Name: Hydrodynamiczne wstrzyknięcie do miedniczki nerkowej w celu niewirusowej ekspresji białek w nerce (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Poznaj metodę hydrodynamicznego wstrzyknięcia DNA plazmidowego do miedniczki nerkowej u myszy. Technika ta umożliwia specyficzną ekspresję białek w nerce, co jest kluczowe dla badań nefrologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nagroda za rozwój kariery od Departamentu ds. Weteranów [BX002797] wspierana przez L.E.W. oraz National Institutes of Health [R01-DK095867] i American Heart Association [15GRNT25700209] wspierały J.C. National Institutes of Health [DK093660], Departament ds. Weteranów [BX002190] i Vanderbilt Center for Kidney Disease wspierały M.H.W. Materiał ten jest wynikiem pracy wspieranej zasobami i wykorzystaniem obiektów w systemie opieki zdrowotnej VA Tennessee Valley.

<ol><li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).</li>
<li>Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+foreign+gene+expression+in+hepatocytes+after+tail+vein+injections+of+naked+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA.</a> Human Gene Therapy. 10, 1735-1737 (1999).</li>
<li>Fumoto, S., Nishimura, K., Nishida, K., Kawakami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Imaging+of+the+Intracellular+Fate+of+Plasmid+DNA+and+Transgene+Expression%3A+ZsGreen1+and+Tissue+Clearing+Method+CUBIC+Are+an+Optimal+Combination+for+Multicolor+Deep+Imaging+in+Murine+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Imaging of the Intracellular Fate of Plasmid DNA and Transgene Expression: ZsGreen1 and Tissue Clearing Method CUBIC Are an Optimal Combination for Multicolor Deep Imaging in Murine Tissues.</a> PLoS One. 11 (1), e0148233(2016).</li>
<li>Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naked+plasmid+DNA+transfer+to+the+porcine+liver+using+rapid+injection+with+large+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume.</a> Gene Ther. 13 (24), 1696-1702 (2006).</li>
<li>Kamimura, K., Suda, T., Xu, W., Zhang, G., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided%2C+lobe-specific+hydrodynamic+gene+delivery+to+swine+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Image-guided, lobe-specific hydrodynamic gene delivery to swine liver.</a> Mol Ther. 17 (3), 491-499 (2009).</li>
<li>Kamimura, K., Zhang, G., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided%2Cintravascular+hydrodynamic+gene+delivery+to+skeletal+muscle+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Image-guided,intravascular hydrodynamic gene delivery to skeletal muscle in pigs.</a> Mol Ther. 18 (1), 93-100 (2010).</li>
<li>Suda, T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+gene+delivery%3A+its+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications.</a> Mol.Ther. 15 (12), 2063-2069 (2007).</li>
<li>Alino, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naked+DNA+delivery+to+whole+pig+cardiac+tissue+by+coronary+sinus+retrograde+injection+employing+non-invasive+catheterization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Naked DNA delivery to whole pig cardiac tissue by coronary sinus retrograde injection employing non-invasive catheterization.</a> J Gene Med. 12 (11), 920-926 (2010).</li>
<li>Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+impact+of+hydrodynamic+injection+on+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver.</a> Gene Ther. 14 (2), 129-137 (2007).</li>
<li>Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+model+of+acute+kidney+injury+and+post+injury+fibrosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Woodard, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney-specific+transposon-mediated+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Kidney-specific transposon-mediated gene transfer in vivo.</a> Sci Rep. 7, 44904(2017).</li>
<li>Liang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+glutathione+S-transferase+A4+accelerates+obstruction-induced+tubule+damage+and+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Loss of glutathione S-transferase A4 accelerates obstruction-induced tubule damage and renal fibrosis.</a> Journal of Pathology. 228 (4), 448-458 (2012).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+of+insulin-like+growth+factor-1+receptor+in+endothelial+cells+against+unilateral+ureteral+obstruction-induced+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Protective role of insulin-like growth factor-1 receptor in endothelial cells against unilateral ureteral obstruction-induced renal fibrosis.</a> Am J Pathol. 185 (5), 1234-1250 (2015).</li>
<li>Corridon, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+facilitate+and+monitor+expression+of+exogenous+genes+in+the+rat+kidney+using+plasmid+and+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">A method to facilitate and monitor expression of exogenous genes in the rat kidney using plasmid and viral vectors.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 304 (9), F1217-F1229 (2013).</li>
<li>Wallace, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+kidney+volume+in+mice+with+polycystic+kidney+disease+by+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Tracking kidney volume in mice with polycystic kidney disease by magnetic resonance imaging.</a> Kidney Int. 73 (6), 778-781 (2008).</li>
<li>Woodard, L. E., Wilson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-ing+models+and+new+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">piggyBac-ing models and new therapeutic strategies.</a> Trends Biotechnol. 33 (9), 525-533 (2015).</li>
<li>Yeikilis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics+based+transfection+in+normal+and+fibrotic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics based transfection in normal and fibrotic rats.</a> World J Gastroenterol. 12 (38), 6149-6155 (2006).</li>
<li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Wooddell, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+damage+after+delivery+of+naked+plasmid+DNA+into+skeletal+muscles+is+batch+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Muscle damage after delivery of naked plasmid DNA into skeletal muscles is batch dependent.</a> Hum Gene Ther. 22 (2), 225-235 (2011).</li>
<li>Crespo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+liver+gene+transfer+mechanism+involves+transient+sinusoidal+blood+stasis+and+massive+hepatocyte+endocytic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles.</a> Gene Ther. 12 (11), 927-935 (2005).</li>
<li>Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rAAV9+combined+with+renal+vein+injection+is+optimal+for+kidney-targeted+gene+delivery%3A+conclusion+of+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study.</a> Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia i deklarują, że nie mają konfliktu interesów.

