Test rekonstytucji organoidów (ORA) do analizy funkcjonalnej jelitowych komórek macierzystych i niszowych
20 listopada 2017
Hodowle organoidów jelitowych są tworzone z całych krypt i nie pozwalają na analizę samoodnowy i różnicowania w sposób specyficzny dla komórki. Protokół ten opisuje rekonstrukcję posortowanych komórek macierzystych (Lgr5+) i niszowych (Paneth), które dają początek organoidom, umożliwiając jednocześnie ich wcześniejszą modyfikację biochemiczną i genetyczną oraz analizę funkcjonalną.
Ogólnym celem testu rekonstytucji organoidów jest analiza funkcjonalna dwóch głównych składników jelitowej niszy komórek macierzystych Lgr5 dodatnich w komórkach Paneth poprzez ich modyfikację genetyczną lub biochemiczną, a następnie rekonstytucję w organoidy samoodnawiające się. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie jelitowych komórek macierzystych, takie jak modyfikacja genetyczna lub biochemiczna komórek macierzystych i niszowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że w przeciwieństwie do innych testów, które wykorzystują całe krypty, wykorzystuje ona posortowane komórki macierzyste i niszowe, umożliwiając w ten sposób analizę specyficzną dla typu komórki.
Demonstracja wideo tej metody ma kluczowe znaczenie, zwłaszcza jeśli chodzi o etapy dysocjacji tkanek i obsługi komórek. Jeśli nie zostaną prawidłowo wykonane, kroki te doprowadzą do słabej żywotności komórek, zwłaszcza po sortowaniu faktów. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania materiałów i poświęcenia myszy Lgr5 na tle C57BL/6J, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Wytnij otrzewną wzdłużnie za pomocą nożyczek. Przytrzymaj żołądek kleszczami i od tego momentu przetnij go poprzecznie na pół za pomocą nożyczek jelitowych. Wyciągnij jelito i umieść je na szalce Petriego zawierającej PBS.
Zacznij od umieszczenia końcówki w żołądku i delikatnie przepchnij ją przez odźwiernik. Kontynuuj, tnąc nożyczkami i ciągnąc kleszczami. Gdy całe jelito cienkie zostanie otwarte wzdłużnie, umyj je w zimnym PBS, trzymając je kleszczami i delikatnie spłukując w roztworze PBS ruchami w kształcie litery U.
Gdy wszystkie resztki stolca zostaną usunięte, przystąp do spłaszczania jelita na desce do krojenia, świetlistą stroną do góry. Strona świetlna jest łatwo rozpoznawalna po braku naczyń krwionośnych i bladym wyglądzie w porównaniu z częścią zewnętrzną. Za pomocą szkiełka delikatnie usuń kosmki, zeskrobując spłaszczone jelito.
Wykonaj ten krok dwukrotnie na całej długości tkanki. Następnie przetnij jelito cienkie sterylnym ostrzem chirurgicznym na dwa do pięciu milimetrowych kawałków. Umieść fragmenty jelita cienkiego w 50-mililitrowej probówce zawierającej 10 mililitrów lodowatego PBS.
Oczyść fragmenty tkanki, usuwając wszelkie pozostałe zanieczyszczenia, pipetując je w górę iw dół w PBS. Odrzucić supernatant i powtarzać ten krok, aż PBS będzie całkowicie czysty. Następnie dodaj 15 mililitrów zimnego PBS, aby całkowita końcowa objętość PBS wyniosła 25 mililitrów.
Dodaj dwa milimolowe EDTA i inkubuj przez 45 minut na walcu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wyrzuceniu PBS EDTA, dodaj 10 mililitrów PBS i odłącz krypty, ostro pipetując fragmenty tkanki w górę iw dół. Następnie zbierz supernatant.
Powtórz ten krok cztery razy. Dodaj pożywkę hodowlaną, aby osiągnąć końcową objętość 50 mililitrów. Osadzać komórki przez odwirowanie.
