Name: Wykrywanie mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj metody wykrywania mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach. Techniki te pomagają badaczom zrozumieć mechanizmy molekularne i opracować nowe strategie terapeutyczne przeciwko chorobom neurodegeneracyjnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Atsushi Miyawaki i dr Richardowi J. Youle za udostępnienie plazmidu mt-Keima i zintegrowanych komórek Hela mt-Keima. Dziękujemy Raghavendrze A. Shamannie i dr Deborah L. Croteau za krytyczną lekturę manuskryptu. Badania te były wspierane przez Intramural Research Program NIH (VAB), National Institute on Ageing, a także grant wewnątrzlaboratoryjny NIA na lata 2014-2015 i 2016-2017 (EFF, VAB). EFF był wspierany przez HELSE SOR-OST RHF (nr projektu: 2017056) oraz Norweską Radę ds. Badań Naukowych (nr projektu: 262175).
WKŁAD AUTORA:
EFF zaprojektowała rękopis i przygotowała szkic; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH i ED napisały różne sekcje artykułu; NT, JP, HN i VAB zrewidowały manuskrypt i dostarczyły ekspertyzy.

<ol><li>Fang, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+DNA+damage+signalling+to+mitochondria+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).</li>
<li>Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+the+mitochondrial+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protecting the mitochondrial powerhouse.</a> Trends Cell Biol. 25 (3), 158-170 (2015).</li>
<li>Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/molecular-cell/pdf/S1097-2765(16)00081-2.pdf">The Mitochondrial Basis of Aging.</a> Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).</li>
<li>Shadel, G. S., Horvath, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+signaling+in+organismal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis.</a> Cell. 163 (3), 560-569 (2015).</li>
<li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+during+ageing+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans.</a> Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).</li>
<li>Lazarou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+kinase+PINK1+recruits+autophagy+receptors+to+induce+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy.</a> Nature. 524 (7565), 309-314 (2015).</li>
<li>Kerr, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+and+Alzheimer%27s+Disease%3A+Cellular+and+Molecular+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+neurosci%22%5BJournal%5D)">Mitophagy and Alzheimer's Disease: Cellular and Molecular Mechanisms.</a> Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).</li>
<li>Fivenson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+in+neurodegeneration+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Mitophagy in neurodegeneration and aging.</a> Neurochem Int. , (2017).</li>
<li>Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compromised+autophagy+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Compromised autophagy and neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).</li>
<li>Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22240478">Mechanisms of autophagosome biogenesis.</a> Curr Biol. 22 (1), R29-R34 (2012).</li>
<li>Kerr, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+and+Alzheimer%27s+disease%3A+cellular+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+neurosci%22%5BJournal%5D)">Mitophagy and Alzheimer's disease: cellular and molecular mechanisms.</a> Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).</li>
<li>Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+autophagic+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of autophagic activity in mammalian cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 15, Unit 15 16(2012).</li>
<li>Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+quantitative+technique+for+detecting+autophagic+events+based+on+lysosomal+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery.</a> Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26549682">Measuring In Vivo Mitophagy.</a> Mol Cell. 60 (4), 685-696 (2015).</li>
<li>Fang, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+mitophagy+in+XPA+via+PARP-1+hyperactivation+and+NAD%28%2B%29%2FSIRT1+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction.</a> Cell. 157 (4), 882-896 (2014).</li>
<li>Diot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+quantitative+assay+of+mitophagy%3A+Combining+high+content+fluorescence+microscopy+and+mitochondrial+DNA+load+to+quantify+mitophagy+and+identify+novel+pharmacological+tools+against+pathogenic+heteroplasmic+mtDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA.</a> Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).</li>
<li>Schiavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-Starvation-Induced+Mitophagy+Mediates+Lifespan+Extension+upon+Mitochondrial+Stress+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans.</a> Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).</li>
<li>Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosella%3A+a+fluorescent+pH-biosensor+for+reporting+vacuolar+turnover+of+cytosol+and+organelles+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast.</a> Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).</li>
<li>Sargsyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+parallel+measurements+of+macroautophagy+and+mitophagy+in+mammalian+cells+using+a+single+fluorescent+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor.</a> Sci Rep. 5, 12397(2015).</li>
<li>Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltun%2C+ZF+%22WormAtlas%22">WormAtlas</a>. , (2009).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), e2293(2011).</li>
<li>Palikaras, K., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Mitophagy+Monitoring+in+Caenorhabditis+elegans+to+Determine+Mitochondrial+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis.</a> Bio Protoc. 7 (7), e2215(2017).</li>
<li>Palikaras, K., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+Mitochondrial+Selective+Autophagy+in+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-based+imaging+method+to+measure+in+vitro+and+in+vivo+mitophagy+using+mt-Keima%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima.</a> Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).</li>
<li>Eiyama, A., Okamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+Mitophagy+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assays for Mitophagy in Yeast.</a> Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).</li>
<li>McWilliams, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mito-QC+illuminates+mitophagy+and+mitochondrial+architecture+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo.</a> J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).</li>
</ol>

