Name: Bezprzewodowy, dwukierunkowy interfejs do rejestrowania in vivo i stymulacji aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Poznaj bezprzewodowy, dwukierunkowy system do rejestracji i stymulacji neuronalnej u swobodnie poruszających się szczurów. Ta metoda umożliwia badanie związków przyczynowych między aktywnością mózgu a zachowaniem w neurobiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została wsparta grantem badawczym z Niemieckiej Federacji Stowarzyszeń Badań Przemysłowych (AiF; numer grantu: KF2780403JL3).

Wszystkie protokoły i eksperymenty były zgodne z aktualnymi wytycznymi europejskimi (2010/63/UE) i zatwierdzone przez władze regionalne (Regierungspräsidium Gießen, MR 20/35 Nr.25/2015).
1. Zwierzęta
<ol>
	<li>Dorosłe szczury Wistar (200-250 g) w grupach po 3-4 osoby w standardowych warunkach laboratoryjnych przez co najmniej tydzień przed operacją, aby umożliwić aklimatyzację.</li>
	<li>Dwa dni po zabiegu szczury domowe w parach. Przykryj pojedyncze klatki wysokimi akrylowymi pokrywami. Unikaj konwencjonalnych pokrywek wykonanych z metalowej siatki, ponieważ implanty mogą utknąć, zwiększając ryzyko, że z czasem ulegną uszkodzeniu i/lub stanie się niestabilne.</li>
</ol>
2. Chirurgia stereotaktyczna
<ol>
	<li>Przed przystąpieniem do zabiegu należy zorganizować i przygotować następujący sprzęt i materiały:
	<ol>
		<li>Zaopatrz się w sterylny sprzęt chirurgiczny składający się ze sterylnych nożyczek, kleszczyków z końcami, szpatułek, maszynek do strzyżenia chirurgicznego, wiertła dentystycznego i patyczków kosmetycznych. </li>
		<li>Zaopatrz się w leki i chemikalia, w tym izofluran, ksylokainę, chlorowodorek tramadolu, maść do oczu dexpantenolu, 3% nadtlenek wodoru, jod powidonu i 70% etanol.</li>
		<li>Uzyskaj materiał mocujący, w tym ze stali nierdzewnej, żywicę akrylową, klej ultrafioletowy i osłonę nasadki.</li>
		<li>Otrzymać zespół mikroelektrody, składający się z (i) pojedynczej elektrody rejestrującej (mikroelektroda platynowo-wolframowa w izolacji szkłem kwarcowym, ze stożkowym kształtem końcówki, średnica zewnętrzna: 80 μm, końcówka stożkowa, impedancja przy 1 kHz: 500 kOhm) lub tetrody (4-żyłowa mikroelektroda platynowo-wolframowa w izolacji szkłem kwarcowym, średnica zewnętrzna: 100 μm, końcówka stożkowa, impedancja przy 1 kHz: 500-800 kOhm); (ii) elektroda stymulująca (drut platynowo-irydowy (90% platyny, 10% irydu), średnica rdzenia 125 μm, średnica zewnętrzna 150 μm, impedancja <10 kOhm) podłączona do płytki stykowej oraz (iii) elektroda referencyjna z drutu platynowego (średnica trzonu, 100 μm; <silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Zaopatrzyć się w uchwyt elektrody przyklejony klejem rozpuszczalnym w wodzie do zespołu mikroelektrod i przetestowany pod kątem funkcjonalności co najmniej 2 godziny wcześniej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B).</li>
		<li>Uzyskaj konwencjonalny system na uwięzi składający się z przedwzmacniacza różnicowego, wzmacniacza głównego i wzmacniacza z filtrem pasmowo-przepustowym do nagrań.</li>
		<li>Zaopatrz się w dodatkowe materiały, takie jak rękawiczki, poduszka grzewcza, strzykawki i sól fizjologiczna.</li>
		<li>Zaopatrz się w klatki domowe (dł. x szer. x wys.: 42 cm x 26 cm x 38 cm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura 
	UWAGA: Wszczepienie elektrody wykonuje się podczas konwencjonalnej operacji stereotaktycznej w znieczuleniu izofluranowym.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że eksperymentator ma na sobie rękawiczki, maskę chirurgiczną i fartuch laboratoryjny.</li>
		<li>Rozpocznij znieczulenie, umieszczając zwierzę w komorze indukcyjnej (izofluran 4-5%, przepływ tlenu 1 l/min, czas trwania ~5 min).</li>
		<li>Przetestuj utratę odruchów (odruchy ogona i palców u stóp) za pomocą kleszczy, aby potwierdzić głębokie znieczulenie.</li>
		<li>Umieść głowę zwierzęcia w masce anestezjologicznej zamocowanej wokół górnego siekacza ramy stereotaktycznej i wyreguluj znieczulenie (izofluran 2-3%, przepływ tlenu 0,7-0,8 l/min).</li>
		<li>Zamocuj i wyrównaj głowę zwierzęcia w aparacie stereotaktycznym za pomocą nauszników i górnego siekacza.</li>
		<li>Ogolić pole operacyjne za pomocą maszynki do strzyżenia lub nożyczek i wysterylizować jodowidonem.</li>
		<li>Umieść zwierzę na poduszce grzewczej, aby zapobiec hipotermii i potraktuj oczy maścią do oczu dexpantenol, aby zapobiec ich wysuszeniu.</li>
		<li>Wstrzyknąć ksylokainę (0,3-0,4 ml, podskórnie, s.c.) w środek pola operacyjnego.</li>
		<li>Ponownie przetestuj pod kątem utraty refleksu.</li>
		<li>Wykonaj małe nacięcie (1,5 cm) skalpelem na środku pola operacyjnego, aby odsłonić czaszkę. Delikatnie oddziel skórę i usuń resztki tkanki za pomocą kleszczy, nożyczek i szpatułki.</li>
		<li>Ostrożnie oczyść czaszkę za pomocą wacików pokrytych nadtlenkiem wodoru.</li>
		<li>Wywierć 4-5 małych otworów (4,7 mm) w czaszce do zamocowania ze stali nierdzewnej.</li>
		<li>Podłącz zespół mikroelektrody/uchwyt elektrody do przedwzmacniacza i podłącz do stereotaktycznego mikromanipulatora (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B i 1C).</li>
		<li>Wywierć otwór (około 7 mm) w czaszce nad obszarem docelowym, używając współrzędnych z atlasu mózgu w zależności od użytego zwierzęcia. W niniejszym badaniu umieść końcówki elektrod skierowane do wzgórka dolnego, używając następujących współrzędnych, przy czym bregma służy jako odniesienie: przedni/tylny, −8,8 mm; przyśrodkowa/boczna, 1,5 mm; i grzbietowo-brzuszny, 3,5 mm<klasa SUP="xref">14.</li>
		<li>Wchłonąć krew za pomocą wacików.</li>
		<li>Wprowadź pionowo jednostkę mikroelektrod, aż końcówki elektrod dotrą do obszaru docelowego.</li>
		<li>Umieść uziemiający wzdłuż ze stali nierdzewnej i pod skórą.</li>
		<li>Monitoruj aktywność spajków i ostrożnie dostosuj położenie elektrody za pomocą mikromanipulatora, aż dotrzesz do strefy aktywnych neuronów w strukturze docelowej i wykryj aktywność neuronalną ze stosunkiem sygnału do szumu odpowiednim do sortowania spajków.</li>
		<li>Przymocuj jednostkę mikroelektrody do czaszki za pomocą kleju ultrafioletowego i przykryj płytkę kontaktową i żywicą akrylową.</li>
		<li>Wstrzyknąć sól fizjologiczną (1 ml i.p.) i tramadol (25 mg/kg s.c.), aby zapobiec odwodnieniu i zapewnić pooperacyjne działanie przeciwbólowe.</li>
		<li>Odłącz zespół mikroelektrody od uchwytu elektrody za pomocą szczotki nasączonej wodą.</li>
		<li>Przerwij znieczulenie, ostrożnie usuń szczura z ramy stereotaktycznej. Odłącz przedwzmacniacz od zespołu mikroelektrod.</li>
		<li>Podłącz zabezpieczenie nasadki na wszczepionym zespole mikroelektrody i odłączaj go tylko podczas procedur eksperymentalnych.</li>
		<li>Trzymaj zwierzęta w parach w klatce domowej od drugiego dnia po zabiegu.</li>
		<li>Codziennie monitoruj zwierzęta pod kątem możliwego zakażenia rany, masy ciała, stanu zdrowia i ogólnego zachowania przez okres 7 dni po zabiegu. Po tym okresie rekonwalescencji należy przeprowadzić elektrofizjologię in vivo i eksperymenty behawioralne. 
		UWAGA: Zabieg chirurgiczny trwa od 60 do 90 minut. Podczas operacji odruchy machania ogonem muszą być stale monitorowane, a w razie potrzeby dostosowane znieczulenie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Elektrofizjologia in vivo
<ol>
	<li>Sprzęt i procedura 
	UWAGA: Zapisy elektrofizjologiczne i stymulacja wykonywane są za pomocą TWS.
	<ol>
		<li>Uzyskanie stopnia czołowego ze zintegrowanym przedwzmacniaczem i podłączoną baterią (cztery kanały nagrywania; zakres wejściowy nagrywania analogowego: 0-12 mV pk-pk; wyjście stymulacji: ±625 μA; dł. x szer. x wys.: 24 mm x 22 mm x 12 mm; waga: 6 g bez baterii, 12 g z baterią; czas pracy baterii do 1 godziny). Ten stopień głowicy nadaje się do bezpośredniego podłączenia do wszczepionego mikroelektrody za pomocą miniaturowego złącza wielobiegunowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
		<li>Zaopatrz się w baterię (akumulator litowo-jonowy, 3,7-4,2 V DC, 230 mAh, 27 mm x 20 mm x 6 mm, czas pracy 1 h) zamontowaną na górze stopnia głowicy (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). W razie potrzeby należy użyć zamiennego akumulatora o pojemności 450 mA przez około 2,5 godziny pracy. Upewnij się, że w głowicy zapala się zielone światło, gdy bateria jest do niego podłączona.</li>
		<li>Zaopatrz się w urządzenie nadawczo-odbiorcze (odbiornik-nadajnik) podłączone do komputera osobistego za pośrednictwem standardowego portu USB i umożliwiające bezprzewodową pracę na odległość do 5 m (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E).</li>
		<li>Zdobądź komputer osobisty z oprogramowaniem TWS do stymulacji elektrycznej i rejestracji aktywności neuronalnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3 i <silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
		<li>Zaopatrzyć się w przedwzmacniacz na uwięzi i system akwizycji danych używany podczas operacji (patrz ppkt 2.1.5) do nagrań oraz generator bodźców do stymulacji, w celu porównania skuteczności TWS u obudzonych szczurów tydzień po operacji. 
		UWAGA: Zapewniona jest stymulacja elektryczna, a aktywność zewnątrzkomórkowa pojedynczych neuronów jest rejestrowana z tej samej wszczepionej jednostki mikroelektrod przy użyciu obu systemów. Parametry stymulacji (natężenie prądu, puls i częstotliwość) powinny być dostosowane do każdego zwierzęcia w zależności od docelowego obszaru mózgu. W niniejszym badaniu do stymulacji wzgórka dolnego użyto prądu o natężeniu 150-250 μA, 2500 Hz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Testy behawioralne 
