Name: Test rekonstytucji organoidów (ORA) do analizy funkcjonalnej jelitowych komórek macierzystych i niszowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj metodę rekonstytucji organoidów jelitowych z posortowanych komórek macierzystych Lgr5+ i komórek Paneth. Ta technika umożliwia modyfikacje genetyczne oraz analizę funkcjonalną niszy komórek macierzystych jelita.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było możliwe dzięki finansowaniu przez Holenderskie Towarzystwo Onkologiczne (KWF; EMCR 2012-5473) oraz Międzynarodowego Funduszu Badań nad Rakiem (WCRF; nr projektu 2014-1181)

Wszystkie procedury zostały wykonane zgodnie z lokalnymi przepisami i wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt.
1. Przygotowanie instrumentów, pożywek hodowlanych i potraw
<ol>
	<li>Autoklaw 1 zestaw nożyczek jelitowych, normalnych nożyczek i kleszczyków w sterylnym pojemniku.</li>
	<li>Umieścić 96-dołkowe (z płaskim dnem) naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotować 10 ml kompletnej pożywki hodowlanej z odczynnikami wymienionymi w tabeli materiałów.</li>
	<li>Inkubować kompletną pożywkę w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Rozmrozić odtworzoną błonę podstawną, umieszczając ją w pojemniku na lód. Odtworzona błona podstawna stanie się płynna w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Napełnić 4 szalki Petriego zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami lub w skrócie PBS (4 °C).</li>
</ol>
2. Izolacja krypt jelita cienkiego
<ol>
	<li>Ofiarowanie przez wdychanie CO2 myszy Lgr5-eGFP-IRES-CreERt2 na tle C57BL6/J. Wytnij otrzewną wzdłużnie za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Przytrzymaj brzuch kleszczami i przetnij go poprzecznie na pół.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek jelitowych od teraz wyciągnij jelito i umieść je na szalce Petriego zawierającej PBS. 
	UWAGA: Nożyczki jelitowe mają ostrą i końcówkę. końcówka tych nożyczek ma za zadanie nie uszkodzić architektury krypty-kosmków podczas otwierania jelita.</li>
	<li>Zacznij od umieszczenia końcówki w żołądku i delikatnie przepchnij ją przez odźwiernik. Kontynuuj, tnąc nożyczkami i ciągnąc kleszczami.</li>
	<li>Gdy całe jelito cienkie zostanie otwarte wzdłużnie, umyj je w zimnym PBS, trzymając je kleszczami i delikatnie spłucz w roztworze PBS ruchami w kształcie litery U.</li>
	<li>Gdy wszystkie resztki stolca zostaną usunięte, przystąp do spłaszczania jelita na desce do krojenia, świetlistą stroną do góry. Strona luminalna jest łatwo rozpoznawalna po braku naczyń krwionośnych i bladym wyglądzie w porównaniu z częścią zewnętrzną.</li>
	<li>Za pomocą szkiełka delikatnie usuń kosmki, zeskrobując spłaszczone jelito. Wykonaj ten krok dwukrotnie na całej długości tkanki.</li>
	<li>Przeciąć jelito cienkie sterylnym ostrzem chirurgicznym na kawałki o średnicy 2 - 5 mm.</li>
	<li>Umieść fragmenty jelita cienkiego w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml lodowatego PBS.</li>
	<li>Oczyść fragmenty tkanki, usuwając wszelkie pozostałe zanieczyszczenia, pipetując je w górę i w dół w PBS. Odrzucić supernatant i powtarzać ten krok, aż PBS będzie całkowicie czysty.</li>
	<li>Dodaj 15 ml zimnego PBS, aby całkowita końcowa objętość PBS wynosiła 25 ml. Dodać 2 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) i inkubować przez 45 minut na walce w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wyrzuć PBS/EDTA.</li>
