Name: Wytwarzanie szczepu Streptococcus mutans z zaburzeniami genetycznymi bez klonowania genów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Poznaj szybką metodę tworzenia szczepów Streptococcus mutans z zaburzeniami genetycznymi bez klonowania genów. Technika ta przyspiesza badania w dziedzinie mikrobiologii i genetyki bakterii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki [Granty o numerach 16K15860 dla T.M. i 15K15777 dla N.H.].

1. Projekt podkładu
<ol>
	<li>Przygotuj startery do 2-etapowej reakcji fuzyjnej PCR i weryfikacji rozerwania genu. 
	UWAGA: Tabela 1 przedstawia sekwencje starterów używane w tym protokole. Rysunek 1 przedstawia schematyczną ilustrację 2-etapowej metody fusion PCR używanej do generowania S. mutans ΔgtfC.
	<ol>
		<li>Zaprojektuj startery do zastąpienia regionu docelowego w genomie genem oporności na spektynomycynę (spcr)7. Protokół ten zastępuje cały region kodujący genu gtfC przez spcr.</li>
		<li>Uwzględnij 15 zasad uzupełniających górny i dolny koniec spcr w regionach 5' odpowiednio starterów góra-odwrócenie i dół-przód. Podobnie, uwzględnij 15 zasad uzupełniających dolny koniec górnych regionów flankujących gtfC i górny koniec dolnych regionów flankujących gtfC w regionach 5' odpowiednio starterów spcr-forward i spcr-reverse (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
		UWAGA: Sekwencje starterów góra-odwrócenie, dół-przód, spcr-naprzód i spcr-odwrócenie są automatycznie określane w zależności od miejsca włączenia konstruktu zakłócającego.</li>
		<li>Zaprojektuj startery góra-przód i dół-tył tak, aby zawierały odpowiednio >1 kb regionów bocznych genu gtfC w górę i w dół. Ustaw temperaturę topnienia (Tm) starterów góra-przód i dół-tył zgodnie z temperaturą topnienia odpowiednio starterów góra-tył i dół-przód (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
		UWAGA: Zapoznaj się z poniższym wzorem, aby określić Tm: Tm (°C) = 2(*NA + *NT) + 4(*NC + *NG) - 5, gdzie *N oznacza liczbę nukleotydów starterowych o określonej tożsamości (A, T, C lub G).</li>
		Zaprojektuj zagnieżdżone startery (N_up-do przodu i N_up-wstecznie) dla 2. PCR (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). <li>
		UWAGA: Chociaż najbardziej zewnętrzna para starterów (góra-przód i dół-tył) może być używana jako startery dla 2ndPCR, zagnieżdżone startery (N_up-naprzód i N_up-odwrotna) zostały zaprojektowane w tym protokole. Zagnieżdżone startery są często wymagane do 2. PCR, jak wyszczególniono w reprezentatywnych wynikach.</li>
		<li>Zaprojektuj podkłady specyficzne dla spcr. Startery są używane do PCR kolonii w celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem zakłóceń gtfC.</li>
		<li>Zaprojektuj podstawowe elementy do weryfikacji zakłóceń gtfC. 
		UWAGA: Produkty PCR amplifikowane przy użyciu tych starterów znajdują się na granicy między gtfC lub spcr a obszarami flankującymi gtfC w górę lub w dół. Zestawy podkładowe "gtfC góra-naprzód i gtfC góra-tył" oraz "gtfC w dół-do przodu i gtfC w dół-wstecz" są specyficzne dla gtfC, a "gtfC w górę do przodu i spcr2-wstecz" oraz "spcr2-do przodu i gtfC w dół-do tyłu" są specyficzne dla spcr.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekstrakcja genomowego DNA z S. mutans
<ol>
	<li>Smugi wywaru S. mutans UA159 na płytce agarowej do naparu z sercem mózgu (BHI). Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych.</li>
	<li>Podnieś pojedynczą kolonię za pomocą wysterylizowanej wykałaczki i zaszczep ją w 5 ml bulionu BHI. Inkubować kulturę S. mutanprzez noc w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych.</li>
	<li>Odwirować hodowlę komórek bakteryjnych przez 15 minut w temperaturze 2 000 × g. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Wirować przez 15 minut przy 2 000 × g. Zawiesić osad komórkowy w 200 μl PBS.</li>
	<li>Ekstrahować genomowe DNA z zawiesiny za pomocą zestawu do ekstrakcji genomowego DNA na bazie kulek zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta.
	<ol>
		<li>Przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 2,0 ml zawierającej szklane kulki (dołączonej do zestawu). Dodać 750 μl roztworu do lizy (dołączonego do zestawu) do zawiesiny komórek.</li>
		<li>Szczelnie zakręć i umieść rurki symetrycznie w uchwycie rurki aparatu do bicia koralików. Przetwarzaj z maksymalną prędkością przez 5 minut. Odwirować próbki ubite kulkami przez 1 minutę przy masie 10 000 × g. Przenieść supernatant do filtra wirowego (dołączonego do zestawu) w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml i wirować przez 1 minutę przy stężeniu 7 000 × g.</li>
		<li>Dodać 1 200 μl buforu wiążącego DNA (dołączonego do zestawu) do filtratu. Przenieść 800 μl mieszaniny do kolumny wirowej (dołączonej do zestawu) do probówki zbiorczej o pojemności 2,0 ml i odwirować przez 1 minutę przy 10 000 ×g.</li>
		<li>Odrzucić przepływ, dodać 200 μl buforu do płukania wstępnego (dołączonego do zestawu) do kolumny wirowej w celu przepłukania matrycy kolumny i odwirować przez 1 minutę przy 10 000 × g. Odrzucić przepływ, dodać 500 μl buforu płuczącego (dołączonego do zestawu) do kolumny wirowej w celu przepłukania matrycy kolumny i odwirować przez 1 minutę przy 10 000 × g.</li>
		<li>Umieść kolumnę wirową w nowej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodaj 100 μl buforu elucyjnego (dołączonego do zestawu) do matrycy kolumny.</li>
		<li>Wirować przez 30 s przy 10 000 × g w celu elucji genomowego DNA. Oszacować stężenie i czystość DNA, mierząc absorbancję przy 260 nm i 280 nm za pomocą spektrofotometru i potwierdzić, że stosunek A260/A280 jest większy niż 1,8.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Amplifikacja PCR
<ol>
	<li>Wykonać 1. PCR, używając genomu S. mutans WT i syntetycznego genu spcr jako matryc PCR (patrz Tabela 1). Amplifikuj górny region flankujący genu gtfC, dolny region flankujący genu gtfC i gen spcr za pomocą trzech zestawów starterów opisanych powyżej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A), zgodnie z Tabelą 2 i Tabelą 3. 
	UWAGA: Startery, odczynniki i cykle amplifikacji PCR podsumowano odpowiednio w Tabeli 1, Tabeli 2 i Tabeli 3.</li>
	<li>Frakcjonować każdy produkt PCR na 1% żelu agarozowym i wycinać odpowiednie prążki za pomocą obcinaka do taśm żelowych.</li>
	<li>Oczyść każdy amplifikowany produkt DNA z żeli za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu na bazie kolumny wirowej i membrany krzemionkowej.
	<ol>
		<li>Przenieś plastry żelu do czystej probówki mikrowirówkowej i wymieszaj z 500 μl buforu wiążącego (dołączonego do zestawu). Inkubować mieszaninę w temperaturze 55 °C przez 15 minut, aż do całkowitego rozpuszczenia plastrów żelu.</li>
		<li>Umieść kolumnę wirową (dołączoną do zestawu) w probówce zbiorczej (dołączonej do zestawu), załaduj próbkę na kolumnę wirową i odwiruj przez 30 s przy 11 000 × g. Wyrzuć przepływ, dodaj 600 μl buforu płuczącego (dołączonego do zestawu) do kolumny wirowej, aby przepłukać membranę krzemionkową i odwirować przez 30 s przy 11 000 × g.</li>
		<li>Odrzucić przepływowy i odwirowywać przez 2 minuty przy 11 000 × g w celu wysuszenia membrany krzemionkowej.</li>