	UWAGA: Gdy między transceiverem a stopniem głowy zwierzęcia nie zostanie wprowadzona metalowa bariera, TWS ma zastosowanie do szerokiego zestawu zadań behawioralnych. Jako przykładowe testy behawioralne zostały użyte w otwartym polu do pomiaru ogólnej aktywności behawioralnej oraz na labiryncie elevated plus, standardowym teście do oceny zachowań podobnych do lęku u gryzoni15. Kamera wideo została umieszczona centralnie nad otwartym polem i podniesiona wraz z labiryntem do nagrań behawioralnych.
	<ol>
		<li>Przed testami behawioralnymi należy obchodzić się z każdym zwierzęciem przez trzy kolejne dni (5 minut każdego dnia). Przed każdym okresem obsługi podłącz stopień głowy z baterią do wcześniej wszczepionej jednostki mikroelektrody. Nie wykonuj żadnych zapisów ani stymulacji podczas obsługi.</li>
		<li>Otwarte pole
		<ol>
			<li>Umieść szczura na środku otwartego pola (40 cm x 40 cm x 40 cm; czerwone światło ~30 luksów) i pozwól mu badać aparaturę przez co najmniej 5 minut pod zapisem neuronalnym.</li>
			<li>Określ próg ucieczki - minimalne natężenie prądu powodujące bieganie lub skakanie. W niniejszym badaniu należy dostarczyć stymulację o wysokiej częstotliwości 2500 Hz (szerokość impulsu: 100 μs; interwał impulsów: 100 μs) do dolnego wzgórka w odstępach 1-minutowych, zwiększając intensywność prądu o 20-50 μA krokach, aż szczury wykażą zachowanie ucieczki.</li>
			<li>Umieść szczura z powrotem w klatce domowej, oczyść otwarte pole (0,1% roztwór kwasu octowego) i wysusz je. 
			UWAGA: W celu porównania skuteczności stymulacji TWS z tradycyjnym systemem na uwięzi, opisana powyżej procedura została wykonana przy użyciu obu systemów.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Podwyższony plus labirynt 
		UWAGA: Labirynt plus używany w tych eksperymentach był wykonany z szarego akrylu i składał się z dwóch otwartych ramion (50 cm długości x 10 cm szerokości) i dwóch zamkniętych ramion (50 cm długości x 10 cm szerokości, ze ścianami o wysokości 40 cm), które rozciągały się z centralnej platformy wyniesionej 50 cm nad podłogą16.
		<ol>
			<li>Umieść szczura w środku labiryntu plus, skierowany w stronę otwartego ramienia i pozwól mu swobodnie eksplorować aparaturę pod ciągłym nagrywaniem przez 5 minut.</li>
			<li>Zapisz liczbę wejść oraz czas spędzony w otwartych i zamkniętych ramionach w ciągu 5 minut.</li>
			<li>Umieść szczura z powrotem w jego klatce domowej, wyczyść (0,1% roztwór kwasu octowego) i osusz labirynt przed każdym testem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Perfuzja i histologia
		<ol>
			<li>Znieczulić szczura ksylazyną/ketaminą (odpowiednio 150 mg/kg i 100 mg/kg).</li>
			<li>Podłącz wszczepiony moduł elektrody do stymacyjnego i zastosuj stymulację elektryczną (natężenie prądu 50 μA, szerokość impulsu: 100 μs; interwał impulsów: 100 μs) przez 90 s w celu wytworzenia niewielkiej zmiany wokół końcówki elektrody.</li>
			<li>Odłącz do stymulacji i przepuść zwierzę przez lewą komorę solą fizjologiczną, a następnie 200 ml 4% paraformaldehydu w 0,1 M buforze fosforanu sodu, pH 7,3 (szczegółowy opis patrz odniesienie17).</li>
			<li>Wyjąć mózg i zanurzyć go na 4 godziny w świeżym utrwalaczu w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Upewnij się, że temperatura głównej komory kriostatu wynosi -20 °C.</li>
			<li>Zamroź mózgi na suchym lodzie i pokrój je na szeregowe odcinki koronalne o wielkości 50 μm za pomocą kriostatu.</li>
			<li>Zabarwić sekcje kresylofioletem, aby zlokalizować pozycje końcówek elektrod, zgodnie z atlasem Paxinosa i Watsona14.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Rao, R. P., Mielke, F., Bobrov, E., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vocalization-whisking+coordination+and+multisensory+integration+of+social+signals+in+rat+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Vocalization-whisking coordination and multisensory integration of social signals in rat auditory cortex.</a> Elife. 3, e03185(2014).</li>
<li>Tseng, W. T., Yen, C. T., Tsai, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bundled+microwire+array+for+long-term+chronic+single-unit+recording+in+deep+brain+regions+of+behaving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A bundled microwire array for long-term chronic single-unit recording in deep brain regions of behaving rats.</a> J. Neurosci. Methods. 201 (2), 368-376 (2011).</li>
<li>Ball, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+scope%3A+a+user-configurable+digital+wireless+telemetry+system+for+freely+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rodent scope: a user-configurable digital wireless telemetry system for freely behaving animals.</a> PLoS One. 9 (2), e89949(2014).</li>
<li>Chien, C. N., Jaw, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniature+telemetry+system+for+the+recording+of+action+and+field+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniature telemetry system for the recording of action and field potentials.</a> J. Neurosci. Methods. 147 (1), 68-73 (2005).</li>
<li>Hawley, E. S., Hargreaves, E. L., Kubie, J. L., Rivard, B., Muller, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telemetry+system+for+reliable+recording+of+action+potentials+from+freely+moving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Telemetry system for reliable recording of action potentials from freely moving rats.</a> Hippocampus. 12 (4), 505-513 (2002).</li>
<li>Alam, M., Chen, X., Fernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost+multichannel+wireless+neural+stimulation+system+for+freely+roaming+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Eng%22%5BJournal%5D)">A low-cost multichannel wireless neural stimulation system for freely roaming animals.</a> J. Neural. Eng. 10 (6), 066010(2013).</li>
<li>Xu, S., Talwar, S. K., Hawley, E. S., Li, L., Chapin, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-channel+telemetry+system+for+brain+microstimulation+in+freely+roaming+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A multi-channel telemetry system for brain microstimulation in freely roaming animals.</a> J. Neurosci Methods. 133 (1-2), 57-63 (2004).</li>
<li>Angotzi, G. N., Boi, F., Zordan, S., Bonfanti, A., Vato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+closed-loop+recording+and+stimulating+wireless+system+for+behaving+small+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">A programmable closed-loop recording and stimulating wireless system for behaving small laboratory animals.</a> Sci. Rep. 4, 5963(2014).</li>
<li>Ativanichayaphong, T., He, J. W., Hagains, C. E., Peng, Y. B., Chiao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+wireless+neural+stimulating+and+recording+system+for+study+of+pain+processing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A combined wireless neural stimulating and recording system for study of pain processing.</a> J. Neurosci. Methods. 170 (1), 25-34 (2007).</li>
<li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+portable+telemetry+system+for+brain+stimulation+and+neuronal+activity+recording+in+freely+behaving+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A portable telemetry system for brain stimulation and neuronal activity recording in freely behaving small animals.</a> J. Neurosci. Methods. 174 (2), 186-193 (2008).</li>
<li>Brandão, M. L., Tomaz, C., Leão-Borges, P. C., Coimbra, N. C., Bagri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense+reaction+induced+by+microinjections+of+bicuculline+into+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Defense reaction induced by microinjections of bicuculline into the inferior colliculus.</a> Physiol Behav. 44, 361-365 (1988).</li>
<li>Brandão, M. L., Melo, L. L., Cardoso, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+defense+in+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of defense in the inferior colliculus.</a> Behav Brain Res. 58, 49-55 (1993).</li>
<li>Melo, L. L., Cardoso, S. H., Brandão, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiaversive+action+of+benzodiazepines+on+escape+behavior+induced+by+electrical+stimulation+of+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Antiaversive action of benzodiazepines on escape behavior induced by electrical stimulation of the inferior colliculus.</a> Physiol Behav. 51, 557-562 (1992).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , 3rd ed, Academic Press. San Diego, CA. (2007).</li>
<li>Walf, A. A., Frye, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+the+elevated+plus+maze+as+an+assay+of+anxiety-related+behavior+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents.</a> Nat. Protoc. 2 (2), 322-328 (2007).</li>
<li>Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+open%3Aclosed+arm+entries+in+an+elevated+plus-maze+as+a+measure+of+anxiety+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat.</a> J Neurosci Methods. 14, 149-167 (1985).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Merrill, D. R., Bikson, M., Jefferys, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+of+excitable+tissue%3A+design+of+efficacious+and+safe+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation of excitable tissue: design of efficacious and safe protocols.</a> J Neurosci Methods. 141, 171-198 (2005).</li>
<li>Ewing, S. G., Porr, B., Riddell, J., Winter, C., Grace, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SaBer+DBS%3A+A+fully+programmable%2C+rechargeable%2C+bilateral%2C+charge-balanced+preclinical+microstimulator+for+long-term+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">SaBer DBS: A fully programmable, rechargeable, bilateral, charge-balanced preclinical microstimulator for long-term neural stimulation.</a> J Neurosci Methods. 213, 228-235 (2013).</li>
</ol>

