Ukierunkowanie tioli cysteinowych na glikozylację białek rekombinowanych in vitro specyficzną dla miejsca

Ogólnym celem tej procedury jest włączenie reszt cysteiny do białek poprzez mutagenezę skierowaną na miejsce w natywnie glikozylowanych miejscach oraz zastosowanie metod przyłączania i oceny glukozy in vitro w celu oceny skuteczności i strukturalnych skutków glikozylacji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii strukturalnej, takie jak: jakie są strukturalne konsekwencje glikozylacji białek i jak te modyfikacje wpływają na podstawowe mechanizmy funkcjonowania? Głównymi zaletami tej techniki jest to, że można ją łatwo przystosować do badania lub obsługi glikozylacji.

Jest bardzo wydajny i można szybko ocenić zarówno perturbacje konstrukcji, jak i wydajność. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób, ponieważ zmienione wzorce glikozylacji są związane z kilkoma nowotworami i zaburzeniami neurodegeneracyjnymi. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat wpływu natywnie glikozylowanych białek, może również dostarczyć bardzo potrzebnych informacji na temat tego, jak zmienić wzorce glikozylacji, które mogą przyczyniać się do tego zakresu chorób.

Aby wprowadzić pojedynczą mutację cysteiny do wektora ekspresyjnego, należy przygotować dwie indywidualne probówki reakcyjne PCR. W pierwszej probówce dodaj przednią starter mutagenny, a w drugiej probówce dodaj odwrotny starter mutagenny. Dodaj końcowe stężenie buforu 1X PCR do obu probówek.

Następnie ustaw pięciocyklowy program dla dwóch oddzielnych probówek reakcyjnych PCR. Dodaj czas przedłużenia o siedem i pół minuty w temperaturze 72 stopni Celsjusza pod koniec piątego cyklu. Po zakończeniu pięciu cykli wymieszaj dwie oddzielne reakcje PCR w jednej probówce, odwiruj probówkę przez około trzy sekundy i powtórz dodatkowe 20 cykli w tych samych warunkach PCR.

Następnie uruchom 15 mikrolitrów próbki na 1% żelu agarozowym DNA o napięciu 120 woltów przez 40 minut. Następnie zanurz żel w wodzie zawierającej 0,5 miligrama na mililitr bromku etydyny i potrząsaj nim w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie potwierdź amplifikację matrycy w świetle UV o długości fali 302 nanometrów.

Następnie dodaj 0,5 mikrolitra enzymu restrykcyjnego DPN1 do pozostałych 25 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej PCR. Inkubuj mieszaninę przez dwie i pół godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby strawić metylowany matrycowy DNA. Następnie dodaj około pięciu do 10 mikrolitrów strawionej mieszaniny do 100 mikrolitrów komórek E. coli kompetentnych do szoku cieplnego i inkubuj na lodzie przez 60 minut.

Następnie poddaj mieszaninie komórka-DNA szok termiczny w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 45 sekund na suchym bloku grzewczym. Następnie natychmiast inkubuj mieszaninę na lodzie przez trzy minuty. Następnie dodaj 900 mikrolitrów bulionu LB do komórek i przenieś zawiesinę do sterylnej 14-mililitrowej probówki z okrągłym dnem.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z ciągłym wytrząsaniem przy 190 obr./min przez 90 minut. Następnie rozprowadź odwirowany osad komórkowy na płytkach agarowych uzupełnionych antybiotykiem. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin.

Następnego dnia aseptycznie zaszczepij pojedynczą kolonię z płytki do pięciu mililitrów pożywki LB uzupełnionej antybiotykiem. Następnie hoduj kulturę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy ciągłym potrząsaniu. Przekształć zmutowany plazmid reszty cysteiny w komórki E. coli poprzez szok cieplny, a następnie hodowanie kultury przez noc w pożywce LB uzupełnionej antybiotykiem.

Następnego dnia bezpośrednio rozprowadź 150 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na płytkach agarowych LB uzupełnionych kanamycyną i trzymaj płytki do inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia należy aseptycznie przenieść pojedynczą rodzinę w 20 mililitrach pożywki LB do kolby Erlenmeyera i pozostawić do inkubacji na noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieś nocną kulturę do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.

Następnie osadzać komórki, odwirowując płynną kulturę przez noc w temperaturze 2 400 razy G przez 15 minut. Następnie dodaj 10 mililitrów minimalnej pożywki M9 do osadu komórkowego, a następnie zawieś mieszaninę komórkową w jednym litrze pożywki M9 zawierającej kanamycynę. Kontynuuj hodowlę płynnej kultury M9 w temperaturze 37 stopni Celsjusza ze stałym wstrząsaniem przy około 190 obr./min, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie około 0,6 do 0,8.

Następnie dodaj 200 mikromoli IPTG do kultury M9 w celu indukowania ekspresji białka i pozostaw kulturę do wzrostu na noc. Następnego dnia osadź komórki bakteryjne z nocnej hodowli, wirując w temperaturze około 10 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Za pomocą 10-mililitrowej zmotoryzowanej pipety transferowej homogenizuj zamrożone osady komórek bakteryjnych w około 40 mililitrach buforu homogenizacyjnego.