W protokole tym opisano solidną metodę osiągania powtarzalnej ekspresji genów specyficznie w nerkach. W rękach umiarkowanie doświadczonego chirurga stwierdziliśmy, że odsetek myszy transfekowanych tą techniką mieści się w zakresie 50-100%, w zależności od wieku myszy i czułości odczytu transgenu. Poziom ekspresji genu lucyferazy utrzymywał się powyżej tła przez kilka miesięcy u myszy otrzymujących transpozony piggyBac i całkowicie utrzymywał się przez kilka tygodni u myszy z obniżoną odpornością otrzymujących te...

Technika hydrodynamicznego wstrzykiwania żył ogonowych stała się powszechnie stosowanym sposobem na osiągnięcie wysokiego poziomu ekspresji genów w wątrobie myszy1,2. Nerki są również transfekowane tą techniką na znacznie niższym poziomie, około 100-krotnie mniej3. Opisana tutaj hydrodynamiczna iniekcja do miednicy nerkowej zapewnia prosty sposób kontrolowania swoistości ekspresji narządów za pomocą środków fizycznych przy użyciu tych samych zasad hydrodynamicznych, które zostały wcześniej ustalone w wątrobie4,5, muscle6 i innych narządach7,8. Metoda ta polega na transfekcji komórek u żywych zwierząt in vivo, wykorzystując ciśnienie i prędkość do wtłaczania płynu zawierającego DNA do komórek, jednocześnie wywołując uszkodzenie narządu, które jest szybko rozwiązywane9. Korzystając z dobrze znanych technik chirurgicznych do wizualizacji nerki za pomocą nacięcia bocznego10 wraz z pojedynczym wstrzyknięciem za pomocą strzykawki insulinowej, odkryliśmy udaną transfekcję różnych typów komórek nerkowych, głównie fibroblastów śródmiąższowych, kanalików i przewodu zbiorczego11. Sekcja tych myszy wykazała, że inne narządy nie są transfekowane na wystarczająco wysokim poziomie, aby można je było uwidocznić za pomocą technik obrazowania lucyferazy11. Ponieważ technika ta nie jest wirusowa, użycie plazmidowego DNA do transfekcji pozwala na szybkie i łatwe przygotowanie odczynników wymaganych do wstrzyknięcia.
Użyliśmy miejscowych iniekcji hydrodynamicznych, aby wyrazić przeciwutleniającą S-transferazę glutationu A4, receptor insulinopodobnego czynnika wzrostu-1 oraz hormon erytropoetynę w nerkach, wszystkie z oczekiwanymi efektami biologicznymi11,12,13. Przeprowadzono szczegółową ocenę drogi podania, objętości wstrzyknięcia, dawki DNA i wyboru promotora11. Ponadto wykazano, że zarówno system transpozonów piggyBac, jak i leczenie cyklofosfamidem w celu stłumienia reakcji immunologicznej na transgen poprawiają długoterminowe wyniki ekspresji genów11. Inni badacze z powodzeniem zastosowali podejście do żyły nerkowej u szczurów, osiągając wysoką skuteczność transfekcji przez okresy dłuższe niż jeden miesiąc14. Jednak genetyczna korekta fenotypów naśladujących ludzką chorobę jest zwykle najpierw wykonywana na myszach jako dowód koncepcji, ponieważ większość modeli genetycznych ssaków to modele mysie. Porównaliśmy wstrzyknięcie do żyły nerkowej z wstrzyknięciem do miedniczki nerkowej i stwierdziliśmy, że wstrzyknięcie do miedniczki nerkowej było lepsze niż w żyle nerkowej pod względem ekspresji genów (około dziesięciokrotnie wyższej) i przeżycia11. Miedniczka nerkowa jest idealną drogą wejścia do nerki, ponieważ jest wystarczająco elastyczna, aby tolerować wahania w produkcji moczu i często jest w stanie zachować swoją integralność strukturalną nawet po rozszerzeniu podczas wodonercza. Dodatkowo wstrzyknięcie do miedniczki nerkowej umożliwiło dostęp do nerki bez przebijania torebki nerkowej, co pozwoliło na widoczne zatrzymanie wstrzykniętego płynu przez nerkę lepiej niż wstrzyknięcie śródmiąższowe. Inne narządy myszy nie mają innej drogi wejścia niż układ krwionośny, ale przestrzeń moczowa nerki jest idealnym miejscem wstrzyknięcia. Dodatkowo wstrzyknięcie do żyły nerkowej powodowało wyciek krwi do jamy brzusznej. Całkowita objętość nerek myszy typu dzikiego została oszacowana za pomocą rezonansu magnetycznego na około 0,2cm3, więc objętość pojedynczej nerki jest w przybliżeniu równa ilości płynu wstrzykniętego przez hydrodynamiczne wstrzyknięcie miedniczki nerkowej (100 μL)15. W niniejszym dokumencie udostępniliśmy wszystkie szczegółowe niuanse protokołu hydrodynamicznego wstrzykiwania do miednicy nerkowej w celu uzyskania powtarzalnej transfekcji nerki.

