Name: Bezkomórkowy biochemiczny fluorometryczny test enzymatyczny do wysokoprzepustowego pomiaru peroksydacji lipidów w lipoproteinach o dużej gęstości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Poznaj bezkomórkowy fluorometryczny test enzymatyczny do pomiaru peroksydacji lipidów w HDL. Ta metoda umożliwia szybkie i niezawodne określenie funkcji lipoprotein o dużej gęstości w badaniach kardiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za pracę dr Mohamada Navaba, Alana Fogelmana i Srinivasy Reddy'ego za ich kluczową rolę w rozwoju wcześniejszych wersji tego modelu. T.A.A. jest wspierany przez stypendium podoktorskie rektora Uniwersytetu RMIT. AJ i AH są wspierane przez grant projektu NHMRC 1108792. TK jest wspierany przez NIH granty NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # μL1TR000124.

Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem ludzkich próbek biologicznych zostały przeprowadzone po uzyskaniu zgody etycznej z University of California Los Angeles, Los Angeles oraz komisji etyki ds. ludzi w Alfred Hospital, Melbourne.
UWAGA: Istnieje wiele wariantów testu funkcji fluorochromowej HDL (patrz dyskusja)32. Poniżej opisano protokół, który daje najbardziej spójne i powtarzalne wyniki. Przegląd testu przedstawiono na Rysunku 2.
1. Przetwarzanie próbek
<ol>
	<li>Należy użyć świeżego, niehemolizowanego surowicy (może być pobrana do probówek z separatorem surowicy) lub osocza z cytratem pobranego po 12–14 godzinach postu. W przypadku korzystania z próbek kriozamrożonych należy dołączyć odpowiednią kontrolę, zgodnie z opisem w niniejszym protokole.</li>
</ol>
2. Dzień 0 – Przygotowanie do analizy
<ol>
	<li>Przygotuj schemat rozmieszczenia doświadczenia z odpowiednimi kontrolami, próbkami i powtórzeniami. Każdą próbkę analizuj co najmniej w trzech powtórzeniach. Reprezentatywny schemat dla płytki 96-dołkowej przedstawiono na Rysunku 3.</li>
	<li>Oblicz objętości wszystkich odczynników, które zostaną wykorzystane w analizie, w zależności od liczby próbek i powtórzeń. 
	UWAGA: Uwzględnij dodatkowe 10% objętości w każdym roztworze roboczym, aby upewnić się, że ilość każdego odczynnika jest wystarczająca dla danego eksperymentu.</li>
	<li>Oznakuj wszystkie wymagane probówki dla poszczególnych etapów analizy, np. do separacji HDL, pomiaru HDL-C (opcjonalnie) oraz analizy fluorochromowej.</li>
</ol>
3. Dzień 1 – Przygotowanie kontroli
<ol>
	<li>Przygotowanie specyficznej dla badania puli kontrolnej
	<ol>
		<li>Przygotować próbkę kontrolną z puli osocza lub surowicy wszystkich próbek badawczych. W przypadku analizy 20 próbek na płytce w trzech powtórzeniach, połączyć 10 µL z każdej próbki w 200 µL puli kontrolnej. Przekazać osobną alikwot tej puli kontrolnej do laboratorium klinicznego w celu oznaczenia wartości HDL-C tej kontroli. 
		UWAGA: Należy użyć tej puli kontrolnej do standaryzacji testu i uwzględnienia wszystkich możliwych znanych (np. rodzaj macierzy: surowica względem osocza, cykle zamrażania i rozmrażania, kriokonserwacja) i nieznanych czynników zakłócających, które mogą wpływać na zmienność eksperymentalną27,28.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie laboratoryjnych kontroli jakości (QC)
	<ol>
		<li>Przygotować w każdym laboratorium duży zapas HDL (na przykład HDL wyizolowany z 5 mL osocza od 10 zdrowych dawców) i kriokonserwować kilka alikwotów tego zapasu, aby zminimalizować liczbę cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
		<li>Wykorzystać co najmniej 10 różnych powtórzeń z tego zapasu do wyznaczenia średniej wartości HDLox. Akceptowalny zakres zmierzonych wartości HDLox dla każdej próbki QC zawartej w każdym teście mieści się w granicach &lt;15% współczynnika zmienności tej wartości średniej.</li>
		<li>Przekazać osobną alikwot tej puli kontrolnej do laboratorium klinicznego w celu oznaczenia wartości HDL-C tej kontroli (np. 40 mg/dL). 
		UWAGA: Szczegółowe podejście do wykorzystania krwi z banków krwi w celu stworzenia tych kontrol zostało opisane wcześniej 27,28,32. Stosować dodatkowe QC w razie potrzeby (np. jedną od zdrowego dawcy o znanej prawidłowej funkcji HDL i jedną od dawcy o znanej w znacznym stopniu nieprawidłowej funkcji HDL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Optymalizacja sygnału tła i wartości blanku (opcjonalnie)
	<ol>
		<li>Aby zminimalizować tło, dodać odpowiednią ilość katalazy (1-4 U/mL) do medium inkubacyjnego w celu szybkiego usunięcia H2O2 powstałego w wyniku spontanicznego utleniania buforów przez powietrze. 