Współautorzy, Uwe Thomas i Sascha Thomas, są właścicielami firmy "Thomas RECORDING GmbH", która opracowuje produkty wykorzystywane w tym badaniu i związane z ogólnym tematem badawczym opisanym w tym artykule. Ponadto współautor Dirk Hoehl otrzymuje dochody od firmy "Thomas RECORDING GmbH". Mogą odnieść korzyści finansowe z tej okoliczności, jeśli firma odniesie sukces w marketingu swoich produktów, które są związane z tymi badaniami. Sprzęt "Thomas RECORDING" wykorzystany w tym badaniu został dedykowany dla Wydziału Neuronauki Behawioralnej, Psychologii Eksperymentalnej i Biologicznej - Philipps Universität Marburg bez żadnych opłat.

Zaprezentowano tu szeroko dostępny bezprzewodowy system rejestracji i stymulacji do badań elektrofizjologicznych i behawioralnych u swobodnie poruszających się zwierząt. TWS został zwalidowany w testach behawioralnych przy użyciu wzgórka dolnego jako struktury modelowej. Podejście TWS ma kilka zalet w porównaniu z istniejącymi. Po pierwsze, system wykorzystuje pojedynczą przenośną stopę czołową TWS wyposażoną w przedwzmacniacz i akumulator, co pozwala na stabilne, długotrwałe nagrania do 1 godziny przy tej samej baterii i bezprzewodowej odległości pracy do 5 m. Po drugie, stopień głowy TWS jest lekki i kompaktowy, waży 12 g wraz z baterią i został opracowany, aby zapobiec wyjmowaniu stopnia głowy przez szczura i gryzieniu przewodów. Był dobrze tolerowany przez zwierzęta, ponieważ nie zaobserwowano wpływu na repertuar behawioralny zwierzęcia z i bez stopnia głowy TWS, dzięki czemu system ma zastosowanie do szerokiego zestawu zadań behawioralnych. Po trzecie, system przesyła w czasie rzeczywistym. Po czwarte, dzięki jednoczesnemu dwukierunkowemu rejestrowaniu i stymulacji aktywności neuronalnej, system zapewnia wyrafinowane narzędzie do oceny związków przyczynowo-skutkowych między określonymi wzorcami aktywacji mózgu a zachowaniem, przezwyciężając w ten sposób niedociągnięcia systemów jednokierunkowych. Cecha ta sprawia, że metoda ta jest szczególnie cenna w dziedzinie głębokiej stymulacji mózgu, która zwykle wymaga precyzyjnej oceny, monitorowania i dostosowywania parametrów stymulacji podczas długotrwałych eksperymentów behawioralnych. Na koniec opracowano przewlekle wszczepialny mikroelektrod ze zintegrowaną elektrodą rejestrującą, stymulacyjną i referencyjną, którą można łatwo wszczepić podczas konwencjonalnej operacji stereotaktycznej. Z tego punktu widzenia TWS jest zintegrowanym systemem bezprzewodowym, który zwiększa powtarzalność eksperymentów stymulacyjnych i rejestrujących. Wykazano, że jakość nagrania TWS jest podobna do jakości nagrania uzyskanej przy użyciu dostępnego na rynku przewodowego systemu nagrywania (patrz rysunek 5).
Powszechnie wiadomo, że stymulacja elektryczna wzgórka dolnego u szczura wywołuje wyraźne zachowanie ucieczki charakteryzujące się bieganiem lub skakaniem, które naśladuje reakcje na strach wywołany wyzwaniami środowiskowymi 11,12,13. Zachowanie to zostało wywołane w niniejszym badaniu poprzez stymulację wzgórka dolnego za pomocą TWS lub tradycyjnego systemu na uwięzi. W celu przetestowania skuteczności stymulacji TWS, progi ucieczki – minimalne natężenie prądu powodujące bieganie lub skakanie – porównano przy użyciu obu systemów. Szczury ze stopniem głowy TWS są w stanie szybko biegać, skakać i wychodzić z otwartego pola, czyli wykazują typowe zachowania ucieczkowe, z większą swobodą ruchów. Co ważne, progi ucieczki były zbliżone w porównaniu z tradycyjnym systemem na uwięzi. Wspólnie, dość wymagający paradygmat został wykorzystany do przetestowania odporności TWS, którą opanował w bezproblemowy sposób.
TWS nadaje się również do eksperymentów z przewlekłą stymulacją elektryczną, ponieważ wszczepiona jednostka mikroelektrody pozwala na przewlekłe użytkowanie. TWS pozwala na bardzo precyzyjną regulację parametrów prądu stymulacji w taki sposób, aby dokładnie wykryć częstotliwość i ilość prądu stymulacji, co jest skuteczne w wywołaniu reakcji behawioralnej. Dodatkowo, to samo zwierzę zostało pobudzone tym samym progiem prądu 3 dni później i wywołano tę samą pożądaną reakcję behawioralną. Sugeruje to, że tkanka wokół końcówki elektrody stymulacyjnej nie została uszkodzona przez prąd stymulacyjny, który zwykle wymaga zwiększonych amplitud prądu stymulacji przy powtarzających się stymulacjach w celu wywołania tej samej reakcji behawioralnej.
Co więcej, możliwe jest znaczne skrócenie czasu eksperymentu, ponieważ mikrostymulator TWS aktualizuje parametry stymulacji w czasie rzeczywistym, gdy eksperymentator zmienia je w graficznym interfejsie użytkownika. Inne stymulatory elektryczne19 używane w badaniach przedklinicznych muszą zostać przeprogramowane w celu aktualizacji parametrów bodźca. W takich przypadkach urządzenie jest programowane poprzez przywiązanie zwierzęcia za pomocą kabla do jednostki programującej. Nie jest to wymagane w przypadku korzystania z TWS.
Na koniec akumulator jest przymocowany do górnej części stopnia głównego TWS i elektrycznie połączony ze stopniem głównym za pomocą dwupinowego złącza magnetycznego w celu łatwej wymiany akumulatora. Zaletą jest to, że podczas eksperymentu możliwa jest wymiana baterii bez odłączania stopnia głowy TWS od wszczepionej elektrody, co jest znacznie wygodniejsze dla zwierzęcia. W niniejszym badaniu wykorzystano akumulator, którego czas pracy wynosi zaledwie 1 godzinę. W przypadku, gdy eksperyment trwa dłużej niż 1 godzinę, zaleca się posiadanie dodatkowo naładowanego akumulatora. TWS można podłączyć do wymiennych akumulatorów o pojemności (i) 230 mA na 1 godzinę pracy lub (ii) 450 mA na około 2,5 godziny pracy. Oba typy akumulatorów można w pełni naładować w 15 minut.
Podsumowując, w niniejszej pracy opisano działanie TWS przeznaczonego do stymulacji neuronalnej i rejestracji od swobodnie zachowujących się małych zwierząt. Zaprezentowano również w pełni zintegrowany zestaw wszczepialnych mikroelektrod, stopnia głównego, odbiornika i oprogramowania. Jakość bezprzewodowego nagrywania i stymulacji jest podobna do jakości systemu nagrywania na uwięzi, z tą zaletą, że jest wygodniejsza, lżejsza i bezpieczniejsza dla zwierzęcia. Dlatego TWS może być używany do zastąpienia systemu na uwięzi, ponieważ nie ogranicza mobilności zwierzęcia i zapewnia elastyczną metodę kontrolowania stymulacji i rejestracji neuronalnej w okolicznościach, w których inne podejścia byłyby trudne lub niemożliwe. Dlatego TWS może być ważnym narzędziem do badania, w jaki sposób aktywność elektryczna w zdefiniowanych obwodach neuronowych generuje pewne formy zachowania, co jest podstawowym pytaniem w neurobiologii.