<table><tbody><tr><td>AnaSed Xylazine</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-808-1947</td><td>Znieczulenie - Substancja niekontrolowana</td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa BD 0,5 ml 29G 1/2 cala</td><td>Cardinal Health</td><td>309306</td><td>Wymagane strzykawki</td></tr><tr><td>Buprenex</td><td>Farmaceuta / weterynarz</td><td></td><td>Analgezja - substancja kontrolowana</td></tr><tr><td>Jednorazowa serweta na ręczniki Dynarex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>19-310-671</td><td>Umieść na poduszce grzewczej</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Używaj tylko plazmidu DNA wolnego od endotoksyn</td></tr><tr><td>Endosafe Gel-Clot LAL Szybka kontrola pozytywna</td><td>Charles River</td><td>PC200</td><td>Kontrola pozytywna do testu endotoksyn</td></tr><tr><td>Endosafe Gel-Clot LAL Szybka pojedyncza fiolka testowa</td><td>Charles River</td><td>R13500</td><td>Test endotoksyn</td></tr><tr><td>Bardzo drobne mikronożyczki preparacyjne</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5882</td><td>Narzędzie chirurgiczne</td></tr><tr><td>Fisherbrand Instant Sealing Worek do sterylizacji - 9 "</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>01-812-51</td><td>Do autoklawowania narzędzi chirurgicznych</td></tr><tr><td>Pompa ciepła Gaymar</td><td>Paragon Medical</td><td>TP-700</td> Pompa <td>ciepła z obiegiem wody</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>Roboz Instrument chirurgiczny</td><td>DS-401</td><td>Do ponownego użycia narzędzi chirurgicznych podczas operacji</td></tr><tr><td>Graefe Kleszcze</td><td>Instrument chirurgiczny Roboz</td><td>RS-5136</td><td>Narzędzie chirurgiczne</td></tr><tr><td>Graefe Kleszcze</td><td>do tkanek Roboz Instrument chirurgiczny</td><td>RS-5153</td><td>Narzędzie chirurgiczne</td></tr><tr><td>Uchwyt igły Halsey,</td><td>instrument chirurgiczny Roboz</td> o długości 5 cali Narzędzie chirurgiczne <td>RS-7841</td><td>Poduszki</td></tr><tr><td>grzewcze - 15 "x 21" - potrzebujesz co najmniej 3</td><td>Paragon Medical</td><td>TP22G</td><td>Do użytku z pompą</td></tr> <tr><td>ciepła GaymarIsoFlo (Isoflurane, USP)</td><td>Abbott Animal Health</td><td>5260-04-05</td><td>Do obrazowania i eutanazji</td></tr><tr><td>System dostarczania izofluranu Isotec Waporyzor</td><td>Smiths Medical</td><td>VCT3K2</td><td>Do obrazowania i eutanazji</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Farmaceuta/Weterynarz</td><td></td><td>Znieczulenie - Substancja kontrolowana</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>Tkanki laboratoryjne</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Living Image</td><td>Caliper Nauki przyrodnicze</td><td></td><td>Do obrazowania żywych zwierząt</td></tr><tr><td>Lucyferyna</td><td>Perkin Elmer</td><td>122796</td><td>Do obrazowania żywych zwierząt</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000-US-CAN</td><td>Spektrofotometr do pomiaru DNA</td></tr><tr><td>Waciki Prevantics</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23-100-110</td><td>Do przygotowania chirurgii skóry</td></tr><tr><td>Szwy Prolene 5-0 Stożek 30"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0256891</td><td>Niewchłanialne szwy do skóry</td></tr><tr><td>Maść okulistyczna marki Puralube</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-888-2572</td><td>Aby utrzymać wilgotność oczu podczas operacji</td></tr><tr><td>Trans IT - QR Hydrodynamiczne rozwiązanie do dostarczania</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR-5240</td><td>Hydrodynamiczny bufor dostarczający do rozcieńczania DNA</td></tr><tr><td>Vicryl 5-0 Szwy J303H</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9816710</td><td>Wchłanialne szwy do warstwy mięśniowej</td></tr><tr><td>Wahl Mini Arco Clipper</td><td>Med-Vet International</td><td>8787-1550</td><td>Golarka do przygotowania skóry</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200</td><td>Caliper Nauki przyrodnicze</td><td></td><td>Do obrazowania żywych zwierząt</td></tr></tbody></table>

hydrodynamiczne wstrzyknięcie do miedniczki nerkowej w celu niewirusowej ekspresji białek w nerce

Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney

Hydrodynamiczne iniekcja tworzy lokalne, wysokociśnieniowe środowisko do transfekcji różnych tkanek plazmidowym DNA i innymi substancjami. Na przykład hydrodynamiczne wstrzykiwanie żył ogonowych jest dobrze znaną metodą, za pomocą której można transfekować wątrobę. Manuskrypt ten opisuje zastosowanie zasad hydrodynamiki poprzez wstrzyknięcie do nerki myszy bezpośrednio plazmidowego DNA w celu ekspresji genów specyficznych dla nerek. Myszy są znieczulane, a nerka jest odsłaniana przez nacięcie boku, a następnie szybkie wstrzyknięcie roztworu zawierającego plazmidowe DNA bezpośrednio do miedniczki nerkowej. Igła jest utrzymywana na miejscu przez dziesięć sekund, a miejsce nacięcia jest zszywane. Następnego dnia obrazowanie żywych zwierząt, Western blot lub immunohistochemia mogą być użyte do zbadania ekspresji genów lub inne testy dostosowane do wybranego transgenu są używane do wykrywania białka będącego przedmiotem zainteresowania. Opublikowane metody przedłużania ekspresji genów obejmują integrację transgenu za pośrednictwem transpozonów i leczenie cyklofosfamidem w celu zahamowania odpowiedzi immunologicznej na transgen.

Technika operacyjna i iniekcyjna są proste w wykonaniu po opanowaniu metody i nie wymagają zaawansowanego sprzętu ani kosztownych materiałów. Osoby rozpoczynające pracę z chirurgią nerek metodą nacięcia bocznego powinny zaplanować jeden dzień treningowy na kilku myszach przeznaczonych do eutanazji, przy czym zwierzęta te nie powinny być wybudzane po operacji, ponieważ pierwsza próba może zająć znacznie więcej czasu niż zwykle. Z kolei badacze zaznajomieni z podobnymi technikami mogą uznać...

Ten protokół opisuje metodę wstrzykiwania plazmidowego DNA do nerki myszy przez miedniczkę nerkową w celu wytworzenia ekspresji transgenu specyficznie w nerce.

Hydrodynamiczne wstrzyknięcie do miedniczki nerkowej w celu niewirusowej ekspresji białek w nerce

Hydrodynamic injection creates a local, high-pressure environment to transfect various tissues with plasmid DNA and other substances. Hydrodynamic tail ...