		UWAGA: Ponieważ wartości z dołków blanku (bez HDL) są odejmowane od wartości próbek HDL, a wyniki są raportowane w odniesieniu do puli kontrolnej (zawartej na tej samej płytce 96-dołkowej), stwierdzono, że krok ten nie wpływa praktycznie na wyniki. Zatem optymalizację sygnału tła za pomocą katalazy można pominąć, jeśli jest to konieczne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Dzień 1 – Wyodrębnianie cholesterolu HDL za pomocą precypitacji HDL
UWAGA: W celu wyizolowania surowicy pozbawionej apoB należy użyć dostępnego komercyjnie, wystandaryzowanego odczynnika do wytrącania cholesterolu HDL, zgodnie z instrukcjami producenta. Odczynniki te są powszechnie stosowane w testach kolorymetrycznych do oznaczania poziomu cholesterolu HDL.
<ol>
	<li>Należy użyć świeżej (lub rozmrożonej) próbki osocza lub surowicy.</li>
	<li>Wymieszać równe objętości (np. 80 µL) osocza i odczynnika do wytrącania cholesterolu HDL (20% w/v glikolu polietylenowego w buforze glicynowym o pH 10,0 (25 °C)).</li>
	<li>Dokładnie wymieszać, pipetując ciecz w górę i w dół.</li>
	<li>Wirować z prędkością 1000-2000 x g przez 10 min.</li>
	<li>Odssać nadsącz (frakcja HDL).</li>
	<li>Wyizolowane HDL należy najlepiej niezwłocznie wykorzystać do testu fluorochromowego na peroksydację lipidów HDL. Jeśli jednak w tym samym dniu analizowanych jest wiele próbek i wykonywane są inne etapy, takie jak pomiar stężenia cholesterolu HDL, wyizolowane HDL należy przechowywać w temperaturze 4 °C i wykorzystać następnego dnia do testu fluorochromowego funkcji HDL.</li>
</ol>
5. Dzień 1 – Oznaczenie HDL-C w wyizolowanym HDL
UWAGA: Krok ten jest opcjonalny, jeśli wartość HDL-C z laboratorium klinicznego jest wykorzystywana do normalizacji HDLox względem ilości HDL-C.
<ol>
	<li>Oznacz ilość cholesterolu HDL w plazmie, stosując standardowe testy kolorymetryczne27. Dodaj 50 µL odczynnika do cholesterolu do każdego dołka i wyznacz stężenie cholesterolu za pomocą kolorymetrycznego czytnika płytek oraz standardu cholesterolu dołączonego do każdego zestawu.</li>
</ol>
6. Dzień 2 – Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Przygotować roztwory HRP oraz cholesterolu w stężeniu 5 U/mL HRP (zakres 1-10 U/mL).</li>
	<li>Przygotować roztwory fluorochromu (np. Amplex Red) o stężeniu 20 mM: rozmrozić fiolkę z odczynnikiem fluorochromowym i DMSO w temperaturze pokojowej. Przed użyciem rozpuścić odczynnik fluorochromowy (1 mg) w 200 µL DMSO. Roztwór zapasowy przechowywać w zamrażarce w temperaturze ≤-20 °C, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Przygotować kontrole pozytywną i negatywną: jako kontrolę negatywną zastosować 1X „bufor reakcyjny” bez cholesterolu, a jako kontrolę pozytywną roboczy roztwór 20 mM H2O2.</li>
</ol>
7. Dzień 2 – Analiza fluorochromowa
<ol>
	<li>Dodaj 50 µL buforu reakcyjnego 1x jako próbę blank (kontrolę negatywną).</li>
	<li>Opcjonalnie: Dodaj 20 mM roztwór roboczy H2O2 jako kontrolę pozytywną na każdej płytce.</li>
	<li>Aby zminimalizować zmienność eksperymentalną i zapewnić spójne oraz terminowe dodawanie odczynników i próbek, wykonaj wszystkie aplikacje próbek w oddzielnej, 96-dołkowej, przezroczystej płytce z polistyrenu lub polipropylenu o okrągłym dnie (Płytka 1). Następnie użyj pipety wielokanałowej, aby przenieść określone objętości do trzech 96-dołkowych płytek (Płytki 2-4: polipropylenowe, z płaskim dnem, czarne) o identycznym układzie (Rysunek 2, Rysunek 3).
	<ol>
		<li>Na przykład, najpierw dodaj 160 µL wyizolowanego HDL do każdego dołka/próbki na płytce 1, a następnie za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 50 µL HDL-cholesterolu z każdego dołka/próbki do czarnych płytek 96-dołkowych. Wymieniaj końcówki pomiędzy każdym rzędem/kolumną i używaj końcówek bez filtra do wszystkich transferów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostaw próbki w dołkach. Nie odrzucać. Między dodawaniem odczynników nie wykonuje się etapów płukania.</li>
	<li>Dodaj 50 µL roztworu HRP o stężeniu 5 U/mL (0,25 U) do każdego dołka. 
	UWAGA: Użyj HRP przed dodaniem odczynnika fluorochromowego.</li>
	<li>Inkubuj przez 30 min w temperaturze 37 °C. Nie odrzucaj próbek po inkubacji (brak etapów płukania między dodawaniem odczynników).</li>
	<li>Dodaj 50 µL odczynnika fluorochromowego do uzyskania stężenia końcowego 300 µM. W tym momencie całkowita objętość reakcji wynosi 150 µL. Wymieszaj dokładnie i chroń przed światłem.</li>
	<li>Kieruj odczyt fluorescencji (w ciemności) co minutę przez 120 min w temperaturze 37 °C za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek (filtry 530/590 nm). 
	UWAGA: W przypadku świeżych próbek zastosuj krótszy interwał 60 minut. Stwierdzono, że test trwający 120 minut daje bardziej powtarzalne dane przy użyciu próbek kriokonserwowanych.</li>
