Name: Ukierunkowanie tioli cysteinowych na glikozylację białek rekombinowanych in vitro specyficzną dla miejsca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Poznaj metodę ukierunkowanej glikozylacji białek rekombinowanych poprzez modyfikację tioli cysteinowych. Technika umożliwia szybką ocenę efektywności i strukturalnych skutków glikozylacji, co jest kluczowe dla zrozumienia funkcji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez Kanadyjską Radę ds. Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (05239 do P.B.S.), Kanadyjską Fundację Innowacji/Fundusz Badawczy Ontario (do P.B.S.), Fundację Walki z Rakiem Prostaty - Telus Ride for Dad (do P.B.S.) oraz Ontario Graduate Scholarship (do Y.J.C. i N.S.).

Glikozylacja białek jest modyfikacją potranslacyjną, w której cukry są kowalencyjnie przyłączone do polipeptydów głównie poprzez wiązania z łańcuchami bocznymi aminokwasów. Aż 50% białek ssaków jest glikozylowanych 54, gdzie glikozylowane białka mogą następnie wywoływać różnorodne efekty, od zmiany powinowactwa wiązania biomolekularnego, wpływu na fałdowanie białek, zmiany aktywności kanałów, kierowania cząsteczek do degradacji i transportu komórkowego, by wymienić tylko kilka (przegląd w<sup clas...

