Name: Wykrywanie potencjału błony mitochondriów w celu badania apoptozy komórek HN4 indukowanej knockdownem CLIC4 in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: Poznaj metodę wykrywania potencjału błony mitochondriów w komórkach HN4 z użyciem rodaminu 123 i mikroskopii fluorescencyjnej. Ta technika umożliwia badanie apoptozy indukowanej knockdownem CLIC4 in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Uprzejmie dziękujemy Panu Chao Fang za hodowlę komórkową. Prace te były wspierane przez granty Chińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych (grant nr 81570403, 81371284); Fundacja Nauk Przyrodniczych Prowincji Anhui (grant nr 1408085MH158); Wybitny Młody Badacz Uniwersytetu Medycznego Anhui; Program wspierający dla wybitnych młodych talentów na uniwersytetach prowincji Anhui.

1. Hodowla komórkowa i transfekcja
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa 
	Uwaga: HN4, linia komórkowa HNSCC, została uzyskana od pacjentów z HNSCC14.
	<ol>
		<li>Hodowla komórek HN4 w zmodyfikowanym pożywce Eagle firmy Dulbecco (DMEM, 4,5 g/L glukozy) uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą i antybiotykami (100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfekcja komórek
	<ol>
		<li>Na dzień przed transfekcją umieścić 5 x 105 komórek w 2 ml / basenik pożywki hodowlanej bez antybiotyków na płytkach 6-dołkowych.</li>
		<li>Rozcieńczyć 100 pmol CLIC4 siRNA lub zaszyfrowany SiRNA w 250 μl zredukowanej pożywki surowicy, delikatnie. Rozcieńczyć 5 μl odczynnika liposomowego w 250 μl zredukowanej pożywki surowicy i inkubować przez 5 min. Połącz rozcieńczony siRNA z rozcieńczonym odczynnikiem liposomowym, delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodaj mieszaninę do każdej studzienki zawierającej komórki i pożywkę. Mieszaj delikatnie, kołysząc talerzem w przód iw tył. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 przez 24 godziny przed przystąpieniem do następującej procedury znakowania Rh123. Zastąp pożywkę normalną pożywką 4 godziny po transfekcji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Etykietowanie Rh123
Uwaga: Rh123 został wykorzystany do pomiaru MMP w komórkach HN41.
<ol>
	<li>Po leczeniu CLIC4 siRNA (sekcja 1) należy użyć komórek HN4 w płytkach 6-dołkowych do następnego leczenia. Ilość komórek HN4 w każdym studzience jest wystarczająca do powtórzenia eksperymentu 10 razy na szkiełkach nakrywkowych.</li>
	<li>Użyj pęsety, aby umieścić okrągłe szkiełka nakrywkowe na dnie nowych płytek 12-dołkowych. Liczba płytek jest ustawiana zgodnie z projektem eksperymentalnym (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Umieść 150 μl polilizyny 100 μg/ml na środku każdego szkiełka nakrywkowego wewnątrz płytek 12-dołkowych i odczekaj 2 minuty. Zwróć uwagę, aby nie umieszczać polilizyny na zewnątrz szkiełek nakrywkowych. Następnie dokładnie usuń polilizynę za pomocą pipetora (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Usuń pożywkę hodowlaną z komórek HN4 wewnątrz naczynia i dodaj 1 ml 0,25% trypsyny, aby odłączyć komórki. Po 6 minutach dodaj 2 ml pożywki hodowlanej, aby zneutralizować trypsynę. Delikatnie wymieszaj komórki HN4 za pomocą pipetora 5 razy i wysiew 2 - 6 x 104 komórki na okrągłych szkiełkach nakrywkowych. Umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Po 8 godzinach inkubacji inkubować komórki HN4 z 2 μmol/L Rh123 przez 40 minut w temperaturze 37 °C. Delikatnie wymieszać pożywkę kilka razy w górę iw dół, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie Rh123 w pożywce (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Przygotować wystarczającą ilość normalnego roztworu soli fizjologicznej (NPSS), aby uzyskać NPSS (w mmol/L): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 glukozy i 5 HEPES, pH 7,4). Rozgrzać do 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Użyj pęsety, aby usunąć szkiełka nakrywkowe i umyj pozostały płyn, na krótko umieszczając szkiełka nakrywkowe w podgrzanym buforze NPBS (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>Umieść szkiełka nakrywkowe na dnie komory ze stali nierdzewnej o pojemności 500 μl (patrz tabela materiałów) z wymiennym dnem szkiełka nakrywkowego o średnicy 25 mm uszczelnionym o-ringiem. Zamocuj to, dokręcając pokrywę komory (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>Dodać 450 μl podgrzanego buforu NPSS do zmontowanej komory i umieścić kąpiel pod polem widzenia mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego skaningowego skaningowego mikroskopu fluorescencyjnego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E).</li>
</ol>
3. Wykrycie MMP
<ol>
	<li>Powszechny mikroskop fluorescencyjny
	<ol>
		<li>Włącz mikroskop fluorescencyjny zgodnie z instrukcjami producenta. 