	<li>Zapisz dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania.</li>
</ol>
8. Dzień 3 – Analiza danych
<ol>
	<li>Zapisz jednostki fluorescencji (jednostki umowne) po 120 minutach od dodania odczynnika fluorochromowego dla wszystkich próbek, w tym dla dołków blank i wszystkich kontroli.</li>
	<li>Oblicz średnią wartość jednostek fluorescencji (na podstawie co najmniej trzech powtórzeń) (HDLox_sample). Nie bierz pod uwagę wartości odstających (&gt; 2 SD od wartości średniej).</li>
	<li>Odejmij fluorescencję tła, korzystając z następującego równania: 
	<img alt="Wzór obliczania fluorescencji dla HDLox_sample; demonstracja odejmowania fluorescencji próbki." src="/files/ftp_upload/56325/56325eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"></li>
	<li>Normalizacja do ilości cholesterolu HDL (HDL-C): Znormalizuj wartość peroksydacji lipidów HDLox dla każdej próbki (w tym dla kontroli z próbek połączonych) do wartości HDL-C (mg/dl). W sekcji wyników HDLox jest prezentowany jako pomiar n(HDL-C) HDLox, aby odzwierciedlić korektę o HDL-C. Użyj następującego równania: 
	<img alt="Równanie fluorescencji w próbce HDL; wzór na ilościowe oznaczenie HDL-C; badania chemiczne." src="/files/ftp_upload/56325/56325eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"></li>
	<li>Zestandaryzuj wyrażenie wartości peroksydacji lipidów HDLox każdej próbki względem wartości kontroli z próbek połączonych. Znormalizuj wartość peroksydacji lipidów n(HDL-C) HDLox dla każdej próbki (skorygowaną o HDL-C) przez wartość peroksydacji lipidów n(HDL-C) HDLox kontroli z próbek połączonych. W sekcji wyników HDLox jest prezentowany jako pomiar nHDLox, aby odzwierciedlić korektę o zmienność eksperymentalną i HDL-C. Użyj następującego równania: 
	<img alt="Wzór na ilościowe oznaczenie nHDLox, stosunek utleniania HDL w analizie biochemicznej, schemat równania." src="/files/ftp_upload/56325/56325eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3"> 
	UWAGA: Podejście to jest podobne do innych uznanych metod eksperymentalnych służących do redukcji zmienności pomiarów, takich jak międzynarodowy wskaźnik zakrzepemialności (INR)44,45. Metoda ta została zwalidowana w badaniach klinicznych32,33,34,35,36,37,38,39.</li>
	<li>Przeprowadź kontrolę jakości wyników eksperymentalnych przy użyciu standardowych próbek kontroli jakości. Każde laboratorium powinno ustanowić własne kontrole jakości (QC). Idealnie powinna istnieć kontrola QC dla nHDLox z próbki o znanej dysfunkcji HDL oraz kontrola QC dla nHDLox z próbki od zdrowych dawców [np. użycie próbek połączonych od młodych dorosłych, którzy są stałymi dawcami krwi i nie mają znanych chorób współistniejących ani czynników ryzyka chorób układu sercowo-naczyniowego, w tym palenia tytoniu]. Ta ostatnia kontrola standaryzuje wyniki między różnymi laboratoriami. Średnie wartości tych QC ustala się na podstawie co najmniej 5 powtórzeń (zazwyczaj w tym ważnym kroku stosujemy 10 powtórzeń).
	<ol>
		<li>Sprawdź, czy zmierzone wartości QC w każdym teście mieszczą się w oczekiwanym zakresie. Zakładając dopuszczalną maksymalną zmienność eksperymentalną na poziomie 15%, wszystkie zmierzone wartości eksperymentalne powinny mieścić się w granicach 15% znanych wartości średnich ustanowionej kontroli QC. Użyj następujących równań: 
		<img alt="Wzór kontroli jakości; zakres wartości eksperymentalnych; koncepcja matematyczna." src="/files/ftp_upload/56325/56325eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 4"> 
		<img alt="Wzór zakresu kontroli jakości; porównanie danych eksperymentalnych; reprezentacja matematyczna." src="/files/ftp_upload/56325/56325eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 5"> 
		UWAGA: Jeśli któraś z uwzględnionych próbek kontroli jakości (normalny w porównaniu z dysfunkcyjnym HDL) daje wartości HDLox poza oczekiwanym zakresem (ustanowionym w danym laboratorium), należy powtórzyć eksperyment.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź kontrolę jakości wyników eksperymentalnych, używając współczynnika zmienności (CV) do określenia zmienności eksperymentalnej: Powtórz wszystkie próbki z CV% &gt; 15%. Użyj następującego równania: 
	<img alt="Wzór współczynnika zmienności, obliczanie CV%, równanie ilustrujące analizę statystyczną." src="/files/ftp_upload/56325/56325eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 6"> 
	UWAGA: Typowa zmienność eksperymentalna wewnątrz serii (na tej samej płytce) i między seriami (między różnymi płytkami) wynosi &lt; 15%. 2) Typowe CV wewnątrz serii mieści się w przedziale 1-7%, a typowe CV między seriami w przedziale 3-10%.</li>
</ol>