Store powered calcium (Ca2+) entry (SOCE) jest główną drogą, za pomocą której komórki odpornościowe pobierają Ca2+ z przestrzeni zewnątrzkomórkowej do cytozolu. W limfocytach T receptory limfocytów T zlokalizowane na błonie komórkowej (PM) wiążą antygeny, które aktywują białkowe kinazy tyrozynowe (recenzja w 1,2,3). Kaskada fosforylacji prowadzi do aktywacji γ fosfolipazy (PLCγ), która następnie pośredniczy w hydrolizie 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu błonowego (2) do diacyloglicerolu i 1,4,5-trifosforanu inozytolu (IP3). IP3 jest małym dyfuzyjnym przekaźnikiem, który wiąże się z receptorami IP3 (IP3R) na retikulum endoplazmatycznym (ER), otwierając w ten sposób ten kanał receptorowy i umożliwiając Ca2 + spływ w dół gradientu stężeń od światła ER do cytozolu (recenzja w 4). Sygnalizacja receptorowa z receptorów sprzężonych z białkiem G i kinazy tyrozynowej w wielu innych pobudliwych i niepobudliwych typach komórek prowadzi do takiej samej produkcji IP3 i aktywacji IP3Rs.
Ze względu na skończoną pojemność magazynowania Ca2+ ER, uwalnianie za pośrednictwem IP3 i wynikający z tego wzrost cytozolowego Ca2+ jest tylko przejściowe; jednak to wyczerpanie światła ER Ca2+ głęboko wpływa na cząsteczkę interakcji zrębowej-1 (STIM1), białko transbłonowe typu I (TM) najczęściej występujące na błonie ER 5,6,7. STIM1 zawiera zorientowaną na światło domenę detekcyjną Ca2+ składającą się z pary EF-ręka i sterylnego motywu α (EFSAM). Trzy zorientowane cytozolowo domeny zwiniętych cewek są oddzielone od EFSAM pojedynczą domeną TM (przejrzane w 8). Po wyczerpaniu luminalu ER Ca2+, EFSAM ulega oligomeryzacji sprzężonej z destabilizacją 7,9, co powoduje strukturalne przegrupowania domen TM i coiled-coils 10. Kulminacją tych zmian strukturalnych jest uwięzienie STIM1 na skrzyżowaniach ER-PM 11,12,13,14 poprzez interakcje z fosfoinozytydami PM 15,16 i podjednostki Orai1 17,18. Białka Orai1 to podjednostki PM, które łączą się, tworząc kanały Ca2+ 19,20,21,22. Oddziaływania STIM1-Orai1 na połączeniach ER-PM ułatwiają konformację kanału Ca2 + aktywowanego uwalnianiem Ca2 + (CRAC), co umożliwia przemieszczanie się Ca2 + do cytozolu z wysokich stężeń przestrzeni zewnątrzkomórkowej. W komórkach odpornościowych utrzymujące się cytozolowe podwyższenie Ca2 + za pośrednictwem kanałów CRAC indukuje zależną od Ca2 + kalmoduliny / kalcyneuryny defosforylację czynnika jądrowego aktywowanych limfocytów T, który następnie dostaje się do jądra i rozpoczyna regulację transkrypcji genów promujących aktywację komórek T 1,3. Proces aktywacji kanału CRAC przez STIM1 23,24 poprzez indukowane przez agonistę zubożenie luminalu Ca2+ ER i wynikające z tego trwałe podwyższenie cytozolowego Ca2+ jest zbiorczo określane jako SOCE 25. Istotna rola SOCE w limfocytach T jest oczywista w badaniach wykazujących, że dziedziczne mutacje zarówno w STIM1, jak i Orai1 mogą powodować ciężkie złożone zespoły niedoboru odporności 3,19,26,27. EFSAM inicjuje SOCE po wykryciu wyczerpania ER-luminalnego Ca2+ poprzez utratę koordynacji Ca2+ w kanonicznym EF-ręku, co ostatecznie prowadzi do samoasocjacji sprzężonej z destabilizacją 7,28,29.
Glikozylacja to kowalencyjne przyłączanie i przetwarzanie struktur oligosacharydowych, znanych również jako glikany, poprzez różne etapy biosyntezy w ER i Golgiego (przejrzane w 30,32,33). Istnieją dwa dominujące typy glikozylacji u eukariontów: sprzężone z N i O, w zależności od konkretnego aminokwasu i atomu łączącego wiązanie. W N-glikozylacji glikany są przyłączone do amidu łańcucha bocznego Asn i w większości przypadków etap inicjacji występuje w ER, gdy łańcuch polipeptydowy przemieszcza się do światła 34. Pierwszym etapem N-glikozylacji jest przeniesienie struktury rdzeniowej składającej się z czternastu cukrów składającej się z glukozy (Glc), mannozy (Man) i N-acetyloglukozaminy (GlcNAc) (tj. Glc3Man9GlcNAc2) z lipidu błony ER za pomocą oligosacharylotransferazy 35,36. Dalsze etapy, takie jak rozszczepienie lub przeniesienie reszt glukozy, są katalizowane w ER przez specyficzne glikozydazy i glikozylotransferazy. Niektóre białka, które opuszczają ER i przemieszczają się do Golgiego, mogą być dalej przetwarzane 37. O-glikozylacja odnosi się do dodawania glikanów, zwykle do grupy hydroksylowej łańcucha bocznego reszt Ser lub Thr, a ta modyfikacja zachodzi całkowicie w kompleksie Golgiego 33,34. Istnieje kilka struktur O-glikanów, które mogą składać się z N-acetyloglukozaminy, fukozy, galaktozy i kwasu sjalowego, przy czym każdy monosacharyd dodaje się kolejno 33.
Chociaż żadna konkretna sekwencja nie została zidentyfikowana jako warunek wstępny dla wielu typów O-glikozylacji, wspólna sekwencja konsensusu została powiązana z modyfikacją powiązaną z N: Asn-X-Ser/Thr/Cys, gdzie X może być dowolnym aminokwasem z wyjątkiem Pro 33. STIM1 EFSAM zawiera dwa z tych konsensusowych miejsc N-glikozylacji: Asn131-Trp132-Thr133 i Asn171-Thr172-Thr173. Rzeczywiście, poprzednie badania wykazały, że EFSAM może być N-glikozylowany w komórkach ssaków w Asn131 i Asn171 38,39,40,41. Jednak wcześniejsze badania nad konsekwencjami N-glikozylacji na SOCE były niespójne, sugerując stłumiony, wzmocniony lub brak wpływu tej potranslacyjnej modyfikacji na aktywację SOCE 38,39,40,41. W związku z tym badania nad biofizycznymi, biochemicznymi i strukturalnymi konsekwencjami N-glikozylacji EFSAM są niezbędne do zrozumienia regulacyjnych skutków tej modyfikacji. Ze względu na wymóg wysokiego poziomu jednorodnych białek w tych eksperymentach in vitro, zastosowano podejście selektywne miejscowo polegające na kowalencyjnym przyłączaniu ugrupowań glukozy do EFSAM. Co ciekawe, glikozylacja Asn131 i Asn171 spowodowała zmiany strukturalne, które zbiegają się w rdzeniu EFSAM i poprawiają właściwości biofizyczne, które promują SOCE za pośrednictwem STIM1 42.
Chemiczne powiązanie grup glikozylowych z tiolami Cys zostało dobrze potwierdzone przez przełomowe prace, które najpierw wykazały użyteczność tego bezenzymatycznego podejścia do zrozumienia specyficznego dla miejsca wpływu glikozylacji na funkcję białka 43,44. Niedawno, w odniesieniu do STIM1, reszty Asn131 i Asn171 zostały zmutowane do Cys, a glukoza-5-(metanothiosiulfonian) [glukoza-5-(MTS)] została użyta do kowalencyjnego powiązania glukozy z wolnymi tiolami <klasa sup = "xref">42. W tym miejscu opisujemy to podejście, które nie tylko wykorzystuje mutagenezę do włączenia specyficznych dla miejsca reszt Cys do modyfikacji, ale także stosuje spektroskopię magnetycznego rezonansu jądrowego w roztworze (NMR) do szybkiej oceny zarówno wydajności modyfikacji, jak i zaburzeń strukturalnych w wyniku glikozylacji. Warto zauważyć, że tę ogólną metodologię można łatwo dostosować do badania skutków O- lub N-glikozylacji dowolnego rekombinowanego białka.

