Wykrywanie mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach

Ogólnym celem tych eksperymentów jest ocena poziomu mitofagii w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach. Mitofagia stała się bardzo ważną koncepcją na skrzyżowaniu neurodegeneracji, chorób metabolicznych i starzenia się, a wgląd w przedstawione tutaj metodologie i ich przyszłe zastosowanie może pomóc w osiągnięciu postępów w tej ważnej dziedzinie. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że wykrywa mitofagię w solidny i skuteczny sposób oraz umożliwia wykrywanie mitofagii zarówno in vitro, jak i in vivo.

Zaprezentowana tu technika pomoże naukowcom w zdobyciu nowych informacji i opracowaniu nowych strategii terapii chorób neurogeneratywnych, w tym choroby Alzheimera i Parkinsona, w przypadku których, jak wiemy, występuje dysfunkcja mitochondriów. Oprócz zapewnienia wglądu w molekularne mechanizmy mitofagii, metody te mogą prowadzić do odkrycia nowych kandydatów na leki poprzez badania przesiewowe induktorów mitofagów. Wizualne demonstracje tych metod mają kluczowe znaczenie, ponieważ poziomy mitofagii są bardzo wrażliwe na zmiany warunków eksperymentalnych zarówno u C. elegans, jak i u myszy.

Zasiej od 300 000 do miliona komórek w 35-milimetrowym naczyniu mikrostudzienkowym ze szklanym dnem, 10-milimetrowym mikrodołkiem, tak aby komórki osiągnęły 70% zbiegu następnego dnia. Utrzymuj komórki w kompletnej pożywce do hodowli komórkowej i inkubuj je w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia rozcieńczyć 15 mikrolitrów odczynnika do transfekcji DNA 150 mikrolitrami pożywki wolnej od surowicy zgodnie z protokołem producenta.

Rozcieńczyć również od dwóch do pięciu mikrogramów plazmidowego DNA mito-Keima 150 mikrolitrami wolnej pożywki w surowicy. Dodaj rozcieńczony plazmid mito-Keima do rozcieńczonego odczynnika do transfekcji DNA i wiruj mieszaninę przez 10 sekund. Następnie inkubuj mieszaninę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie kroplami dodawaj mieszaninę odczynników do transfekcji DNA do komórek, delikatnie potrząsaj płytkami przez pięć do 10 sekund, aby wymieszać roztwór. W tym momencie umieść komórki z powrotem w inkubatorze i inkubuj je przez 24 godziny. Następnego dnia zmień pożywkę na świeżą, kompletną pożywkę do hodowli komórkowych, a następnie inkubuj transfekowane komórki przez dodatkowe 24 godziny.

Zobrazuj transfekowane komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej. Losowo zobrazuj 20 obszarów pod 40-krotnym powiększeniem, aby udokumentować łącznie od 100 do 200 komórek w każdej studzience. Pierwszego dnia wybierz larwy L4 zwierząt transgenicznych wykazujących ekspresję zarówno DCT-1 GFP, jak i DSRed LGG-1 w komórkach mięśniowych ściany ciała i umieść je na pożywce wzrostowej nicienia z nasionami OP50.

Umieść od pięciu do 10 robaków na każdej 3,5-centymetrowej płytce, używając co najmniej trzech płytek. Po zakończeniu inkubuj nicienie w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie, w piątym dniu, zsynchronizuj nicienie, wybierając od 15 do 20 transgenicznych larw L4 i przenosząc je na świeże płytki z nasionami OP50.

Na każdy warunek doświadczalny należy użyć co najmniej pięciu płytek. W siódmym dniu przygotuj niektóre tablice nośnika dla mitofagii wpływającej na interesujące nas leki, a niektóre do wykorzystania jako kontrole pozytywne. Następnie wystaw płytki z nasionami E. coli na działanie światła UV przez 15 minut o intensywności 222 mikrowatów na centymetr kwadratowy, aby upewnić się, że związki wywołujące mitofagię na płytkach nie są metabolizowane przez bakterie.