Ten protokół i test są istotne dla patentu PCT/US2015/018147.

Opisany tutaj protokół stanowi solidne narzędzie do udzielenia odpowiedzi na ważne pytania badawcze dotyczące roli funkcji HDL w miażdżycy i chorobach człowieka. Test określa ilościowo zawartość nadtlenku lipidów HDL na mg HDL-C za pomocą amplifikacji enzymatycznej (HRP). Podejście to pozwala uniknąć znanych ograniczeń wcześniejszych testów funkcji HDL (np. testu wypływu cholesterolu), w tym znacznej heterogeniczności w odniesieniu do typów użytych komórek, rodzaju zgłaszanego odczytu, braku standaryzacji i zakłócających...

Miażdżycowa choroba sercowo-naczyniowa (CVD) jest główną przyczyną zgonów na całym świecie1,2. Badania epidemiologiczne wykazały, że niski poziom cholesterolu lipoprotein o dużej gęstości (HDL) jest na ogół odwrotnie proporcjonalny do ryzyka rozwoju miażdżycy1,2. Chociaż kilka badań potwierdza rolę miażdżycową HDL1,2, mechanizm, dzięki któremu HDL osłabia inicjację i progresję miażdżycy, jest złożony 3,4. W związku z tym zasugerowano, że złożona struktura i funkcja HDL, a nie poziom bezwzględny, może dokładniej przewidywać miażdżycę 5,6,7,8. W stanach zapalnych, takich jak miażdżyca, występuje kilka zmian w składzie białka HDL i lipidów, które upośledzają funkcję HDL. I) zmniejszają potencjał wypływu cholesterolu 9, ii) zmniejszają działanie przeciwzapalne i zwiększają białka prozapalne związane z HDL 6,7, iii) zmniejszają poziom i aktywność czynników antyoksydacyjnych oraz zdolność HDL do hamowania utleniania lipoprotein o niskiej gęstości (LDLox)10 oraz iv) zwiększają zawartość wodoronadtlenku lipidów i aktywność redoks (HDLox)9,11. Solidne testy, które oceniają pleotropowe funkcje HDL (takie jak wypływ cholesterolu, funkcja przeciwutleniająca) mogą uzupełniać oznaczanie HDL-HDL-C w klinice.
funkcja HDL jest zwykle oceniana za pomocą metod opartych na komórkach, takich jak test wypływu cholesterolu8,12,13,14. Metody te mają poważne ograniczenia, w tym znaczną niejednorodność w odniesieniu do typów używanych komórek, rodzaju zgłaszanego odczytu, braku standaryzacji i zakłócających skutków triglicerydów 7,15. Te wady stwarzają trudności w przypadku dużych badań klinicznych16. Testy bezkomórkowe mogą dawać bardziej wiarygodne pomiary funkcji HDL w porównaniu z testami opartymi na komórkach. Wypływ cholesterolu jest jedną z najważniejszych funkcji HDL, ale można go określić tylko za pomocą testów komórkowych. Inne podejścia do określania funkcji HDL, takie jak proteomika17,18,19,20,21,22,23,24 i komórkowe testy chemotaksji monocytów funkcji HDL 17,22,25 nie zostały ustandaryzowane i nie mogą być używane w badaniach na dużą skalę na ludziach.
HDL ma znaczące działanie przeciwutleniające, przeciwmiażdżyco-protekcyjne5,6,7,8. Funkcja przeciwutleniająca HDL została określona w obecności LDL w poprzednich testach fluorometrycznych bez komórek 26. Te biochemiczne metody fluorometryczne funkcji przeciwutleniacza HDL zostały pierwotnie opracowane przez Mohamada Navaba i Alana Fogelmana oraz ich kolegów26. Chociaż w wielu badaniach na ludziach wykorzystano te metody do określenia funkcji HDL 17,18,19,20,21,22,23,24, interakcje lipidowe (HDL)-lipidowe (LDL) i lipidowo-fluorochromowe mogą ograniczać odtwarzalność tych bezkomórkowych nieenzymatycznych testów biochemicznych funkcji HDL27,28.
Ostatnie zainteresowanie skupiło się na funkcjonalnych konsekwencjach utleniania HDL, które jest wynikiem utleniania zarówno lipidów, jak i białek w HDL 27,29,30. Wcześniejsze badania wykazały, że utlenianie HDL upośledza funkcję HDL 27,29,30. HDL odgrywa główną rolę w transporcie nadtlenku lipidów, a duża ilość nadtlenków lipidów jest związana z nieprawidłową funkcją HDL. W ten sposób zawartość nadtlenku lipidów HDL może być wykorzystana do określenia funkcji HDL 9,17,20,31 i biorąc pod uwagę znane ograniczenia wcześniejszych testów funkcji HDL7,15,27,32opracowaliśmy alternatywną metodę fluorometryczną, która określa ilościowo zawartość nadtlenku lipidów HDL (HDLox) 32. Metoda ta opiera się na enzymie peroksydazie chrzanowej (HRP) i fluorochromie Amplex Red, które mogą określić ilościowo (bez oksydazy cholesterolowej) zawartość nadtlenku lipidów na mg HDL-C <klasa sup = "xref">32. Zasada biochemiczna testu jest pokazana w <silna klasa="xfig">Rysunek 1. Wykazaliśmy, że to podejście oparte na fluorescencji nie ma ograniczeń wynikających z wcześniejszych testów funkcji HDL27,28. Test ten został dodatkowo udoskonalony i ustandaryzowany w naszym laboratorium, dzięki czemu może być niezawodnie stosowany w badaniach na dużą skalę na ludziach, nawet z kriokonserwowanym osoczem 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. Odczyt tego testu jest powiązany z odczytami zwalidowanych testów opartych na komórkach, zastępczych miar chorób sercowo-naczyniowych, ogólnoustrojowych stanów zapalnych, dysfunkcji immunologicznych i powiązanych fenotypów ryzyka sercowo-naczyniowego i metabolicznego32,33,34,35,36,37,38,39. Tutaj opisujemy tę prostą, ale solidną metodę pomiaru zawartości nadtlenku lipidów HDL (HDLox). Test ten może być wykorzystany jako narzędzie do udzielenia odpowiedzi na ważne pytania badawcze dotyczące roli funkcji HDL w chorobach człowieka, w których ogólnoustrojowe zapalenie, stres oksydacyjny i utlenione lipidy odgrywają kluczową rolę (np. miażdżyca)32.