<table><tbody><tr><td>Polimeraza DNA Phusion</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td>Użyj w kroku 1.3.</td></tr><tr><td>Generuler 1kb DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FERSM1163</td><td>Użyj w kroku 1.6.</td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny DpnI</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>R0176</td><td>Użyć w kroku 1.8.</td></tr><tr><td>Zestaw plazmidu Presto Mini GeneAid</td><td>, Inc.</td><td>PDH300</td><td>Użyj w kroku 1.16.</td></tr><tr><td>BL21 DE3 kodon (+) E. coli</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>230280</td><td>Użyj w kroku 2.1.</td></tr><tr><td>DH5a E. coli</td><td>Invitrogen, Inc.</td><td>18265017</td><td>Użyj w kroku 1.9.</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy 0,22 mm</td><td>Millipore, Inc.</td><td>SLGV033RS</td><td>Użyj w kroku 2.3.</td></tr><tr><td>HisPur Ni2+-NTA Żywica agarozowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88221</td><td>Użyj w kroku 3.3.</td></tr><tr><td>3,500 Da MWCO Rurki do dializy</td><td>BioDesign, Inc.</td><td>D306</td><td>Użyć w krokach 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 i 4.6.</td></tr><tr><td>Trombin bydlęcy</td><td>BioPharm Laboratories, Inc.</td><td>SKU91-055</td><td>Użyj w kroku 3.9.</td></tr><tr><td>5 ml kolumny wymiennika anionowego HiTrap Q FF</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>17-5156-01</td><td>Użyj w kroku 3.11.</td></tr><tr><td>Glukoza-5-MTS</td><td>Toronto Research Chemicals, Inc.</td><td>G441000</td><td>Użyj w kroku 4.1.</td></tr><tr><td>Koncentratory odśrodkowe do ultrafiltracji Vivaspin 20</td><td>Sartorius, Inc.</td><td>VS2001</td><td>Użyj w krokach 3.11, 4.2, 4.5 i 4.6.</td></tr><tr><td>PageRuler Niebarwiona szeroka drabinka białkowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26630</td><td>Zastosowanie w krokach 3.7, 3.10 i 3.15</td></tr><tr><td>Kolumna wymiany anionowej HiTrap Q FF</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>17-5053-01</td><td>Użyj w kroku 3.12.</td></tr>System <tr><td>chromatografii cieczowej AKTA Pure Fast Protein</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>29018224</td><td>Użyj w kroku 3.14.</td></tr><tr><td>Spektrometr NMR Varian Inova 600 MHz</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td>Użyj w krokach 5.2 i 5.5.</td></tr></tbody></table>