		UWAGA: Wspólny mikroskop fluorescencyjny został wykonany z światłowodowym źródłem światła z lampą rtęciową, zestawem filtrów FITC dla Rh123 (filtr wzbudzenia 480/40, lustro dichroiczne 505 LP i filtr emisyjny 535/40) w temperaturze pokojowej. Obiektyw 20X został wykorzystany do obrazowania żywych komórek.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie systemu obrazowania i wybierz przycisk "Nowy" z paska poleceń, aby rozpocząć nowy eksperyment (Rysunek 2A).</li>
		<li>Dostosuj pole widzenia i ostrość, aby znaleźć położenie komórek w białym świetle.</li>
		<li>Wyłącz światło i naciśnij przycisk, aby zamknąć białe światło. Kliknij przycisk "Ostrość" na pasku poleceń i wybierz "Rozpocznij ustawianie ostrości", aby włączyć fluorescencję. Znajdź ponownie lokalizację komórek za pomocą mikroskopu o wzbudzeniu 507 nm i długości fali emisji długoprzepustowej 529 nm (ustawionej przed eksperymentem). Dostosuj pole widzenia i ponownie ustaw ostrość w razie potrzeby (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
		<li>Wybierz pole widzenia zawierające tylko od 20 do 30 oddzielnych komórek HN4. Zmiana wewnątrzkomórkowego sygnału fluorescencji dla każdej komórki zostanie dokładnie zarejestrowana.</li>
		<li>Po uzyskaniu wyraźnego pola widzenia kliknij "Zamknij ostrość" na pasku ostrości. Kliknij "Acq One" na pasku poleceń, aby uzyskać jeden zestaw obrazów. Kliknij "Regiony" na pasku poleceń i kliknij przycisk "OK", aby edytować regiony pomiaru. 
		UWAGA: Na pasku Edytuj region można używać różnych kształtów regionów w zależności od badania.</li>
		<li>Aby dopasować do różnych kształtów poszczególnych komórek, wybierz narzędzie "Śledź region" i zakreśl region jednej pojedynczej komórki, a po zakończeniu kliknij dwukrotnie. Powtarzaj procedurę, aż wszystkie komórki zostaną zakreślone (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). Kliknij "Gotowe" i wybierz "Zapisz obrazy", aby znaleźć zapisaną lokalizację.</li>
		<li>Kliknij "Zeroclock " i szybko naciśnij F4, aby rozpocząć monitorowanie zmiany intensywności fluorescencji. Rejestruj zmianę intensywności fluorescencji w czasie rzeczywistym raz na 5 s przez 5 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
		<li>Gdy linia podstawowa się ustabilizuje, dodać 50 μl NPSS zmieszanych z 0,5 μl 100 mmol/L ATP do komory za pomocą pipetora. Pamiętaj, aby nie dotykać komory, aby uniknąć usunięcia pola widzenia (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E). 
		UWAGA: Obraz fluorescencyjny będzie rejestrowany przez 20 minut, a następnie eksperyment może się zakończyć za pomocą obsługi ręcznej. Czas trwania jest rutynowo ustalany na 20 minut, aby zaobserwować całą zmianę fluorescencji. Jednak ręczna operacja zatrzymania przechwytywania jest stosowana, gdy nieoczekiwane czynniki wpływają na stabilność krzywej lub gdy cały proces trwa krócej niż 20 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfokalny laserowy skaningowy mikroskop fluorescencyjny
	<ol>
		<li>Włącz konfokalny skaningowy mikroskop fluorescencyjny postępując zgodnie z instrukcjami producenta i otwórz dołączone oprogramowanie. 
		UWAGA: W tym przypadku Rh123 został wzbudzony przez laser argonowy ustawiony na 488 nm, a wyemitowany sygnał został zarejestrowany w zakresie 545 - 700 nm poprzez zastosowanie filtra TD488/543/633.</li>
		<li>Kliknij "Obiektyw" w menu "Acquire", aby wybrać soczewkę obiektywu olejowego 63X/1.4 N.A. Obserwuj próbkę i znajdź czyste pole widzenia pod polem świetlnym.</li>
		<li>Naciśnij przycisk "TL/IL", aby przełączyć się w tryb fluorescencji i wybierz odpowiednie filtry fluorescencyjne, aby znaleźć lokalizację komórki w ciemności za pomocą mikroskopu. Naciśnij "SHUTTER", aby chronić próbkę po zakończeniu obserwacji.</li>
		<li>W menu "Acquire" dostosuj odpowiedni kanał PMT i kliknij "Achieve", aby aktywować ustaloną ścieżkę optyczną (Rysunek 3A). Kliknij menu "Konfiguracja" i wybierz "Laser", aby określić potrzebny typ lasera. "Argon" jest zalecany dla tego protokołu (Rysunek 3B).</li>
		<li>Kliknij "Na żywo", aby uzyskać obraz w czasie rzeczywistym i upewnij się, że pole widzenia zawiera tylko 20 do 30 oddzielnych komórek HN4. Zmiana wewnątrzkomórkowego sygnału fluorescencji dla każdej komórki zostanie dokładnie zarejestrowana.</li>
		<li>Wybierz "xyt" w trybie akwizycji w podmenu "Akwizycja" pod menu "Nabycie" (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). Ustaw odpowiednio 5 s i 20 min dla interwału czasowego i czasu trwania. Kliknij "Zastosuj", gdy wszystkie parametry zostaną ustalone.</li>
		<li>W menu "Kwantyfikuj" użyj narzędzia "Rysuj polilinię", aby zakreślić obszar nagrywania każdej komórki. Wybierz "Profil linii" i wybierz "Start", aby przeprowadzić obserwację. Rejestruj zmianę intensywności fluorescencji w czasie rzeczywistym przez 5 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D - E).</li>
		<li>Gdy linia podstawowa się ustabilizuje, dodać 50 μl NPSS zmieszanych z 0,5 μl 100 mmol/L ATP do komory za pomocą pipetora. Pamiętaj, aby nie dotykać komory, aby uniknąć utraty pola widzenia. 
		UWAGA: Obraz fluorescencyjny będzie rejestrowany przez 20 minut, a następnie eksperyment zostanie zakończony.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Powszechny mikroskop fluorescencyjny