Ogólnym celem tego zabiegu chirurgicznego jest wytworzenie ekspresji białka z plazmidowego DNA w nerce dorosłej myszy. Metoda ta jest nowym narzędziem do odpowiedzi na kluczowe pytania w nefrologii, takie jak to, w jaki sposób ekspresja białka będącego przedmiotem zainteresowania wpływa na dorosłą nerkę. Główną zaletą tej techniki jest to, że wytwarza ona ekspresję białka w powtarzalny sposób, szczególnie w nerkach, w przeciwieństwie do innych metod, które mogą również powodować ekspresję genów w innych narządach.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ wstrzyknięcie miedniczki nerkowej wymaga starannej ekspozycji i musi być wykonane szybko, aby DNA osocza dostało się do komórek. Zacznij od ponownego zawieszenia plazmidowego DNA w hydrodynamicznym buforze dostarczającym. Na poduszce grzewczej z cyrkulacją wody pokrytej niebieską podkładką umieść mysz.Używając golarki przeznaczonej do pielęgnacji zwierząt, ogol lewą stronę grzbietu myszy od ramienia do zadu i od boku do kręgosłupa. Oczyść luźne włosy i zanieczyszczenia i nałóż maść weterynaryjną w oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. Teraz przygotuj 100 mikrolitrów zawierających od 10 do 50 mikrogramów rozcieńczonego plazmidowego DNA w osobnej strzykawce dla każdej znieczulonej myszy, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza.Igła powinna być przymocowana na stałe bez bezpiecznika. Przed wykonaniem zabiegu opróżnij sterylne narzędzia chirurgiczne bez dotykania sterylnej tacki umieszczonej na poduszce grzewczej. Teraz podnieś mysz i zasznuruj ją w oświetlonym polu view.Z opakowania wyjmij 3,15% glukonianu chlorheksydyny i 70% wacików antyseptycznych z alkoholu izopropylowego i umieść w pobliżu zwierzęcia. Załóż sterylne rękawice chirurgiczne i zaczynając od miejsca nacięcia, przetrzyj zwierzę nowym wacikiem nasączonym alkoholem chlorheksydyny, trzy razy okrężnymi ruchami. Teraz zlokalizuj miejsce nacięcia.Uszczypnij skórę pęsetą i za pomocą nożyczek odetnij warstwę skóry około jednego centymetra od kręgosłupa, poniżej klatki piersiowej. Wykonaj kolejne centymetrowe cięcie poniżej w warstwie mięśni. Zlokalizuj nerkę i nie dotykając jej, delikatnie odsłoń ją od jamy brzusznej, wywierając stały, delikatny nacisk palcami na brzuch.Odsłonięcie nerki jest czasami trudne. Delikatnie uciskaj brzuch i kręgosłup, aby uniknąć uszkodzenia śledziony. Jeśli wyjdą narządy inne niż nerka, w razie potrzeby delikatnie przywróć je z powrotem do jamy ciała za pomocą zamkniętych kleszczy.Następnie delikatnie oddziel nerkę od otaczającego tłuszczu na tyle, aby uwidocznić miedniczkę nerkową, która może być widoczna jako mała biała kropka. Po uwidocznieniu miedniczki nerkowej użyj zamkniętych kleszczy, aby nacisnąć na prawą stronę nerki, tak aby miedniczka nerkowa pozostała w zasięgu wzroku. Następnie chwyć załadowaną strzykawkę insulinową w prawą rękę, trzymając ją równolegle do powierzchni roboczej i ostrożnie włóż igłę do miedniczki nerkowej.Po wkłuciu igły należy wstrzyknąć roztwór szybko, w ciągu trzech sekund. Pozostaw igłę na miejscu przez około 10 sekund, aby zapobiec cofaniu się roztworu. Następnie powoli i ostrożnie wyjmij igłę i przywróć narząd do jamy brzusznej, delikatnie rozciągając miejsce nacięcia za pomocą zamkniętych kleszczy.Teraz zszyj warstwę mięśniową wchłanialnymi szwami o pięciu i umieść od dwóch do czterech niezależnych węzłów. Podobnie zszyj warstwę skóry niewchłanialnymi nylonowymi szwami pięcio- lub sześcioma O i umieść od dwóch do czterech niezależnych węzłów. Aby ocenić skuteczność transfekcji, należy wprowadzić 