<table><tbody><tr><td>Eksperymentalne odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDL PEG (Polyethyle Glycol) Odczynnik strącający</td><td>Pointe Scientific</td><td>H7511</td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Zestaw do oznaczania czerwonego cholesterolu Amplex. &bull; &le; &ndash; 20&stopni; C i byk; Desykat i byk; Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>DMSO.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Zestaw do oznaczania czerwonego cholesterolu Amplex. &bull; &le; &ndash; 20&stopni; C i byk; Desykat i byk; Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Peroksydaza chrzanowa (HRP)</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. &bull; &le; &ndash; 20&stopni; C i byk; Desykat i byk; Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Esterazy cholesterolu.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Zestaw do oznaczania czerwonego cholesterolu Amplex. &bull; &le; &ndash; 20&stopni; C i byk; Desykat i byk; Chroń przed światłem</td></tr><tr><td>Cholesterol Reference standard</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. &bull; &le; &ndash; 20&stopni; C i byk; Desykat i byk; Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Wzorzec referencyjny fluorescencji Rezorufiny</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Zestaw do oznaczania czerwonego cholesterolu Amplex. &bull; &le; &ndash; 20&stopni; C i byk; Desykat i byk; Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>5x bufor reakcyjny.</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A12216</td><td>Zestaw do oznaczania czerwonego cholesterolu Amplex. &bull; &le; &ndash; 20&stopni; C i byk; Desykat i byk; Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>HDL Cholesterol Automated Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td><td>TR39601</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki (polipropylenowe, płaskie dno, przezroczyste).</td><td>Płytki 96-dołkowe Sigma Aldrich</td><td>M0687</td><td></td></tr><tr><td>(polipropylenowe, płaskie dno, czarne).</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9936</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówki Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>ClipTip 200, sterylne</td><td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td><td>14-488-058</td><td></td></tr><tr><td>Pipety wielokanałowe Thermo Scientific, 8-kanałowe, 125&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, Kalifornia, Stany Zjednoczone.</td><td>&nbsp; 14-387--955</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 2.01 oprogramowanie</td><td>Biotek, Vermont, USA</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Nazwa</td><td> Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 Czytnik płyt</td><td>Biotek, Vermont, USA</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

bezkomórkowy biochemiczny fluorometryczny test enzymatyczny do wysokoprzepustowego pomiaru peroksydacji lipidów w lipoproteinach o dużej gęstości