	<ol>
		<li>Włączaj mikroskop fluorescencyjny rutynowo postępując zgodnie z instrukcją obsługi. Otwórz oprogramowanie systemu obrazowania i wybierz przycisk "Otwórz" z paska poleceń, aby otworzyć zapisany eksperyment. Kliknij "Regiony" na "pasku poleceń" i kliknij przycisk "OK", aby edytować regiony pomiaru.</li>
		<li>Wybierz narzędzie "Śledź region" i zakreśl obszar jednej pojedynczej komórki, a po zakończeniu kliknij dwukrotnie. Powtarzaj procedurę, aż wszystkie komórki zostaną zakreślone. Kliknij "Gotowe" i wybierz przycisk "F4: do przodu", aby uzyskać ślad pokazujący intensywność fluorescencji.</li>
		<li>Po zakończeniu kliknij przycisk strzałki w dół znajdujący się w prawym dolnym rogu wykresu i kliknij "Pokaż dane wykresu" (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2F). Kliknij dwukrotnie "OK" i wybierz przycisk "Dane dziennika", aby otworzyć interfejs oprogramowania do przetwarzania danych. Kliknij ponownie "Dane dziennika" i znajdź zapisy fluktuacji intensywności fluorescencji w czasie rzeczywistym pojawiające się w arkuszu kalkulacyjnym. 
		UWAGA: Dla każdej komórki zmiany MMP zostały wyświetlone jako stosunek fluorescencji do intensywności przed zastosowaniem ATP lub TG (F1/F0). Każde dane dotyczące intensywności fluorescencji były średnią z 20 - 30 komórek. Dane dla Rh123 przedstawiono jako średnią ± SE. Wyniki z 2 grup przetestowano za pomocą dwustronnego niezależnego testu t, a wartość P <0,05 uznano za istotność statystyczną. Do przeprowadzenia analiz statystycznych w tym eksperymencie zastosowano oprogramowanie do analizy statystycznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfokalny laserowy skaningowy mikroskop fluorescencyjny
	<ol>
		<li>Włącz konfokalny mikroskop laserowy i zaloguj się do dołączonego oprogramowania, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Wybierz "Odpal", aby otworzyć nagrany eksperyment.</li>
		<li>Wybierz narzędzie "Profil stosu" w menu "Quantify", wybierz "Wszystko w jednym" z "Sortuj wykresy według kanałów i ROI".</li>
		<li>Użyj narzędzia "Rysuj wielokąt", aby zakreślić obszary komórek w celu obserwacji.</li>
		<li>Wybierz menu "Wykres" i kliknij prawym przyciskiem myszy, a następnie wybierz "Eksportuj do Excela", aby dodać wartości intensywności fluorescencji do arkusza kalkulacyjnego. Poniższa analiza jest zgodna z normalnymi mikroskopami fluorescencyjnymi (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3F).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+hypoxia+protects+cerebral+mitochondrial+function+from+calcium+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurol+Belg%22%5BJournal%5D)">Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload.</a> Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).</li>
<li>Gogol, P., Trzcińska, M., Bryła, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility%2C+mitochondrial+membrane+potential+and+ATP+content+of+rabbit+spermatozoa+stored+in+extender+supplemented+with+GnRH+analogue+%5Bdes-Gly10%2C+D-Ala6%5D-LH-RH+ethylamide%5BTitle%5D)+AND+%22Pol+J+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide.</a> Pol J Vet Sci. 17, (2014).</li>
<li>Machiels, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+management+of+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Prime+Rep%22%5BJournal%5D)">Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> F1000Prime Rep. 6, 44(2014).</li>
<li>Behera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+therapy+with+taxane+versus+non-taxane+containing+regimens+in+locally+advanced+squamous+cell+carcinomas+of+the+head+and+neck+%28SCCHN%29%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review.</a> Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).</li>
<li>Pancari, P., Mehra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+therapy+for+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Oncology+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).</li>
<li>Peretti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+channels+in+cancer%3A+Focus+on+chloride+intracellular+channel+1+and+4+%28CLIC1+AND+CLIC4%29+proteins+in+tumor+development+and+as+novel+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets.</a> Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).</li>
<li>Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+and+physiological+function+of+chloride+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular structure and physiological function of chloride channels.</a> Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).</li>
<li>Ponnalagu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+supporting+characterization+of+CLIC1%2C+CLIC4%2C+CLIC5+and+DmCLIC+antibodies+and+localization+of+CLICs+in+endoplasmic+reticulum+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Data+Brief%22%5BJournal%5D)">Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes.</a> Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).</li>