10 mikrogramów plazmidu eksprymującego lucyferazy do rozcieńczonego DNA w celu wstrzyknięcia w celu wykonania obrazowania żywych zwierząt następnego dnia.Umieść pierwszą klatkę myszy w komorze i zamknij ją. Po znieczuleniu wstrzyknij każdej myszy dootrzewnowo 100 mikrolitrów rozmrożonej lucyferyny i zapisz czas. Wybierz poprawny identyfikator użytkownika i na górnym pasku menu kliknij pobieranie i wybierz opcję automatycznego zapisywania dwóch z menu rozwijanego.Zainicjuj system, klikając przycisk inicjuj. Poczekaj na zakończenie inicjalizacji i zmień pole widzenia na D, aby zobrazować pięć myszy. Upewnij się, że zwierzęta są ułożone w żądanej kolejności i że są tyłem skierowanym w stronę kamery, aby uwidocznić nerkę.Następnie naciśnij przycisk pobierania pięć minut po wstrzyknięciu, aby zrobić zdjęcie. Po pobraniu wyjmij myszy z urządzenia do obrazowania. Wyłącz gaz.Wyczyść komorę, grzebienie do nosa i stolik do obrazowania. Aby przeanalizować dane, po kliknięciu narzędzi ROI, kliknij ikonę koła i wybierz jedno z menu rozwijanego, aby umieścić nowy ROI na obrazie, jak wskazuje czerwony owal z czterema kwadratami wokół niego. Aby dostosować rozmiar ROI, umieść kursor na czerwonym kwadracie i przeciągnij, aby objąć fioletowy obszar nakładający się na wstrzykniętą nerkę.Teraz kliknij prawym przyciskiem myszy ten ROI i wybierz zduplikowany ROI, aby zduplikować ROI w bieżącym oknie i przenieść go do następnego myszy. Po umieszczeniu wszystkich ROI z menu bezpośrednio nad obrazem, zmień jednostki z zliczania na fotony radiancji. Na koniec utwórz arkusz kalkulacyjny z pomiarami, eksportując dane ROI z palety narzędzi, klikając narzędzia ROI, a następnie ikonę linijki ołówka.Pokazano specyficzną ekspresję genów plazmidów reporterowych w nerkach. Wszystkim myszom wstrzyknięto plazmid pTet wykazujący ekspresję wzmocnionej lucyferazy świetlika, podczas gdy myszom drugim, trzecim i pięciu wstrzyknięto również plazmid pEF1-alfa-tdtomato, wyrażający czerwone białko fluorescencyjne, tdtomato. Ogólnie rzecz biorąc, promieniowanie u młodych myszy będzie mieścić się w granicach jednego rzędu wielkości.Możliwe, że niektóre myszy nie wykazują znacznego poziomu promieniowania, albo z powodu niskiej wydajności transfekcji, albo braku samego transgenu. Wtrysk bufora hydrodynamicznego służy jako kontrola. Nie obserwuje się ekspresji plazmidu, gdy podaje się tylko bufor hydrodynamiczny.W ciągu pierwszych kilku dni po transfekcji prawdopodobnie wystąpi niewielka liczba komórek barwiących się pozytywnie na obecność transgenu. Komórki te są zlokalizowane w plamach w obszarach naciekanych przez płyn do wstrzykiwań. Na tym zdjęciu zielone sygnały pochodzą z kanalików proksymalnych, które są barwione na aglutyninę tetragonolobus lotosu, a czerwone sygnały pochodzą z transfekowanych komórek wyrażających gen reporterowy tdtomato.Po opanowaniu operacji można ją wykonać w mniej niż 10 minut, jednak znieczulenie wymaga czasu, aby wywołać i dojść do siebie. Tak więc dwóch wyszkolonych pracowników, ściśle współpracujących ze sobą, byłoby w stanie zrobić tylko około 10 do 15 myszy dziennie. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wykorzystaniu młodych myszy.Technika hydrodynamiczna nie działa tak dobrze w starszych narządach zwłóknieniowych. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak analiza próbek krwi, moczu i tkanki nerkowej, w celu oceny ekspresji interesującego genu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wstrzyknąć miedniczkę nerkową plazmidowemu DNA, aby osiągnąć ekspresję białka specyficznego dla nerek.