ukierunkowanie tioli cysteinowych na glikozylację białek rekombinowanych in vitro specyficzną dla miejsca

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Molekuła interakcji zrębowej-1 (STIM1) jest białkiem transbłonowym typu I zlokalizowanym na retikulum endoplazmatycznym (ER) i błonach plazmatycznych (PM). STIM1 rezydent ER reguluje aktywność kanałów PM Orai1 w procesie znanym jako wejście wapnia w magazynie (Ca2 +), które jest głównym procesem sygnalizacyjnym Ca2 +, który napędza odpowiedź immunologiczną. STIM1 ulega potranslacyjnej N-glikozylacji w dwóch luminalnych miejscach Asn w domenie wykrywania Ca2+ cząsteczki. Jednak biochemiczne, biofizyczne i strukturalne efekty biologiczne N-glikozylowanego STIM1 były do niedawna słabo poznane ze względu na niezdolność do łatwego uzyskania wysokich poziomów jednorodnego białka N-glikozylowanego. W tym miejscu opisujemy implementację podejścia chemicznego in vitro, które przyłącza ugrupowania glukozy do określonych miejsc białkowych, co ma zastosowanie do zrozumienia leżącego u podstaw wpływu N-glikozylacji na strukturę i mechanizm białka. Za pomocą roztworowej spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego oceniamy zarówno skuteczność modyfikacji, jak i strukturalne konsekwencje przyłączenia glukozy do pojedynczej próbki. Podejście to można łatwo zaadaptować do badania niezliczonych glikozylowanych białek występujących w przyrodzie.

Pierwszym krokiem tej metody jest wprowadzenie mutagenezy do kandydujących reszt glikozylacji, zamieniając je na reszty Cys, które mogą być modyfikowane za pomocą glukozy-5-MTS. EFSAM nie posiada naturalnych reszt Cys, więc przed przeprowadzeniem mutagenezy nie trzeba uwzględniać żadnych szczególnych warunków. Jednak naturalne reszty Cys należy najpierw zmienić na niemodyfikowalne reszty przed przeprowadzeniem opisanej chemii. Aby minimalnie wpłynąć na naturalną strukturę, sugerujemy wyko...

Analizy biochemiczne i strukturalne glikozylowanych białek wymagają stosunkowo dużej ilości jednorodnych próbek. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę chemiczną specyficznej dla miejsca glikozylacji rekombinowanych białek oczyszczonych z bakterii poprzez celowanie w reaktywne tiole Cys.

Ukierunkowanie tioli cysteinowych na glikozylację białek rekombinowanych in vitro specyficzną dla miejsca