		<li>Umieść kolumnę wirową w nowej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, dodaj 50 μl buforu elucyjnego (dołączonego do zestawu) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.</li>
		<li>Wirować przez 2 minuty przy 11 000 × g, aby wymyć amplifikowane DNA. Oszacować stężenie i czystość DNA, mierząc absorbancję przy 260 nm i 280 nm za pomocą spektrofotometru i potwierdzić, że stosunek A260/A280 jest większy niż 1,8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonać drugi PCR 2-etapowego PCR fuzyjnego, używając trzech w przybliżeniu równomolowych fragmentów jako matryc PCR, zgodnie z tabelą 2 i tabelą 3. 
	UWAGA: Fragmenty te zostały amplifikowane i połączone za pomocą zagnieżdżonych starterów 'N_up-forward and N_down-reverse' lub najbardziej zewnętrznych starterów 'góra-przód i dół-tył' (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Startery, odczynniki i cykle amplifikacji PCR podsumowano odpowiednio w Tabeli 1, Tabeli 2 i Tabeli 3.</li>
	<li>Załaduj jedną dziesiątą mieszaniny reakcyjnej PCR (5 μl) na 0,8% żel agarozowy i porównaj amplifikowany rozmiar prążka z oczekiwanym rozmiarem prążka, aby potwierdzić wytworzenie odpowiedniego amplikonu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C).</li>
	<li>Zagęścić pozostały końcowy produkt PCR przez wytrącanie etanolu bez oczyszczania.
	<ol>
		<li>Dodać 55 μl ultraczystej wody do pozostałej mieszaniny PCR, aby dostosować całkowitą objętość do 100 μl. Dodać jedną dziesiątą objętości 3 M octanu sodu (10 μl), pH 5,2, a następnie 2,5 objętości 100% etanolu (250 μl). Mieszać i zamrażać przez 30 minut w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Wirować przez 20 minut w temperaturze 15 000 × g w temperaturze 4 °C, sprawdzić, czy na dnie probówki nie ma osadu i wyrzucić supernatant. Przemyć osad 1 ml 70% etanolu, odwirować przez 5 minut w temperaturze 15 000 × g w temperaturze 4 °C i odrzucić sklarowany osad. Suszyć granulki na powietrzu przez około 30 minut i rozpuścić w 10 μl ultraczystej wody.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Kompetentne przygotowanie komórek i transformacja komórek
<ol>
	<li>Nałóż bulion S. mutans UA159 na płytkę agarową BHI. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych.</li>
	<li>Podnieś pojedynczą kolonię za pomocą wysterylizowanej wykałaczki i zaszczep ją w 5 ml bulionu BHI. Inkubować kulturę S. mutanprzez noc w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych.</li>
	<li>Przenieść 2 ml kultury S. mutando 50 ml bulionu BHI i inkubować przez 6-8 godzin w temperaturze 37 °C do gęstości optycznej przy 600 nm (OD600) 0,2-0,4 w warunkach beztlenowych.</li>
	<li>Odwirować komórki przez 15 minut w temperaturze 2 000 × g w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć komórki 40 ml lodowatej wody, a następnie 40 ml 10% glicerolu. 
	UWAGA: Substancje resztkowe wpływają na późniejszą elektroporację.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant pipetą Pasteura, ponieważ przyleganie osadu komórkowego do 10% glicerolu jest zmniejszone. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml świeżej 10% glicerolu, dozować 50 μl zawiesiny do każdej probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu tuż przed użyciem.</li>
	<li>Zmieszać 50 μl podwielokrotności lodowato zimnych kompetentnych komórek z 5 μl konstruktu rozrywającego opisanego powyżej w sekcji 3. Dodać mieszaninę do kuwet do elektroporacji (z zachowaniem odległości 0,2 cm między elektrodami). Do elektroporacji należy zastosować tryb Staphylococcus aureus (1,8 kV, 600 Ω, 10 μF, 1 impuls) aparatu do elektroporacji.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 500 μl bulionu BHI natychmiast po elektroporacji i dodać 50 μl zawiesiny do płytek agarowych BHI zawierających spektynomycynę. 
	UWAGA: Dodatkowy czas inkubacji po elektroporacji nie jest wymagany. Jednak inkubacja przez 1-2 godziny po elektroporacji może poprawić wydajność przemiany.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 2-6 dni w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych. 
	UWAGA: S. mutans ΔgtfB jest zbudowany zgodnie z powyższym opisem. Cały region kodujący genu gtfB jest zastąpiony genem oporności na erytromycynę8 w S. mutans ΔgtfB. Każdy szczep S. mutans jest hodowany w bulionie BHI w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych.</li>
</ol>
5. Weryfikacja zaburzeń i przechowywania genów
<ol>
	<li>Wybierz losowe kolonie i zaszczep je w mieszaninie PCR, aby przeprowadzić PCR kolonii zgodnie z tabelą 2 i tabelą 3. Startery, odczynniki i cykle amplifikacji PCR podsumowano odpowiednio w Tabeli 1, Tabeli 2 i Tabeli 3.</li>
	<li>Załaduj mieszaninę reakcyjną PCR na 1% żel agarozowy, aby potwierdzić pasmo DNA specyficzne dlaspc r.</li>
	<li>Zebrać dodatnią kolonię za pomocą wysterylizowanej wykałaczki i komórek subkultury w 10 ml bulionu BHI zawierającego spektynomycynę przez 2 dni w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych.</li>
	<li>Sprawdzić generowanie S. mutans ΔgtfC.
	<ol>
		<li>Podziel zawiesinę komórek równomiernie. Wyodrębnić genomowe DNA z komórek opisanych powyżej (etapy od 2.3 do 2.5.5). Przeprowadzić PCR z genomowym DNA jako matrycą PCR, używając starterów do weryfikacji zakłócenia gtfC (Tabela 1) zgodnie z Tabelą 2 i Tabelą 3. 
		UWAGA: Startery, odczynniki i cykle amplifikacji PCR podsumowano odpowiednio w Tabeli 1, Tabeli 2 i Tabeli 3.</li>
		<li>Załaduj mieszaninę PCR na 2% żel agarozowy i porównaj amplifikowany rozmiar prążka z oczekiwanym rozmiarem prążka, aby potwierdzić wytwarzanie odpowiedniego amplikonu.</li>
		<li>Pozostałą zawiesinę komórkową odwirować przez 15 minut w temperaturze 2 000 × g w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml PBS.</li>
		<li>Wirować przez 15 minut w temperaturze 2 000 × g w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad komórkowy w 1,5 ml bulionu BHI zawierającego 25% glicerolu i przechowywać w temperaturze -80°Cor -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza fenotypowa
<ol>
	<li>Umieść każdy szczep S. mutanna płytce z agarem BHI. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych.</li>
	<li>Podnieś pojedynczą kolonię za pomocą wysterylizowanej wykałaczki i zaszczep ją w 2 ml bulionu BHI z odpowiednim antybiotykiem lub bez niego. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych.</li>
	<li>Zaszczepić 20 μl zawiesiny do hodowli przez noc w 2 ml bulionu BHI zawierającego 1% lub 5% sacharozy bez antybiotyków w szklanej probówce; hodować komórki z probówką w pozycji pochylonej przez noc w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych.</li>
	<li>Wirować szklane probówki przez 10 s i zdekantować zawiesiny kultur. Umyj probówki trzykrotnie wodą destylowaną. Dodaj 1 ml 0,25% błękitu brylantowego Coomassie (CBB), aby zabarwić biofilmy na ściance probówki, a następnie inkubuj przez 1 minutę.</li>
	<li>Zdekantować roztwór barwiący, umyć probówki trzykrotnie wodą destylowaną i wysuszyć probówki.</li>
	<li>Oceń wizualnie zarówno gęstość koloru, jak i rozszerzenie barwionego biofilmu CBB, aby określić zdolność do tworzenia biofilmu w analizie fenotypowej.</li>
</ol>