hydrodynamic-renal-pelvis-injection-for-non-viral-expression-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Gupta, K. i inni. Iniekcja do nerczy Escherichia coli w modelu szczura z zapaleniem pelonerek.  J. Vis. Exp. (2017).Ten film pokazuje intraneralne wstrzyknięcie E. coli do miednicy nerkowej u znieczulonego szczura, aby wywołać miejscowe zapalenie nerek, modelując ostre zapalenie nerek. Podkreśla kluczowe etapy chirurgiczne oraz techniki aseptyczne niezbędne do ustanowienia powtarzalnego modelu zakażenia in vivo do dalszej analizy.

Iniekcja śródnerkowa E. coli do miednicy nerkowej szczura

Source: Van Lidth de Jeude, et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the process of producing viral particles through transfection of embryonic kidney cells with plasmid–polyethylenimine complexes, which leads to viral genome expression, particle assembly, and virus collection in the medium.

Polyethylenimine-Mediated Transfection of Embryonic Kidney Cells for Recombinant Virus Production

W tym filmie prezentujemy protokół hydrodynamicznego wstrzykiwania plazmidów do miedniczki nerkowej myszy w celu transfekcji kwasów nukleinowych. Technika ta umożliwia dostarczanie plazmidów specyficznie dla narządu, wykorzystując zasadę wysokiego ciśnienia hydrostatycznego, które z impetem kieruje plazmidy do określonego miejsca, nie powodując uszkodzenia tkanek.