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Niski poziom cholesterolu lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL-C) jest jednym z najpotężniejszych niezależnych negatywnych predyktorów miażdżycowej choroby sercowo-naczyniowej (CVD). Struktura i funkcja HDL, a nie HDL-C, może dokładniej przewidywać miażdżycę. W stanach zapalnych, takich jak miażdżyca, występuje kilka zmian w składzie białka HDL i lipidów, które upośledzają funkcję HDL. Funkcja HDL jest zwykle określana za pomocą testów komórkowych, takich jak test wypływu cholesterolu, ale testy te mają wiele wad, brak standaryzacji. Testy bezkomórkowe mogą dawać bardziej wiarygodne pomiary funkcji HDL w porównaniu z testami opartymi na komórkach. Utlenianie HDL upośledza funkcję HDL. HDL odgrywa główną rolę w transporcie nadtlenku lipidów, a duża ilość nadtlenków lipidów jest związana z nieprawidłową funkcją HDL. Interakcje między lipidem a sondą powinny być brane pod uwagę przy interpretacji wyników nieenzymatycznych testów fluorescencyjnych do pomiaru stanu utlenienia lipidów. To zmotywowało nas do opracowania bezkomórkowej biochemicznej metody enzymatycznej do oceny zawartości nadtlenku lipidów HDL (HDLox), który przyczynia się do dysfunkcji HDL. Metoda ta opiera się na enzymie peroksydazie chrzanowej (HRP) i fluorochromie Amplex Red, które mogą określić ilościowo (bez oksydazy cholesterolowej) zawartość nadtlenku lipidów na mg HDL-C. Tutaj opisano protokół oznaczania peroksydacji lipidów HDL za pomocą odczynnika fluorochromowego. Zmienność testu można zmniejszyć poprzez ścisłą standaryzację warunków eksperymentalnych. Wyższe wartości HDLox są związane ze zmniejszoną funkcją przeciwutleniającą HDL. Odczyt tego testu jest powiązany z odczytami zwalidowanych testów komórkowych, zastępczych miar chorób sercowo-naczyniowych, ogólnoustrojowych stanów zapalnych, dysfunkcji immunologicznych oraz powiązanych fenotypów ryzyka sercowo-naczyniowego i metabolicznego. To podejście techniczne jest solidną metodą oceny funkcji HDL w chorobach ludzkich, w których ogólnoustrojowy stan zapalny, stres oksydacyjny i utlenione lipidy odgrywają kluczową rolę (takich jak miażdżyca).

Do każdej studzienki dodaje się 50 µL każdej próbki HDL, zgodnie z krokiem 7.3. Następnie do każdej studzienki dodaje się 50 µL roztworu HRP 5 U/mL (0,25 U), zgodnie z krokiem 7.5. Próbki inkubuje się przez 30 min w temperaturze 37 °C, zgodnie z krokiem 7.6. Następnie do każdej studzienki dodaje się 50 µL odczynnika fluorochromowego zgodnie z krokiem 7.7 (stężenie końcowe 300 µM). Odczyt fluorescencji (w ciemności) jest następnie oceniany co minutę przez 120 minut w temperaturze 37 °C za ...

Opisujemy tutaj fluorometryczny, bezkomórkowy test biochemiczny do oznaczania peroksydacji lipidów HDL. Ten szybki i powtarzalny test może być wykorzystany do określenia funkcji HDL w badaniach na dużą skalę i może przyczynić się do zrozumienia funkcji HDL w chorobach ludzkich.

Bezkomórkowy biochemiczny fluorometryczny test enzymatyczny do wysokoprzepustowego pomiaru peroksydacji lipidów w lipoproteinach o dużej gęstości