Na koniec ponownie zawieś osad w 10 mililitrach pożywki hodowlanej przed granulowaniem krypt przez odwirowanie. W przypadku przygotowania jednokomórkowego należy najpierw wyrzucić supernatant z granulowanych krypt i ponownie zawiesić je w jednym mililitrze enzymów podobnych do trypsyny wraz z 50 mikrolitrami DNazy. Inkubuj komórki w łaźni wodnej w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez dwie minuty.
Po dodaniu 10 mililitrów pożywki hodowlanej, rozdziel krypty na pojedyncze komórki, ostro pipetując w górę iw dół co najmniej pięć razy. Przefiltruj roztwór przez sitko o średnicy 40 mikronów, aby wyeliminować grudki i inne zanieczyszczenia. Następnie granuluj pojedyncze komórki pod ciśnieniem 300-krotności grawitacji przez pięć minut.
W przypadku cytometrii przepływowej ponownie zawieś osad w jednym mililitrze jednego buforowanego roztworu soli X Hanka z 2% płodową surowicą krowią na każdy milion komórek. Do zawiesiny komórkowej dodać przeciwciała znakowane Brilliant Violet 421 dla markera linii CD31, CD45 i Ter119 w stężeniu od jednego do 100. Dodaj również anty-CD24 APC i anty-CD117 PE w stężeniu od 1 do 250.
Po 30 minutach posortuj Lgr5-dodatnie komórki macierzyste i komórki Panetha do oddzielnych probówek o niskim stopniu wiązania. Odwiruj posortowane komórki pod 300-krotnością grawitacji przez pięć minut. Następnie ponownie zawieś komórki w 100 mikrolitrach pożywki ze składnikami opisanymi w protokole tekstowym.
Do leczenia komórek należy użyć pięciu mikrolitrów odczynnika do transfekcji za pośrednictwem liposomów w łącznej objętości 100 mikrolitrów pożywki hodowlanej i małego interferującego RNA o stężeniu 100 nanomolowców. Inkubuj komórki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w przypadku małego interferującego RNA lub przez czas niezbędny do wybranej modyfikacji. Umyj komórki dwukrotnie w 500 mikrolitrach pożywki hodowlanej.
Po odwirowaniu komórek przy 300-krotności grawitacji przez pięć minut, ponownie zasmów je w 10 mikrolitrach pożywki hodowlanej. Następnie połącz dwa składniki komórkowe w całkowitej objętości 20 mikrolitrów, a następnie odwiruj przy 300-krotności grawitacji przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Współinkubować komórki Paneth i Lgr5-dodatnie przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Usunąć 10 mikrolitrów supernatantu i pozostawić je w nartach z płynem, aby uniknąć zasysania osadu komórkowego. Następnie dodaj 30 mikrolitrów odtworzonej błony podstawnej do komórek, aby uzyskać łączną objętość 40 mikrolitrów. Ponownie zawieś komórki i umieść je we wstępnie podgrzanej 96-dołkowej płytce.
Po 10 minutach dodaj 200 mikrolitrów kompletnego podłoża. Zmieniaj podłoże co 48 godzin. Na koniec policz liczebność organoidów w piątym dniu.
Małe interferencyjne RNA za pośrednictwem knockdown mysiego genu APC w Lgr5-dodatnich komórkach macierzystych i wynikająca z tego aktywacja kanonicznego szlaku sygnałowego Wnt / beta-kateniny pozytywnie wpływa na mnogość organoidów w porównaniu z ich nieleczonymi odpowiednikami lub kontrolą zakodowanej sekwencji. Skład aktywacji Wnt ratuje również zapotrzebowanie na komórki Panetha, jak wcześniej informowano. Co więcej, organoidy te wyglądają jak puste kule, dobrze opisany fenotyp dla organoidów z mutacją APC lub stymulowanych przez Wnt w porównaniu z morfologią tych uzyskanych z dubletów komórkowych Paneth-Lgr5.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując tej techniki, ważne jest, aby przestrzegać wszystkich kroków i czasów inkubacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyodrębnić kryptę jelitową, przygotować trawienie pojedynczej komórki i odtworzyć komórki niszowe i macierzyste w celu wytworzenia organoidów.
Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się jelitowymi komórkami macierzystymi do przeanalizowania specyficznych efektów komórek macierzystych lub niszowych w jelicie cienkim lub jelicie grubym myszy. Chociaż metoda ta została opracowana do analizy funkcjonalnej niszy jelitowych komórek macierzystych, można ją również zastosować do innych nisz somatycznych komórek macierzystych, takich jak gruczoł sutkowy lub mieszek włosowy. Po tej procedurze można przeprowadzić dodatkowe eksperymenty w celu analizy ekspresji białek genomu w organoidach, takich jak QPCR lub Western blotting.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje rekonstytucję posortowanych komórek macierzystych jelita (Lgr5+) oraz komórek niszy (Paneth) w celu utworzenia organoidów. Metoda ta umożliwia wprowadzanie modyfikacji biochemicznych i genetycznych, co pozwala na analizę funkcjonalną tych typów komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Badania nad komórkami macierzystymi
Wstęp
- Kultury organoidów jelitowych są zazwyczaj pochodne z całych krypt.
- Całe krypty ograniczają możliwość analizy samoodnowy i różnicowania w sposób specyficzny dla konkretnych komórek.
- Posortowane komórki macierzyste i komórki niszy zapewniają bardziej precyzyjne podejście badawcze.
- Demonstracje wideo są kluczowe dla prawidłowego przeprowadzenia dysocjacji tkanek i manipulacji komórkami.
Cel badania
- Analiza ról funkcjonalnych komórek macierzystych Lgr5+ oraz komórek Panetha.
- Umożliwienie modyfikacji genetycznych lub biochemicznych w tych konkretnych typach komórek.
- Odpowiedź na kluczowe pytania dotyczące niszy komórek macierzystych jelit.
Zastosowane metody
- Przygotowanie materiałów i uśmiercenie myszy Lgr5 na tle C57BL/6J.
- Sortowanie komórek macierzystych i komórek niszy do rekonstytucji organoidów.
- Modyfikacja genetyczna lub biochemiczna posortowanych komórek.
- Analiza funkcjonalna powstałych organoidów.
Główne wyniki
- Skuteczna rekonstytucja organoidów z posortowanych komórek macierzystych i komórek niszy.
- Wykazanie możliwości modyfikacji komórek przed formowaniem organoidów.
- Wgląd w role komórek Lgr5+ oraz komórek Panetha w niszy jelitowej.
- Poprawa żywotności komórek dzięki zastosowaniu właściwych technik manipulacji.
Wnioski
- Metoda ta usprawnia analizę dynamiki jelitowych komórek macierzystych.
- Dzięki temu protokołowi możliwa jest analiza specyficzna dla danego typu komórek.
- Instruktaż wideo jest niezbędny do prawidłowego wdrożenia tej techniki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Test rekonstrukcji organoidów (Organoid Reconstitution Assay, ORA) umożliwia specyficzną dla typu komórek analizę funkcjonalną komórek macierzystych jelita oraz komórek niszy, rozwiązując kluczowe ograniczenie modeli organoidów pochodzących z całych krypt. Poprzez umożliwienie genetycznej lub biochemicznej modyfikacji posortowanych komórek macierzystych Lgr5+ oraz komórek Panetha przed formowaniem organoidów, ORA wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w procesie walidacji celów i badania szlaków sygnałowych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkryć poprzez wyizolowanie wpływu poszczególnych komponentów niszy na samoodnawianie i różnicowanie komórek macierzystych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez badanie funkcjonalnego wpływu modyfikacji genetycznych lub biochemicznych w konkretnych typach komórek macierzystych lub komórek niszy.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki rozdzielczości specyficznej dla typu komórek w analizie aktywności szlaków, np. modulacji sygnalizacji Wnt/beta-catenin poprzez knockdown APC w komórkach Lgr5+.