<ol><li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes%3A+gene+splicing+by+overlap+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li>
<li>Kuwayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-mediated+generation+of+a+gene+disruption+construct+without+the+use+of+DNA+ligase+and+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors.</a> Nucleic Acids Res. 30 (2), E2(2002).</li>
<li>Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digalactosyldiacylglycerol+is+required+for+stabilization+of+the+oxygen-evolving+complex+in+photosystem+II%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II.</a> Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).</li>
<li>Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+Streptococcus+mutans+glucosyltransferase+gene+coding+for+insoluble+glucan+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis.</a> Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).</li>
<li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutans+gtfC+gene%2C+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li>
<li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD%289%29+determinant+from+Enterococcus+faecalis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li>
<li>Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cloning+vector+able+to+replicate+in+Escherichia+coli+and+Streptococcus+sanguis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis.</a> Gene. 19 (3), 345-353 (1982).</li>
<li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).</li>
<li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).</li>
<li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci%3A+application+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li>
<li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> J Vis Exp. (69), (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym protokole startery do 1.PCR muszą być zaprojektowane tak, aby amplifikować około 1 kb w górę i w dół regionów flankujących region docelowy w genomie. Takie długie sekwencje flankujące są niezbędne do poprawy efektywności rekombinacji homologicznej.
Sekwencje starterów (góra-odwrócenie, dół-przód, spcr-naprzód i spcr-odwrócenie) w tym protokole zostały automatycznie określone na podstawie miejsca włączenia konstruktu zakłócającego....

