Obrazowanie aktywności neuronalnej w pierwotnej korze somatosensorycznej przy użyciu transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s
January 7th, 2019
Opisujemy eksperymentalną procedurę pomiaru aktywności neuronalnej za pomocą podwójnych okien optycznych nad obustronnymi głównymi korami somatosensorycznymi (S1) u transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s przy użyciu mikroskopii 2-fotonowej (2P) in vivo.
Metoda ta umożliwia rejestrację i kwantyfikację aktywności neuronalnej w obustronnych obszarach kory mózgowej myszy przez dłuższy czas in vivo. Technika dwóch fotonów ma tę zaletę, że wykrywa aktywność jednocześnie w dużej lub rozproszonej populacji neuronów przez dłuższy czas. Implikacje tej techniki rozszerzyły się w kierunku badania wzorców aktywności w określonych populacjach neuronów w różnych regionach żywego mózgu.
Na 12 godzin przed rozpoczęciem zabiegu należy ogrzać szyby optyczne w temperaturze 50 stopni Celsjusza w 70% etanolu. Okienko optyczne składa się z okrągłej górnej pokrywy o średnicy pięciu milimetrów i dolnej części zawierającej okrągłe szkło osłonowe o średnicy trzech milimetrów. Pod koniec inkubacji rozgrzewającej potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi znieczulonej 20 do 25-gramowej 1 1/2 do 2 1/2 miesięcznej myszy Thy1 GCaMP6s i nałóż maść na oczy zwierzęcia.
Umieść mysz na poduszce grzewczej pokrytej sterylną zasłoną i użyj adaptera do trzymania głowy dla myszy, aby ustabilizować głowę. Ogol większość skóry głowy maszynką do golenia z dwoma krawędziami, a odsłoniętą skórę oczyść sekwencyjnie sterylnymi wacikami nasączonymi alkoholem i peelingami z roztworem jodonu powidonu. Następnie użyj nożyczek, aby wykonać prostokątne nacięcie na skórę głowy o wymiarach dwa na trzy milimetry po prawej stronie czaszki.
Za pomocą bawełnianego wacika odepchnij skórę na bok, aby utworzyć obszar ekspozycji o średnicy większej niż trzy milimetry, a następnie użyj ostrza mikrochirurgicznego, aby delikatnie usunąć tkankę łączną przyczepioną do czaszki. Za pomocą wiertła dentystycznego delikatnie zaznacz okrąg o średnicy trzech milimetrów wokół obszaru S1. Po wykonaniu podobnego okręgu po lewej stronie czaszki, nałóż cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego po obu stronach kości, aby zapewnić podstawę do nałożenia cementu dentystycznego.
Pod mikroskopem preparacyjnym użyj szybkoobrotowego mikrowiertła, aby rozrzedzić okrągły rowek po prawej stronie czaszki wokół obszaru S1, aby uzyskać gładką krawędź, w razie potrzeby zasysając resztki kości za pomocą podciśnienia. Po osiągnięciu około 2/3 głębokości kości, powoli i ostrożnie rozrzedź pozostałą 1/3 kości, aż okrągły płat kostny zostanie całkowicie uwolniony od otaczającej czaszki. Użyj pary kleszczy 5/45, aby powoli i ostrożnie usunąć okrągły kawałek kości, aby odsłonić oponę twardą, uważając, aby nie uszkodzić naczyń włosowych.
Po usunięciu płata kostnego z lewej strony czaszki w ten sam sposób, przepłucz okienko optyczne prawej strony czaszki sterylnym roztworem soli fizjologicznej i sprawdź, czy nie ma niedoskonałości pod mikroskopem stereoskopowym. Zamontuj okienko optyczne nad obszarem kraniotomii, tak aby górna część okienka spoczywała na czaszce, a dolna część w otworze kraniotomicznym, spoczywała na oponie twardej, w obecności płynu mózgowo-rdzeniowego. Użyj kleju superglue cyjanoakrylowego, aby uszczelnić górną część krawędzi okna optycznego do czaszki.
Gdy klej wyschnie, nałóż cement dentystyczny na krawędź szkła, resztę prawej strony odsłoniętej czaszki i brzegi rany, aby zablokować światło. Następnie zainstaluj lewe okienko optyczne i pozwól zwierzęciu dojść do siebie z monitorowaniem aż do pełnego opadnięcia. Siedem do 10 dni po zabiegu umieść znieczulone zwierzę w adapterze do trzymania głowy na poduszce grzewczej pod mikroskopem dwufotonowym, uważając, aby okienko optyczne i prawa strona czaszki były ustawione prostopadle do osi optycznej mikroskopu.
Uzyskaj wstępny obraz mapy referencyjnej okna czaszki przy użyciu oświetlenia jasnego pola przy czterokrotnym powiększeniu. Po uzyskaniu wielu obrazów tego samego obszaru zainteresowania, zobrazuj dynamikę wapnia w obszarze S1 w lewej półkuli i oblicz zmiany fluorescencji z każdego obszaru zainteresowania po obu stronach czaszki. Na tych reprezentatywnych obrazach dendryty i naczynie krwionośne u myszy z ekspresją EGFP zostały uwidocznione na różnych głębokościach w drugiej warstwie regionu S1 dzień po zainstalowaniu okna optycznego.