	<li>Dodać 10 ml PBS i odłączyć krypty, ostro pipetując fragmenty tkanek w górę iw dół (co najmniej trzy razy). Zebrać supernatant.</li>
	<li>Powtórz krok 2.13 cztery razy. Dodaj pożywkę hodowlaną, aby osiągnąć końcową objętość 50 ml.</li>
	<li>Granulować komórki przez odwirowanie (300 x g przez 5 min).</li>
	<li>Zawiesić osad w 10 ml pożywki hodowlanej i osadzać krypty przez odwirowanie (80 x g przez 3 min).</li>
</ol>
3. Przygotowanie pojedynczej komórki
<ol>
	<li>Odrzucić supernatant z granulowanych krypt i ponownie zawiesić go w 1 ml enzymów podobnych do trypsyny razem z 50 μl DNAzy (50 μg/ml).</li>
	<li>Inkubować komórki w łaźni wodnej w temperaturze 32 °C przez 2 minuty.</li>
	<li>Dodać 10 ml pożywki hodowlanej. Rozdziel krypty na pojedyncze komórki, ostro pipetując w górę iw dół co najmniej 5 razy.</li>
	<li>Przefiltrować roztwór przez sitko o wielkości 40 μm (w celu wyeliminowania grudek i innych zanieczyszczeń) i granulować pojedyncze komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut.</li>
</ol>
4. Cytometria przepływowa i posiewanie
<ol>
	<li>Przygotuj 50 ml 1x buforowanego roztworu soli Hanka lub HBSS/2% roztworu surowicy płodowej krowy (FCS) i ponownie zawieś osad w 1 ml na każde 106 komórek</li>
	<li>Dodać do zawiesiny komórkowej BV421 Lin- (CD31, CD45, TER119) w stężeniu 1:100 oraz CD24-APC i CD117-PE oba w stężeniu 1:250 przeciwciała przez 30 min.</li>
	<li>Sortuj komórki macierzyste Lgr5+ i komórki Panetha do oddzielnych probówek o niskim poziomie wiązania. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat protokołów sortowania komórek Lgr5+ i Panetha, zobacz Roth i wsp.7 oraz Schewe et al.6
	<ol>
		<li>Odwirować posortowane komórki przy stężeniu 300 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w pożywce o objętości 100 μl ze składnikami opisanymi jak w ppkt 1.3 (patrz Tabela Materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczyć (np. poprzez modyfikację chemiczną lub genetyczną) komórki Panetha (n = 2000) lub komórki macierzyste Lgr5+ (n = 2000).
	<ol>
		<li>Do leczenia komórek należy użyć 5 μl odczynnika do transfekcji za pośrednictwem liposomów w całkowitej objętości 100 μl pożywki hodowlanej i małego interferującego RNA (siRNA) o stężeniu 100 nM. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C dla siRNA lub przez czas niezbędny do wybranej modyfikacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie w pożywce hodowlanej o pojemności 500 μl.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić komórki w 10 μl pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Połączyć dwa składniki komórkowe (komórki Paneth lub Lgr5+) w całkowitej objętości 20 μl i wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Współinkubować komórki Paneth i Lgr5+ przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć 10 μl supernatantu i pozostawić menisk z płynem, aby upewnić się, że nie zasysają osadu komórkowego.</li>
	<li>Dodać 30 μl odtworzonej błony podstawnej do komórek, aby uzyskać całkowitą objętość 40 μl, ponownie zawiesić komórki i płytkę na wstępnie ogrzanej 96-dołkowej płytce. Po 10 minutach dodać 200 μl kompletnej pożywki (patrz tabela materiałów). Zmieniaj podłoże co 48 godzin.</li>
	<li>Policz liczebność organoidów w 5 dniu.</li>
</ol>

