protokół opisuje nowe narzędzia do testowania wiązania SPR do badania wiązania CV-N z HA, glikoproteiną S, pokrewnymi glikanami typu hybrydowego i oligosacharydami o wysokiej zawartości mannozy. SPR służy do oznaczaniaK D do wiązania dimerycznego lub monomerycznego CV-N z tymi glikanami.

Inżynieria środków przeciwwirusowych za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Ta metoda opisuje test sedymentacji in vitro oparty na lektynie, który pozwala określić ilościowo powinowactwo wiązania fosfatazy glukanowej i amylopektyny. Ten test kosedymentacji jest niezawodny w pomiarze wiązania substratu fosfatazy glukanowej i może być stosowany do różnych rozpuszczonych substratów glukanu.

Test sedymentacyjny na bazie konkanawaliny A do pomiaru wiązania substratów fosfataz glukanu

Ostatnie badania podkreślają rolę enzymów mikroflory jelitowej człowieka w metabolizowaniu glikozydów C. W tym miejscu przedstawiamy kompleksową metodologię integrującą techniki chemii analitycznej (LC-MS/MS i NMR) z podejściami biologii strukturalnej w celu systematycznego charakteryzowania strukturalnych i enzymatycznych łańcuchów reakcji tych enzymów metabolizujących glikozydy C.

Podejścia biologii strukturalnej i chemii analitycznej do charakteryzowania enzymów metabolicznych glikozydu C w mikrobiocie jelitowej człowieka

Ten protokół oparty na NMR bada słabe interakcje białko-glikan przy użyciu cyjanowiryny-N i D-mannozy. Łącząc metody wykrywania ligandów i białek, mapuje miejsca wiązania, wykrywa efekty allosteryczne i identyfikuje kompleksy spotkań. Podejście to obejmuje przygotowanie próbek i analizę danych, oferując strukturalne i dynamiczne spostrzeżenia cenne dla mechanizmów diagnostyki i rozpoznawania specyficznych dla glikanów.

Badanie interakcji białko-glikan: postępy w magnetycznym rezonansie jądrowym

Poznaj metodę charakteryzacji biochemicznej i strukturalnej białka wiążącego substrat SP0092 z Streptococcus pneumoniae. Protokół obejmuje optymalizację buforów, analizę oligomeryzacji SEC-MALS oraz krystalografię rentgenowską.

Charakterystyka biochemiczna i strukturalna białka wiążącego substrat transportu węglowodanów SP0092

Przeglądaj więcej filmów