Laboratorium Bohr zawarło umowy CRADA z firmami ChromaDex i GlaxoSmithKline.

Dokładny pomiar mitofagii jest wymagający technicznie. W tym miejscu przedstawiliśmy kilka solidnych technik, które pozwalają zarówno na jakościowe wykrywanie mitofagii, jak i kwantyfikację poziomów mitofagii w najpopularniejszych laboratoryjnych modelach eksperymentalnych.
Aby uzyskać powtarzalne dane, konieczny jest projekt eksperymentalny z co najmniej trzema powtórzeniami biologicznymi. Wszyscy badacze zaangażowani w eksperymenty i analizy muszą być ślepi na eksperymentalną tożsamość grupo...

Mitofagia jest niezbędna do utrzymania mitochondriów. Mitochondria przecinają wiele szlaków sygnalizacji komórkowej i są uniwersalnymi organellami subkomórkowymi odpowiedzialnymi za produkcję energii komórkowej, metabolizm komórkowy i homeostazę wapnia1,2,3,4. Mitochondria stale doświadczają wyzwań związanych ze źródłami endogennymi i egzogennymi, takimi jak odpowiednio reaktywne formy tlenu (ROS) i toksyny mitochondrialne, co prowadzi do powstawania "starzejących się" i dysfunkcyjnych mitochondriów. Nagromadzenie uszkodzonych mitochondriów zmniejsza wydajność produkcji ATP, jednocześnie zwiększając ilość szkodliwych ROS, i jest powiązane z chorobami związanymi z wiekiem, takimi jak choroby metaboliczne, AD i PD1,5,6. Aby zapobiec dysfunkcji komórkowej wywołanej mitochondriami, komórki muszą specyficznie rozpoznawać uszkodzone mitochondria i skutecznie usuwać je w procesie komórkowym zwanym autofagią mitochondrialną (mitofagią). Wykazano znaczenie mitofagii w zdrowiu i chorobie, co ilustruje potrzebę dokładnych i skutecznych metod wykrywania mitofagii zarówno in vitro, jak i in vivo.
Mitofagia to wieloetapowy proces, w którym bierze udział wiele białek i kompleksów białkowych5,7,8. Krótko mówiąc, uszkodzone mitochondrium jest najpierw rozpoznawane i pochłaniane przez fagofor o podwójnej błonie, który może pochodzić z błony plazmatycznej, retikulum endoplazmatycznego, kompleksu Golgiego, jądra lub samego mitochondrium9,10. Fagofor sferyczny wydłuża się i ostatecznie uszczelnia mitochondria wewnątrz, tworząc autofagosom mitochondrialny (mitofagosom). Mitofagosom następnie łączy się z lizosomem w celu degradacji, tworząc autolizosom, w którym uszkodzone mitochondrium jest degradowane i poddawane recyklingowi7,8. Główne białka autofagiczne zaangażowane również w mitofagię to: Autofagia związana z 7 (ATG7) i Beclin1 (inicjacja), białko związane z mikrotubulami 1A/1B-Light Chain 3 (LC3-II) (LGG-1 w C. elegans) i p62 (składniki fagoforu) oraz glikoproteina błonowa związana z lizosomem 2 (LAMP2)6,7. Ponadto istnieje kilka niezbędnych białek unikalnych dla mitofagii, w tym między innymi indukowana przez PTEN przypuszczalna kinaza 1 (PINK-1), parkin1, białko jądrowe kropki 52 kDa (NDP52), optineuryna, białko oddziałujące BCL2 3 Like (NIX/BNIP3L) (DCT-1 w C. elegans), między innymi5,6,11.
Powszechną metodą wykrywania zmian w poziomach autofagii jest stosunek LC3-II/LC3-I lub LC3-II/aktyny. Jednak ta metoda jest niespecyficzna, ponieważ wzrost tego współczynnika może odzwierciedlać zwiększoną inicjację lub upośledzoną fuzję mitofagosomu z lizosomem12. Inną metodą jest ocena kolokalizacji między markerem autofagii (np. LC3) a białkiem mitochondrialnym (np. Translokaza zewnętrznej błony mitochondrialnej 20 (TOMM20, które może być degradowane przez proteasomy)). Może to jednak wskazywać jedynie na zmiany w całkowitym poziomie mitofagii i nie może odróżnić etapu, na którym dochodzi do blokady. Można to wyjaśnić, stosując równolegle inhibitory lizosomalne (np. E64d + pepstatyna A, określane jako EP) w celu spowodowania akumulacji mitofagosomów. Różnica między liczbą mitofagosomów na początku badania a liczbą mitofagosomów po leczeniu EP może wskazywać na mitofagię. Ograniczenia te skłoniły do opracowania nowych technik wykrywania mitofagii. W związku z rosnącym znaczeniem mitofagii w szerokim spektrum chorób człowieka, przedstawiamy kilka solidnych technik wykrywania mitofagii, które mogą być przydatne dla badaczy. Omawiamy zarówno techniki in vitro, jak i in vivo i zalecamy łączenie wielu technik w celu weryfikacji zmian mitofagii.

