Hydrodynamiczne wstrzyknięcie do miedniczki nerkowej w celu niewirusowej ekspresji białek w nerce
8 stycznia 2018
Ten protokół opisuje metodę wstrzykiwania plazmidowego DNA do nerki myszy przez miedniczkę nerkową w celu wytworzenia ekspresji transgenu specyficznie w nerce.
Ogólnym celem tego zabiegu chirurgicznego jest wytworzenie ekspresji białka z plazmidowego DNA w nerce dorosłej myszy. Metoda ta jest nowym narzędziem do odpowiedzi na kluczowe pytania w nefrologii, takie jak to, w jaki sposób ekspresja białka będącego przedmiotem zainteresowania wpływa na dorosłą nerkę. Główną zaletą tej techniki jest to, że wytwarza ona ekspresję białka w powtarzalny sposób, szczególnie w nerkach, w przeciwieństwie do innych metod, które mogą również powodować ekspresję genów w innych narządach.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ wstrzyknięcie miedniczki nerkowej wymaga starannej ekspozycji i musi być wykonane szybko, aby DNA osocza dostało się do komórek. Zacznij od ponownego zawieszenia plazmidowego DNA w hydrodynamicznym buforze dostarczającym. Na poduszce grzewczej z cyrkulacją wody pokrytej niebieską podkładką umieść mysz.
Używając golarki przeznaczonej do pielęgnacji zwierząt, ogol lewą stronę grzbietu myszy od ramienia do zadu i od boku do kręgosłupa. Oczyść luźne włosy i zanieczyszczenia i nałóż maść weterynaryjną w oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. Teraz przygotuj 100 mikrolitrów zawierających od 10 do 50 mikrogramów rozcieńczonego plazmidowego DNA w osobnej strzykawce dla każdej znieczulonej myszy, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
Igła powinna być przymocowana na stałe bez bezpiecznika. Przed wykonaniem zabiegu opróżnij sterylne narzędzia chirurgiczne bez dotykania sterylnej tacki umieszczonej na poduszce grzewczej. Teraz podnieś mysz i zasznuruj ją w oświetlonym polu view.
Z opakowania wyjmij 3,15% glukonianu chlorheksydyny i 70% wacików antyseptycznych z alkoholu izopropylowego i umieść w pobliżu zwierzęcia. Załóż sterylne rękawice chirurgiczne i zaczynając od miejsca nacięcia, przetrzyj zwierzę nowym wacikiem nasączonym alkoholem chlorheksydyny, trzy razy okrężnymi ruchami. Teraz zlokalizuj miejsce nacięcia.
Uszczypnij skórę pęsetą i za pomocą nożyczek odetnij warstwę skóry około jednego centymetra od kręgosłupa, poniżej klatki piersiowej. Wykonaj kolejne centymetrowe cięcie poniżej w warstwie mięśni. Zlokalizuj nerkę i nie dotykając jej, delikatnie odsłoń ją od jamy brzusznej, wywierając stały, delikatny nacisk palcami na brzuch.
Odsłonięcie nerki jest czasami trudne. Delikatnie uciskaj brzuch i kręgosłup, aby uniknąć uszkodzenia śledziony. Jeśli wyjdą narządy inne niż nerka, w razie potrzeby delikatnie przywróć je z powrotem do jamy ciała za pomocą zamkniętych kleszczy.
Następnie delikatnie oddziel nerkę od otaczającego tłuszczu na tyle, aby uwidocznić miedniczkę nerkową, która może być widoczna jako mała biała kropka. Po uwidocznieniu miedniczki nerkowej użyj zamkniętych kleszczy, aby nacisnąć na prawą stronę nerki, tak aby miedniczka nerkowa pozostała w zasięgu wzroku. Następnie chwyć załadowaną strzykawkę insulinową w prawą rękę, trzymając ją równolegle do powierzchni roboczej i ostrożnie włóż igłę do miedniczki nerkowej.
Po wkłuciu igły należy wstrzyknąć roztwór szybko, w ciągu trzech sekund. Pozostaw igłę na miejscu przez około 10 sekund, aby zapobiec cofaniu się roztworu. Następnie powoli i ostrożnie wyjmij igłę i przywróć narząd do jamy brzusznej, delikatnie rozciągając miejsce nacięcia za pomocą zamkniętych kleszczy.
Teraz zszyj warstwę mięśniową wchłanialnymi szwami o pięciu i umieść od dwóch do czterech niezależnych węzłów. Podobnie zszyj warstwę skóry niewchłanialnymi nylonowymi szwami pięcio- lub sześcioma O i umieść od dwóch do czterech niezależnych węzłów. Aby ocenić skuteczność transfekcji, należy wprowadzić 10 mikrogramów plazmidu eksprymującego lucyferazy do rozcieńczonego DNA w celu wstrzyknięcia w celu wykonania obrazowania żywych zwierząt następnego dnia.