Analiza funkcji genów zazwyczaj obejmuje porównanie fenotypowe między szczepem dzikiego a szczepem, w którym konkretny gen będący przedmiotem zainteresowania został zakłócony. Ta technika zakłócania genów została wykorzystana do analizy funkcji genów w szerokim zakresie taksonów, od bakterii po ssaki. Konstrukt rozrywający gen jest niezbędny do wytworzenia szczepu z zaburzonym genem; ten konstrukt kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) składa się z genu markera oporności na antybiotyki połączonego z górnymi i dolnymi regionami bocznymi genu docelowego i jest wprowadzany do genomu w drodze rekombinacji homologicznej. Szczep z zaburzonym genem można wyizolować za pomocą selektywnych pożywek zawierających antybiotyk. Konwencjonalna metoda stosowana do budowy szczepu z zaburzonym genem wymaga złożonych etapów, takich jak amplifikacja genu docelowego przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), ligacja genu do odpowiedniego plazmidu, trawienie enzymami restrykcyjnymi i religacja w celu wprowadzenia genu markera oporności na antybiotyki. Proces ten jest czasochłonny, trwa od kilku dni do kilku tygodni, w zależności od powodzenia każdego kroku. Ponadto konstrukcja konstruktów zakłócających jest zależna od miejsc enzymów restrykcyjnych genu docelowego. Aby rozwiązać te problemy, zgłoszono metody splicingu DNA oparte na PCR1,2 do projektowania mutantów z zaburzonymi genami Dictyostelium discoideum3 i Synechocystis sp. PCC68034. W niniejszym badaniu opracowano metodę generowania zaburzonego genowo szczepu paciorkowców w stosunkowo szybki, łatwy i niedrogi sposób, wykorzystując zmodyfikowaną metodę opartą na PCR (oznaczoną jako 2-etapowy PCR fuzyjny) do budowy konstruktu zakłócającego i elektroporacji do transformacji genetycznej.
2-etapowy PCR fuzyjny wymaga genomowego DNA, genu markera oporności na antybiotyki jako matrycy PCR oraz czterech par odpowiednio zaprojektowanych starterów oligonukleotydowych. W pierwszym etapie (1. PCR) 1-kb region flankujący w górę genu docelowego, 1-kb region flankujący w dół genu docelowego oraz gen markera oporności na antybiotyki są amplifikowane przez PCR. Regiony 5' zarówno startera odwrotnego, jak i startera przedniego, w celu amplifikacji odpowiednio regionów flankujących w górę i w dół, zawierają 15 zasad komplementarnych do końców genu markerowego. Regiony 5' zarówno starterów do przodu, jak i do tyłu do amplifikacji genu markerowego podobnie obejmują 15 zasad komplementarnych odpowiednio do dolnego końca górnego regionu flankującego docelowego genu i górnego końca dolnego regionu flankującego genu docelowego. W związku z tym trzy amplifikowane fragmenty zawierają nakładające się na siebie obszary 30 par zasad w miejscu fuzji. W drugim etapie (2. PCR) PCR przeprowadza się za pomocą zagnieżdżonych starterów PCR przy użyciu trzech fragmentów amplifikowanych przez 1. PCR jako matryce. Komplementarne regiony matryc są dodatkowo połączone ze sobą za pomocą 2.PCR. Wreszcie, konstrukt do rekombinacji homologicznej jest wprowadzany do szczepu typu dzikiego przez elektroporację. Pomyślne rozerwanie genu można zweryfikować za pomocą PCR przy użyciu określonych starterów. Chociaż konstrukt rozrywający jest amplifikowany przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności, dodatkowe reakcje enzymatyczne, takie jak ligacja DNA lub trawienie DNA, nie są konieczne do wygenerowania konstruktu. Ponadto usunięty lub zachowany region genomu może być elastycznie wybrany zgodnie z projektem startera.
W obecnej pracy przeprowadzono delecję całego regionu kodującego gen gtfC, który koduje glukozylotransferazę w Streptococcus mutans, aby zademonstrować szybką i łatwą metodę rozbijania genów u gatunków paciorkowcowych. Dodatkowo, w ten sam sposób wygenerowano szczep zakłócony przez gtfB. Glukozylotransferazy kodowane zarówno przez gtfC, jak i gtfB przyczyniają się do próchnicotwórczego rozwoju biofilmu zębowego5,6. Do porównawczych analiz fenotypowych oceniono zdolności do tworzenia biofilmu szczepu typu dzikiego (S. mutans WT), szczepu zakłóconego przez gtfC (S. mutans ΔgtfC) i szczepu zakłóconego przez gtfB (S. mutans ΔgtfB). Protokół ten rozszerza zastosowanie dwuetapowej metody rozrywania genów na dodatkowe gatunki i może być modyfikowany na potrzeby badań funkcji genów w szerszym zakresie taksonów.