<table><tbody><tr><td>mt-Keima mysz</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Odczynnik do transfekcji DNA</td><td>Thermofisher</td><td>#11668027</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Opti-MEM (Gibco)</td><td>Pożywka bez surowicy</td> <td>Thermofisher</td><td>#31985062</td></tr><tr><td>plazmid mtEmia: pCHAC-mt-mKeima</td><td>addgene</td><td>#72342</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało COXII (mysz)</td><td>abcam</td><td>#ab110258</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało LAMP2 (królik)</td><td>NOVUS</td><td></td><td></td></tr>#CD107b <tr><td>kozio-anty-królik o długości fali 568 nm czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP)</td><td>Thermofisher</td><td>#Z25306</td><td>Alexa Fluor 568</td></tr><tr><td>barwnik kozio-anty-mysz o długości fali 488 nm zielonego białka fluorescencyjnego (GFP)</td><td>Thermofisher</td><td>#Z25002</td><td>Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>barwnik przedłuża złoty środek zapobiegający blaknięciu z DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>#P36931</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>SIGMA Corning Costar</td><td>#CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>4-dołkowa szkiełko komorowe</td><td>THermofisher, Nunc Lab-Tek</td><td>#171080</td><td></td></tr><tr><td>Nunc F 96-dołkowa płytka</td><td>Thermofisher</td><td>#152038</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało LC3B królik</td><td>NOVUS</td><td>#NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>DNA</td><td>Progen Biotechnik</td><td>#anti-DNA mysie monoklonalne, AC-30-10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher</td><td>#D1306</td><td>podłoże montażowe zapobiegające blaknięciu z DAPI</td></tr><tr><td>IN Analizator komórek (czytnik fluorescencyjny)</td> <td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>#IN Analizator komórek Mikroskop konfokalny 2200</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE-2000e</td><td>Nikon</td><td>#TE-2000e</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do kolokalizacji</td><td>Volocity</td><td>#Volocity 6.3</td><td>alternatywne oprogramowanie Zeiss ZEN 2012</td></tr><tr><td>IN Cell Investigator Software</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>#28408974</td><td></td></tr><tr><td>pożywka do hodowli komórkowych</td><td>Thermofisher</td><td>#DMEM&ndash; Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Thermofisher</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#12003C-1000ML</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli komórkowych</td><td>Thermofisher</td><td>#Thermo Forma 3110 CO2 Inkubator</td><td></td>z płaszczem wodnym</tr><tr>Mikroskop<td>epifluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axio Imager Z2</td></tr><tr><td>kamera</td> Mikroskop konfokalny <td>Olympus</td><td></td><td>Olympus DP71</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td></td> Oprogramowanie konfokalne <td>Zeiss Axio Observer Z1</td></tr><tr>Oprogramowanie<td>do</td> analizy obrazu <td>Zeiss</td><td></td><td>ZEN 2012</td></tr><tr><td></td><td>Analiza kolokalizacji</td><td>obrazu Image J</td> itp <td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>oprogramowanie do analizy statystycznej</td><td>GraphPad Software Inc., San Diego, USA</td><td></td><td>Pakiet oprogramowania GraphPad Prism</td></tr><tr><td>materiał do wykonania kilofa ślimakowego</td><td>Surepure Chemetals</td><td>#4655</td><td>Kilof wykonany jest z drutu o grubości 30 90% platyny 10% irydu</td></tr><tr><td>IR: N2; Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella]</td><td>Zapytanie materiałowe do Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td>Utrzymuj transgeniczne zwierzęta w temperaturze 20 stopni Celsjusza; C</td></tr><tr><td>IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1]</td><td>Zapytanie o materiał do Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pmyo-3 TOMM-20::Rosella</td><td>Zapytanie o materiał do Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pdct-1 DCT-1::GFP</td><td>Zapytanie o materiał do Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pmyo-3 DsRed:: LGG-1</td><td>Zapytanie materiałowe do Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraquat roztwór</td><td>patrz dane uzupełniające do przygotowania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>buforu M9</td><td>patrz dane uzupełniające do przygotowania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>buforu M9-lewamizolu</td><td>patrz dane uzupełniające do przygotowania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>#B9992000</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze chirurgiczne</td><td>STERIS Animal Health</td><td>19-częściowy pakiet do sterylizacji psów Ekonomiczne</td><td></td></tr><tr><td>nożyczki chirurgiczne</td><td>STERIS Animal Health</td><td>19-częściowy pakiet do sterylizacji psów Ekonomiczny</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Thermofisher</td><td>#AM9625</td><td>10x PBS należy rozcieńczyć do 1x PBS za pomocą</td></tr><tr><td>wytrząsarki</td> ddH2O <td>Fisher Scientific</td><td>#11-676-178</td><td>Thermo Scientific MaxQ HP Stołowa orbitalna mała wytrząsarka platformowa na otwartym powietrzu Pakiet</td></tr><tr><td>2% podkładki agarozowej</td><td>Zobacz dane uzupełniające dotyczące przygotowania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ostrza Vibroslice</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>#BLADES-2</td> metalowa <td>płyta z jednokrawędziowym ostrzem</td></tr><tr><td></td><td>MSC</td><td>#78803988</td><td>0,012 cala grubości x 6 cali szerokości x 12 cali długości, blacha ze stali nierdzewnej 430</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>detergent</td></tr><tr><td>Hydrat dichlorku wioligogenu metylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#856177</td><td>parakwat</td></tr><tr><td>Inkubator dla nicieni</td><td>AQUALYTIC</td><td></td><td>Inkubator do utrzymania 20 &deg; C</td></tr><tr><td>Stereoskop preparacyjny</td><td>Olympus</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver Z1</td><td>Dla nicieni (krok 2)</td></tr><tr><td>mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>AxioImager Z2</td><td>Dla nicieni (krok 2)</td></tr><tr><td>Środek sieciujący UV</td><td>Vilber Lourmat</td><td>BIO-LINK &ndash; BLX-E365</td><td>Źródło światła UV; 356 nm</td></tr></tbody></table>