<li>Fernandez-Salas, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mtCLIC%2FCLIC4%2C+an+Organellular+Chloride+Channel+Protein%2C+Is+Increased+by+DNA+Damage+and+Participates+in+the+Apoptotic+Response+to+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53.</a> Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).</li>
<li>Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIC4%2C+an+intracellular+chloride+channel+protein%2C+is+a+novel+molecular+target+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Derm+Symp+P%22%5BJournal%5D)">CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy.</a> J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).</li>
<li>Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+CLIC4+Enhances+Autophagy+and+Triggers+Mitochondrial+and+ER+Stress-Induced+Apoptosis+in+Human+Glioma+U251+Cells+under+Starvation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation.</a> PloS one. 7, 39378(2012).</li>
<li>Ponnalagu, D., Singh, H. Anion Channels of Mitochondria. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPonnalagu%2C+D+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22">Handbook of Experimental Pharmacology</a>. , (2016).</li>
<li>Leanza, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+ion+channels+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular ion channels and cancer.</a> Front Physiol. 4, 227(2013).</li>
<li>Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+nine+new+head+and+neck+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oto-Laryngologica%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines.</a> Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).</li>
<li>Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Calcium-Activated+Chloride+Channel+ANO1%2FTMEM16A+Suppresses+Tumor+Growth+and+Invasion+in+Human+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer.</a> PloS one. 10, 0136584(2015).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+CLIC4%2FmtCLIC+enhances+hydrogen+peroxide-induced+apoptosis+in+C6+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells.</a> Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).</li>
<li>Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C2-ceramide+induces+cell+death+and+protective+autophagy+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells.</a> Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).</li>
<li>McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neurological+perspective+on+mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">A neurological perspective on mitochondrial disease.</a> Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).</li>
<li>Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+and+pathology+of+mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The genetics and pathology of mitochondrial disease.</a> J Pathol. 241, 236-250 (2017).</li>
<li>Zhang, W., Wang, X., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+induces+mitochondria-mediated+AIF+and+to+a+lesser+extent+caspase-9-dependent+apoptosis+in+human+lung+adenocarcinoma+ASTC-a-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells.</a> Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).</li>
<li>Bernardi, P., Rasola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+cell+death%3A+the+mitochondrial+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Calcium and cell death: the mitochondrial connection.</a> Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).</li>
<li>Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanidin-3-glucoside+Inhibits+ATP-induced+Intracellular+Free+Ca%282%2B%29+Concentration%2C+ROS+Formation+and+Mitochondrial+Depolarization+in+PC12+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells.</a> Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).</li>
<li>Paddock, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+practices+of+laser+scanning+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Principles and practices of laser scanning confocal microscopy.</a> Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).</li>
<li>Paddock, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+boldly+glow...+applications+of+laser+scanning+confocal+microscopy+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays+%3A+news+and+reviews+in+molecular%2C+cellular+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">To boldly glow... applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology.</a> BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jest dobrze udokumentowane, że kanały Cl− są niezbędne do utrzymania hemostazy środowiska wewnętrznego i odgrywają ważną rolę w proliferacji komórek i apoptozie15,16. Dlatego zrozumienie związku między interwencją ukierunkowaną na kanał jonowy a apoptozą jest bardzo potrzebne i znaczące, aby znaleźć lepsze podejście terapeutyczne dla różnych nowotworów17. Mitochondria utrzymują prawidłowy stan biologiczny komórki, a ich funkcja ...