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Ogólnym celem tej procedury jest włączenie reszt cysteiny do białek poprzez mutagenezę skierowaną na miejsce w natywnie glikozylowanych miejscach oraz zastosowanie metod przyłączania i oceny glukozy in vitro w celu oceny skuteczności i strukturalnych skutków glikozylacji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii strukturalnej, takie jak: jakie są strukturalne konsekwencje glikozylacji białek i jak te modyfikacje wpływają na podstawowe mechanizmy funkcjonowania? Głównymi zaletami tej techniki jest to, że można ją łatwo przystosować do badania lub obsługi glikozylacji.Jest bardzo wydajny i można szybko ocenić zarówno perturbacje konstrukcji, jak i wydajność. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób, ponieważ zmienione wzorce glikozylacji są związane z kilkoma nowotworami i zaburzeniami neurodegeneracyjnymi. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat wpływu natywnie glikozylowanych białek, może również dostarczyć bardzo potrzebnych informacji na temat tego, jak zmienić wzorce glikozylacji, które mogą przyczyniać się do tego zakresu chorób.Aby wprowadzić pojedynczą mutację cysteiny do wektora ekspresyjnego, należy przygotować dwie indywidualne probówki reakcyjne PCR. W pierwszej probówce dodaj przednią starter mutagenny, a w drugiej probówce dodaj odwrotny starter mutagenny. Dodaj końcowe stężenie buforu 1X PCR do obu probówek.Następnie ustaw pięciocyklowy program dla dwóch oddzielnych probówek reakcyjnych PCR. Dodaj czas przedłużenia o siedem i pół minuty w temperaturze 72 stopni Celsjusza pod koniec piątego cyklu. Po zakończeniu pięciu cykli wymieszaj dwie oddzielne reakcje PCR w jednej probówce, odwiruj probówkę przez około trzy sekundy i powtórz dodatkowe 20 cykli w tych samych warunkach PCR.Następnie uruchom 15 mikrolitrów próbki na 1% żelu agarozowym DNA o napięciu 120 woltów przez 40 minut. Następnie zanurz żel w wodzie zawierającej 0,5 miligrama na mililitr bromku etydyny i potrząsaj nim w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie potwierdź amplifikację matrycy w świetle UV o długości fali 302 nanometrów.Następnie dodaj 0,5 mikrolitra enzymu restrykcyjnego DPN1 do pozostałych 25 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej PCR. Inkubuj mieszaninę przez dwie i pół godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby strawić metylowany matrycowy DNA. Następnie dodaj około pięciu do 10 mikrolitrów strawionej mieszaniny do 100 mikrolitrów komórek E. coli kompetentnych do szoku cieplnego i inkubuj na lodzie przez 60 minut.Następnie poddaj mieszaninie komórka-DNA szok termiczny w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 45 sekund na suchym bloku grzewczym. Następnie natychmiast inkubuj mieszaninę na lodzie przez trzy minuty. Następnie dodaj 900 mikrolitrów bulionu LB do komórek i przenieś zawiesinę do sterylnej 14-mililitrowej probówki z okrągłym dnem.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z ciągłym wytrząsaniem przy 190 obr./min przez 90 minut. Następnie rozprowadź odwirowany osad komórkowy na płytkach agarowych uzupełnionych antybiotykiem. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin.Następnego dnia aseptycznie zaszczepij pojedynczą kolonię z płytki do pięciu mililitrów pożywki LB uzupełnionej antybiotykiem. Następnie hoduj kulturę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy ciągłym potrząsaniu. Przekształć zmutowany plazmid reszty cysteiny w komórki E. coli poprzez szok cieplny, a następnie hodowanie kultury przez noc w pożywce LB uzupełnionej antybiotykiem.Następnego dnia bezpośrednio rozprowadź 150 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na płytkach agarowych LB uzupełnionych kanamycyną i trzymaj płytki do inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia należy aseptycznie przenieść pojedynczą rodzinę w 20 mililitrach pożywki LB do kolby Erlenmeyera i pozostawić do inkubacji na noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieś nocną kulturę do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.Następnie osadzać komórki, odwirowując płynną kulturę przez noc w temperaturze 2 400 razy G przez 15 minut. Następnie dodaj 10 mililitrów minimalnej pożywki M9 do osadu komórkowego, a następnie zawieś mieszaninę komórkową w jednym litrze pożywki M9 zawierającej kanamycynę. Kontynuuj hodowlę płynnej kultury M9 w temperaturze 37 stopni Celsjusza ze stałym wstrząsaniem przy około 190 obr./min, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie około 0,6 do 0,8.Następnie dodaj 200 mikromoli IPTG do kultury M9 w celu indukowania ekspresji białka i pozostaw kulturę do wzrostu na noc. Następnego dnia osadź komórki bakteryjne z nocnej hodowli, wirując w temperaturze około 10 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Za pomocą 10-mililitrowej zmotoryzowanej pipety transferowej homogenizuj zamrożone osady komórek bakteryjnych w około 40 mililitrach buforu homogenizacyjnego.Następnie inkubować homogenat w piecu do hybrydyzacji