Wytwarzanie szczepu Streptococcus mutans z zaburzeniami genetycznymi bez klonowania genów

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie ukierunkowanych szczepów Streptococcus mutans z zaburzonymi genami za pomocą dwuetapowej fuzji PCR i elektroporacji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii, takie jak działanie interesującego nas genu. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie jest wymagana żadna reakcja enzymatyczna inna niż PCR, a właściwe przygotowanie komórek do elektroporacji jest dość proste. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat techniki zakłócania genów Streptococcus mutans, można ją również zastosować do innych gatunków drobnoustrojów, takich jak Staphylococcus aureus. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ nie są zaznajomione ze skutecznością zagnieżdżonych starterów dla drugiego PCR. Procedurę zademonstruje dr Ayako Okada, instruktor badawczy z naszego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy umieścić S.mutans UA159 na naparze z mózgiem, sercem lub płytce agarowej BHI i inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach beztlenowych. Następnego dnia użyj wysterylizowanej wykałaczki, aby wybrać pojedynczą kolonię i zaszczepić ją w pięciu mililitrach bulionu BHI. Inkubuj kulturę S. mutans przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach beztlenowych. Następnie odwiruj kulturę w temperaturze 2000 razy G przez 15 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach PBS. Odwirować ponownie w temperaturze 2000 razy G przez 15 minut. Ponownie zawiesić powstały osad komórkowy w 200 mikrolitrach PBS. Wyodrębnij genomowe DNA z zawiesiny za pomocą zestawu do ekstrakcji genomowego DNA na bazie kulek. Najpierw przenieś zawiesinę komórek do dwumililitrowej probówki zawierającej szklane kulki. Następnie dodaj 750 mikrolitrów roztworu do lizy do zawiesiny komórek. Szczelnie zakryj rurki i umieść je symetrycznie w uchwycie rurki aparatu do bicia koralików. Przetwarzaj z maksymalną prędkością przez pięć minut. Odwirować próbki ubite kulkami w temperaturze 10 000 razy G przez jedną minutę. Przenieść supernatant do kolumny wirowej w dwumililitrowej probówce zbiorczej i odwirować w temperaturze 7000 razy G przez jedną minutę. Dodać 1200 mikrolitrów buforu wiążącego DNA do filtratu i przenieść 800 mikrolitrów mieszaniny do kolumny wirowej w dwumililitrowej probówce zbiorczej. Wirować przy 10 000 razy G przez jedną minutę. Odrzuć przepływ. Dodać 200 mikrolitrów buforu do płukania wstępnego do kolumny wirowej, aby przepłukać matrycę kolumny i odwirować 10 000 razy G przez jedną minutę. Odrzucić przepływ, dodać 500 mikrolitrów buforu płuczącego do kolumny wirowej, aby przepłukać matrycę kolumny i ponownie odwirować. Umieść każdą kolumnę wirową w nowej 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówek i dodaj 100 mikrolitrów buforu elucyjnego do matrycy kolumny. Wirować przy 10 000 razy G przez 30 sekund, aby wymyć genomowe DNA. Oszacuj stężenie i czystość DNA, mierząc absorbancję przy 260 nanometrach i 280 nanometrach za pomocą spektrofotometru. Pierwszy PCR przeprowadza się przy użyciu genomu typu dzikiego S.mutans i syntetycznego genu oporności na streptomycynę jako matryc PCR. Do amplifikacji stosuje się odpowiednio trzy zestawy starterów, górny region flankujący genu glikozylotransferazy C lub gtfC, dalszy region flankujący genu gtfC i gen oporności na spektynomycynę. Frakcjonuj każdy produkt PCR na 1% żelu agarozowym. Rozmiar każdego produktu z pierwszego PCR powinien wynosić około jednego KB. Użyj obcinacza do gumek żelowych, aby wyciąć odpowiednie prążki i oczyścić każdy produkt z amplifikowanym DNA, jak opisano w protokole tekstowym. Następnym krokiem jest użycie trzech w przybliżeniu równych fragmentów trzonowych jako matryc PCR do wykonania drugiego PCR. Fragmenty te są amplifikowane i łączone przy użyciu odpowiednich starterów w celu wytworzenia konstruktu rozrywającego. Ponieważ powodzenie tej procedury zależy od amplifikacji konstruktu rozrywającego przez drugi PCR, ważne jest, aby potwierdzić drugi produkt PCR za pomocą elektroforezy. Załaduj 1/10 mieszaniny reakcyjnej PCR na 0,8% żelu agarozowym, aby potwierdzić, że wygenerowany amplikon ma przewidywany rozmiar pasma. W tym przykładzie zagnieżdżone startery dały znacznie lepsze wzmocnienie. Przenieś pozostałą mieszaninę PCR do nowej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej i dodaj 55 mikrolitrów ultraczystej wody, aby dostosować całkowitą objętość do 100 mikrolitrów. Dodać 1/10 objętości trzech molowych octanów sodu o pH 5,2, a następnie 2,5 objętości 100% etanolu i wymieszać. Zamrażać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez 30 minut. Wirować w temperaturze 15 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Po zakończeniu wirowania sprawdź, czy na dnie probówki nie ma osadu. Odrzucić supernatant. Umyj granulat jednym mililitrem 70% etanolu i odwiruj w temperaturze 15 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Wyrzucić supernatant i wysuszyć osad na powietrzu przez około 30 minut. Na koniec rozpuść osad w 10 mikrolitrach ultraczystej wody. Kompetentne komórki S.mutans UA159 zostały wcześniej przygotowane i przechowywane jako 50 mikrolitrów podwielokrotności w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Wymieszaj każdą 50 mikrolitrową porcję lodowato zimnych kompetentnych komórek z pięcioma mikrolitrami konstruktu zakłócającego. Dodaj mieszaninę do kuwet do elektroporacji z zachowaniem odległości 0,2 centymetra między elektrodami. Wykonać elektroporację w trybie Staphylococcus aureus aparatu do elektroporacji. Natychmiast po elektroporacji zawiesić komórki w 500 mikrolitrach bulionu BHI i dodać 50 mikrolitrów zawiesiny do płytek agarowych BHI zawierających spektynomycynę. Inkubuj płytki przez dwa do sześciu dni w temperaturze 37