Rh123 to kationowy barwnik fluorescencyjny, który służy jako wskaźnik potencjału transbłonowego. Rh123 jest zdolny do przenikania przez błonę komórkową i wnikania do macierzy mitochondrialnej w zależności od różnicy potencjałów wewnątrz i na zewnątrz błony1. Apoptoza prowadzi do uszkodzenia integralności błony mitochondrialnej. Pory przejściowe przepuszczalności mitochondriów (MPTP) otworzą się i doprowadzą do zapadnięcia się MMP, co z kolei spowoduje uwolnienie Rh123 na zewnątrz mitochondriów. Wreszcie, silniejszy sygnał zielonej fluorescencji zostanie wykryty pod mikroskopem fluorescencyjnym. Jest dobrze udokumentowane, że wyczerpanie MMP i podwyższona przepuszczalność błony są wczesnymi objawami apoptozy komórek2. Dlatego Rh123 może być stosowany do wykrywania zmian MMP i występowania apoptozy komórek.
Jako szósty najczęściej występujący rak na świecie, rak głowy i szyi poważnie pogarsza stan zdrowia człowieka3. Chociaż w ostatnich latach opracowano wiele podejść, wyniki kliniczne leczenia pacjentów cierpiących na raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) nadal nie są idealne4. Odkrywanie nowych metod terapeutycznych może poprawić leczenie HNSCC5. Kanały jonowe obejmujące liczne procesy biologiczne odgrywają ważną rolę w rozwoju różnych nowotworów6. Częściowy lub całkowity udział kanałów Cl jest silnie zaangażowany w różne właściwości transformacji nowotworowej, w tym aktywną migrację, wysoki wskaźnik proliferacji i inwazyjność. W związku z tym CLIC, nowa rodzina białek, została wymieniona jako obiecująca klasa celów terapeutycznych w leczeniu raka6,7. Ostatnie badania wykazały, że członkowie rodziny CLIC, w tym CLIC1, CLIC4 i CLIC5, lokalizują się w mitochondriach serca, a poziom reaktywnych form tlenu (ROS) jest regulowany w górę przez CLIC5, co wskazuje na funkcjonalną rolę mitochondrialnych kanałów Cl- w odpowiedzi apoptotycznej8. CLIC4, jeden z członków rodziny CLIC (znany również jako mtCLIC, P64H1 i RS43), został najszerzej przebadany pod kątem właściwości regulacji apoptozy w komórkach rakowych i lokalizacji subkomórkowej, w tym Golgiego, retikulum endoplazmatyczne i mitochondrium u ludzkich keratynocytów7,9,10. Profil ekspresji CLIC4 był regulowany przez czynnik martwicy nowotworu-α (TNF-α), P53 i bodziec zewnętrzny. Nadekspresja i regulacja w dół CLIC4 wywołują odpowiedź apoptotyczną głównie poprzez szlak mitochondrialny, której towarzyszy brak równowagi członków rodziny Bcl-2, aktywacja kaskady kaspazy i uwalnianie cytochromu C11,12,13. Dlatego pomiar MMP ma kluczowe znaczenie dla zbadania apoptozy związanej z CLIC4, a Rh123 służy jako idealny wskaźnik fluorescencji.
Niniejsze badanie opisuje szczegółowy protokół wykrywania MMP do badania apoptozy wywołanej przez knockdown CLIC4 w komórkach HN4. Rh123 jest używany jako sonda fluorescencyjna do obserwacji zmian MMP. Pod zwykłym mikroskopem fluorescencyjnym i konfokalnym skaningowym mikroskopem fluorescencyjnym można rozwiązać fluktuację MMP w czasie rzeczywistym. Szczegółowo omawiamy zalety i ograniczenia zastosowania konfokalnego laserowego skaningowego mikroskopu fluorescencyjnego, a także porównujemy go z innymi metodami. Protokół ten może być również stosowany w innych badaniach związanych z apoptozą.