- Wartość naukowa: Ułatwia potwierdzenie celu poprzez wykazanie odwrócenia fenotypów (np. wielokrotności organoidów) po modulacji sygnałów pochodzących z niszy, takich jak Wnt3, EGF lub Dll1 z komórek Panetha.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe, powtarzalne odczyty liczebności organoidów, które umożliwiają porównanie warunków eksperymentalnych w zmodyfikowanych i kontrolnych populacjach komórek.
- Wartość operacyjna: Pozwala na wytworzenie znormalizowanych struktur 3D odpowiednich do obrazowania wysokotreściowego (high-content imaging) oraz późniejszych analiz molekularnych (np. qPCR, Western blotting) w formacie 96-dołkowym.
- Wartość naukowa: Zwiększa gotowość testu dzięki wymogowi współinkubacji posortowanych komórek macierzystych i komórek niszy, co zapewnia fizjologiczną istotność oddziaływań międzykomórkowych w niszy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zapewnia system istotny z punktu widzenia chorób do badania interakcji między komórkami macierzystymi a niszą, z bezpośrednim zastosowaniem w patofizjologii przewodu pokarmowego i medycynie regeneracyjnej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużną ocenę formowania i morfologii organoidów (np. fenotypu pustej sfery w stanach aktywacji Wnt) jako biomarkera aktywacji szlaku.
- Wartość naukowa: Wspiera rozwój modeli przedklinicznych, umożliwiając ekstrapolację na inne nisze somatycznych komórek macierzystych (np. gruczoł mlekowy, mieszek włosowy) przy zastosowaniu odpowiedniego sortowania komórek i adaptacji hodowli.
Integracja potoków i przepływów pracy
ORA wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, w którym mechanistyczne ograniczanie ryzyka modulatorów szlaków komórek macierzystych poprzedza etapy screeningu związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez izolację zmiennych w funkcji komórek macierzystych w stosunku do komórek niszy za pomocą rekonstytucji posortowanych komórek.
- Screening: Dostarcza organoidów gotowych do analizy z ilościowymi wynikami zwielokrotnienia, co umożliwia wiarygodne porównanie efektów terapii w różnych warunkach.
- Analityka: Generuje mierzalne odczyty fenotypowe (liczba organoidów, morfologia) i wspiera walidację molekularną (np. ekspresję celów Wnt), co pozwala na podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki odkryć z ciągłością przedkliniczną poprzez modelowanie współzależności między komórkami macierzystymi a niszą w fizjologicznie ustrukturyzowanym systemie 3D.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę do screeningu modulatorów niszy, którą można zaadaptować do wielu systemów komórek macierzystych poza jelitami.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki perturbacji specyficznej dla typu komórek.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki zdefiniowanym etapom sortowania, modyfikacji i rekonstytucji z jasnymi parametrami inkubacji i obchodzenia się z materiałem.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) na podstawie modulacji szlaków specyficznych dla niszy, co zmniejsza liczbę niepowodzeń na późnych etapach wynikających z nieprzewidzianych zależności od zrębu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka poprzez wyjaśnienie, czy obserwowane fenotypy wynikają z efektów wewnętrznych dla komórek macierzystych, czy z sygnalizacji pośredniczonej przez niszę.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu cytometrii przepływowej, sortowania komórek oraz sterylnej dysocjacji tkanek w celu utrzymania żywotności komórek Lgr5+ i komórek Panetha.
- Metoda jest zależna od dostępu do sprzętu do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) oraz zwalidowanych paneli przeciwciał do detekcji markerów linii komórkowej i markerów komórek macierzystych.
- Konieczne są zestandaryzowane warunki hodowli, w tym zdefiniowane medium, macierz pozakomórkowa (np. zrekonstytuowana błona podstawna) oraz kontrolowany czas inkubacji w celu formowania organoidów.
- Adaptacja do innych nisz komórek macierzystych wymaga optymalizacji enzymów dysocjujących, markerów powierzchniowych oraz specyficznych dla danej niszy czynników wzrostu.
- Ograniczenia praktyczne obejmują utratę komórek podczas sortowania oraz wrażliwość na czas ekspozycji na trypsynę, co w przypadku braku ścisłej kontroli może wpłynąć na późniejszą zdolność do formowania organoidów.