wykrywanie mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, c. elegans i myszach

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria są elektrowniami komórek i wytwarzają energię komórkową w postaci ATP. Dysfunkcja mitochondriów przyczynia się do biologicznego starzenia się i wielu różnych zaburzeń, w tym chorób metabolicznych, zespołów przedwczesnego starzenia się i chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera (AD) i choroba Parkinsona (PD). Utrzymanie zdrowia mitochondriów zależy od biogenezy mitochondriów i skutecznego usuwania dysfunkcyjnych mitochondriów poprzez mitofagię. Opracowanie eksperymentalnych metod dokładnego wykrywania autofagii/mitofagii, zwłaszcza w modelach zwierzęcych, było trudne. Niedawny postęp w kierunku zrozumienia molekularnych mechanizmów mitofagii umożliwił opracowanie nowych technik wykrywania mitofagii. Tutaj przedstawiamy kilka wszechstronnych technik monitorowania mitofagii w komórkach ludzkich, Caenorhabditis elegans (np. szczepy Rosella i DCT-1 / LGG-1) oraz myszy (mt-Keima). Połączenie tych technik wykrywania mitofagii, w tym ocena międzygatunkowa, poprawi dokładność pomiarów mitofagii i doprowadzi do lepszego zrozumienia roli mitofagii w zdrowiu i chorobie.