<table><tbody><tr><td>Komórki HNSCC</td><td>ATCC</td><td>CRL-3241</td><td></td></tr><tr><td>Polilizyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P4981</td><td></td></tr><tr><td>Specyficzne siRNA dla ludzkiego CLIC4</td><td>Biomics</td><td>NM_013943</td><td>(numery dostępu, NM_013943; odpowiadające sekwencji cDNA 5-GCTGAAGGAGGACACAAAGA-3) i zakodowane siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) zostały zaprojektowane i uzyskane od firmy</td></tr> <tr><td>BiomicsOdczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000-015</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowana pożywka surowicy, GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51985-042</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina 123, FluoroPure grede</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R22420</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' smodified Eagle medium (DMEM, 4,5 g/L glukozy)</td> <td>Gibco</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, Australia Pochodzenie</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Beyotime</td><td>C0201</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk, 100X</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>LEICA. SP5-DMI6000-DIC</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Nikon Eclipse TE300</td><td>Nikon</td><td>N/A Metaflour</td><td></td></tr><tr><td>, V7.5.0.0</td><td>Universal Imaging Corporation</td><td>N/A Pakiet</td><td></td></tr><tr><td>aplikacji Leica, v2.6.0.7266</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel 2007</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sigma Plot 12.5</td><td>Systat Software</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>komory komórek attofluorowych</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A7816</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie potencjału błony mitochondriów w celu badania apoptozy komórek hn4 indukowanej knockdownem clic4 in vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Wyczerpanie potencjału błony mitochondrialnej (MMP, ΔΨm) jest uważane za najwcześniejsze zdarzenie w kaskadzie apoptotycznej. Występuje nawet przed charakterystykami apoptozy jądrowej, w tym kondensacją chromatyny i pękaniem DNA. Gdy MMP zapadnie się, apoptoza komórek rozpocznie się nieodwracalnie. Szereg lipofilowych barwników kationowych może przechodzić przez błonę komórkową i agregować się w macierzy mitochondrium i służyć jako marker fluorescencyjny do oceny zmiany MMP. Jako jeden z sześciu członków rodziny kanałów wewnątrzkomórkowych Cl- (CLIC), CLIC4 uczestniczy w procesie apoptozy komórki, głównie poprzez szlak mitochondrialny. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół pomiaru MMP poprzez monitorowanie fluktuacji fluorescencji rodaminy 123 (Rh123), za pomocą którego badamy apoptozę wywołaną knockdownem CLIC4. Szczegółowo omawiamy zalety i ograniczenia zastosowania konfokalnego skaningu laserowego i zwykłego mikroskopu fluorescencyjnego, a także porównujemy je z innymi metodami.