przez 90 minut ze stałą rotacją. Odwirować mieszaninę w temperaturze około 15 000 razy G w temperaturze ośmiu stopni Celsjusza przez 40 minut, aby oddzielić rozpuszczalną frakcję białkową od nierozpuszczalnego osadu. Następnie dodać 50% objętościowo zawiesiny agarozy z kwasem niklowo-nitrylotroctowym do supernatantu i inkubować przez inwersję w piecu do hybrydyzacji przez 90 minut w temperaturze pokojowej.Następnie użyj kolumny do oczyszczania białek grawitacyjnie, aby zebrać kulki agarozy z białkiem znakowanym heksahistydyną przyłączonym do niklu. Na koniec trzykrotnie umyj zebrane koraliki agarozy. Eluować białka w szeregu dwóch mililitrowych frakcji.Następnie potwierdź oczyszczone białko znakowane heksahistydyną w eluowanych frakcjach, uruchamiając żel Coomassie barwiony na niebiesko SDS-PAGE. Połączyć eluowane frakcje białkowe w membranie dializacyjnej z odciętą masą cząsteczkową 3 500 daltonów i inkubować w buforze do ponownego składania w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc z mieszaniem magnetycznym. Następnie dodać około jednej jednostki trombiny na miligram białka do białka zgromadzonego w błonie dializacyjnej i ponownie inkubować przez jeden dzień w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia należy wyjąć białko z worka dializacyjnego i zagęścić je około dziesięciokrotnie za pomocą koncentratora odśrodkowego do ultrafiltracji z wartością graniczną masy cząsteczkowej 10 000 daltonów. Następnie ponownie rozcieńczyć koncentrat białkowy około 20-krotnie w buforze do ponownego fałdowania bez chlorku sodu. Aby oczyścić białko, należy je załadować do wstępnie wypełnionej kolumny wymieniacza anionowego zrównoważonej tym samym buforem wolnym od chlorku sodu.Rozpocząć elucję białek w gradiacji od zera do 60% jednego molowego chlorku sodu zawierającego bufor do ponownego fałdowania. Przenieść zebrane frakcje białkowe do worka do dializy. Przeprowadź etap dializy w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby wymienić białko do eksperymentalnego buforu do ponownego fałdowania o optymalnym stężeniu molowym chlorku sodu.Najpierw dializuj 1,5 mililitra około 60 mikromolowych białek w jednym litrze buforu modyfikującego do glikozylacji białka. Po 24 godzinach, w temperaturze czterech stopni Celsjusza, przenieś zmodyfikowane białko do probówki mikrowirówkowej i dodaj rozpuszczoną w DMSO glukozę-5-MTS do końcowego stężenia dwóch milimolów. Delikatnie postukać w probówkę mikrowirówki co 10 minut, jednocześnie inkubując próbkę w ciemności przez godzinę w temperaturze otoczenia.Po inkubacji należy przeprowadzić dializę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu ponownej wymiany białka do końcowego buforu doświadczalnego. Zmierz dokładną masę białka za pomocą spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą. Na koniec użyj roztworu NMR, aby obliczyć wydajność modyfikacji i zidentyfikować zmiany strukturalne glikozylowanych reszt cys w białku.Udany mutacyjny amplifikowany matrycowy DNA PCR jest pokazany w tym reprezentatywnym żelu agarozowym 1% DNA. Drabinka DNA i równoważna ilość matrycowego DNA, która nie została amplifikowana metodą PCR, są używane jako kontrole w żelu. Najwyższe pasmo z barwieniem bromkiem etydyny o wysokiej intensywności pokazuje amplifikowany szablon o pożądanym rozmiarze.Następnie białko oczyszczono za pomocą kolumny wymieniacza anionowego. Chromatogram pokazuje profil elucji obserwowany przy 280 nanometrach w kolorze niebieskim, wykazujący trzy piki eluujące w stosunku do gradientu chlorku sodu wskazanego na czerwono ze wzrostem stężenia aż do 0,6 mola. Dolny panel przedstawia zabarwiony na niebiesko żel SDS-PAGE Coomassie z frakcjami białkowymi.Glikozylację reszt cysteiny oznaczono metodą spektrometrii mas z jonizacją w elektrorozpylaniu. Chromatogram przedstawia masy niemodyfikowanego i modyfikowanego białka przed i po glikozylacji reszty cysteiny. W celu potwierdzenia wykonano NMR w roztworze, pokazując widmową nakładkę HSQC zmian chemicznych amidów specyficznych dla pozostałości, wskazując zarówno na modyfikacje, jak i zaburzenia strukturalne białka glikozylowanego.Po opanowaniu wszystkie etapy od mutagenezy do oceny NMR można zakończyć w ciągu około 12 dni, z wyłączeniem czasu oczekiwania na syntezę starterów, sekwencjonowanie DNA i usługi spektroskopii mas. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o ocenie strukturalnych i biofizycznych skutków mutacji cysteiny przy braku modyfikacji tiolu jako podstawowych pomiarów kontrolnych. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak stabilność, struktura drugorzędowa, wiązanie jonów, ocena interakcji białko-białko, aby ujawnić, w jaki sposób glikozylacja wpływa na właściwości biofizyczne podstawowych funkcji białka.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się sygnalizacją wapniową do indywidualnej i kumulacyjnej oceny ról asparaginy 131 i asparaginy 171 oraz glikozylacji w interakcji zrębowej cząsteczki 1 sygnalizacji wapniowej związanej z wejściem wapnia w magazynie.