Wykrywanie mitofagii w komórkach ludzkich:
Stosując przedstawioną tutaj procedurę, ludzkie komórki HeLa poddano transfekcji plazmidem mt-Keima. Zdrowe komórki wykazały dobrze zorganizowaną sieć mitochondrialną (GFP, 488 nm) z niewielką liczbą zdarzeń mitofagii (RFP, 561 nm). Jednakże komórki poddane wstępnemu traktowaniu mitochondrialnym odsprzęgaczem FCCP (30 µM przez 3 h) wykazały znaczny wzrost częstości występowania mitofagii (...

Mitofagia, proces oczyszczania uszkodzonych mitochondriów, jest niezbędny do homeostazy mitochondriów i utrzymania zdrowia. W tym artykule przedstawiono niektóre z najnowszych metod wykrywania mitofagii w komórkach ludzkich, Caenorhabditis elegans i myszach.

Wykrywanie mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Ogólnym celem tych eksperymentów jest ocena poziomu mitofagii w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach. Mitofagia stała się bardzo ważną koncepcją na skrzyżowaniu neurodegeneracji, chorób metabolicznych i starzenia się, a wgląd w przedstawione tutaj metodologie i ich przyszłe zastosowanie może pomóc w osiągnięciu postępów w tej ważnej dziedzinie. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że wykrywa mitofagię w solidny i skuteczny sposób oraz umożliwia wykrywanie mitofagii zarówno in vitro, jak i in vivo.Zaprezentowana tu technika pomoże naukowcom w zdobyciu nowych informacji i opracowaniu nowych strategii terapii chorób neurogeneratywnych, w tym choroby Alzheimera i Parkinsona, w przypadku których, jak wiemy, występuje dysfunkcja mitochondriów. Oprócz zapewnienia wglądu w molekularne mechanizmy mitofagii, metody te mogą prowadzić do odkrycia nowych kandydatów na leki poprzez badania przesiewowe induktorów mitofagów. Wizualne demonstracje tych metod mają kluczowe znaczenie, ponieważ poziomy mitofagii są bardzo wrażliwe na zmiany warunków eksperymentalnych zarówno u C. elegans, jak i u myszy.Zasiej od 300 000 do miliona komórek w 35-milimetrowym naczyniu mikrostudzienkowym ze szklanym dnem, 10-milimetrowym mikrodołkiem, tak aby komórki osiągnęły 70% zbiegu następnego dnia. Utrzymuj komórki w kompletnej pożywce do hodowli komórkowej i inkubuj je w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia rozcieńczyć 15 mikrolitrów odczynnika do transfekcji DNA 150 mikrolitrami pożywki wolnej od surowicy zgodnie z protokołem producenta.Rozcieńczyć również od dwóch do pięciu mikrogramów plazmidowego DNA mito-Keima 150 mikrolitrami wolnej pożywki w surowicy. Dodaj rozcieńczony plazmid mito-Keima do rozcieńczonego odczynnika do transfekcji DNA i wiruj mieszaninę przez 10 sekund. Następnie inkubuj mieszaninę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie kroplami dodawaj mieszaninę odczynników do transfekcji DNA do komórek, delikatnie potrząsaj płytkami przez pięć do 10 sekund, aby wymieszać roztwór. W tym momencie umieść komórki z powrotem w inkubatorze i inkubuj je przez 24 godziny. Następnego dnia zmień pożywkę na świeżą, kompletną pożywkę do hodowli komórkowych, a następnie inkubuj transfekowane komórki przez dodatkowe 24 godziny.Zobrazuj transfekowane komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej. Losowo zobrazuj 20 obszarów pod 40-krotnym powiększeniem, aby udokumentować łącznie od 100 do 200 komórek w każdej studzience. Pierwszego dnia wybierz larwy L4 zwierząt transgenicznych wykazujących ekspresję zarówno DCT-1 GFP, jak i DSRed LGG-1 w komórkach mięśniowych ściany ciała i umieść je na pożywce wzrostowej nicienia z nasionami OP50.Umieść od pięciu do 10 robaków na każdej 3,5-centymetrowej płytce, używając co najmniej trzech płytek. Po zakończeniu inkubuj nicienie w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie, w piątym dniu, zsynchronizuj nicienie, wybierając od 15 do 20 transgenicznych larw L4 i przenosząc je na świeże płytki z nasionami OP50.Na każdy warunek doświadczalny należy użyć co najmniej pięciu płytek. W siódmym dniu przygotuj niektóre tablice nośnika dla mitofagii wpływającej na interesujące nas