W niniejszym badaniu do detekcji MMP zastosowano Rh123. Początkowo komórki HN4 hodowano na potrzeby następujących eksperymentów z barwieniem fluorescencyjnym. Za pomocą pęsety na dno płytek 6-dołkowych umieszczono okrągłe szkiełka nakrywki (Rycina 1A). Szkiełka nakrywki pokryto polilizyną przez 5 min, a następnie polilizynę usunięto za pomocą pipetora (Rycina 1B). Następnie komórki HN4 poddano tr...

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół zastosowania rodaminy 123 do identyfikacji potencjału błony mitochondrialnej (MMP) i badania indukowanej przez CLIC4 apoptozy komórek HN4 in vitro. Pod zwykłym mikroskopem fluorescencyjnym i konfokalnym laserowym skaningowym mikroskopem fluorescencyjnym zarejestrowano zmianę MMP w czasie rzeczywistym.

Wykrywanie potencjału błony mitochondriów w celu badania apoptozy komórek HN4 indukowanej knockdownem CLIC4 in vitro

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie cytobiologii, w tym zrozumieć apoptozę i dysfunkcję mitochondriów. Główną zaletą tej techniki jest to, że badacze mogą łatwo i prawidłowo monitorować w czasie rzeczywistym potencjał błony mitochondriów za pomocą rodaminy-123 w pojedynczej komórce. Hodowla linii komórkowej HN4 z raka płaskonabłonkowego komórek głowy i szyi, jak opisano w protokole tekstowym.Na dzień przed transfekcją umieść 0,5 miliona komórek w dwóch mililitrach na studzienkę pożywki hodowlanej bez antybiotyków na płytkach sześciodołkowych. Delikatnie rozcieńczyć 100 pikomoli małego interferującego RNA CLIC4 lub zaszyfrowanego małego interferującego RNA w 250 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy. Następnie rozcieńczyć pięć mikrolitrów odczynnika liposomowego w 250 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy i inkubować przez pięć minut.Połącz rozcieńczony mały interferujący RNA z rozcieńczonym odczynnikiem liposomowym i delikatnie wymieszaj. Dodaj mieszaninę do każdej studzienki zawierającej komórki w pożywce. Delikatnie wymieszaj, kołysząc talerzem w przód iw tył.Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze CO2. Zastąp po

detection-mitochondria-membrane-potential-to-study-clic4-knockdown

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy protokół opisuje metodę pomiaru przepływów wapnia w mitochondriach w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Metoda ta wykorzystuje ratiometryczny sensor wapnia oparty na cyklicznie permutowanej białku YFP z podwójnym wzbudzeniem (ratiometryczny pericam-mt), który jest selektywnie ekspresowany w mitochondriach.

Monitorowanie dynamicznych zmian poziomu wapnia w mitochondriach podczas apoptozy z wykorzystaniem genetycznie kodowanego sensora wapnia

Obrazowanie żywych komórek w celu analizy apoptozy pośredniczonej przez kaspazę-3 w unieśmiertelnionych kulturach komórek oligodendrocytów N19 z wykorzystaniem substratu kaspazy-3 NucView 488. Technika ta znajduje zastosowanie w testach programowanej śmierci komórki w czasie rzeczywistym w różnych typach komórek i tkanek.

Monitorowanie aktywności rozszczepionej kaspazy-3 i apoptozy unieśmiertelnionych komórek oligodendroglialnych z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek oraz rozszczepialnych fluorescencyjnych substratów barwiących po indukowanej potasem depolaryzacji błony

Opisano wpływ aktywacji izoformy kinazy białkowej C (PKC) na funkcje mitochondrialne związane z oddychaniem i fosforylacją oksydacyjną oraz na żywotność komórek. Podejście to adaptuje technikę adenowirusową w celu selektywnej nadekspresji izoform PKC w pierwotnych hodowlach komórkowych oraz szereg analiz służących do określenia funkcji mitochondriów i stanu energetycznego komórki.