<table><tbody><tr><td>Streptococus mutans</td><td>Szczep zapasowy w laboratorium.</td><td></td><td>Szczep typu dzikiego (szczep UA159)</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji genomowego DNA</td><td>Zymo Research</td><td>D6005</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do bicia koralików</td><td>Taitec</td><td>GM-01</td><td></td></tr><tr><td>Geny</td><td>syntetyczne Eurofins Genomics Zamówiony</td> na <td>zamówienie</td><td>gen oporności na spektynomycynę i erytromycynę</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Startery PCR Astec</td><td>PC-708</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eurofins Genomics</td><td>Zamówione</td><td>na zamówienie 35 zasad o długości</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA</td><td>Takara</td><td>R045A Zestaw do ekstrakcji</td> żelu <td>polimerazy DNA o wysokiej wierności</td></tr><tr><td></td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91202</td><td>Ekstrakcja DNA z żelu agarozowego</td></tr><tr><td>Obcinak do gumek Nippon</td><td>Genetics</td><td>FG-830</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Beckman Coulter</td><td>DU 800</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>Bio-rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta do elektroporacji</td><td>Bio-rad</td><td>1652086</td><td>odstęp 0,2 cm</td></tr><tr><td>Anaeropack</td><td>Mitsubishi Gas Chemical</td><td>A-03</td><td>System hodowli beztlenowej</td></tr><tr><td>Bulion do infuzji serca mózgu</td><td>Becton, Dickinson</td><td>237500</td><td>Pożywka do hodowli bakteryjnych</td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Wako</td><td>195-11531</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Erytromycyna</td><td>Wako</td><td>057-07151</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td>Do tworzenia biofilmu</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>Do barwienia biofilmu</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie szczepu streptococcus mutans z zaburzeniami genetycznymi bez klonowania genów