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Ogólnym celem tej metody eksperymentalnej jest określenie funkcji lipoprotein o wysokiej gęstości za pomocą biochemicznego testu bezkomórkowego, który mierzy zawartość nadtlenku lipidów w określonej ilości HDL. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w kilku dziedzinach medycyny, takich jak rola funkcji HDL w nieprawidłowościach metabolicznych chorób sercowo-naczyniowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to bezkomórkowa metoda biochemiczna, którą można wykorzystać do wiarygodnego określenia funkcji HDL.Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat roli funkcji HDL w chorobach sercowo-naczyniowych i nieprawidłowościach metabolicznych, może być również stosowana w innych badaniach nad chorobami, takimi jak choroby zapalne. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować układ roboczy dla płytki 96-dołkowej, w tym odpowiednie kontrole, próbki i powtórzenia, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Obliczyć potrzebną objętość odczynników na podstawie liczby próbek i kontrprób.Za pomocą markera permanentnego oznacz probówki dla każdego etapu testu. Następnie połącz 10 mikrolitrów z każdej próbki, aby utworzyć zbiorczą próbkę kontrolną. Utwórz drugą zbiorczą próbkę kontrolną dla laboratorium klinicznego w celu określenia wartości HDL-C.Po przygotowaniu dużego zapasu HDL, zakonserwuj kriogenicznie kilka porcji, aby zminimalizować cykle zamrażania i rozmrażania. Zbierz co najmniej 10 różnych powtórzeń, aby utworzyć zbiorczą kontrolę jakości. Następnie określ średnią wartość HDLox zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Utwórz drugą zbiorczą kontrolę jakości dla laboratorium klinicznego w celu określenia wartości HDL-C. Na początek rozmrozić świeżą próbkę osocza lub surowicy. Wymieszać ze sobą równe objętości odczynnika wytrącającego cholesterol w osoczu i HDL.Kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół, aby dobrze wymieszać. Wirować z prędkością od 1000 do 2000 razy G przez 10 minut. Następnie odessać supernatant.Przechowuj wyizolowany HDL w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu, gdy będzie gotowy do wykonania testu funkcji fluorochromu HDL. Jeśli wartość HDL-C laboratorium klinicznego jest używana do normalizacji HDLox, określ ilościowo HDL-C z osocza, jak opisano w protokole tekstowym. Na początek wymieszaj cholesterol i HRP, tak aby przygotowane roztwory zawierały pięć jednostek na mililitr HRP.Rozmrozić fiolkę z odczynnikiem fluorochromowym i fiolkę z DMSO do temperatury pokojowej. Po ich rozmrożeniu rozpuść jeden miligram odczynnika fluorochromowego w 200 mikrolitrach DMSO. Roztwór należy przechowywać w temperaturze poniżej minus 20 stopni Celsjusza, chroniąc go przed światłem.Następnie dodaj 50 mikrolitrów buforu reakcyjnego 1X do płytki próbki jako kontrolę ujemną. Dodaj 50 mikrolitrów 20-milimolowego roztworu roboczego nadtlenku wodoru jako kontrolę pozytywną. Następnie należy wyłożyć świeżą 96-dołkową płytkę z okrągłym dnem, która ma być użyta jako płytka przygotowawcza.Dodaj 200 mikrolitrów wyizolowanego HDL do każdego dołka tej płytki przygotowawczej. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 50 mikrolitrów HDL z płytki przygotowawczej na płytki doświadczalne, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, przy czym liczba płytek doświadczalnych jest równa liczbie powtórzeń w teście. Następnie dodaj 50 mikrolitrów przygotowanego roztworu HRP do każdej studzienki.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, a następnie dodać 50 mikrolitrów odczynnika fluorochromowego do każdej studzienki, co daje całkowitą objętość 150 mikrolitrów na studzienkę. Dobrze wymieszaj i chroń przed światłem. Za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych oceniaj odczyt fluorescencyjny przy 37 stopniach Celsjusza, w ciemności, co minutę przez 120 minut.Zapisz dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania, a następnie oblicz średnią wartość jednostek fluorescencji zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W tym badaniu opracowano bezkomórkowy biochemiczny test fluorometryczny w celu ilościowego określenia zawartości nadtlenku lipidów HDL na miligram HDL-C. Osiąga się to poprzez amplifikację enzymatyczną przy użyciu HRP.Czytnik płytek fluorescencyjnych jest następnie używany do pomiaru fluorescencji w ciemności, co minutę, przez 120 minut. Poniżej przedstawiono reprezentatywne dane dotyczące pacjenta, u którego stwierdzono dysfunkcyjną HDL, w porównaniu z grupą kontrolną. Obserwuje się, że dysfunkcyjny HDL ma dwukrotnie wyższy poziom nadtlenku lipidów niż ten obserwowany w zbiorczym HDL od zdrowych uczestników.Następnie izoluje się HDL i oznacza HDLox u 50 zdrowych osób i 100 pacjentów zakażonych wirusem HIV. Obserwuje się, że pacjenci zakażeni wirusem HIV mają średnio o 60% wyższą zawartość nadtlenku HDL na miligram HDL-C niż osoby zdrowe. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż sześć godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wcześniejszym przygotowaniu wszystkich odczynników i kontroli, być konsekwentnym, precyzyjnym i zawsze uwzględniać odpowiednią kontrolę eksperymentalną na każdej płytce doświadczalnej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować HDL, określić zawartość nadtlenku lipidów w określonej ilości HDL i zdeprecjonować naszą funkcję HDL. Nie zapominaj, że praca z próbkami biologicznymi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak rękawiczki.

cell-free-biochemical-fluorometric-enzymatic-assay-for-high

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Lipogeneza de novo i utlenianie β-kwasów tłuszczowych stanowią kluczowe szlaki metaboliczne w hepatocytach, szlaki, które są zaburzone w wielu zaburzeniach metabolicznych, w tym w stłuszczeniu wątroby. Tutaj pokazujemy izolację pierwotnych hepatocytów myszy i opisujemy ilościowe oznaczanie utleniania i lipogenezy β-kwasów tłuszczowych.