Fundamentalnym pytaniem w neurobiologii jest to, w jaki sposób aktywność elektryczna w zdefiniowanych obwodach neuronowych generuje określone formy zachowania. Elektrofizjologia in vivo jest potężną techniką pozwalającą odpowiedzieć na to pytanie, dostarczając narzędzia do rejestrowania lub stymulowania aktywności elektrycznej w mózgu, podczas gdy zwierzęta wykonują określone zadania behawioralne. Jednak obecne systemy często opierają się na nagraniach kablowych na uwięzi1,2, co prawdopodobnie ogranicza mobilność i uniemożliwia pełną ekspresję repertuaru behawioralnego zwierzęcia. Co więcej, stosowane są głównie systemy jednokierunkowe, pozwalające na rejestrowanie3,4,5 lub stimulation6,7 aktywności neuronalnej, ale nie w tym samym czasie lub w tym samym celu, co utrudnia rozwikłanie związków przyczynowych między określonymi wzorcami aktywacji mózgu a zachowaniem. Obecnie dostępnych jest tylko kilka bezprzewodowych, dwukierunkowych systemów do preparatów in vivo. Są one jednak zazwyczaj ciężkie (40-50 g) i składają się z dwóch oddzielnych jednostek przenośnych, tj. stopnia głównego i podłączonego plecaka do zasilania bateryjnego8,9,10, co czyni je mniej elastycznymi i zwiększa ryzyko rozłączenia, np. podczas zachowania autopielęgnacji. Żaden z wyżej wymienionych systemów bezprzewodowych nie oferuje wszczepialnych mikroelektrod, które pozwoliłyby uzyskać kompletną, zintegrowaną koncepcję aktywności neuronalnej podczas pełnego etologicznie ważnego zachowania z wysoką odtwarzalnością warunków eksperymentalnych.
Tutaj wprowadzane jest nowe bezprzewodowe, dwukierunkowe urządzenie do rejestracji in vivo i stymulacji aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się szczurów. System bezprzewodowy Thomas (TWS) działa poprzez pojedynczy zdejmowany stopień głowicy, który może transmitować aktywność wielokanałową za pomocą maksymalnie czterech niezależnych kanałów nagrywania i może być ukierunkowany na elektryczną stymulację mózgu w czasie rzeczywistym. Dodatkowo opracowano przewlekle wszczepialną jednostkę mikroelektrod kompatybilną z TWS, która umożliwia zarówno stymulację neuronalną, jak i rejestrację. Zaprezentowano również graficzny interfejs użytkownika oprogramowania TWS, służący do nagrywania i stymulacji. W niniejszym badaniu opisano walidację i wdrożenie in vivo całego urządzenia.
Aby zweryfikować system TWS, dolny wzgórek został wybrany jako docelowa struktura neuronalna, ponieważ jego elektryczna stymulacja może wywołać jawną reakcję behawioralną. Powszechnie wiadomo, że stymulacja elektryczna wzgórka dolnego wywołuje u szczurów bezwarunkowe reakcje behawioralne "podobne do strachu", takie jak czujność, pozycje boczne, wygięcie pleców, zamrożenie i zachowanie ucieczki (ucieczki). Ten wzorzec reakcji naśladuje reakcje na strach wywołany przez wyzwania środowiskowe, takie jak postrzegane szkodliwe zdarzenie, atak lub zagrożenie dla przetrwania11,12,13. Zakładano, że możliwość wywołania tak jasnego i jednoznacznego zachowania będzie prawdziwym wyzwaniem dla TWS.

<table><tbody><tr><td>Thomas Wireless System (TWS) wersja 2.0</td><td>Thomas RECORDING GmbH</td><td>AN001165</td><td>Thomas Wireless System (TWS) wersja 2.0 to przenośny wielokanałowy system telemetryczny z laptopem, preinstalowanym systemem operacyjnym Microsoft Windows i oprogramowaniem sterującym TWS. TWS zawiera: niski poziom szumów 4-kanałowy pre&ndash; i programowalny wzmacniacz główny o stałej szerokości pasma, jednokanałowej stałej&ndash; Stymulator prądu do aplikacji dwufazowych impulsów prądowych, programowalny programowo mikrostymulator, wszczepialny system łączników i podstawowa jednostka czołowa do montażu na zwierzęciu. System jest dostarczany z transceiverem z portem USB do laptopów lub komputerów stacjonarnych, oprogramowaniem sterującym działającym pod kontrolą systemu operacyjnego Microsoft Windows. System TWS może być wykorzystywany do zewnątrzkomórkowej stymulacji neuronalnej i rejestracji u swobodnie zachowujących się małych zwierząt (np. szczurów, świnek morskich). System ten można dostosować do stosowania również u większych zwierząt (np. naczelnych).</td></tr><tr><td>Oprogramowanie dla systemu bezprzewodowego Thomas (TWS)</td><td>Firma Thomas RECORDING GmbH</td><td>dołączona do AN001165</td><td>Oprogramowanie dla systemu bezprzewodowego Thomas działa pod kontrolą systemu operacyjnego Microsoft Windows i zapewnia graficzny interfejs użytkownika (GUI) dla systemu bezprzewodowego Thomas (TWS). TWS GUI oferuje pełną kontrolę nad funkcjami TWS, nagrywaniem 4-kanałowym i stymulacją 1-kanałową.</td></tr><tr><td>Wszczepialna tetroda do nagrywania (4 kanały) i stymulacji (pojedynczy kanał)</td><td>Thomas RECORDING GmbH</td><td>AN001132</td><td>Wszczepialna tetroda do nagrywania (4 kanały) i stymulacji (pojedynczy kanał) do użytku z systemami bezprzewodowymi Thomas (TWS). Specyfikacja tetrody do nagrywania: materiał z włókna tetrodowego: włókno platynowo-wolframowe izolowane włóknem kwarcowym, średnica zewnętrzna włókna tetrodowego: 100 i mikro; m, kształt końcówki D, impedancja 0,5-0,8MOHm; Elektroda referencyjna: kształt końcówki: D; Impedancja: 300-500kOhm; Materiał: izolowana platyną / wolframem kwarcowym; Specyfikacja elektrody stymulacyjnej: materiał włókna: platyna / iryd, średnica: 125&mikro; m, izolowany lakierem, kształt końcówki : D, impedancja: < 10kOhm, wymiary elektrody mogą być określone przez użytkownika końcowego</td></tr><tr><td>Wszczepialna mikroelektroda do nagrywania (pojedynczy kanał) i stymulacji (pojedynczy kanał)</td><td>Thomas RECORDING GmbH</td><td>AN001118</td><td>Wszczepialna mikroelektroda do nagrywania (pojedynczy kanał) i stymulacji (pojedynczy kanał) do użytku z systemami bezprzewodowymi Thomas (TWS). Specyfikacja elektrody rejestrującej: materiał włókna elektrody: włókno platynowo-wolframowe izolowane włóknem kwarcowym, średnica zewnętrzna włókna elektrody: 80&micro; M/250 i mikro; m (proszę określić), kształt końcówki D, impedancja 0,5-0,8MOHm; Elektroda referencyjna: kształt końcówki: D; Impedancja. 300-500kOhm; Materiał: izolowana platyną / wolframem kwarcowym; Specyfikacja elektrody stymulacyjnej: materiał włókna: platyna / iryd, średnica: 125&mikro; m, izolowany lakierem, kształt końcówki : D, impedancja: < 10kOhm</td></tr><tr><td>Uchwyt do implantacji elektrod</td><td>Thomas RECORDING GmbH</td><td>AN000838</td><td>Specjalny gięty metalowy pręt do implantacji mikroelektrod do standardowych uchwytów elektrod. Pręt służy do przytrzymywania elektrody wszczepialnej. Elektroda wszczepialna jest mocowana do pręta za pomocą specjalnego kleju rozpuszczalnego w wodzie Thomas RECORDING (AN001080). (Uchwyt elektrody nie jest dołączony)</td></tr><tr><td>Zapasowy zasilacz akumulatorowy do systemu bezprzewodowego Thomas (3,7V/230mAh)</td><td>Thomas RECORDING GmbH</td><td>AN001208</td><td>Wymienny akumulator (akumulator) do systemu bezprzewodowego Thomas o pojemności 230mA na czas pracy około 1h. (wymiary: 27mm x 20mm x 6mm, waga ok. 6g)</td></tr><tr><td>Zapasowy zasilacz akumulatorowy do systemu bezprzewodowego Thomas (3,7V/450mAh)</td><td>Thomas RECORDING GmbH</td><td>AN001209</td><td>Wymienny akumulator (akumulator) do systemu bezprzewodowego Thomas o pojemności 450mA na czas pracy powyżej 1h. (wymiary: 48mm x 30mm x 4mm, waga ok. 11g)</td></tr><tr><td>Ładowarka akumulatora do akumulatora Thomas Wireless System (TWS)</td> Thomas <td>RECORDING GmbH</td><td>AN001207</td><td>Ładowarka sieciowa do akumulatorów akumulatorowych Thomas Wirless System (TWS) (AN001209 i AN001209)</td></tr><tr><td>Klej rozpuszczalny w wodzie</td><td>Thomas RECORDING GmbH</td><td>AN001080</td><td>Thomas RECORDING Rozpuszczalny w wodzie klej elektrodowy to specjalnie dobrany produkt do stosowania z wszczepialnymi mikroelektrodami w badaniach neuronaukowych. Jego unikalne właściwości zapewniają sztywne połączenie między elektrodą a urządzeniem montażowym, chociaż można go łatwo usunąć ciepłą wodą. Rozpuszczalny w wodzie klej elektrodowy Thomas RECORDING może być używany od razu po wyjęciu z pudełka, bez czasochłonnego przygotowania. Rozpuszczalny w wodzie klej elektrodowy Thomas RECORDING nie jest szkodliwy dla ludzi, zwierząt ani środowiska. Ilość: 1 pudełko po 10 gramów</td></tr><tr><td>Miniaturowy przedwzmacniacz różnicowy</td><td>Thomas RECORDING GmbH</td><td>AN000329</td><td>Miniaturowy przedwzmacniacz różnicowy, model MDPA-2 to 2-kanałowy, różnicowy przedwzmacniacz wejściowy, który jest przeznaczony do nagrań o niskim poziomie szumów z pobudliwej tkanki. Jest przeznaczony do rejestracji zewnątrzkomórkowej w połączeniu z implantacją wszczepialnych mikroelektrod do swobodnie poruszających się zwierząt za pomocą systemu bezprzewodowego Thomas Wireless System (TWS). 2-kanałowy miniaturowy przedwzmacniacz różnicowy (MDPA-2) jest podłączony do wszczepialnych mikroelektrod w celu zapewnienia początkowego dziesięciokrotnego stopnia wzmocnienia. Idealnie byłoby, gdyby elektrody platynowo-wolframowe Thomas RECORDING z izolacją kwarcowym i szkłem kwarcowym zapewniały optymalne wyniki nagrywania przy wysokich amplitudach sygnału i niskim poziomie szumów. MDPA-2 posiada dodatkowe wejścia elektrod wspólnego uziemienia i odniesienia.</td></tr><tr><td>połączeniowy</td><td>Thomas RECORDING GmbH</td><td>AN000330</td><td>połączeniowy do podłączenia przedwzmacniacza różnicowego Thomas Miniature (MDPA-2) do wzmacniacza głównego i zasilacza akumulatorowego.</td></tr><tr><td>Akumulator do miniaturowego przedwzmacniacza</td><td>Thomas RECORDING GmbH</td><td>AN000328</td><td>Akumulator do miniaturowego przedwzmacniacza różnicowego (MDPA-2).</td></tr><tr><td>Ładowarka akumulatorów (USA)</td><td>Thomas RECORDING GmbH</td><td>AN000167</td><td>Ładowarka akumulatora do AN000328 zasilającego (amerykański łącznik gniazdka sieciowego)</td></tr>Ładowarka akumulatorów <tr><td>(UE)</td><td>Thomas RECORDING GmbH</td><td>AN000168</td><td>Ładowarka akumulatora do AN000328 zasilającego (złącze gniazdka sieciowego UE)</td></tr><tr><td>Przedwzmacniacz różnicowy/wzmacniacz główny/filtr pasmowo-przepustowy</td><td>Thomas RECORDING GmbH</td><td>AN000677</td><td>Główny wzmacniacz TREC AC (LabAmp-03) to jednokanałowy, różnicowy wzmacniacz główny do zastosowań neurofizjologicznych (np. nagrywanie zewnątrzkomórkowe za pomocą mikroelektrod). Ten instrument jest przeznaczony do pracy z miniaturowym przedwzmacniaczem różnicowym, model MDPA-2. Pojedynczy kanał LabAmp-03 zawiera stopień wzmacniacza różnicowego o wysokim wzmocnieniu i niskim poziomie szumów, a następnie filtry niskich i wysokich częstotliwości. Wzmacniacz posiada dwa różne wzmacniacze filtrujące, filtr SUA (single unit activity) &ndash; wzmacniacz i wzmacniacz z filtrem LFP (Local Field Potential), oba są połączone równolegle w ścieżce sygnałowej. Tryb nagrywania oferuje dwa poziomy wzmocnienia sygnału (x10, x100) w pierwszym stopniu i 4 dodatkowe poziomy (x5, x10, x25 i x50) w końcowym stopniu wzmacniacza. Każdy wzmacniacz ma inną charakterystykę pasmowoprzepustową dla aktywności pojedynczej jednostki (SUA) 500Hz&hellip; 20kHz i lokalne potencjały pola (LFP) 0,1Hz&hellip; 140Hz. W urządzeniu zintegrowany jest monitor audio i dyskryminator okienny. LabAmp-03 posiada zintegrowany monitor audio z głośnikiem. To urządzenie zapewnia odtwarzanie dźwięku sygnałów elektrofizjologicznych. Urządzenie łączy w sobie wzmacniacz audio w kompaktowej, wytrzymałej obudowie. Jest to szczególnie przydatne do monitorowania wypalania neuronów i skurczów mięśni. Wejście monitora audio jest wewnętrznie podłączone do SUA-Filter amplifier wyjście. LabAmp-03 jest dostarczany z zewnętrznym zasilaczem do zasilania sieciowego w zakresie napięcia 100-240V AC/50-60Hz.</td></tr><tr><td>Oscyloskop USB</td><td>Thomas RECORDING GmbH</td><td>AN001096</td><td>USB PC Oszilloskop, 2 Kanał. Ten 2-kanałowy oscyloskop PC doskonale nadaje się do użytku mobilnego na laptopie i do stałej instalacji w szafach sterowniczych, urządzeniach przemysłowych i wielu innych zastosowaniach, w których wymagany jest mały, lekki i wydajny oscyloskop. Ten oscyloskop jest podłączony do wyjścia sygnału głównego wzmacniacza w celu wyświetlenia zarejestrowanej aktywności zewnątrzkomórkowej podczas implanacji wszczepialnych mikroelektrod dla systemu bezprzewodowego Thomas (TWS). Użytkownik może pobierać dane pomiarowe za pośrednictwem kilku interfejsów danych bezpośrednio na komputerze PC za pomocą dołączonego oprogramowania komputerowego.</td></tr><tr><td>Generator bodźców</td><td>Systemy wielokanałowe</td><td>STG3008-FA</td><td>Generator bodźców dla prądu (STG) i stymulacji sterowanej napięciem spełniają trzy funkcje: stymulację sterowaną prądem, stymulację sterowaną napięciem, sterowanie i czas. STG jest dostępny z 2, 4 lub 8 niezależnymi kanałami wyjściowymi. Wyposażony w zintegrowane jednostki izolacyjne dla każdego kanału wyjściowego, STG jest w stanie zapewnić dowolny przebieg.</td></tr><tr><td>Osłona nasadki do elektrody</td><td>Thomas RECORDING GmbH</td><td>AN001193</td><td>Nasadka ochronna do wszczepialnego modułu elektrod do systemu bezprzewodowego Thomas</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td> chirurgiczny <td>Nożyczki, kleszcze z końcówkami, szpatułki, maszynki do strzyżenia, wiertło dentystyczne i patyczki kosmetyczne</td></tr><tr><td>Leki i chemikalia</td><td></td><td></td><td>Izofluran, ksylokaina, chlorowodorek tramadolu (Tramadol-CT, AbZ-Pharma GmbH, Ulm, Niemcy), maść do oczu dexpantenol (Bepanthen, Bayer AG, Leverkusen, Niemcy), 3% nadtlenek wodoru, powidon-jod (Betaisodona, Mundipharma GmbH, Limburg, Niemcy) i 70% etanol;</td></tr><tr><td>Materiał mocujący, w tym</td><td></td><td></td><td>ze stali nierdzewnej (BN650 M1,2x5; 4,7 mm), żywica akrylowa (Paladur, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Niemcy), klej ultrafioletowy (Cyberbond U3300, Cyberbond Europe GmbH, Niemcy) i osłona nasadki (Thomas Recording GmbH, Giessen, Niemcy);</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Materiał dodatkowy: rękawice, poduszka grzewcza, strzykawki i sól fizjologiczna.</td><td></td></tr><tr><td>Instrument stereotaktyczny dla małych zwierząt (SASI)</td><td>Thomas RECORDING GmbH</td><td>AN000287</td><td>Model należy dobrać w zależności od zwierzęcia (szczur, świnka morska, małpy itp.) użytego w badaniu</td></tr><tr><td>Kamera wideo</td><td>EverFocus</td><td></td><td>EverFocus, model: EQ150</td></tr><tr><td>Otwarte pole</td><td></td><td></td><td>Wykonany z przezroczystego lub szarego akrylu, o okrągłym kształcie o wymiarach 40x40x40cm</td></tr><tr><td>Podwyższony plus labirynt</td><td></td><td></td><td>Wykonany z szarego akrylu i składał się z dwóch otwartych ramion (50 cm długości x 10 cm szerokości) i dwóch zamkniętych ramion (50 cm długości x 10 cm szerokości, ze ścianami o wysokości 40 cm), które wysuwały się z centralnej platformy wyniesionej 50 cm nad podłogą.</td></tr></tbody></table>