Obrazy z projekcją Z zostały wykonane w pierwszym i siódmym dniu po implantacji okna optycznego, ilustrując niezwykle stabilną liczbę i lokalizację gałęzi dendrytycznych i kolców w okresie eksperymentalnym. Pomiar wewnątrzkomórkowego przejściowego wapnia u transgenicznych myszy Thy1 GCaMP6s pozwala na ilościowe określenie spontanicznej aktywności wapnia i populacji neuronów piramidowych warstwy piątej znajdujących się na głębokości większej niż 500 mikrometrów poniżej pia, a także obliczenie średniej liczby spontanicznych odpowiedzi w czasie. Badacz przeszkolony zarówno w zakresie przygotowania okna czaszkowego, jak i technik obrazowania dwufotonowego wapnia in vivo, powinien być w stanie uzyskać zapisy od 100 do 200 neuronów po obu stronach czaszki u jednego do dwóch zwierząt dziennie.
Dzięki otwartemu oknu optycznemu po obu stronach czaszki, metoda umożliwia rejestrowanie aktywności neuronalnej w symetrycznych obszarach mózgu ssaków w celu przedłużonego i stabilnego obrazowania wapnia in vivo. Metoda ta może być również stosowana do badania aktywności i plastyczności kory mózgowej po jednostronnym uszkodzeniu obwodowego lub ośrodkowego układu nerwowego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zainstalować obustronne okna czaszkowe do pomiaru dynamiki wapnia za pomocą mikroskopu dwufotonowego u transgenicznych myszy Thy1 GCaMP6s.
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę pomiaru aktywności neuronalnej u transgennych myszy Thy1-GCaMP6s z wykorzystaniem podwójnych okien optycznych i mikroskopii dwufotonowej. Technika ta pozwala na długotrwałe rejestracje aktywności neuronalnej w obustronnych pierwotnych korowo-czuciowych korach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Neuroobrazowanie
- Wizualizacja wapnia
Tło
- Mikroskopia dwufotonowa umożliwia jednoczesne wykrywanie aktywności w dużych populacjach neuronów.
- Metoda jest przydatna do badania wzorców aktywności w określonych populacjach neuronów.
- Myszy Thy1-GCaMP6s są używane do wizualizacji dynamiki wapnia w neuronach.
- Techniki rejestracji mogą być stosowane do oceny aktywności korowej po urazach.
Cel badania
- Zapewnienie szczegółowego protokołu instalacji okien czaszkowych do obrazowania in vivo.
- Umożliwienie ilościowej oceny spontanicznej aktywności wapnia w neuronach korowych.
- Ułatwienie badania dynamiki neuronalnej w żywym tkance mózgowej.
Zastosowanie metod
- Przygotowanie okien optycznych i procedury chirurgiczne dla kraniotomii.
- Instalacja okien optycznych nad pierwotnym korowo-czuciowym korą.
- Mikroskopia dwufotonowa do obrazowania dynamiki wapnia.
- Analiza zmian fluorescencji do ilościowej oceny aktywności neuronalnej.
Główne wyniki
- Stabilne obrazowanie gałęzi dendrytycznych i kolców w czasie.
- Możliwość rejestracji od 100 do 200 neuronów dziennie.
- Ilościowa ocena przejściowych stężeń wapnia wewnątrzkomórkowego w neuronach pięciowarstwowych kory.
- Metoda stosowana do badania plastyczności korowej po urazie.
Wnioski
- Metoda podwójnego okna optycznego pozwala na skuteczne obrazowanie wapnia in vivo.
- Ta technika zwiększa zrozumienie aktywności neuronalnej w korze.
- Dostarcza cennego narzędzia do badania funkcji i plastyczności mózgu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables prolonged, stable in vivo imaging of neural activity across symmetric brain regions, supporting target validation in neuroscience drug discovery. By quantifying calcium dynamics in defined neuronal populations, it provides mechanistic de-risking for CNS-targeted therapeutics. The bilateral imaging capability enhances predictive confidence in pathway modulation studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring spontaneous calcium activity in layer five pyramidal neurons.
- Operational Value: Supports functional target validation through stable imaging of dendritic structures over 7 days.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by quantifying intracellular calcium transients in deep cortical neurons (>500 µm).
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for compound evaluation via dual optical window implantation.
- Quantitative Output: Enables fluorescence change calculations from regions of interest for activity quantification.
- Scalability: Allows recording of 100–200 neurons per side per day in 1–2 animals.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to studying cortical activity and plasticity after unilateral peripheral or central nervous system injury.
- Translational Continuity: Connects discovery imaging to preclinical validation of neuronal dynamics in living brain tissue.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports advancement decisions by stabilizing imaging of dendritic branches and spines over time.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology through hypothesis testing and pathway clarification in symmetric cortical regions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling quantification of neural activity in bilateral S1 regions.
- Screening: Delivers assay readiness via stable calcium imaging windows for prolonged in vivo recordings.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence measurements to compare conditions across hemispheres.
- Translational Research: Connects to preclinical work by enabling post-injury cortical plasticity studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal neural activity monitoring across studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target engagement through quantification of spontaneous calcium activity.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via stabilized dendritic imaging over experimental periods.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk by enabling mechanistic de-risking of CNS targets.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via longitudinal neural activity tracking in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cranial window preparation and in vivo two-photon calcium imaging.
- Needs instrumentation for two-photon microscopy and surgical tools for bilateral craniotomy.
- Demands cross-team standardization for optical window installation and fluorescence analysis.
- Involves adaptation considerations when applying to other brain regions beyond S1.
- Limited by the need for postoperative recovery period (7–10 days) before imaging.