Hydrodynamiczne wstrzyknięcie do miednicy nerkowej: technika bezpośredniego dostarczania DNA do komórek nerkowych modelu mysiego

W tym filmie demonstrujemy podawanie leku do środka u szczurów przez tętnicę nerkową. Ta metoda jest korzystna w poprawie ukierunkowania leku, siły działania leku i minimalizacji toksyczności ogólnoustrojowej.

Donerkowe podawanie leków u szczurów: metoda dostarczania leków terapeutycznych do nerki szczura poprzez wstrzyknięcie dotętnicze

Tutaj prezentujemy protokół do wykorzystania map losu i znaczników linii do celowania w zastrzyki do poszczególnych blastomerów, które dają początek nerkom zarodków Xenopus laevis.

Technika celowania w mikrowstrzyknięcie do rozwijającej się nerki Xenopus

Uszkodzenia nerek spowodowane nefrotoksynami, które obejmują różne leki, od antybiotyków po chemioterapeutyki, mogą powodować złożone zaburzenia, których patogeneza pozostaje nie do końca poznana. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób danio pręgowany może być wykorzystany do modelowania chorób tych stanów, co można zastosować do identyfikacji środków renoprotekcyjnych.

Mikroiniekcja nefrotoksyny u danio pręgowanego w celu modelowania ostrego uszkodzenia nerek

Podawanie leków na przywrócenie funkcji nerek wymaga kontroli lokalizacji i dystrybucji związku terapeutycznego. Tutaj szczegółowo opisujemy prostą technikę donerkowego podawania leków szczurom. Procedura ta może być łatwo wykonana bez śmiertelności i z wysoką odtwarzalnością.

Donaczyniowe podawanie leków biologicznych do nerki szczura

Ten manuskrypt opisuje szczurzy model chirurgiczny odmiedniczkowego zapalenia nerek wykorzystujący bezpośrednie zakażenie wewnątrznerkowe przez Escherichia coli do miedniczki nerkowej. Procedura eksperymentalna może być wykorzystana do badania patogenezy odmiedniczkowego zapalenia nerek, a także związanego z nim stanu zapalnego i zwłóknienia.

Donerkowe wstrzyknięcie Escherichia coli w szczurzym modelu odmiedniczkowego zapalenia nerek

Niniejszy manuskrypt opisuje metodę celowanego podania do pojedynczej nerki za pomocą cewnika umieszczonego w aorcie podnierzeni brzusznej myszy.

Bezpośrednie podawanie leku do nerki przez tętnicę nerkową

Tutaj dostarczamy egzogenne, sztucznie syntetyzowane mimiki miRNA do nerki poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej wektora niewirusowego i nanocząsteczek polietyleniminy w kilku modelach myszy z chorobą nerek. Doprowadziło to do znacznej nadekspresji docelowego miRNA w nerce, co spowodowało zahamowanie progresji choroby nerek w kilku modelach mysich.

Dostarczanie egzogennego, sztucznie syntetyzowanego miRNA naśladującego mimikę do nerki przy użyciu nanocząstek polietyleniminy w kilku mysich modelach choroby nerek

Ten raport szczegółowo opisuje zlokalizowany sposób wstrzyknięcia wektorów AAV za pośrednictwem miednicy nerkowej w celu skutecznego i bezpiecznego przeniesienia genu do nerki myszy.

Skuteczne i bezpieczne dostarczenie genów do nerki myszy poprzez powolne wstrzyknięcie wsteczne do miedniczki nerkowej wektorów adeno-stowarzyszonych wirusów

Poznaj metodę hydrodynamicznego wstrzyknięcia DNA plazmidowego do miedniczki nerkowej u myszy. Technika ta umożliwia specyficzną ekspresję białek w nerce, co jest kluczowe dla badań nefrologicznych.

Hydrodynamiczne wstrzyknięcie do miedniczki nerkowej w celu niewirusowej ekspresji białek w nerce

Przeglądaj więcej filmów