Teraz dodaj interesujący związek w 10 mikrolitrach do górnej części płytek z nasionami i dodaj równoważną ilość pojazdu złożonego do płytek pojazdu jako kontrolę ujemną. W celu pozytywnej kontroli indukcji mitofagii dodaj parakwat, toksyczny mitochondrialny. Delikatnie obracaj płytki, aż roztwór pokryje całą powierzchnię, i pozostaw płytki do wyschnięcia z zamkniętymi pokrywkami, w temperaturze pokojowej, przez co najmniej godzinę.

Po wyschnięciu przenieś 10 do 20 dwudniowych dorosłych zwierząt transgenicznych na płytki. Inkubuj je w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez dwa dni. Dziewiątego dnia przygotuj 2% płatki agarozy i dodaj jedną kroplę 20-milimolowego lewamizolu w M9 na wkładkę.

Unieruchomij transgeniczne zwierzęta do obrazowania, umieszczając je w kropli lewamizolu M9. Następnie delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu kropli. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu konfokalnego i zobrazuj pojedyncze komórki mięśniowe ściany ciała, wykonując obrazy Z-stack pod 63-krotnym powiększeniem.

Umieść świeżą, wyizolowaną wątrobę myszy mito-Keima na schłodzonej metalowej płytce, na lodzie, aby szybko schłodzić tkankę. Trzymaj go tam podczas przetwarzania tkanki tak szybko, jak to możliwe, ponieważ sygnał z białka mito-Keima pozostaje stabilny na lodzie przez okres do jednej godziny. Następnie użyj pary zakrzywionych kleszczy, aby podnieść próbkę wątroby i spłukać ją pięcioma mililitrami lodowatego PBS.

Na koniec zobrazuj skrawki tkanek za pomocą mikroskopii konfokalnej z dwoma sekwencyjnymi wzbudzeniami. Korzystając z przedstawionej tutaj procedury, ludzkie komórki HeLa transfekowano plazmidem mito-Keima. Zdrowe komórki wykazywały dobrze zorganizowaną sieć mitochondrialną z niewielką częstością występowania mitofagii.

Jednak komórki wstępnie potraktowane mitochondrialnym rozprzęgaczem FCCP wykazały głęboki wzrost częstości występowania mitofagii. Mitofagię mierzono również za pomocą kolokalizacji LAMP2 i COXII. W celu wykrycia in vivo mitofagii u C. elegans, transgeniczne nicienie eksprymujące rozellę MT w komórkach mięśniowych ściany ciała potraktowano ośmioma milimolami parakwatu.

Stwierdzono, że poziom indukcji mitofagii, na który wskazuje spadek współczynnika fluorescencji wrażliwego na pH, był znacznie obniżony u nicieni traktowanych parakwatem. Dodatkowo, zwiększona liczba zdarzeń kolokalizacyjnych między GPF z DCT-1 i LGG-1 ze stopioną DSR, oznacza stymulację mitofagii w odpowiedzi na stres oksydacyjny. Wreszcie, obrazy te reprezentują sygnały mito-Keima z wątroby i móżdżku myszy mito-Keima.

Tkanki muszą być przechowywane w niskiej temperaturze i obrazowane tak szybko, jak to możliwe, ale po odpowiednim przygotowaniu mogą być wykorzystane do uzyskania wglądu w mitofagię w normalnych i patofizjologicznych warunkach. Zastosowanie tej techniki utorowało drogę naukowcom zajmującym się szeroko pojętą neurodegeneracją i biologią mitochondriów do badania funkcji mitochondriów w różnych systemach modelowych, w tym w hodowanych komórkach, robakach lub C.elegans i modelach mysich. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś zapoznać się z wieloma metodami, które można wykorzystać w ilościowej ocenie poziomów mitofagii zarówno u C.elegans, jak i myszy.