bezprzewodowy, dwukierunkowy interfejs do rejestrowania in vivo i stymulacji aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się szczurów

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

Elektrofizjologia in vivo to potężna technika badania związku między aktywnością mózgu a zachowaniem w skali milisekundowej i mikrometrowej. Jednak obecne metody opierają się głównie na nagraniach kablowych na uwięzi lub wykorzystują tylko systemy jednokierunkowe, umożliwiające rejestrację lub stymulację aktywności neuronalnej, ale nie w tym samym czasie lub w tym samym celu. W tym artykule opisano nowe bezprzewodowe, dwukierunkowe urządzenie do jednoczesnego wielokanałowego nagrywania i stymulacji aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się szczurów. System działa za pomocą jednego przenośnego stopnia głównego, który zarówno przesyła zarejestrowaną aktywność, jak i może być kierowany w czasie rzeczywistym w celu stymulacji mózgu za pomocą wielokanałowego oprogramowania opartego na telemetrii. Stopień główny wyposażony jest w przedwzmacniacz oraz akumulator, pozwalający na stabilne długotrwałe nagrania lub stymulację do 1 godziny. Co ważne, stopień głowy jest kompaktowy, waży 12 g (łącznie z baterią), a tym samym ma minimalny wpływ na repertuar behawioralny zwierzęcia, dzięki czemu metoda ma zastosowanie do szerokiego zestawu zadań behawioralnych. Co więcej, metoda ma tę główną zaletę, że wpływ stymulacji mózgu na aktywność neuronalną i zachowanie może być mierzony jednocześnie, dostarczając narzędzia do oceny związków przyczynowych między określonymi wzorcami aktywacji mózgu a zachowaniem. Ta cecha sprawia, że metoda jest szczególnie cenna w dziedzinie głębokiej stymulacji mózgu, umożliwiając precyzyjną ocenę, monitorowanie i dostosowywanie parametrów stymulacji podczas długotrwałych eksperymentów behawioralnych. Możliwość zastosowania systemu została zweryfikowana przy użyciu wzgórka dolnego jako struktury modelowej.