Umieść pierwszą klatkę myszy w komorze i zamknij ją. Po znieczuleniu wstrzyknij każdej myszy dootrzewnowo 100 mikrolitrów rozmrożonej lucyferyny i zapisz czas. Wybierz poprawny identyfikator użytkownika i na górnym pasku menu kliknij pobieranie i wybierz opcję automatycznego zapisywania dwóch z menu rozwijanego.
Zainicjuj system, klikając przycisk inicjuj. Poczekaj na zakończenie inicjalizacji i zmień pole widzenia na D, aby zobrazować pięć myszy. Upewnij się, że zwierzęta są ułożone w żądanej kolejności i że są tyłem skierowanym w stronę kamery, aby uwidocznić nerkę.
Następnie naciśnij przycisk pobierania pięć minut po wstrzyknięciu, aby zrobić zdjęcie. Po pobraniu wyjmij myszy z urządzenia do obrazowania. Wyłącz gaz.
Wyczyść komorę, grzebienie do nosa i stolik do obrazowania. Aby przeanalizować dane, po kliknięciu narzędzi ROI, kliknij ikonę koła i wybierz jedno z menu rozwijanego, aby umieścić nowy ROI na obrazie, jak wskazuje czerwony owal z czterema kwadratami wokół niego. Aby dostosować rozmiar ROI, umieść kursor na czerwonym kwadracie i przeciągnij, aby objąć fioletowy obszar nakładający się na wstrzykniętą nerkę.
Teraz kliknij prawym przyciskiem myszy ten ROI i wybierz zduplikowany ROI, aby zduplikować ROI w bieżącym oknie i przenieść go do następnego myszy. Po umieszczeniu wszystkich ROI z menu bezpośrednio nad obrazem, zmień jednostki z zliczania na fotony radiancji. Na koniec utwórz arkusz kalkulacyjny z pomiarami, eksportując dane ROI z palety narzędzi, klikając narzędzia ROI, a następnie ikonę linijki ołówka.
Pokazano specyficzną ekspresję genów plazmidów reporterowych w nerkach. Wszystkim myszom wstrzyknięto plazmid pTet wykazujący ekspresję wzmocnionej lucyferazy świetlika, podczas gdy myszom drugim, trzecim i pięciu wstrzyknięto również plazmid pEF1-alfa-tdtomato, wyrażający czerwone białko fluorescencyjne, tdtomato. Ogólnie rzecz biorąc, promieniowanie u młodych myszy będzie mieścić się w granicach jednego rzędu wielkości.
Możliwe, że niektóre myszy nie wykazują znacznego poziomu promieniowania, albo z powodu niskiej wydajności transfekcji, albo braku samego transgenu. Wtrysk bufora hydrodynamicznego służy jako kontrola. Nie obserwuje się ekspresji plazmidu, gdy podaje się tylko bufor hydrodynamiczny.
W ciągu pierwszych kilku dni po transfekcji prawdopodobnie wystąpi niewielka liczba komórek barwiących się pozytywnie na obecność transgenu. Komórki te są zlokalizowane w plamach w obszarach naciekanych przez płyn do wstrzykiwań. Na tym zdjęciu zielone sygnały pochodzą z kanalików proksymalnych, które są barwione na aglutyninę tetragonolobus lotosu, a czerwone sygnały pochodzą z transfekowanych komórek wyrażających gen reporterowy tdtomato.
Po opanowaniu operacji można ją wykonać w mniej niż 10 minut, jednak znieczulenie wymaga czasu, aby wywołać i dojść do siebie. Tak więc dwóch wyszkolonych pracowników, ściśle współpracujących ze sobą, byłoby w stanie zrobić tylko około 10 do 15 myszy dziennie. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wykorzystaniu młodych myszy.
Technika hydrodynamiczna nie działa tak dobrze w starszych narządach zwłóknieniowych. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak analiza próbek krwi, moczu i tkanki nerkowej, w celu oceny ekspresji interesującego genu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wstrzyknąć miedniczkę nerkową plazmidowemu DNA, aby osiągnąć ekspresję białka specyficznego dla nerek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę wstrzykiwania plazmidowego DNA do nerki myszy poprzez miedniczkę nerkową w celu wywołania ekspresji transgenu specyficznie w nerkach. Technika ta umożliwia powtarzalną ekspresję białek w nerkach dorosłych myszy, co pozwala na rozstrzygnięcie kluczowych kwestii w dziedzinie nefrologii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nefrologia
- Terapia genowa
- Biologia molekularna
Wstęp
- Zrozumienie ekspresji białek w nerkach jest kluczowe dla badań nefrologicznych.
- Istniejące metody mogą prowadzić do ekspresji genów w wielu organach.
- Niniejsza technika skupia się na specyficznej ekspresji w nerkach.
- Demonstracja wizualna jest niezbędna dla prawidłowego wykonania metody.
Cel badania
- W celu uzyskania ekspresji białka z plazmidowego DNA w nerce dorosłej myszy.
- W celu zbadania wpływu konkretnych białek na funkcję nerek.