targeting-cysteine-thiols-for-vitro-site-specific-glycosylation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opiszemy metodę służącą do pomiaru kinetyki transportu jonów przez białka błonowe wraz z analizą zmian konformacyjnych w konkretnych miejscach z wykorzystaniem fluorescencji w pojedynczych komórkach. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku kanałów jonowych, transporterów i pomp jonowych, a także może być wykorzystana do określenia ograniczeń odległości między podjednostkami białek.

Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego

Opisano metodę analizy dostępności rozpuszczalnika grupy tiolowej reszt cysteinowych wirusa Maize rayado fino virus (MRFV) - wirusopodobnych cząstek (VLP), po których następuje reakcja sieciowania peptydów. Metoda wykorzystuje dostępność kilku grup chemicznych na powierzchni VLP, które mogą być celami dla określonych reakcji.

Analiza dostępności rozpuszczalników reszt cysteiny na cząstkach wirusopodobnych wirusa rayado fino kukurydzy wytwarzanych w roślinach Nicotiana benthamiana i sieciowanie peptydów z VLP

Przyczepienie się bakterii do komórek gospodarza jest kluczowym krokiem podczas kolonizacji i infekcji gospodarza. Protokół ten opisuje wytwarzanie rekombinowanych adhezyn sprzężonych z polimerami jako materiałów biomimetycznych, które umożliwiają analizę udziału poszczególnych adhezyn w tych procesach, niezależnie od innych czynników bakteryjnych.