Dane techniczne TWS
System bezprzewodowy oferuje 4 niezależne kanały rejestracji i 1 kanał stymulacji. Aktywność zewnątrzkomórkowa była rejestrowana przez jednordzeniową elektrodę rejestrującą i przekazywana na wejście sygnałowe o wysokiej impedancji systemu bezprzewodowego. Rejestrowany sygnał był przedwzmacniany (x200) przez przedwzmacniacz różnicowy z wejściem sprzężonym pojemnościowo i filtrowany pasmowo (stała szerokość pasma sygnału, 500 Hz … 5 kHz), aby rejestrować wyłącznie aktywność wielojednostkową, ponieważ w niniejszym badaniu głównym celem było rejestrowanie aktywności jednostek, a nie potencjałów polowych lokalnych. Zintegrowany programowalny wzmacniacz główny oferuje regulowaną programowo wzmocnienie dla czterech kanałów rejestracji (x1, x2, x4, x8, x16, x32, x64). Kompletna ścieżka sygnałowa systemu bezprzewodowego oferowała całkowite wartości wzmocnienia x200, x400, x800, x1600, x3200, x6400 oraz x12800. Po wzmocnieniu i filtrowaniu sygnał analogowy był digitalizowany przez przetwornik analogowo-cyfrowy, modulowany na wysokoczęstotliwościowym nośniku i przesyłany przez radiowy transceiver w paśmie ISM 2,4 - 2,5 GHz. Po drugiej stronie ścieżki transmisji zastosowano transceiver tego samego typu. Ten drugi transceiver został podłączony do komputera osobistego poprzez port USB. Ścieżka transmisji była wykorzystywana do dwukierunkowego przesyłu danych w celu przesyłania zarejestrowanych sygnałów zewnątrzkomórkowych ze zwierzęcia do komputera oraz w drugą stronę parametrów sterujących wzmocnieniem sygnału i stymulacją z komputera do zwierzęcia.
Dzięki zastosowaniu TWS możliwe było pomyślne zarejestrowanie aktywności wielu neuronów w mózgu oraz modyfikacja zachowania zwierzęcia poprzez stymulację kolcolbycia w czasie, gdy szczur poruszał się swobodnie w otwartej przestrzeni. Odbiornik-nadajnik został umieszczony w odległości do 5 m od zwierzęcia i podłączony do komputera za pomocą portu USB (patrz Rysunek 2). Porównanie jakości sygnałów zarejestrowanych za pomocą systemu przewodowego i bezprzewodowego przedstawiono na Rysunku 5. TWS rejestruje aktywność wielu jednostek z jakością sygnału zbliżoną do przewodowego systemu rejestracji. Mikrostymulator jest prawdziwym stymulatorem bezprzewodowym, który aktualizuje parametry stymulacji w czasie rzeczywistym; oznacza to, że sygnał stymulacji, którego parametry są definiowane w oprogramowaniu TWS, jest przesyłany do elektrody stymulującej podłączonej do modułu głowowego w ciągu kilku milisekund od naciśnięcia przycisku stymulacji. Dzięki temu możliwe było zmienianie parametrów stymulacji bez wyjmowania zwierzęcia z klatki. Funkcja ta pozwala na zminimalizowanie czasu trwania eksperymentów stymulacyjnych.
Oprogramowanie TWS zostało specjalnie zaprojektowane, aby umożliwić sterowanie wszystkimi funkcjami systemu bezprzewodowego (np. rejestracją i stymulacją) za pomocą jednego graficznego interfejsu użytkownika (Rysunek 3 i Rysunek 4). Do mikrostymulacji wykorzystano sygnał stymulujący opracowany w graficznym interfejsie użytkownika oprogramowania TWS. Stymulator TWS był używany w trybie stymulacji prądem stałym z wyważeniem ładunku. Wzór stymulacji był przesyłany bezprzewodowo do stymulatora prądem stałym zintegrowanego z bezprzewodową jednostką głowicy. Prąd stymulujący przyłożono pomiędzy mikroelektrodą roboczą umieszczoną w docelowym obszarze zainteresowania (na przykład w wzniesieniu dolnym w niniejszym badaniu) a większą, oddaloną elektrodą przeciwległą, która służyła jako elektroda uziemiająca lub referencyjna systemu TWS. W zależności od impedancji elektrody stymulującej i zgodności napięcia stymulatora prądem stałym, możliwe jest zastosowanie maksymalnego zakresu prądu stymulującego ±625 µA, choć w niniejszych eksperymentach wymagany był znacznie niższy próg prądowy. Tutaj zastosowano dwufazową stymulację prądem stałym z wyważeniem ładunku z prądami szczytowymi do 300 µA. W przypadku stymulacji dwufazowej pierwszy impuls służy do wywołania efektu fizjologicznego, a drugi impuls zazwyczaj odwraca procesy elektrochemiczne zachodzące podczas impulsu stymulującego18. Głowica TWS dostarcza wzory stymulacji w czasie rzeczywistym, ustawione za pomocą graficznego interfejsu użytkownika oprogramowania TWS (patrz Rysunek 4).
Oprogramowanie TWS podzielone jest na trzy główne sekcje: (i) okno główne z panelami sterowania rejestracją i stymulacją, (ii) okno generatora bodźców ze wszystkimi opcjami ustawień parametrów sygnału stymulującego oraz (iii) okno odtwarzacza służące do odtwarzania zarejestrowanych plików danych. Okno główne umożliwia użytkownikowi wyświetlanie zarejestrowanych sygnałów z maksymalnie 4 kanałów rejestrujących, ustawienie wzmocnienia dla wszystkich kanałów oraz uruchamianie i zatrzymywanie rejestracji wyświetlanych sygnałów. Dane sygnałowe są zapisywane w pliku na dysku twardym komputera. Ścieżkę pliku ustawia się w menu konfiguracji. Poza parametrami rejestracji, okno główne pozwala na uruchamianie i zatrzymywanie procesu stymulacji. Stały prąd stymulujący, przepływający przez elektrodę stymulującą w mózgu zwierzęcia, jest wyświetlany w czasie rzeczywistym na ekranie okna głównego. Parametry sygnału stymulującego są wstępnie konfigurowane w oknie ustawień parametrów bodźca. Możliwe jest zdefiniowanie jednofazowych lub dwufazowych serii impulsów stymulujących oraz ustawienie wszystkich powszechnie stosowanych parametrów impulsu stymulującego, takich jak np. szerokość impulsu, amplituda impulsu, czas między impulsami itp. (szczegóły znajdują się na Rysunku 4). Funkcja impulsu stymulującego, wynikająca z wcześniej wybranych wartości parametrów, jest przedstawiona na wykresie w oknie generatora stymulacji.
Oprogramowanie TWS zostało zaprojektowane z uwzględnieniem aspektów użyteczności. Użyteczność oprogramowania jest kluczowym czynnikiem gwarantującym sprawny przebieg eksperymentu z bezprzewodową stymulacją/rejestracją oraz bezpieczne i komfortowe środowisko pracy. Pomaga ona również w poprawie powtarzalności eksperymentu.
Rejestracja danych z pojedynczych jednostek i stymulacja elektryczna
Pozakomórkową aktywność wielojednostkową rejestrowano sukcesywnie w wzgórzu dolnym z tej samej wszczepionej elektrody, wykorzystując system TWS oraz konwencjonalny system rejestracji przewodowej. Rysunek 5 przedstawia reprezentatywne surowe dane zarejestrowane przy użyciu obu systemów podczas swobodnego poruszania się zwierzęcia w otwartym polu. Bezpośrednie porównanie sygnałów sugeruje podobne kształty potencjałów czynnościowych oraz poziomy szumów (Rysunek 5A i 5B). Demonstracja kształtu potencjału przedstawiona jest w A' i B'.
Ponieważ szczury nie próbowały usuwać głowicy TWS po operacji oraz w kolejnych dniach, przyjęto, że nie wpływa ona znacząco na ich ruchy i nie powoduje dyskomfortu. Dzięki zastosowaniu TWS uniknięto powszechnego problemu występującego podczas rejestracji z przewodami u szczurów, jakim jest usuwanie oraz przegryzanie złączy i kabli. Rzeczywiście, szczury z zamontowaną głowicą TWS były w stanie eksplorować otwarte pole oraz labirynt w kształcie krzyża (patrz Film 1), wykazując prawidłowe zachowania związane z przecinaniem ramion, wstawaniem na tylne łapy oraz pielęgnacją.
Dodatkowo, parametry stymulacji zastosowane w systemie TWS lub konwencjonalnym systemie z przewodami wywołały ten sam efekt behawioralny, w tym przypadku zachowanie ucieczkowe. Zaczynając od 100 µA, amplitudę prądu stymulującego zwiększano stopniowo, aż do osiągnięcia progu ucieczki – minimalnej intensywności prądu wywołującej bieg lub skakanie – i wywołania zachowania ucieczkowego. Indywidualne progi ucieczki u 4 szczurów były podobne przy zastosowaniu obu systemów (Rysunek 5C).
<img alt="Diagram statycznej równowagi; konfiguracja sprzętu do mechanicznych testów w mikro-skali; opisane części; eksperyment." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56299/56299fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Jednostka mikroelektrod TWS. (1) pojedyncza elektroda rejestrująca/tetroda, (2) elektroda stymulująca, (3) płytka połączeń włókien elektrod, (4) elastyczne kable połączeniowe, (5) przewód uziemiający, (6) płytka złączy, (7) złącze męskie lub żeńskie systemu TWS (A); jednostka mikroelektrod TWS podłączona do przedwzmacniacza (8) i uchwytu (9); (B) gotowa do zamocowania w aparacie stereotaksycznym (C). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56299/56299fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Komponenty i konfiguracja systemu telemetrii; bezprzewodowa rejestracja u szczura; analiza danych na laptopie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56299/56299fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Widok z góry modułu zamontowanego na etapie głowicowym TWS (A) bez zasilania akumulatorowego. Całkowite wymiary: wysokość 12,5 mm, głębokość 24 mm (19,3 mm+4,7 mm), szerokość 22,1 mm, waga: 5,96 g. Widok z dołu (B) pokazujący złącze jednostki elektrodowej; zasilanie akumulatorowe, wysokość 9 mm, głębokość 26 mm, szerokość 20 mm, waga 6 g (C); przegląd komponentów TWS użytych w tym teście: (1) jednostka etapu głowicowego z akumulatorem zamontowana na czaszce zwierzęcia, (2) jednostka transceivera podłączona do portu USB komputera, (3) oprogramowanie TWS (D); zdjęcie swobodnie poruszającego się szczura z podłączoną głowicą TWS do wcześniej zaimplantowanej jednostki mikroelektrodowej (E) oraz oprogramowanie TWS pokazujące przykładowe zarejestrowane sygnały (F). Głowica TWS dostarcza wzorce stymulacji w czasie rzeczywistym, ustawione za pomocą graficznego interfejsu użytkownika oprogramowania TWS. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56299/56299fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Dane z rejestracji neuronalnej, wyświetlanie wykresu EEG, analiza sygnału przy użyciu Thomas Wireless System, detekcja kolców." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56299/56299fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Graficzny interfejs użytkownika oprogramowania TWS, ekran rejestracji. Na ekranie przedstawiono wydajność rejestracji TWS z pojedynczą bipolarną elektrodą rejestrującą, wszczepioną do kolliculus inferior. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56299/56299fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Projekt przebiegu elektrofizjologicznego, parametry impulsu i konfiguracja czasowa; interfejs oprogramowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56299/56299fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Graficzny interfejs użytkownika oprogramowania TWS. Ekran stymulacji (A) i specyfikacje parametrów stymulacji (B). Parametry sygnału stymulującego (C), takie jak szerokość impulsu (PxW), amplituda impulsu (PxA), opóźnienie między impulsami (IPD), czas między impulsami (TBP), liczba impulsów w serii (PPT) oraz czas między seriami (TBT), są regulowane za pomocą graficznego interfejsu użytkownika oprogramowania TWS. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56299/56299fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza sygnałów neuronalnych z danymi przebiegu fal, tabela parametrów dla wyników eksperymentu modulacji impulsów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56299/56299fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Jakościowe porównanie sygnału wielkodopaminergicznego zarejestrowanego pozakomórkowo za pomocą TWS (A) oraz przewodowego zestawu rejestracyjnego (B). Oba zapisy uzyskano z tej samej jednostki mikroelektrody TWS (impedancja 0,5 MOhm) wszczepionej do kolizka dolnego. Odległość osiowa między dwoma kontaktami elektrod rejestrujących wynosiła około 400 µm. Pasmo rejestracji systemu przewodowego i TWS było identyczne (500 Hz … 5 kHz), a sygnały próbkowano z częstotliwością 40 kHz (system przewodowy) i 32 kHz (TWS). Oba systemy zarejestrowały aktywność wielkodopaminergiczną o podobnej jakości sygnału. Nie stwierdzono wyraźnej różnicy w częstotliwości wyładowań między zapisami TWS a przewodowymi. Przebiegi fal potencjałów czynnościowych neuronu z obu rejestracji przedstawiono w A' i B'. Podobne parametry stymulacji były niezbędne dla 4 szczurów, aby osiągnąć próg ucieczki przy użyciu systemu z przewodami (TS) lub TWS (C). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56299/56299fig5large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Podwyższony labirynt w kształcie krzyża z myszą do testu zachowań lękowych; układ eksperymentalny w badaniu behawioralnym." src="/files/ftp_upload/56299/56299mov1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Film"> 
Film 1: Przykładowy szczur wykazujący prawidłowe zachowania eksploracyjne podczas testu w labiryncie w kształcie krzyża. System TWS umożliwia zwierzęciu wejście do ramion otwartych i zamkniętych bez plątania się przewodów w aparaturze testowej, a jednocześnie jest na tyle mały i lekki, że minimalnie wpływa na samo zadanie. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56299/Movie_1_Exploratory_behavior_JoVE2017.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>