- Aby dostarczyć wiarygodną metodę do badań w dziedzinie nefrologii.
Zastosowane metody
- Resuspensja plazmidowego DNA w buforze do dostarczania hydrodynamicznego.
- Umieszczenie myszy na podgrzewaczu z obiegiem wody.
- Iniekcja plazmidowego DNA do miednicy nerkowej.
- Staranne odsłonięcie miejsca wstrzyknięcia i szybkie wykonanie iniekcji.
Główne wyniki
- Pomyślna ekspresja transgenu w nerkach.
- Wykazano powtarzalność ekspresji białka.
- Osiągnięto specyficzne nakierowanie na nerki.
- Metodę zwalidowano do dalszych badań nefrologicznych.
Wnioski
- Metoda ta stanowi nowe narzędzie w badaniach z zakresu nefrologii.
- Umożliwia ona ukierunkowaną ekspresję genów w nerkach.
- Prowadzenie procedury pod kontrolą wizualną zwiększa skuteczność zabiegu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia specyficzną dla nerek ekspresję białek u dorosłych myszy, rozwiązując kluczowy problem w badaniach nefrologicznych, w których podawanie systemowe często prowadzi do efektów poza docelowych. Dzięki zapewnieniu powtarzalnej, zlokalizowanej ekspresji transgenu, metoda ta wspiera mechanistyczną minimalizację ryzyka w odniesieniu do celów nerkowych oraz walidację szlaków sygnałowych. Technika ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania poprzez izolację biologicznych odpowiedzi specyficznych dla nerek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w kontekście specyficznym dla nerek, bez zakłóceń wynikających z ekspresji w całym organizmie.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną ekspresję białka w nerkach dorosłych myszy, co wspiera spójne eksperymenty z walidacji celu.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez izolację fenotypów nerkowych i redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w ocenie celów w nefrologii.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje mierzalne wyniki za pomocą reporterów lucyferazowych lub fluorescencyjnych do późniejszej walidacji przesiewowej.
- Powtarzalność: Zapewnia spójną wydajność transfekcji u zwierząt, co umożliwia niezawodne przesiewanie związków lub modulatorów w modelach chorób nerek.
- Użyteczność platformy: Wspiera opracowywanie specyficznych dla nerek testów, które mogą być wykorzystywane wielokrotnie w kampaniach walidacji celów terapeutycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Modeluje patofizjologię ludzkiej nerki, umożliwiając ukierunkowaną ekspresję białek związanych z chorobą w tkance nerkowej.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, zapewniając powtarzalny system do badań nad funkcjami białek w nerce.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspomaga podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez wyjaśnienie efektów specyficznych dla celu w nerkach przed szerszym przesiewem fenotypowym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od testowania hipotez dotyczących celu po walidację przedkliniczną, umożliwiając w szczególności prowadzenie mechanistycznych badań nad nerkami przed identyfikacją związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez ograniczenie ekspresji białek do nerek, co redukuje ogólnoustrojowe czynniki zakłócające.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację testów dzięki powtarzalnej ekspresji reportera, co ułatwia ilościową ocenę celów nerkowych.
- Analityka: Zapewnia mierzalne wyniki, takie jak bioluminescencja i fluorescencja, umożliwiając porównanie poziomów ekspresji w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez walidację efektów białek specyficznych dla nerek w fizjologicznie istotnym modelu.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnie wykorzystywalną platformę chirurgiczną dla wielu celów nefrologicznych, redukując potrzebę redundantnego opracowywania modeli.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez eliminację artefaktów wynikających z ekspresji poza celem w badaniach nerek.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje dostarczanie do miednicy nerkowej, poprawiając powtarzalność między laboratoriami i partiami eksperymentalnymi.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez redukcję nieudanych badań spowodowanych niespecyficzną ekspresją, usprawniając proces selekcji celów nefrologicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów nerkowych w oparciu o analizę ryzyka dzięki wyraźniejszym wnioskom mechanistycznym z danych o ekspresji specyficznej dla nerek.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu mikrochirurgii w celu odsłonięcia i kaniulacji miedniczki nerkowej w znieczuleniu.
- Metoda opiera się na wykorzystaniu sterylnych instrumentów chirurgicznych, przygotowaniu buforu do dostarczania hydrodynamicznego oraz systemów obrazowania do oceny transfekcji.
- Konieczna jest standaryzacja działań między zespołami chirurgicznymi, obrazowania i biologii molekularnej w celu zapewnienia spójności wykonania procedury.
- Rozważania dotyczące adaptacji obejmują różnice w wielkości nerek, stopień włóknienia oraz wiek, przy czym najlepsze wyniki uzyskuje się u młodych myszy bez włóknienia.
- Ograniczenia praktyczne obejmują niższą wydajność transfekcji w nerkach starszych lub chorych oraz konieczność szybkiego wstrzyknięcia w celu zapobiegania cofaniu się płynu.