leki, a niektóre do wykorzystania jako kontrole pozytywne. Następnie wystaw płytki z nasionami E. coli na działanie światła UV przez 15 minut o intensywności 222 mikrowatów na centymetr kwadratowy, aby upewnić się, że związki wywołujące mitofagię na płytkach nie są metabolizowane przez bakterie.Teraz dodaj interesujący związek w 10 mikrolitrach do górnej części płytek z nasionami i dodaj równoważną ilość pojazdu złożonego do płytek pojazdu jako kontrolę ujemną. W celu pozytywnej kontroli indukcji mitofagii dodaj parakwat, toksyczny mitochondrialny. Delikatnie obracaj płytki, aż roztwór pokryje całą powierzchnię, i pozostaw płytki do wyschnięcia z zamkniętymi pokrywkami, w temperaturze pokojowej, przez co najmniej godzinę.Po wyschnięciu przenieś 10 do 20 dwudniowych dorosłych zwierząt transgenicznych na płytki. Inkubuj je w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez dwa dni. Dziewiątego dnia przygotuj 2% płatki agarozy i dodaj jedną kroplę 20-milimolowego lewamizolu w M9 na wkładkę.Unieruchomij transgeniczne zwierzęta do obrazowania, umieszczając je w kropli lewamizolu M9. Następnie delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu kropli. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu konfokalnego i zobrazuj pojedyncze komórki mięśniowe ściany ciała, wykonując obrazy Z-stack pod 63-krotnym powiększeniem.Umieść świeżą, wyizolowaną wątrobę myszy mito-Keima na schłodzonej metalowej płytce, na lodzie, aby szybko schłodzić tkankę. Trzymaj go tam podczas przetwarzania tkanki tak szybko, jak to możliwe, ponieważ sygnał z białka mito-Keima pozostaje stabilny na lodzie przez okres do jednej godziny. Następnie użyj pary zakrzywionych kleszczy, aby podnieść próbkę wątroby i spłukać ją pięcioma mililitrami lodowatego PBS.Na koniec zobrazuj skrawki tkanek za pomocą mikroskopii konfokalnej z dwoma sekwencyjnymi wzbudzeniami. Korzystając z przedstawionej tutaj procedury, ludzkie komórki HeLa transfekowano plazmidem mito-Keima. Zdrowe komórki wykazywały dobrze zorganizowaną sieć mitochondrialną z niewielką częstością występowania mitofagii.Jednak komórki wstępnie potraktowane mitochondrialnym rozprzęgaczem FCCP wykazały głęboki wzrost częstości występowania mitofagii. Mitofagię mierzono również za pomocą kolokalizacji LAMP2 i COXII. W celu wykrycia in vivo mitofagii u C. elegans, transgeniczne nicienie eksprymujące rozellę MT w komórkach mięśniowych ściany ciała potraktowano ośmioma milimolami parakwatu.Stwierdzono, że poziom indukcji mitofagii, na który wskazuje spadek współczynnika fluorescencji wrażliwego na pH, był znacznie obniżony u nicieni traktowanych parakwatem. Dodatkowo, zwiększona liczba zdarzeń kolokalizacyjnych między GPF z DCT-1 i LGG-1 ze stopioną DSR, oznacza stymulację mitofagii w odpowiedzi na stres oksydacyjny. Wreszcie, obrazy te reprezentują sygnały mito-Keima z wątroby i móżdżku myszy mito-Keima.Tkanki muszą być przechowywane w niskiej temperaturze i obrazowane tak szybko, jak to możliwe, ale po odpowiednim przygotowaniu mogą być wykorzystane do uzyskania wglądu w mitofagię w normalnych i patofizjologicznych warunkach. Zastosowanie tej techniki utorowało drogę naukowcom zajmującym się szeroko pojętą neurodegeneracją i biologią mitochondriów do badania funkcji mitochondriów w różnych systemach modelowych, w tym w hodowanych komórkach, robakach lub C.elegans i modelach mysich. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś zapoznać się z wieloma metodami, które można wykorzystać w ilościowej ocenie poziomów mitofagii zarówno u C.elegans, jak i myszy.

in-vitro-vivo-detection-mitophagy-human-cells-c-elegans

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film demonstruje test in vivo do badania mitofagii u Caenorhabditis elegans. Po wystawieniu nicieni na działanie leku indukującego mitofagię, występowanie mitofagii ocenia się na podstawie kolokalizacji między DCT-1, receptorem mitofagii na uszkodzonych mitochondriach, a autofagosomalnym białkiem błonowym LGG-1.