Wprowadzono bezprzewodowy, dwukierunkowy system do wielokanałowych zapisów neuronowych i stymulacji u swobodnie zachowujących się szczurów. System jest lekki i kompaktowy, dzięki czemu ma minimalny wpływ na repertuar behawioralny zwierzęcia. Co więcej, ten dwukierunkowy system zapewnia wyrafinowane narzędzie do oceny związków przyczynowo-skutkowych między wzorcami aktywacji mózgu a zachowaniem.

Bezprzewodowy, dwukierunkowy interfejs do rejestrowania in vivo i stymulacji aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się szczurów

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...

Ogólnym celem tego badania było opracowanie telemetrycznego, dwukierunkowego urządzenia do wykonywania wielokanałowych nagrań neuronowych i stymulacji u swobodnie zachowujących się szczurów. To nowe urządzenie może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii behawioralnej, takie jak związki przyczynowo-skutkowe między wzorcami aktywacji mózgu a zachowaniem. Aby zweryfikować system telemetryczny, wybieramy wzgórek dolny jako docelową neurostrukturę, ponieważ jego stymulacja elektryczna może wywołać jawną reakcję behawioralną.Powszechnie wiadomo, że elektryczna stymulacja wzgórka dolnego wywołuje u szczurów uwarunkowane reakcje behawioralne podobne do strachu, takie jak czujność, zamrożenie i zachowanie ucieczki. Założyliśmy, że możliwość wywołania tak jasnego i jednoznacznego zachowania będzie prawdziwym wyzwaniem dla naszego systemu telemetrycznego. Zintegrowany system telemetryczny składa się ze stopnia głównego, baterii, odbiornika i jednostki mikroelektrody, którą należy wszczepić podczas operacji stereotaktycznej.Pokazano tutaj całkowicie zintegrowany, opracowany przez nas system bezprzewodowy, który składa się z pojedynczej elektrody rejestrującej, tetrody, elektrody stymulacyjnej, płytki przyłączeniowej światłowodu elektrody, elastycznych połączeniowych, przewodu uziemiającego, płytki połączeniowej, złącza męskiego lub żeńskiego do TWS, jednostki mikroelektrody TWS podłączonej do przedwzmacniacza oraz uchwytu do mocowania do ramy stereotaktycznej. Aby rozpocząć tę procedurę, zamocuj i wyrównaj głowę zwierzęcia w aparacie stereotaktycznym za pomocą nauszników i górnego siekacza. Następnie ogol pole operacyjne za pomocą maszynki do strzyżenia lub nożyczek chirurgicznych i wysterylizuj skórę głowy jodem powidonu.Umieść poduszkę grzewczą pod zwierzęciem, aby zapobiec hipotermii i potraktuj jego oko dekspantenolem, aby zapobiec wysuszeniu. Następnie wstrzyknąć lek Xylocaine w środek pola operacyjnego. Następnie wykonaj małe nacięcie skalpelem, aby odsłonić czaszkę.Delikatnie oddziel skórę i usuń resztki tkanki. Następnie ostrożnie oczyść czaszkę za pomocą patyczków kosmetycznych pokrytych nadtlenkiem wodoru. Następnie wywierć cztery małe otwory w czaszce, aby zamocować ze stali nierdzewnej.Następnie wywierć otwór około siedmiu milimetrów w czaszce nad obszarem docelowym, aby zamocować jednostkę elektrody. Podłącz zespół mikroelektrod i uchwyt elektrody do przedwzmacniacza, który jest podłączony do mikromanipulatora stereotaktycznego. Wchłonąć krew za pomocą wacików.Następnie wprowadź pionowo jednostkę mikroelektrody, aż końcówki dotrą do obszaru docelowego. Umieść uziemiający wzdłuż ze stali nierdzewnej i pod skórą. Następnie ostrożnie wyreguluj elektrodę za pomocą mikromanipulatora, aż dotrze do strefy aktywnych neuronów w strukturze docelowej.W międzyczasie monitoruj aktywność spajków i wykrywaj aktywność neuronalną ze stosunkiem sygnału do szumu odpowiednim do sortowania spajków. Następnie przymocuj jednostkę mikroelektrody do czaszki za pomocą kleju ultrafioletowego. Przykryj i uziemiający żywicą akrylową.Następnie odłącz zespół mikroelektrod od uchwytu elektrody. Przykryj płytkę stykową i małe żywicą akrylową. Ostrożnie wyjmij sztyft z ramy stereotaktycznej i odłącz przedwzmacniacz od jednostki mikroelektrody.Następnie podłącz zabezpieczenie nasadki na wszczepionym zespole mikroelektrody i odłączaj go tylko podczas procedur eksperymentalnych. Monitoruj dobrostan zwierząt i wypełniaj arkusz wyników codziennie aż do końca eksperymentów. Trzymaj szczury pojedynczo w klatce domowej przez co najmniej jeden dzień po operacji, aby umożliwić powrót do zdrowia, a następnie trzymaj szczury w parach.Pojedyncze klatki powinny być przykryte wysokimi akrylowymi pokrywami. Unikaj konwencjonalnych pokrywek wykonanych z metalowej siatki, ponieważ implanty mogą z czasem utknąć i ulec uszkodzeniu lub niestabilności. Otwórz oprogramowanie TWS i podłącz transceiver do portu USB komputera.Transceiver można umieścić w odległości nie większej niż pięć metrów nad zwierzęciem. Gdy między nadajnikiem-odbiornikiem a stopniem głowy zwierzęcia nie zostanie wprowadzona żadna metalowa bariera, TWS ma zastosowanie do szerokiego zestawu zadań behawioralnych. Podłącz akumulator do górnej części głowicy stage.Upewnij się, że w głowicy zapala się zielone światło, gdy bateria jest do niego podłączona. Następnie podłącz stopień głowicy bezpośrednio do wszczepionej mikroelektrody. Jako przykładowe testy behawioralne używamy otwartego pola do pomiaru ogólnej aktywności behawioralnej oraz labiryntu podwyższonego plus, standardowego testu do oceny zachowania podobnego do lęku u szczurów.W przypadku testu na otwartym polu umieść szczura na środku otwartego pola. Pozwól szczurowi na zbadanie aparatury przez co najmniej pięć minut. Naciśnij przycisk połączenia, aby połączyć komputer hosta z systemem telemetrycznym.Stan powinien zmienić się z offline na online. Wybierz menu ustawień parametrów bodźca. Wybierz parametry generatora stymulacji zgodnie z eksperymentem stymulacji.Na przykład amplituda impulsu jeden, amplituda impulsu druga, częstotliwość impulsów i częstotliwość pociągu. Jeśli wszystkie parametry stymulacji są ustawione na wymagane wartości, przesuń mysz do pozycji Start bodźca i naciśnij przycisk Start bodźca. Przesuń wskaźnik myszy na przycisk Graph Start Display (Wyświetlanie początku wykresu).Przesuń wskaźnik myszy do menu Widok wykresu, aby wybrać wykresy, które mają być wyświetlane jako sygnał stymulacji. W przypadku testu labiryntu na podwyższonym plusie, labirynt plus używany w tych eksperymentach jest wykonany z szarego akrylu i składa się z dwóch otwartych ramion i dwóch zamkniętych ramion, które wystają z centralnej platformy podniesionej 50 centymetrów nad podłogą. Umieść stawkę w środku i labiryncie skierowanym w stronę otwartego ramienia.Pozwól mu swobodnie eksplorować aparaturę przez pięć minut. Naciśnij przycisk połączenia, aby połączyć komputer hosta z systemem telemetrycznym. Stan powinien zmienić się z offline na online.Siła komunikacji i pozostała pojemność baterii są wyświetlane za pomocą zielonego paska w lewym górnym rogu. Przesuń menu konfiguracji, aby wyświetlić opcje wykresu. Wybierz menu ścieżki pliku, aby wprowadzić nazwę pliku i ścieżkę, w której mają być przechowywane zarejestrowane dane.Naciśnij Zapisz, aby zapisać nazwę pliku i ścieżkę. Naciśnij przycisk start wyświetlacza, aby rozpocząć wyświetlanie wykrytych sygnałów z czterech kanałów nagrywania. Zwróć uwagę na fakt, że nagrane sygnały nie są jeszcze przechowywane.Wybierz wzmocnienie zintegrowanego wzmacniacza stopnia głównego TWS. Uruchom monitor audio, naciskając zieloną strzałkę i wybierz próg sygnału za pomocą suwaka, aby zredukować szumy tła i akustycznie wyświetlić nagrane skoki. Naciśnij czerwony przycisk nagrywania w menu nagrywania.Po naciśnięciu przycisku nagrywania nagrany sygnał jest zapisywany na dysku twardym. Nagrany sygnał jest wyświetlany w sposób ciągły po prawej stronie. Pokazane tutaj jest działanie nagrania TWS z pojedynczą bipolarną elektrodą rejestrującą wszczepioną w wzgórek dolny.Następnie odłącz stopień głowicy od wszczepionej jednostki mikroelektrody i podłącz osłonę nasadki. Następnie przywróć szczura do jego domowej klatki. Zewnątrzkomórkową aktywność wielojednostkową rejestrowano kolejno w wzgórku dolnym z tej samej wszczepionej elektrody za pomocą TWS i konwencjonalnego systemu rejestracji na uwięzi.Rysunek ten przedstawia reprezentatywne dane surowe zarejestrowane przy użyciu obu systemów, gdy zwierzę swobodnie poruszało się w otwartym polu. W tym przypadku bezpośrednie porównanie sygnałów sugeruje podobne formy fal szczytowych i poziomy szumu. Tutaj zaprezentowaliśmy nasz bezprzewodowy system rejestracji i stymulacji do badań elektrofizjologicznych i behawioralnych u swobodnie poruszających się zwierząt.Nasze podejście ma kilka zalet w porównaniu z istniejącymi. Po pierwsze, system ten wykorzystuje pojedynczy przenośny stopień główny. Utrzymuj go za pomocą przedwzmacniacza i akumulatora.Stopień główny jest lekki i kompaktowy, waży 12 gramów wraz z baterią. Po drugie, był dobrze tolerowany przez zwierzęta i w tym celu może być używany do zastąpienia systemu na uwięzi, ponieważ nie ogranicza mobilności zwierzęcia. Po trzecie, dzięki jednoczesnemu dwukierunkowemu rejestrowaniu i stymulacji aktywności neuronalnej, system ten zapewnia wyrafinowane narzędzie do oceny związków przyczynowo-skutkowych między określonymi wzorcami aktywacji mózgu a zachowaniem.Wreszcie, opracowaliśmy przewlekle wszczepialny mikroelektrod, który można łatwo wszczepić podczas konwencjonalnej operacji stereotaktycznej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wszczepić jednostkę mikroelektrod i wykonywać stymulację elektryczną oraz zewnątrzkomórkowe nagrania neuronowe. System telemetryczny jest użytecznym narzędziem do badania mechanizmów stymulacji mózgu.System telemetryczny jest ważnym narzędziem, które można połączyć z szerokim zestawem testów behawioralnych w celu zbadania, w jaki sposób aktywność elektryczna w zdefiniowanych obwodach neuronowych generuje określone formy zachowania, co jest podstawowym zadaniem neuronauki.

