Mapowanie chromatyny dostępnej w całym genomie w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pomocą ATAC-Seq

Ogólnym celem tej wysokoprzepustowej metody wykorzystującej transpozazę jest identyfikacja dostępnych regionów chromatyny w ludzkim genomie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinach epigenomicznych, takich jak lokalizacja elementów regulatorowych w całym genomie. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest ona solidna, stosunkowo krótka i wymaga mniej materiału wyjściowego w porównaniu z innymi metodami pomiaru dostępności chromatyny, takimi jak sekwencja DNazy lub sekwencja FAIRE.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w krajobraz regulacyjny ludzkich limfocytów T, może być również stosowana do innych systemów, takich jak inne ludzkie komórki pierwotne, komórki rakowe, ludzkie próbki kliniczne, komórki innych ssaków i organizmów. Rozmrozić jednomililitrową porcję 10 milionów ludzkich PBMC i przenieść ją do 50-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów uzupełnionej pożywki RPMI. Oni odwirowują komórki w temperaturze 500 G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza.

Następnie usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w 15 mililitrach uzupełnionej pożywki RPMI. Następnie przenieś komórki do kolby hodowlanej T-75 i inkubuj je przez noc z nawilżaniem. Następnego dnia przenieś pływające komórki za pomocą sterylnej 25-mililitrowej pipety do 50-mililitrowej probówki.

Następnie policz żywe komórki, stosując wykluczenie błękitu trypanowego. Następnie wyizoluj komórki CD4-dodatnie od 10 milionów żywych, nieprzylegających PBMC za pomocą kolumny do separacji mikrokulek. Po wyizolowaniu komórek należy płytkować i aktywować limfocyty T w warunkach polaryzacji Th1 i Th2 zgodnie z protokołem tekstowym, a następnie wyizolować ich jądra.

Aby być, przygotuj świeży bufor do lizy i trzymaj go schłodzony na lodzie. Ponadto, przygotowując się do reakcji transpozycji, podgrzej wytrząsarkę termiczną do 37 stopni Celsjusza. Następnie załaduj pół miliona limfocytów T do 1,5-mililitrowych mikrorurek i wiruj je w temperaturze 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie umyj komórki jednym mililitrem zimnego PBS i powtórz cykl wirowania, ale teraz zawieś komórki w jednym mililitrze buforu do lizy zimna. Wymieszaj komórki delikatnym pipetowaniem, aby zapobiec zbyt dużemu zakłóceniu jąder. Następnie szybko weź 10-mikrolitrowe podwielokrotności, aby obserwować frakcję lizy komórek.

Upewnij się, że ogniwa są zimne i działają szybko. W ciągu pięciu minut przystąp do reakcji transpozycji. Na początek przenieś 100 000 jąder do mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra i wiruj próbkę w temperaturze 500 g przez 10 minut w zimnej wirówce.

Następnie delikatnie usuń supernatant. Następnie dodaj składniki reakcji transpozycji do jąder. Następnie ponownie zawiesić jądra za pomocą delikatnego pipetowania i inkubować jądra na wytrząsarce termicznej przy 500 RMP przez 30 minut, aby zakończyć reakcję transpozycji.

Następnie wykonaj etap oczyszczania DNA i wymyj fragmenty DNA w 20 mikrolitrach chlorowodorku Tris. Następnie użyj PCR, aby dokonać wstępnej amplifikacji bibliotek sekwencjonowania ATAC. Następnie oceń optymalną liczbę dodatkowych cykli potrzebnych do ostatecznej amplifikacji za pomocą ilościowej PCR.

Na podstawie zmierzonych wyników określ liczbę cykli potrzebnych do końcowej amplifikacji PCR bibliotek sekwencjonowania ATAC. Następnie wykonaj końcowe wzmocnienie. Ustawienie optymalnego rozmiaru fragmentów biblioteki DNA może usprawnić sekwencjonowanie nowej generacji.

Najpierw rozgrzej kulki magnetyczne do temperatury pokojowej i przygotuj świeży 70% etanol w wodzie wolnej od nukleaz. Następnie dodaj wodę wolną od nukleaz do bibliotek sekwencjonowania ATAC do objętości 100 mikrolitrów. Następnie dodaj 50 mikrolitrów zawieszonych kulek magnetycznych wiążących DNA.

Odpipetuj kulki do DNA co najmniej 10 razy i odczekaj pięć minut. Jeśli jakiekolwiek krople koralików utkną na ściance lub pokrywie rurki, krótko zakręć rurką. Teraz umieść próbkę obok magnesu na dwie minuty, a następnie przenieś supernatant do nowej mikroprobówki.

Zmierz objętość kolekcji i dodaj 70% objętości zawiesiny kulek magnetycznych. Wymieszaj koraliki jak poprzednio i pozwól im inkubować przez pięć minut przed kontynuowaniem. Następnie oddziel koraliki za pomocą magnesu na dwie minuty, a teraz wyrzuć supernatant.

Wciąż opierając się o magnes, dodaj do koralików 200 mikrolitrów 70% etanolu. Odczekaj 30 sekund, a następnie wyrzuć etanol i powtórz płukanie etanolem jeszcze raz. Zakończ pranie, całkowicie usuwając pozostały etanol i pozostawiając kulki do wyschnięcia na powietrzu przez pięć minut na magnesie.

W razie potrzeby krótko zakręć rurką i odessaj widoczny etanol za pomocą pipety o pojemności 10 mikrolitrów. Teraz wyjmij rurkę z magnesu i dodaj 22 mikrolitry chlorowodorku Tris. Po dwóch minutach umieść probówkę z powrotem na stojaku magnetycznym i pozwól, aby roztwór się klarował.

Następnie należy zebrać 20 mikrolitrów eluatu zawierającego przygotowaną bibliotekę i przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Ten protokół tworzy biblioteki sekwencjonowania ATAC, które zwykle mają od trzech do 20 nanogramów na mikrolitr. Po uruchomieniu w systemie do analizy integralności DNA mają one wygląd przypominający drabinę.

Kolejną ważną kontrolą jakości jest między innymi wzbogacenie kontroli dodatnich. W stosunku do kontroli ujemnych, trzecia para starterów powinna być wzbogacona co najmniej 25-krotnie, a czwarta para starterów powinna być wzbogacona co najmniej 75-krotnie. Po początkowych 10 milionach odczytów, jeśli próbka przejdzie wszystkie kluczowe parametry w pliku raportu FastQC, a 1 000 do 2 000 pików zostanie uzyskanych z wywołania szczytowego, wówczas biblioteka może być sekwencjonowana głębiej dla ponad 30 milionów odczytów.

Z bibliotek spełniających standardy jakości, tylko od sześciu do 20% odczytów jest mapowanych na genom mitochondrialny. Pozostałe unikalne odczyty są mapowane na referencyjny genom ludzki, a od siedmiu do 12% znajduje się w szczytach sekwencjonowania ATAC. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć biblioteki ATAC-seq, przesyłać i dostarczać sekwencjonowanie racji pokarmowych oraz analizować uzyskane dane.

Po opanowaniu przygotowanie biblioteki ATAC-seq można wykonać w ciągu jednego lub dwóch dni roboczych. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że być może trzeba będzie najpierw zoptymalizować niektóre kroki, takie jak liczba komórek i skład buforu do lizy na etapie izolacji jąder. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak immunoprecypitacja chromatyny, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, który czynnik transkrypcyjny wiąże się z otwartymi regionami chromatyny w badanych próbkach?