Wykrywanie potencjału błony mitochondriów w celu badania apoptozy komórek HN4 indukowanej knockdownem CLIC4 in vitro

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie cytobiologii, w tym zrozumieć apoptozę i dysfunkcję mitochondriów. Główną zaletą tej techniki jest to, że badacze mogą łatwo i prawidłowo monitorować w czasie rzeczywistym potencjał błony mitochondriów za pomocą rodaminy-123 w pojedynczej komórce. Hodowla linii komórkowej HN4 z raka płaskonabłonkowego komórek głowy i szyi, jak opisano w protokole tekstowym.

Na dzień przed transfekcją umieść 0,5 miliona komórek w dwóch mililitrach na studzienkę pożywki hodowlanej bez antybiotyków na płytkach sześciodołkowych. Delikatnie rozcieńczyć 100 pikomoli małego interferującego RNA CLIC4 lub zaszyfrowanego małego interferującego RNA w 250 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy. Następnie rozcieńczyć pięć mikrolitrów odczynnika liposomowego w 250 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy i inkubować przez pięć minut.

Połącz rozcieńczony mały interferujący RNA z rozcieńczonym odczynnikiem liposomowym i delikatnie wymieszaj. Dodaj mieszaninę do każdej studzienki zawierającej komórki w pożywce. Delikatnie wymieszaj, kołysząc talerzem w przód iw tył.

Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze CO2. Zastąp pożywkę normalną pożywką wzrostową cztery godziny po transfekcji. Kontynuuj inkubację komórek przez dodatkowe 20 godzin przed przystąpieniem do procedury znakowania rodaminy-123.

Po potraktowaniu komórek HN4 małymi interferującymi RNA CLIC4 na płytkach sześciodołkowych, za pomocą pęsety umieść okrągłe szkiełka nakrywkowe na dnie nowych płytek 12-dołkowych. Odpipetować 150 mikrolitrów po 100 mikrogramów na mililitr polilizyny na środku każdego szkiełka nakrywkowego wewnątrz płytek 12-dołkowych. Po dwóch minutach dokładnie usunąć polilizynę za pomocą pipetry.

Następnie usuń pożywkę hodowlaną z komórek HN4 wewnątrz naczynia i dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny, aby odłączyć komórki. Po sześciu minutach dodaj dwa mililitry pożywki hodowlanej, aby zneutralizować trypsynę. Delikatnie wymieszać komórki HN4 za pomocą pipetera pięć razy i wysiać komórki na okrągłych szkiełkach nakrywkowych.

Umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2. Po ośmiu godzinach inkubacji dodaj dwa mikromole na litr rodaminy-123 i delikatnie wymieszaj pożywkę kilka razy w górę iw dół, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie w pożywce. Inkubować komórki HN4 przez 40 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Użyj pęsety, aby usunąć szkiełka nakrywkowe i na krótko przenieś je do podgrzanego bufora NPSS, aby zmyć pozostały płyn. Umieść szkiełka nakrywkowe na dnie komory ze stali nierdzewnej o pojemności 500 mikrolitrów z wymiennym dnem szkiełka nakrywkowego o grubości 25 milimetrów, uszczelnionym na miejscu za pomocą pierścienia uszczelniającego o przekroju okrągłym. Zamocuj szkiełka nakrywkowe na miejscu, dokręcając pokrywę komory.

Dodać 450 mikrolitrów podgrzanego buforu NPSS do zmontowanej komory. Następnie umieść kąpiel pod polem widzenia mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego laserowego skaningowego mikroskopu fluorescencyjnego. Włącz mikroskop fluorescencyjny zgodnie z instrukcjami producenta.

Otwórz oprogramowanie systemu obrazowania i wybierz nowy przycisk z paska poleceń, aby rozpocząć nowy eksperyment. Dostosuj pole widzenia i ostrość, aby znaleźć lokalizację komórek w białym świetle. Następnie wyłącz światło i naciśnij przycisk, aby zamknąć białe światło.

Kliknij przycisk ostrości na pasku poleceń i wybierz rozpocznij ustawianie ostrości, aby włączyć fluorescencję. Znajdź ponownie lokalizację komórek za pomocą mikroskopu o wzbudzeniu 507 nanometrów i długości fali emisji długoprzepustowej 529 nanometrów. Dostosuj pole widzenia i w razie potrzeby ponownie ustaw ostrość.

Wybierz pole widzenia zawierające tylko od 20 do 30 oddzielnych komórek HN4. Po uzyskaniu wyraźnego pola widzenia kliknij przycisk zamykania ostrości na pasku ostrości. Następnie kliknij opcję Pobierz jeden na pasku poleceń, aby pobrać jeden zestaw obrazów.

Następnie kliknij regiony na pasku poleceń i kliknij przycisk OK, aby edytować regiony pomiaru. Aby dopasować je do różnych kształtów poszczególnych komórek, wybierz narzędzie do śledzenia regionu. Zakreśl obszar jednej pojedynczej komórki i kliknij dwukrotnie po zakończeniu.

Powtarzaj procedurę, aż wszystkie komórki zostaną zakreślone. Kliknij gotowe i wybierz zapisz obrazy, aby znaleźć zapisaną lokalizację. Kliknij zegar zerowy i szybko naciśnij F4, aby rozpocząć monitorowanie zmiany intensywności fluorescencji.

Rejestruj zmianę intensywności fluorescencji w czasie rzeczywistym raz na pięć sekund przez pięć minut. Gdy linia podstawowa się ustabilizuje, dodaj 50 mikrolitrów NPSS zmieszanych z 0,5 mikrolitra 100 milimoli na litr ATP do komory za pomocą pipetera. Włącz konfokalny skaningowy mikroskop fluorescencyjny z laserem konfokalnym zgodnie z instrukcjami producenta i otwórz dołączone oprogramowanie.