Ocena funkcji mitochondriów i żywotności komórek w komórkach nerkowych z nadekspresją izoform kinazy białkowej C

Zmierzono wkład czynnika przebudowy chromatyny ACF w indukowaną przez E4orf4 śmierć komórek. Protokół obejmuje selekcję klonów komórkowych, w których traktowanie doksycykliną indukuje warunkowy knockdown podjednostek ACF: Acf1 i SNF2h, oraz zastosowanie testu z DAPI do pomiaru indukowanej przez E4orf4 śmierci komórek w indukowalnych liniach komórkowych.

Przygotowanie linii komórkowych do warunkowego wyciszenia ekspresji genu i pomiar efektów wyciszenia w odniesieniu do indukowanej przez E4orf4 śmierci komórek

Testy multipleksowe mogą dostarczyć korzystnych informacji dla podstawowych mechanizmów komórkowych i wyeliminować marnotrawstwo odczynników oraz niepotrzebne powtarzalne eksperymenty. Opisujemy tutaj multipleksowy test aktywności kaspazy-3/7, przy użyciu metod fluorescencyjnych i luminescencyjnych, w celu określenia żywotności komórek w modelu podwzgórza in vitro po prowokacji oksydacyjnej kwasem palmitynowym.

Zastosowanie testu multipleksowania kaspazy w celu określenia apoptozy w modelu komórkowym podwzgórza

Opisana tutaj jest metoda wykrywania i ilościowego oznaczania białek zewnętrznej błony mitochondrialnej poprzez immunoznakowanie mitochondriów wyizolowanych z tkanek gryzoni i analizę za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta może być rozszerzona o ocenę funkcjonalnych aspektów subpopulacji mitochondrialnych.

Immunodetekcja białek błony zewnętrznej za pomocą cytometrii przepływowej izolowanych mitochondriów

Termin anastasis odnosi się do zjawiska, w którym umierające komórki odwracają proces samobójstwa komórki na późnym etapie, naprawiają się i ostatecznie przeżywają. Tutaj pokazujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które przechodzą anastazę.

Strategie śledzenia anastazy, zjawiska przeżycia komórek, które odwraca apoptozę

Porównanie potencjału błony mitochondrialnej między próbkami dostarcza cennych informacji o stanie komórek. Opisano szczegółowe etapy izolacji mitochondriów i oceny odpowiedzi na inhibitory i rozprzęgacze za pomocą fluorescencji. Metoda i użyteczność tego protokołu są zilustrowane przez zastosowanie hodowli komórkowej i zwierzęcego modelu stresu komórkowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Mitofagia, proces oczyszczania uszkodzonych mitochondriów, jest niezbędny do homeostazy mitochondriów i utrzymania zdrowia. W tym artykule przedstawiono niektóre z najnowszych metod wykrywania mitofagii w komórkach ludzkich, Caenorhabditis elegans i myszach.

Wykrywanie mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach

Zrozumienie wpływu środowiskowych pestycydów chloroorganicznych (OCP) na funkcję mitochondriów w hepatocytach jest ważne dla zbadania mechanizmu OCP powodującego zaburzenia metaboliczne. W pracy przedstawiono szczegółowe metody wykrywania funkcji mitochondriów wątroby.

Eksperymentalny protokół wykrywania funkcji mitochondriów w hepatocytach narażonych na pestycydy chloroorganiczne

Tutaj pokazujemy procedury knockdownu FAM83A; testy wykrywające jego wpływ na proliferację, migrację i inwazję komórek raka szyjki macicy; oraz uwrażliwienie tych komórek na cisplatynę. Badanie to stanowi obiecujący gen docelowy dla raka szyjki macicy i punkt odniesienia dla dalszych badań nad lekami.

knockdown FAM83A w celu sprawdzenia jego roli we wzroście komórek raka szyjki macicy i wrażliwości na cisplatynę

Poznaj metodę wykrywania potencjału błony mitochondriów w komórkach HN4 z użyciem rodaminu 123 i mikroskopii fluorescencyjnej. Ta technika umożliwia badanie apoptozy indukowanej knockdownem CLIC4 in vitro.

Wykrywanie potencjału błony mitochondriów w celu badania apoptozy komórek HN4 indukowanej knockdownem CLIC4 in vitro

Przeglądaj więcej filmów