<ol><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li>
<li>Cantrell, M. A., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+modeling+for+cancer+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Organoid modeling for cancer precision medicine.</a> Genome Med. 7, 32(2015).</li>
<li>Schewe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+Phospholipases+A2+Are+Intestinal+Stem+Cell+Niche+Factors+with+Distinct+Roles+in+Homeostasis%2C+Inflammation%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer.</a> Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).</li>
<li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+in+intestinal+homeostasis+and+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury.</a> PLoS One. 7, e38965(2012).</li>
<li>Rodriguez-Colman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+metabolic+identities+in+the+intestinal+crypt+supports+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function.</a> Nature. 543, 424-427 (2017).</li>
<li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apc+Restoration+Promotes+Cellular+Differentiation+and+Reestablishes+Crypt+Homeostasis+in+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer.</a> Cell. 161, 1539-1552 (2015).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li>
<li>Igarashi, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+and+SIRT1+Cooperate+to+Foster+Expansion+of+Gut+Adult+Stem+Cells+during+Calorie+Restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction.</a> Cell. , 436-450 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów

ORA pozwala na wyrafinowaną analizę funkcjonalną dwóch podstawowych składników jelitowej niszy komórek macierzystych, a mianowicie komórek Lgr5+ i Panetha. To podejście było wcześniej stosowane przez nas i innych z niewielkimi modyfikacjami 6,10,11. W tym miejscu przedstawiamy procedurę ORA jako powtarzalny i ustandaryzowany protokół laboratoryjny. Informujemy również o skutkach regulacji w dół Apc w...

Nabłonek jelitowy jest najszybciej samoodnawiającą się tkanką w ciele ssaków i jako taki był przedmiotem mnóstwa badań mających na celu identyfikację i funkcjonalną charakterystykę dorosłych komórek macierzystych znajdujących się na dnie krypty Lieberkühn, oznaczonych ekspresją genu Lgr5 i zależnych od kanonicznych sygnałów Wnt1. Warto zauważyć, że komórki macierzyste Lgr5+ są flankowane i wspierane przez wyspecjalizowane komórki niszowe, tj. komórki Panetha, które również zależą od sygnalizacji Wnt w swoim dojrzewaniu2. Razem te dwa typy komórek leżą u podstaw samoodnawiania się wyściółki nabłonka jelitowego i utrzymują codzienną równowagę homeostatyczną: komórki macierzyste Lgr5+ szybko dzielą się i dają początek progenitorowym i bardziej wyspecjalizowanym komórkom nabłonka jelitowego; Komórki Panetha dostarczają niezbędnych czynników niszowych (np. Dll1, Wnt3, EGF) komórkom macierzystym Lgr5+ 2. Zdolność krypt jelitowych po posianiu ex vivo do tworzenia zorganizowanych i samoodnawiających się struktur zwanych organoidami lub "mini-jelitami" została wykorzystana jako narzędzie eksperymentalne w celu uzyskania wglądu w procesy takie jak samoodnawianie i różnicowanie w normalnych i patologicznych stanach, w tym raku4. Hodowle organoidów zostały stworzone z kilku tkanek, w tym z jelita, trzustki, wątroby i nerki, zarówno z próbek mysich, jak i ludzkich4. Metoda ekstrakcji i czynniki wzrostu zastosowane do opracowania tych kultur organoidowych są specyficzne dla tkanki i zaprojektowane tak, aby napędzać różnicowanie wieloliniowe i jak najwierniej naśladować pierwotną niszę komórek macierzystych in vivo. Organoidy mogą mieć potencjalne zastosowania, w tym w leczeniu chorób genetycznych, ocenie skuteczności terapeutycznej w leczeniu raka, analizie toksyczności leków lub badaniu organogenezy in vitro5.
Ogólnie rzecz biorąc, głównym ograniczeniem kultur organoidowych tworzonych na podstawie próbek tkanek jest brak specyficzności komórkowej. Na przykład organoidy jelitowe utworzone z całych krypt jelitowych nie pozwalają na analizę poszczególnych składników komórkowych zawartych w źródle tkankowym (np. całe krypty zawierają Lgr5+, Paneth i komórki progenitorowe).
Tutaj opisujemy nowatorską metodę, określaną jako ORA, która łączy zalety hodowli organoidów jelitowych z funkcjonalną analizą jej najbardziej podstawowych składników, a mianowicie komórek macierzystych (Lgr5+) i niszowych (Paneth). Osiąga się to dzięki unikalnej zdolności komórek Paneth i Lgr5+ do fizycznego łączenia się ze sobą podczas wspólnej inkubacji i powstawania organoidów2,6,10. Wykorzystaliśmy tę cechę i poddaliśmy wstępnie obie typy komórek indywidualnej obróbce, zanim pozwoliliśmy im na odtworzenie organoidów. W ten sposób każdy składnik komórki może być wystawiony na działanie dowolnego leku, czynnika wzrostu, inhibitora biochemicznego, modyfikacji genetycznej lub leczenia chemicznego przed odtworzeniem i utworzeniem organoidów. W związku z tym zastosowanie testu ORA pozwoli na określenie, czy określone leczenie farmakologiczne lub modyfikacja genetyczna ma określony wpływ na komórki macierzyste, czy ich niszowy odpowiednik.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM F12 *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Stężenie końcowe: 10 mM</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Stężenie końcowe: 1%</td></tr><tr><td>Hepes *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>Stężenie końcowe: 10 mM</td></tr><tr><td>Rekombinowany mysi EGF *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PMG8041</td><td>Stężenie końcowe: 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Rekombinowany mysi Noggin *</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Stężenie końcowe: 100 ng/ml</td></tr><tr><td>y27632 *</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>Stężenie końcowe: 10 &mikro; M</td></tr><tr><td>Jagged-1 *</td><td>Anaspec Bio</td><td>AS-61298</td><td>Stężenie końcowe: 1 &mikro; M</td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia R-spondyna *</td><td>R& Systemy D</td><td>3474-RS-050</td><td>Stężenie końcowe: 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Flexitube Gene roztwór siRNA APC</td><td>Qiagen GS11789</td><td></td><td>Stężenie końcowe: 100 nM</td></tr><tr><td>Lipofektamina 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>CD24 APC</td><td>Biolegend</td><td>101814</td><td></td></tr><tr><td>zestaw PE</td><td>Biolegend</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>BV 421 CD31</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>102424</tr><tr><td>BV 421 CD45</td><td>Biolegend</td><td>103134</td><td></td></tr><tr><td>BV421 TER119</td><td>Biolegend</td><td>116234</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>B6.129P2-LGR5tm1(cre/ERT2)Cle/J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>008875</td><td></td></tr><tr><td>Rurki o niskim poziomie wiązania</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>* Połączenie tych odczynników stanowi kompletną pożywkę</td><td></td><td></td><td></td> hodowlaną</tr></tbody></table>