a-wireless-bidirectional-interface-for-vivo-recording-stimulation

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Ten film demonstruje szczegółową procedurę przygotowania znieczulonego szczura do elektrofizjologicznych zapisów aktywności mózgu z wielu miejsc. Skóra głowy jest preparowana w celu uzyskania dostępu do czaszki, a otwory są wiercone w precyzyjnych miejscach, aby zainstalować i zabezpieczyć elektrody. Elektrody wolframowe są następnie umieszczane w docelowym miejscu w celu zarejestrowania danych.

Elektrofizjologiczne zapisy in vivo aktywności mózgu z wielu miejsc u szczurów

Film demonstruje procedurę wszczepienia bezprzewodowej dwukierunkowej wielokanałowej elektrody do mózgu szczura w celu nagrywania i stymulowania wielokanałowych sieci neuronowych.

Wszczepienie bezprzewodowego dwukierunkowego systemu mikroelektrod do mózgu szczura

Ten film demonstruje metodę wszczepienia systemu elektrod na głowę znieczulonemu szczurowi w celu wykrywania napadów w czasie rzeczywistym. Zabieg polega na umieszczeniu elektrod stymulacyjnych i rejestrujących, zabezpieczeniu ich cementem dentystycznym oraz podłączeniu do wzmacniacza montowanego na głowie.

Implantacja systemu elektrod na głowie w modelu szczurzym w celu wykrywania napadów w czasie rzeczywistym

Film demonstruje długoterminowe, ciągłe monitorowanie elektroencefalografii (EEG) u młodych gryzoni za pomocą bezprzewodowego systemu nadajników. Nadajnik zawiera dwie elektrody rejestrujące i jedną elektrodę odniesienia sięgającą do powierzchni mózgu. Po umieszczeniu szczeniaka w komorze rejestracyjnej, EEG może być stale monitorowane przez cały okres rozwoju szczeniaka do dorosłości.

Długotrwały ciągły monitoring elektroencefalograficzny u młodego gryzonia

Tutaj demonstrujemy użycie bezprzewodowej technologii umożliwiającej elektroencefalogram (EEG) w modelach chorób ludzkich noworodków gryzoni. Dzięki telemetrii nie ma obciążających połączeń, co pozwala na naturalne zachowania.

Długotrwałe, ciągłe monitorowanie EEG w modelach chorób człowieka u małych gryzoni przy użyciu systemu nadajników bezprzewodowych Epoch

Pokazujemy chirurgiczne implanty i procedury rejestrujące do pomiaru wizualnych sygnałów elektrofizjologicznych z oka (elektroretinogram) i mózgu (wizualny potencjał wywołany) u przytomnych szczurów, co jest bardziej analogiczne do stanu ludzkiego, gdzie nagrania są prowadzone bez zakłóceń znieczulenia.

Implantacja i rejestracja bezprzewodowego elektroretinogramu i wizualnego potencjału wywołanego u świadomych szczurów

To badanie wprowadza metodę jednoczesnego rejestrowania lokalnych potencjałów pola w mózgu, elektrokardiogramów, elektromiogramów i sygnałów oddechowych swobodnie poruszającego się szczura. Technika ta, która obniża koszty eksperymentów i upraszcza analizę danych, przyczyni się do zrozumienia interakcji między mózgiem a narządami obwodowymi.

Jednoczesne zapisy lokalnych potencjałów pola korowego, elektrokardiogram, elektromiogram i rytm oddychania swobodnie poruszającego się szczura

Tutaj prezentujemy unikalny, drukowalny w 3D implant dla szczurów, nazwany TD Drive, zdolny do symetrycznych, obustronnych zapisów elektrod drucianych, obecnie w maksymalnie dziesięciu rozproszonych obszarach mózgu jednocześnie.

TD Drive: parametryczny implant o otwartym kodzie źródłowym do wieloobszarowych zapisów elektrofizjologicznych u zachowujących się i śpiących szczurów

Przedstawiono protokół instalacji i przygotowania elektrod domięśniowych, wraz z montowanym na zwierzętach, zminiaturyzowanym urządzeniem pomiarowym do analizy elektromiografii (EMG) w badaniach lokomocji. System ten umożliwia bezprzewodową transmisję danych EMG w czasie rzeczywistym w celu zbadania regeneracji lokomocji u szczurów po udarze.

Przenośny system pomiarowy elektromiograficzny dla małych zwierząt w czasie rzeczywistym

Protokół ten został opracowany, aby stworzyć niezawodny i łatwo dostępny system do rejestrowania swobodnie poruszającego się EEG gryzoni.

Opłacalny i minimalnie inwazyjny protokół do przewlekłej wielomiejscowej elektroencefalografii u swobodnie poruszających się myszy

Poznaj bezprzewodowy, dwukierunkowy system do rejestracji i stymulacji neuronalnej u swobodnie poruszających się szczurów. Ta metoda umożliwia badanie związków przyczynowych między aktywnością mózgu a zachowaniem w neurobiologii.

Bezprzewodowy, dwukierunkowy interfejs do rejestrowania in vivo i stymulacji aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się szczurów (Wideo) | JoVE Journal

Bezprzewodowy, dwukierunkowy interfejs do rejestrowania in vivo i stymulacji aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się szczurów

Przeglądaj więcej filmów