Test in vivo do wykrywania mitofagii u nicieni transgenicznych

Protokół jest opisany do wykrywania in vivo efektów inhibitorów mitochondrialnych w organizmie modelowym Caenorhabditis elegans oraz do identyfikacji potencjalnych związków wzmacniających. Protokół ten może być używany do badań przesiewowych bibliotek leków pod kątem związków modulujących funkcję mitochondriów.

Przesiewowy test in vivo dla modulatorów mitochondrialnych przy użyciu transgenicznych bioluminescencyjnych Caenorhabditis elegans

Opisujemy tutaj test fagocytozy z wykorzystaniem rozproszonych komórek embrionalnych Drosophila. Umożliwia nam łatwe i precyzyjne ilościowe określenie poziomów fagocytozy in vivo oraz identyfikację nowych cząsteczek wymaganych do fagocytozy komórek apoptotycznych.

Test fagocytozy na obecność komórek apoptotycznych w zarodkach Drosophila

Mitofagia, selektywna degradacja mitochondriów, jest związana z homeostazą mitochondriów i jest rozregulowana w różnych chorobach ludzkich. Jednak wygodne metody eksperymentalne do pomiaru aktywności mitofagii są bardzo ograniczone. Tutaj zapewniamy czuły test do pomiaru aktywności mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej.

Czuły pomiar mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu zależnego od pH reportera fluorescencyjnego mt-Keima

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Badanie mitofagii za pomocą mikroskopii elektronowej, czujników genetycznych i immunofluorescencji wymaga kosztownego sprzętu, wykwalifikowanego personelu i znacznej inwestycji czasu. Tutaj pokazujemy skuteczność komercyjnego zestawu barwników fluorescencyjnych w ilościowym określaniu procesu mitofagii zarówno w Caenorhabditis elegans, jak i w linii komórkowej raka wątroby.

Wykrywanie mitofagii w Caenorhabditis elegans i komórkach ssaków przy użyciu barwników specyficznych dla organelli

Ten protokół przedstawia dwie metody analizy ilościowej mitofagii w komórkach β trzustki: pierwsza, kombinacja przepuszczalnych dla komórek barwników specyficznych dla mitochondriów, a druga, genetycznie kodowany reporter mitofagii. Te dwie techniki są komplementarne i mogą być wdrażane w zależności od konkretnych potrzeb, co pozwala na elastyczność i precyzję w ilościowym podejściu do kontroli jakości mitochondriów.

Uzupełniające podejścia do badania strumienia mitofagii w komórkach β trzustki

Ten protokół zapewnia ustandaryzowane podejście do obrazowania morfologii mitochondriów w wielu tkankach C. elegans podczas starzenia.

Obrazowanie i ilościowe określanie morfologii mitochondriów u C. elegans podczas starzenia

Opisano metodę propagacji ludzkich guzów siatkówczaka u myszy. Komórki nowotworowe są wstrzykiwane bezpośrednio do oczu myszy z niedoborem odporności. Guzy wtórne zostały pomyślnie wywołane z wykorzystaniem zarówno komórek pobranych bezpośrednio z ludzkich guzów, jak i hodowanych tumorsfer.

Ustanowienie i propagacja guzów retinoblastomy ludzkiej u myszy z niedoborem odporności

Tutaj opisujemy, jak wykonywać zapisy wieloelektrodowe tkanki ludzkiej kory padaczkowej. Szczegółowo zademonstrowano resekcję tkanki padaczkowej, przygotowanie plastrów i zapisy wieloelektrodowe zdarzeń międzynapadowych i ictalowych.

Wieloelektrodowe zapisy pooperacyjnej tkanki korowej ludzkiego epilepsji

Poznaj metody wykrywania mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach. Techniki te pomagają badaczom zrozumieć mechanizmy molekularne i opracować nowe strategie terapeutyczne przeciwko chorobom neurodegeneracyjnym.

Wykrywanie mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach

Przeglądaj więcej filmów