test rekonstytucji organoidów (ora) do analizy funkcjonalnej jelitowych komórek macierzystych i niszowych

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Nabłonek jelitowy charakteryzuje się niezwykle szybkim tempem rotacji. U ssaków cała wyściółka nabłonka odnawia się w ciągu 4-5 dni. Dorosłe jelitowe komórki macierzyste znajdują się na dnie krypt Lieberkühn, są oznaczone ekspresją genu Lgr5 i zachowują homeostazę dzięki charakterystycznemu dla nich wysokiemu wskaźnikowi proliferacji1. W całym jelicie cienkim komórki macierzyste Lgr5+ mieszają się z wyspecjalizowanymi komórkami wydzielniczymi zwanymi komórkami Panetha. Komórki Panetha wydzielają związki przeciwbakteryjne (tj. lizozym i kryptyny/defensyny) i odgrywają rolę kontrolną we florze jelitowej. Niedawno odkryto nową funkcję komórek Panetha, a mianowicie ich zdolność do zapewniania niszowego wsparcia komórkom macierzystym Lgr5 + za pośrednictwem kilku kluczowych ligandów, takich jak Wnt3, EGF i Dll12.
Po wyizolowaniu ex vivo i hodowli w obecności specyficznych czynników wzrostu i składników macierzy zewnątrzkomórkowej, całe krypty jelitowe dają początek długotrwałym i samoodnawiającym się strukturom 3D zwanym organoidami, które bardzo przypominają architekturę nabłonka krypty i kosmków dorosłego jelita cienkiego3. Hodowle organoidów, gdy są zakładane z całych krypt, pozwalają na badanie samoodnawiania się i różnicowania niszy jelitowych komórek macierzystych, choć bez zajmowania się wkładem ich poszczególnych składników, a mianowicie komórek Lgr5+ i Panetha.
Tutaj opisujemy nowatorskie podejście do testu organoidowego, które wykorzystuje zdolność komórek Paneth i Lgr5+ do łączenia i tworzenia organoidów podczas wspólnej hodowli. To podejście, zwane tutaj "testem rekonstytucji organoidów" (ORA), umożliwia genetyczną i biochemiczną modyfikację komórek macierzystych Paneth lub Lgr5+, a następnie rekonstytucję w organoidy. W związku z tym umożliwia analizę funkcjonalną dwóch głównych składników niszy jelitowych komórek macierzystych.

