Generowanie modeli komórkowych raka gruczołu krokowego oporności na lek antymitotyczny docetaksel

Oporność na terapie przeciwnowotworowe przyczynia się do postępu choroby i śmierci. Określenie mechanistycznych podstaw oporności ma kluczowe znaczenie dla poprawy odpowiedzi terapeutycznej. Niniejszy manuskrypt szczegółowo opisuje protokół generowania opornych na taksany modeli komórkowych raka gruczołu krokowego (PC), aby pomóc w analizie szlaków zaangażowanych w progresję do oporności na docetaksel u pacjentów z PC.

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie eksperymentalnych modeli komórek nowotworowych opornych na docetaksel jako platformy do badania mechanizmów molekularnych napędzających oporność na terapię antymitotyczną. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórek nowotworowych i genomu, takie jak identyfikacja szlaków sygnałowych przyczyniających się do postępu choroby oraz określenie potencjalnych strategii docelowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to niezawodny i łatwy sposób generowania modeli eksperymentalnych w celu zbadania odpowiedzi na leki przeciwnowotworowe, oprócz wykorzystania próbek guzów pacjentów i modeli zwierzęcych.

Procedurę zademonstrują Lisa Mohr, doktor habilitowany z mojego laboratorium, oraz Jungreem Woo, kolejny doktor w naszym zespole. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść komórki DU145 lub 22Rv1 w kolbach o powierzchni 150 centymetrów kwadratowych zawierających 20 mililitrów pożywki. Po 24 godzinach, gdy komórki osiągną około 70 do 80% zbieżności, dodaj docetaksel w ilości pięciu nanomolowców.

Po 72 godzinach odessać pożywkę zawierającą lek i dodać świeżą pożywkę wolną od docetakselu. Zmieniaj nośnik co trzy do czterech dni. Odczekać od jednego do dwóch tygodni, aż w kolbie pojawią się klony.

Odessać pożywkę, ostrożnie umyć komórki 15 mililitrami PBS i inkubować je z czterema mililitrami 0,05% trypsyny-EDTA przez trzy do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby oderwać komórki od powierzchni kolby. Następnie ponownie zawiesić trypsynizowane komórki w kolbie za pomocą ośmiu mililitrów świeżego podłoża. Wyciągnąć komórki ze wszystkich poddanych działaniu substancji kolb i zagnieździć je przez odwirowanie.

Następnie usuń superna-den, ponownie zawieś osad komórek w 20 mililitrach świeżego podłoża i umieść komórki w kolbach o powierzchni 150 centymetrów kwadratowych. Po 24 godzinach, gdy komórki osiągną około 70 do 80% zbieżności, ponownie dodaj pięć nanomolowych docetakselu. Powtarzać procedury, jak pokazano wcześniej, aż klony pojawią się w kolbie.

Następnie ponownie umieść komórki w kolbach o powierzchni 150 centymetrów kwadratowych. Po 24 godzinach, gdy komórki osiągną około 70 do 80% zbieżności, potraktuj je 10 nanomolowym docetakselem. Powtórz te same kroki w sposób zwiększania dawki docetakselu i kontynuuj łączenie klonów, które przeżyły, po każdym leczeniu skoncentrowanym.

Pod koniec procesu otrzymasz pulę odpornych komórek gotowych do eksperymentalnego użycia. W tej procedurze płytka 2 000 komórek przy użyciu 2 mililitrów pożywki na dołek w sześciu płytkach dołkowych. Po 24 godzinach dodać rosnące stężenie docetakselu zarówno dla linii komórkowych DU145, jak i 22Rv1.

Dodać DMSO tylko do jednego dołka jako kontrolnego o tej samej objętości, co dla najwyższej dawki docetakselu. Po 72 godzinach odessać pożywkę zawierającą lek i dodać świeżą pożywkę wolną od docetakselu. Inkubuj płytki przez jeden do dwóch tygodni, aż kolonie będą widoczne pod mikroskopem.

Aby poplamić kolonie, umyj je delikatnie dwoma do trzech mililitrami PBS. Inkubować je z dwoma do trzech mililitrów roztworu fioletu krystalicznego przez 20 minut w kapturze do hodowli tkankowych lub okapie oparowym. Następnie usuń stojący roztwór i umyj płytki dwoma do trzech mililitrów wody.

Następnie usuń wodę i wysusz płytki na powietrzu. Zrób cyfrowe zdjęcia płyt w celu przedstawienia postaci. Przeanalizuj wynik, wizualizując dołki i ręcznie licząc kolonie za pomocą markera.

I reprezentują procent żywotności komórki na wykresie. Poniżej znajduje się schemat przedstawiający oznaczanie docetakselu IC50 w rodzicielskich liniach komórkowych raka prostaty DU145 i 22Rv1. Oczekiwane wartości procentowe żywotności komórek w wymaganych stężeniach zwiększających dawkę docetakselu przedstawiono tutaj.

A oto reprezentatywne obrazy mikroskopowe w jasnym polu komórek DU145 i 22Rv1 we wskazanych momentach podczas generowania oporności na docetaksel. Czerwone strzałki wskazują klon odporny na docetaksel po zakończeniu protokołu. Przedstawiono tutaj reprezentatywne testy tworzenia kolonii odpowiadające walidacji funkcjonalnej komórek opornych na docetaksel.

Komórki wystawiono na działanie rosnących stężeń docetakselu i przeżywalność oceniano za pomocą barwienia fioletem krystalicznym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować i walidować lekooporne linie komórkowe, które mogą być następnie wykorzystane do wybranych przez Ciebie badań i procedur, takich jak analiza ekspresji genów i manipulacje genetyczne. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.