Kliknij obiektyw w menu uzyskiwania, aby wybrać obiektyw olejowy 63X 1.4 z aperturą numeryczną. Obserwuj próbkę i znajdź czyste pole widzenia pod polem świetlnym. Naciśnij przycisk wyboru światła, aby przełączyć się w tryb fluorescencji i wybierz odpowiednie filtry fluorescencyjne, aby znaleźć lokalizację komórki w ciemności za pomocą mikroskopu.

Naciśnij spust migawki, aby chronić próbkę po zakończeniu obserwacji. W menu pobierania dostosuj odpowiedni kanał PMT i kliknij przycisk osiągania, aby aktywować ustaloną ścieżkę optyczną. Kliknij menu konfiguracji i wybierz laser, aby określić wymagany typ lasera.

Kliknij na żywo, aby uzyskać obrazy w czasie rzeczywistym i upewnij się, że pole widzenia zawiera tylko 20 do 30 oddzielnych komórek HN4. Następnie wybierz XYT w trybie akwizycji w podmenu akwizycji w menu pozyskiwania. Ustaw pięć sekund dla przedziału czasu i 20 minut dla czasu trwania.

Kliknij przycisk Zastosuj, gdy wszystkie parametry zostaną wyrównane. W menu kwantyfikacji użyj narzędzia do rysowania polilinii, aby zakreślić obszar nagrywania każdej komórki. Wybierz profil linii i wybierz start do prowadzenia obserwacji.

Rejestruj zmianę intensywności fluorescencji w czasie rzeczywistym przez pięć minut. Gdy linia podstawowa się ustabilizuje, dodaj 50 mikrolitrów NPSS zmieszanych z 0,5 mikrolitra 100 milimoli na litr ATP do komory za pomocą pipetera. Aby przeprowadzić analizę statystyczną przy użyciu zwykłego mikroskopu fluorescencyjnego, otwórz oprogramowanie systemu obrazowania i wybierz przycisk otwierania na pasku poleceń, aby otworzyć zapisany eksperyment.

Kliknij regiony na pasku poleceń i kliknij przycisk OK, aby edytować regiony pomiaru. Wybierz narzędzie do śledzenia regionu. Zakreśl obszar jednej pojedynczej komórki i kliknij dwukrotnie po zakończeniu.

Powtarzaj procedurę, aż wszystkie komórki zostaną zakreślone. Kliknij Gotowe i wybierz przycisk F4 do przodu, aby uzyskać ślad pokazujący intensywność fluorescencji. Po zakończeniu kliknij przycisk strzałki w dół znajdujący się w prawym dolnym rogu wykresu i kliknij pokaż dane wykresu.

Kliknij dwukrotnie OK i wybierz przycisk danych dziennika, aby otworzyć interfejs oprogramowania do przetwarzania danych. Następnie ponownie kliknij dane dziennika, aby znaleźć zapisy fluktuacji intensywności fluorescencji w czasie rzeczywistym, które pojawiają się w arkuszu kalkulacyjnym. Pokazano tutaj reprezentatywne wyniki pokazujące indukowane przez ATP zmiany depolaryzacji mitochondriów w komórce HN4 pod wpływem różnych interwencji, rozwiązane przez powszechną mikroskopię fluorescencyjną.

Depolaryzacja błony mitochondrialnej gwałtownie wzrosła po leczeniu ATP i stopniowo powróciła do normalnego poziomu w obu grupach. Reprezentatywne ślady intensywności fluorescencji rodaminy-123 wskazują, że leczenie MMP CLIC4 małym interferującym RNA nasilało depolaryzację mitochondriów w porównaniu z grupą kontrolną. Reprezentatywny histogram ujawnił ponadto, że knockdown CLIC4 zwiększył depolaryzację mitochondriów w porównaniu z grupą kontrolną.

W tym przypadku reprezentatywne wyniki konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej pokazują również zmiany depolaryzacji mitochondriów w komórce HN4 wywołane przez ATP przy różnych interwencjach. Depolaryzacja błony mitochondrialnej gwałtownie wzrasta po leczeniu ATP i stopniowo wraca do normalnego poziomu w obu grupach. Reprezentatywne ślady intensywności fluorescencji rodaminy-123 pokazują, że traktowanie MMP małych interferujących RNA CLIC4 nasilało depolaryzację mitochondriów w porównaniu z grupą kontrolną.

Podobnie, reprezentatywny histogram ujawnił ponadto, że knockdown CLIC4 zwiększył depolaryzację mitochondriów w porównaniu z grupą kontrolną. Po obejrzeniu tego filmu lepiej zrozumiesz, jak używać rodaminy-123 do monitorowania potencjału błony mitochondrialnej w czasie rzeczywistym zarówno za pomocą normalnej mikroskopii fluorescencyjnej, jak i konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. Po opanowaniu, tę technikę mikroskopii z rodaminą-123 można wykonać w mniej niż 20 minut dla jednej próbki, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie kontaktować się z komorą w oczekiwaniu na proces skanowania. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak Western Blot i cytometria przepływowa, aby odpowiedzieć na dalsze pytania, takie jak to, czy wystąpiła apoptoza, czy martwica. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się nauką na żywo do zbadania dysfunkcji mitochondriów i znalezienia solidnych dowodów na apoptozę komórek w różnych żywych komórkach.

Nie zapominaj, że praca z rodaminą-123 może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i masek na twarz.