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typowe metody wyjaśniania funkcji konkretnego genu obejmują porównawcze analizy fenotypowe szczepu dzikiego i szczepu, w którym interesujący nas gen został zakłócony. Konstrukt DNA rozrywający geny zawierający odpowiedni gen markera oporności na antybiotyki jest przydatny do generowania szczepów zaburzonych genowo u bakterii. Jednak konwencjonalne metody konstrukcyjne, które wymagają etapów klonowania genów, obejmują złożone i czasochłonne protokoły. W tym artykule opisano stosunkowo łatwą, szybką i opłacalną metodę celowanego rozrywania genów u Streptococcus mutans. Metoda wykorzystuje 2-etapową reakcję łańcuchową polimerazy fuzyjnej (PCR) w celu wygenerowania konstruktu zakłócającego i elektroporacji do transformacji genetycznej. Metoda ta nie wymaga reakcji enzymatycznej, innej niż PCR, a dodatkowo oferuje większą elastyczność w zakresie projektowania konstruktu rozrywającego. Zastosowanie elektroporacji ułatwia przygotowanie kompetentnych ogniw i poprawia wydajność przemiany. Obecna metoda może być dostosowana do wytwarzania szczepów różnych gatunków z zaburzeniami genetycznymi.

Rysunek 2 wykazuje, że rozmiar każdego produktu z 1st Wyniki PCR, obserwowane na 1% żelu agarozowym, były zgodne z przewidywaną wielkością wynoszącą około 1 kb. Rysunek 3 przedstawia analizę elektroforezą żelową produktów 2nd PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy). Rycina 4 wykazuje S. mutans kolonie przekształcone konstruktem do przerwania genu oraz analiza elektroforezą ...

Opisujemy łatwą, szybką i stosunkowo tanią metodę generowania zaburzonych genami szczepów Streptococcus mutans; technika ta może być dostosowana do generowania zaburzonych genami szczepów różnych gatunków.

Wytwarzanie szczepu Streptococcus mutans z zaburzeniami genetycznymi bez klonowania genów