Następnie inkubować homogenat w piecu do hybrydyzacji przez 90 minut ze stałą rotacją. Odwirować mieszaninę w temperaturze około 15 000 razy G w temperaturze ośmiu stopni Celsjusza przez 40 minut, aby oddzielić rozpuszczalną frakcję białkową od nierozpuszczalnego osadu. Następnie dodać 50% objętościowo zawiesiny agarozy z kwasem niklowo-nitrylotroctowym do supernatantu i inkubować przez inwersję w piecu do hybrydyzacji przez 90 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie użyj kolumny do oczyszczania białek grawitacyjnie, aby zebrać kulki agarozy z białkiem znakowanym heksahistydyną przyłączonym do niklu. Na koniec trzykrotnie umyj zebrane koraliki agarozy. Eluować białka w szeregu dwóch mililitrowych frakcji.

Następnie potwierdź oczyszczone białko znakowane heksahistydyną w eluowanych frakcjach, uruchamiając żel Coomassie barwiony na niebiesko SDS-PAGE. Połączyć eluowane frakcje białkowe w membranie dializacyjnej z odciętą masą cząsteczkową 3 500 daltonów i inkubować w buforze do ponownego składania w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc z mieszaniem magnetycznym. Następnie dodać około jednej jednostki trombiny na miligram białka do białka zgromadzonego w błonie dializacyjnej i ponownie inkubować przez jeden dzień w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia należy wyjąć białko z worka dializacyjnego i zagęścić je około dziesięciokrotnie za pomocą koncentratora odśrodkowego do ultrafiltracji z wartością graniczną masy cząsteczkowej 10 000 daltonów. Następnie ponownie rozcieńczyć koncentrat białkowy około 20-krotnie w buforze do ponownego fałdowania bez chlorku sodu. Aby oczyścić białko, należy je załadować do wstępnie wypełnionej kolumny wymieniacza anionowego zrównoważonej tym samym buforem wolnym od chlorku sodu.

Rozpocząć elucję białek w gradiacji od zera do 60% jednego molowego chlorku sodu zawierającego bufor do ponownego fałdowania. Przenieść zebrane frakcje białkowe do worka do dializy. Przeprowadź etap dializy w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby wymienić białko do eksperymentalnego buforu do ponownego fałdowania o optymalnym stężeniu molowym chlorku sodu.

Najpierw dializuj 1,5 mililitra około 60 mikromolowych białek w jednym litrze buforu modyfikującego do glikozylacji białka. Po 24 godzinach, w temperaturze czterech stopni Celsjusza, przenieś zmodyfikowane białko do probówki mikrowirówkowej i dodaj rozpuszczoną w DMSO glukozę-5-MTS do końcowego stężenia dwóch milimolów. Delikatnie postukać w probówkę mikrowirówki co 10 minut, jednocześnie inkubując próbkę w ciemności przez godzinę w temperaturze otoczenia.

Po inkubacji należy przeprowadzić dializę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu ponownej wymiany białka do końcowego buforu doświadczalnego. Zmierz dokładną masę białka za pomocą spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą. Na koniec użyj roztworu NMR, aby obliczyć wydajność modyfikacji i zidentyfikować zmiany strukturalne glikozylowanych reszt cys w białku.

Udany mutacyjny amplifikowany matrycowy DNA PCR jest pokazany w tym reprezentatywnym żelu agarozowym 1% DNA. Drabinka DNA i równoważna ilość matrycowego DNA, która nie została amplifikowana metodą PCR, są używane jako kontrole w żelu. Najwyższe pasmo z barwieniem bromkiem etydyny o wysokiej intensywności pokazuje amplifikowany szablon o pożądanym rozmiarze.

Następnie białko oczyszczono za pomocą kolumny wymieniacza anionowego. Chromatogram pokazuje profil elucji obserwowany przy 280 nanometrach w kolorze niebieskim, wykazujący trzy piki eluujące w stosunku do gradientu chlorku sodu wskazanego na czerwono ze wzrostem stężenia aż do 0,6 mola. Dolny panel przedstawia zabarwiony na niebiesko żel SDS-PAGE Coomassie z frakcjami białkowymi.

Glikozylację reszt cysteiny oznaczono metodą spektrometrii mas z jonizacją w elektrorozpylaniu. Chromatogram przedstawia masy niemodyfikowanego i modyfikowanego białka przed i po glikozylacji reszty cysteiny. W celu potwierdzenia wykonano NMR w roztworze, pokazując widmową nakładkę HSQC zmian chemicznych amidów specyficznych dla pozostałości, wskazując zarówno na modyfikacje, jak i zaburzenia strukturalne białka glikozylowanego.

Po opanowaniu wszystkie etapy od mutagenezy do oceny NMR można zakończyć w ciągu około 12 dni, z wyłączeniem czasu oczekiwania na syntezę starterów, sekwencjonowanie DNA i usługi spektroskopii mas. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o ocenie strukturalnych i biofizycznych skutków mutacji cysteiny przy braku modyfikacji tiolu jako podstawowych pomiarów kontrolnych. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak stabilność, struktura drugorzędowa, wiązanie jonów, ocena interakcji białko-białko, aby ujawnić, w jaki sposób glikozylacja wpływa na właściwości biofizyczne podstawowych funkcji białka.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się sygnalizacją wapniową do indywidualnej i kumulacyjnej oceny ról asparaginy 131 i asparaginy 171 oraz glikozylacji w interakcji zrębowej cząsteczki 1 sygnalizacji wapniowej związanej z wejściem wapnia w magazynie.