Oznaczanie utleniania i lipogenezy kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach myszy

Opisujemy test oparty na fluorescencji do pomiaru mieszania fosfolipidów w dużych liposomach jednowarstwowych odtworzonych za pomocą opsyny.

Test fluorescencyjny aktywności scramblazy fosfolipidowej

Ten protokół zapewnia skuteczne podejście do pomiaru wychwytu cholesterolu LDL z rzeczywistymi wskaźnikami napływu przy użyciu systemu obrazowania żywych komórek w różnych typach komórek. Technika ta stanowi platformę do badania przesiewowego aktywności farmakologicznej związków wpływających na napływ LDL przy jednoczesnym monitorowaniu morfologii komórek, a tym samym potencjalnej cytotoksyczności.

Test wychwytu cholesterolu LDL przy użyciu analizy obrazowania żywych komórek z monitorowaniem stanu zdrowia komórek

Pomiar zdolności in vitro cholesterolu do surowicy lub osocza w modelach komórek makrofagów jest obiecującym narzędziem jako biomarker miażdżycy. W niniejszym badaniu optymalizujemy i standaryzujemy metodę fluorescencyjnego wypływu cholesterolu NBD oraz opracowujemy analizę wysokoprzepustową przy użyciu płytek 96-dołkowych.

Wysokoprzepustowy test wypływu cholesterolu znakowany nitrobenzoksadiazolem

Tutaj przedstawiono ilościowy protokół oparty na reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym do określania natywnej zawartości mikro-RNA (bezwzględnej/względnej) w cząsteczkach lipoprotein. Ponadto przedstawiono metodę zwiększania poziomu mikro-RNA, a także metodę określania szybkości wychwytu komórkowego cząstek lipoprotein.

Wzbogacenie natywnych cząstek lipoprotein w mikroRNA, a następnie określenie ich bezwzględnej/względnej zawartości mikroRNA i szybkości transferu komórkowego

Prezentowany tutaj jest czuły test fluorescencyjny do monitorowania aktywności N-acylotransferazy apolipoproteiny przy użyciu peptydu diacyloglicerylu i alkinofosfolipidów jako substratów z chemią kliknięć.

Test fluorometryczny oparty na technologii click-chemistry dla N-acylotransferazy apolipoproteiny od charakterystyki enzymu do wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące fluorescencyjne czujniki lipidowe i liposomy do określenia, czy białko ekstrahuje i transportuje fosfatydyloserynę czy fosfatydyloinozytol 4-fosforan in vitro.

Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

Choroby zwyrodnieniowe oczu, które wpływają na warstwę nabłonka barwnikowego siatkówki, mają pochodzenie monogenowe i poligenowe. Opracowano kilka modeli chorób i aplikację LipidUNet w celu badania mechanizmów choroby, a także potencjalnych interwencji terapeutycznych.

Oparta na uczeniu maszynowym metoda charakterystyki i kwantyfikacji złogów lipidowych LipidUNet przy użyciu nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPSC

Opisujemy metodę użycia cyklodekstryny do pośredniczenia w wymianie między lipidami błony komórkowej a lipidami egzogennymi. Technikę tę można połączyć z eksperymentami badającymi białka transbłonowe, które zachowują się inaczej w środowiskach podobnych do tratw lipidowych niż w środowiskach niepodobnych do tratwy.

Test wymiany lipidów w żywych komórkach

Protokół ten opisuje test in vitro do pomiaru pobierania lipidów komórkowych przez komórki śródbłonka po stymulacji fluorescencyjnymi analogami BODIPY-C12 i BODIPY-C16 nasyconych kwasów tłuszczowych długołańcuchowych i bardzo długołańcuchowych. Ta metoda jest wydajna i adaptowalna do innych typów komórek, oferując użyteczne podejście do badania metabolizmu lipidów.

Ilościowa identyfikacja pochłaniania kwasów tłuszczowych śródbłonka za pomocą analogów kwasów tłuszczowych fluorescencyjnych

Tutaj opisujemy protokoły pomiaru ilości fluorescencyjnego fosfolipidu specjalnie usuwanego z cząstek dawcy lipidów za pomocą lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL) obecnej w całym ludzkim osoczu lub surowicy. Wykazaliśmy, że ten wskaźnik funkcjonalności HDL przewiduje występ chorób sercowo-naczyniowych.

Testy wypływu lipoproteiny o wysokiej gęstości

Poznaj bezkomórkowy fluorometryczny test enzymatyczny do pomiaru peroksydacji lipidów w HDL. Ta metoda umożliwia szybkie i niezawodne określenie funkcji lipoprotein o dużej gęstości w badaniach kardiologicznych.

Bezkomórkowy biochemiczny fluorometryczny test enzymatyczny do wysokoprzepustowego pomiaru peroksydacji lipidów w lipoproteinach o dużej gęstości (Wideo) | JoVE Journal

Bezkomórkowy biochemiczny fluorometryczny test enzymatyczny do wysokoprzepustowego pomiaru peroksydacji lipidów w lipoproteinach o dużej gęstości

Przeglądaj więcej filmów