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie ukierunkowanych szczepów Streptococcus mutans z zaburzonymi genami za pomocą dwuetapowej fuzji PCR i elektroporacji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii, takie jak działanie interesującego nas genu. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie jest wymagana żadna reakcja enzymatyczna inna niż PCR, a właściwe przygotowanie komórek do elektroporacji jest dość proste. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat techniki zakłócania genów Streptococcus mutans, można ją również zastosować do innych gatunków drobnoustrojów, takich jak Staphylococcus aureus. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ nie są zaznajomione ze skutecznością zagnieżdżonych starterów dla drugiego PCR. Procedurę zademonstruje dr Ayako Okada, instruktor badawczy z naszego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy umieścić S.mutans UA159 na naparze z mózgiem, sercem lub płytce agarowej BHI i inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach beztlenowych. Następnego dnia użyj wysterylizowanej wykałaczki, aby wybrać pojedynczą kolonię i zaszczepić ją w pięciu mililitrach bulionu BHI. Inkubuj kulturę S. mutans przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach beztlenowych. Następnie odwiruj kulturę w temperaturze 2000 razy G przez 15 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach PBS. Odwirować ponownie w temperaturze 2000 razy G przez 15 minut. Ponownie zawiesić powstały osad komórkowy w 200 mikrolitrach PBS. Wyodrębnij genomowe DNA z zawiesiny za pomocą zestawu do ekstrakcji genomowego DNA na bazie kulek. Najpierw przenieś zawiesinę komórek do dwumililitrowej probówki zawierającej szklane kulki. Następnie dodaj 750 mikrolitrów roztworu do lizy do zawiesiny komórek. Szczelnie zakryj rurki i umieść je symetrycznie w uchwycie rurki aparatu do bicia koralików. Przetwarzaj z maksymalną prędkością przez pięć minut. Odwirować próbki ubite kulkami w temperaturze 10 000 razy G przez jedną minutę. Przenieść supernatant do kolumny wirowej w dwumililitrowej probówce zbiorczej i odwirować w temperaturze 7000 razy G przez jedną minutę. Dodać 1200 mikrolitrów buforu wiążącego DNA do filtratu i przenieść 800 mikrolitrów mieszaniny do kolumny wirowej w dwumililitrowej probówce zbiorczej. Wirować przy 10 000 razy G przez jedną minutę. Odrzuć przepływ. Dodać 200 mikrolitrów buforu do płukania wstępnego do kolumny wirowej, aby przepłukać matrycę kolumny i odwirować 10 000 razy G przez jedną minutę. Odrzucić przepływ, dodać 500 mikrolitrów buforu płuczącego do kolumny wirowej, aby przepłukać matrycę kolumny i ponownie odwirować. Umieść każdą kolumnę wirową w nowej 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówek i dodaj 100 mikrolitrów buforu elucyjnego do matrycy kolumny. Wirować przy 10 000 razy G przez 30 sekund, aby wymyć genomowe DNA. Oszacuj stężenie i czystość DNA, mierząc absorbancję przy 260 nanometrach i 280 nanometrach za pomocą spektrofotometru. Pierwszy PCR przeprowadza się przy użyciu genomu typu dzikiego S.mutans i syntetycznego genu oporności na streptomycynę jako matryc PCR. Do amplifikacji stosuje się odpowiednio trzy zestawy starterów, górny region flankujący genu glikozylotransferazy C lub gtfC, dalszy region flankujący genu gtfC i gen oporności na spektynomycynę. Frakcjonuj każdy produkt PCR na 1% żelu agarozowym. Rozmiar każdego produktu z pierwszego PCR powinien wynosić około jednego KB. Użyj obcinacza do gumek żelowych, aby wyciąć odpowiednie prążki i oczyścić każdy produkt z amplifikowanym DNA, jak opisano w protokole tekstowym. Następnym krokiem jest użycie trzech w przybliżeniu równych fragmentów trzonowych jako matryc PCR do wykonania drugiego PCR. Fragmenty te są amplifikowane i łączone przy użyciu odpowiednich starterów w celu wytworzenia konstruktu rozrywającego. Ponieważ powodzenie tej procedury zależy od amplifikacji konstruktu rozrywającego przez drugi PCR, ważne jest, aby potwierdzić drugi produkt PCR za pomocą elektroforezy. Załaduj 1/10 mieszaniny reakcyjnej PCR na 0,8% żelu agarozowym, aby potwierdzić, że wygenerowany amplikon ma przewidywany rozmiar pasma. W tym przykładzie zagnieżdżone startery dały znacznie lepsze wzmocnienie. Przenieś pozostałą mieszaninę PCR do nowej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej i dodaj 55 mikrolitrów ultraczystej wody, aby dostosować całkowitą objętość do 100 mikrolitrów. Dodać 1/10 objętości trzech molowych octanów sodu o pH 5,2, a następnie 2,5 objętości 100% etanolu i wymieszać. Zamrażać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez 30 minut. Wirować w temperaturze 15 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Po zakończeniu wirowania sprawdź, czy na dnie probówki nie ma osadu. Odrzucić supernatant. Umyj granulat jednym mililitrem 70% etanolu i odwiruj w temperaturze 15 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Wyrzucić supernatant i wysuszyć osad na powietrzu przez około 30 minut. Na koniec rozpuść osad w 10 mikrolitrach ultraczystej wody. Kompetentne komórki S.mutans UA159 zostały wcześniej przygotowane i przechowywane jako 50 mikrolitrów podwielokrotności w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Wymieszaj każdą 50 mikrolitrową porcję lodowato zimnych kompetentnych komórek z pięcioma mikrolitrami konstruktu zakłócającego. Dodaj mieszaninę do kuwet do elektroporacji z zachowaniem odległości 0,2 centymetra między elektrodami. Wykonać elektroporację w trybie Staphylococcus aureus aparatu do elektroporacji. Natychmiast po elektroporacji zawiesić komórki w 500 mikrolitrach bulionu BHI i dodać 50 mikrolitrów zawiesiny do płytek agarowych BHI zawierających spektynomycynę. Inkubuj płytki przez dwa do sześciu dni w temperaturze 37

generation-gene-disrupted-streptococcus-mutans-strain-without-gene

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Systematyczne, wielkoskalowe przesiewy syntetycznych interakcji genetycznych (gen-gen lub epistaza) mogą być wykorzystywane do badania redundancji genetycznej i wzajemnych powiązań między szlakami sygnałowymi. W niniejszej pracy opisujemy opracowaną przez nas technologię wysokoprzepustowych ilościowych przesiewów macierzy syntetycznych interakcji genetycznych, nazwaną eSGA, służącą do wyjaśniania relacji epistatycznych i badania sieci interakcji genetycznych w Escherichia coli.

Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

Opracowano wydajną metodę wprowadzania pojedynczych mutacji genowych w całym genomie, wykorzystując Streptococcus sanguinis jako organizm modelowy. Metoda ta została osiągnięta dzięki zastosowaniu wysokoprzepustowych reakcji PCR rekombinacyjnego oraz transformacji.

Delecje genów w całym genomie Streptococcus sanguinis za pomocą wysokoprzepustowej PCR

Źródło: Lea-Smith, D. J., et al. Generowanie znakowanych i bezznacznikowych mutantów w modelowych gatunkach sinic. J. Vis. Exp. (2016)Film przedstawia metodę generowania mutantów znakowanych antybiotykami w sinicach. Protokół rozpoczyna się od hodowli sinic, po której następują etapy wirowania i mycia, które zachowują pilusy powierzchniowe. Następnie wprowadza się plazmid niosący gen oporności na antybiotyki otoczony sekwencjami homologicznymi. Podczas inkubacji plazmid jest internalizowany...

Wytwarzanie mutantów znakowanych antybiotykami w sinicach poprzez rekombinację homologiczną

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the phage-mediated transfer of donor DNA carrying an excisable antibiotic resistance cassette into Escherichia coli. The integrated cassette replaces the target gene via homologous recombination, resulting in a stable gene deletion.

Generating Gene Deletions in E. coli via Phage-Mediated Transfer of an Excisable Antibiotic Cassette

Enterobacter sp. YSU rośnie w pożywce z minimalnymi solami glukozy. Auksotrofy są generowane przez przekształcenie go w transposom, który losowo wstawia się do genomu gospodarza. Mutanty są znajdowane przez replikowanie posiewu ze złożonej pożywki do minimalnej pożywki. Przerwane geny są identyfikowane przez ratowanie genów i sekwencjonowanie.

Wytwarzanie auksotrofów Enterobacter sp. YSU z wykorzystaniem mutagenezy transpozonów

Wprowadzanie wielu zmian genomowych do cyjanobakterii jest niezbędnym narzędziem w rozwoju szczepów do celów przemysłowych i badań podstawowych. Opisano system generowania nieoznaczonych mutantów w modelowym gatunku sinic Synechocystis sp. PCC6803 oraz znakowanych mutantów w Synechococcus sp. PCC7002.

Generowanie znakowanych i bezznacznikowych mutantów w modelowych gatunkach sinic

Tutaj prezentujemy protokół użycia istniejących wcześniej konstruktów delecji kasety oporności na antybiotyki jako podstawy do tworzenia mutantów delecyjnych w innych szczepach E. coli. Takie mutacje delecji mogą być mobilizowane i wprowadzane do odpowiedniego locus szczepu biorcy za pomocą transdukcji bakteriofaga P1.

Wytwarzanie delecji genów w Escherichia coli przez transdukcję P1 z kasetami oporności na antybiotyki podlegającymi akcyzie

Opisana tutaj jest prosta metoda oczyszczania produktu genowego u Streptococcus mutans. Technika ta może być korzystna w oczyszczaniu białek, zwłaszcza białek błonowych i białek o dużej masie cząsteczkowej, i może być stosowana z różnymi innymi gatunkami bakterii.

Oczyszczanie białka o wysokiej masie cząsteczkowej w Streptococcus mutans

Tutaj opisujemy prosty i powtarzalny protokół mysiego modelu infekcji do oceny osłabienia genetycznie zmodyfikowanych szczepów Pseudomonas aeruginosa w porównaniu z zatwierdzonymi przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) Escherichia coli do zastosowań komercyjnych.

Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa i testowanie tłumienia wirulencji w prostym mysim modelu infekcji

Opisana tutaj jest metoda celowanej, bezznacznikowej delecji genu w Chlamydia trachomatis przy użyciu mutagenezy wymiany alleli w kasecie floksowanej, FLAEM.

Bezmarkerowa delecja genu przez mutagenezę wymiany alleli w kasecie floksowanej w Chlamydia trachomatis

Tutaj opisujemy budowę mutantów zerowych Aeromonas w określonych glikozylotransferazach lub regionach zawierających glikozylotransferazy, testy ruchliwości i oczyszczanie wici przeprowadzone w celu ustalenia udziału i funkcji kodowanych przez nie enzymów w biosyntezie glikanu, a także rolę tego glikanu w patogenezie bakterii.

Generowanie mutantów zerowych w celu wyjaśnienia roli glikozylotransferaz bakteryjnych w ruchliwości bakterii

Poznaj szybką metodę tworzenia szczepów Streptococcus mutans z zaburzeniami genetycznymi bez klonowania genów. Technika ta przyspiesza badania w dziedzinie mikrobiologii i genetyki bakterii.

Wytwarzanie szczepu Streptococcus mutans z zaburzeniami genetycznymi bez klonowania genów

Przeglądaj więcej filmów