Materiały biomimetyczne do charakteryzowania interakcji bakteria-gospodarz

Ten artykuł opisuje metody znakowania spinów kierowanych przez miejsce i odtwarzania pentamerycznych kanałów bramkowanych ligandem do badań elektronowego rezonansu paramagnetycznego. Protokół ten można dostosować do dowolnego białka błonowego. Opisana tutaj metoda rekonstytucji może być również stosowana do pomiarów patch-clamp prądów makroskopowych i jednokanałowych w zdefiniowanym układzie lipidowym.

Znakowanie spinowe skierowane w miejscu i badania spektroskopowe EPR kanałów jonowych bramkowanych ligandem pentamierycznym

Ten protokół szczegółowo opisuje ważne kroki wymagane do biokoniugacji białka zawierającego cysteinę z maleimidem, w tym oczyszczanie odczynników, warunki reakcji, oczyszczanie biokoniugatu i charakterystykę biokoniugatu.

Synteza biokoniugatów białkowych za pomocą chemii cysteiny-maleimidu

Protokół dla wysoce precyzyjnych eksperymentów FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki jest przedstawiony tutaj. Ponadto metodologia ta może być wykorzystana do identyfikacji trzech stanów konformacyjnych w domenie wiążącej ligand receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA). Wyznaczanie precyzyjnych odległości jest pierwszym krokiem w kierunku budowy modeli konstrukcyjnych w oparciu o eksperymenty FRET.

Wysoka precyzja FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki do określania struktury biomolekuły

Prezentujemy podejścia do biofizycznej i strukturalnej charakterystyki glikoprotein z fałdowaniem immunoglobulin za pomocą interferometrii biowarstwowej, izotermicznej kalorymetrii miareczkowej i krystalografii rentgenowskiej.

Charakterystyka glikoprotein z fałdem immunoglobulinowym za pomocą krystalografii rentgenowskiej i technik biofizycznych

W tym protokole opiszemy syntezę PODS, odczynnika na bazie fenyoksadiazolylu metylosulfonu do selektywnego przyłączania ładunków do tioli biomolekuł, szczególnie przeciwciał. Ponadto opiszemy syntezę i charakterystykę dwufunkcyjnego chelatora nośnego POD oraz jego koniugację z modelowym przeciwciałem.

Synteza i biokoniugacja odczynników tiolowo-reaktywnych do tworzenia immunokoniugatów modyfikowanych selektywnie

Rozszerzenie kodu genetycznego jest stosowane do wprowadzenia nienaturalnego aminokwasu posiadającego biorthogonalną grupę funkcyjną na białku nośnikowym w określonym miejscu. Funkcja biortogalna jest dalej wykorzystywana do selektywnego sprzęgania antygenu węglowodanowego w celu uzyskania jednorodnej szczepionki skoniugowanej glikokoniugatem.

Jednorodny glikokoniugat wytwarzany przez połączenie nienaturalnej inkorporacji aminokwasów i chemii kliknięć do celów szczepionkowych

Utlenianie tiolu białka ma znaczące implikacje w normalnych warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Opisujemy szczegóły ilościowej metody proteomiki redoks, która wykorzystuje wychwytywanie wspomagane żywicą, znakowanie izobaryczne i spektrometrię mas, umożliwiając specyficzną dla miejsca identyfikację i kwantyfikację odwracalnie utlenionych reszt cysteiny białek.

Wychwytywanie wspomagane żywicą w połączeniu z izobarycznym tandemowym etykietowaniem masy w celu multipleksowanej kwantyfikacji utleniania tiolu białek

Poznaj metodę ukierunkowanej glikozylacji białek rekombinowanych poprzez modyfikację tioli cysteinowych. Technika umożliwia szybką ocenę efektywności i strukturalnych skutków glikozylacji, co jest kluczowe dla zrozumienia funkcji białek.

Ukierunkowanie tioli cysteinowych na glikozylację białek rekombinowanych in vitro specyficzną dla miejsca

Przeglądaj więcej filmów