Test rekonstrukcji organoidów umożliwia oddzielną analizę funkcjonalną niezbędnych komponentów niszy oraz komórek macierzystych nabłonka jelitowego, co w niniejszym przypadku wykazano z użyciem małych interferujących RNA (siRNA) skierowanych przeciwko genowi Apc.
Aby osiągnąć ten cel, w pierwszej kolejności wykorzystaliśmy fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS) do wyizolowania 8000 komórek Lgr5+ ...

Hodowle organoidów jelitowych są tworzone z całych krypt i nie pozwalają na analizę samoodnowy i różnicowania w sposób specyficzny dla komórki. Protokół ten opisuje rekonstrukcję posortowanych komórek macierzystych (Lgr5+) i niszowych (Paneth), które dają początek organoidom, umożliwiając jednocześnie ich wcześniejszą modyfikację biochemiczną i genetyczną oraz analizę funkcjonalną.

Test rekonstytucji organoidów (ORA) do analizy funkcjonalnej jelitowych komórek macierzystych i niszowych

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Ogólnym celem testu rekonstytucji organoidów jest analiza funkcjonalna dwóch głównych składników jelitowej niszy komórek macierzystych Lgr5 dodatnich w komórkach Paneth poprzez ich modyfikację genetyczną lub biochemiczną, a następnie rekonstytucję w organoidy samoodnawiające się. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie jelitowych komórek macierzystych, takie jak modyfikacja genetyczna lub biochemiczna komórek macierzystych i niszowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że w przeciwieństwie do innych testów, które wykorzystują całe krypty, wykorzystuje ona posortowane komórki macierzyste i niszowe, umożliwiając w ten sposób analizę specyficzną dla typu komórki.Demonstracja wideo tej metody ma kluczowe znaczenie, zwłaszcza jeśli chodzi o etapy dysocjacji tkanek i obsługi komórek. Jeśli nie zostaną prawidłowo wykonane, kroki te doprowadzą do słabej żywotności komórek, zwłaszcza po sortowaniu faktów. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania materiałów i poświęcenia myszy Lgr5 na tle C57BL/6J, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Wytnij otrzewną wzdłużnie za pomocą nożyczek. Przytrzymaj żołądek kleszczami i od tego momentu przetnij go poprzecznie na pół za pomocą nożyczek jelitowych. Wyciągnij jelito i umieść je na szalce Petriego zawierającej PBS.Zacznij od umieszczenia końcówki w żołądku i delikatnie przepchnij ją przez odźwiernik. Kontynuuj, tnąc nożyczkami i ciągnąc kleszczami. Gdy całe jelito cienkie zostanie otwarte wzdłużnie, umyj je w zimnym PBS, trzymając je kleszczami i delikatnie spłukując w roztworze PBS ruchami w kształcie litery U.Gdy wszystkie resztki stolca zostaną usunięte, przystąp do spłaszczania jelita na desce do krojenia, świetlistą stroną do góry. Strona świetlna jest łatwo rozpoznawalna po braku naczyń krwionośnych i bladym wyglądzie w porównaniu z częścią zewnętrzną. Za pomocą szkiełka delikatnie usuń kosmki, zeskrobując spłaszczone jelito.Wykonaj ten krok dwukrotnie na całej długości tkanki. Następnie przetnij jelito cienkie sterylnym ostrzem chirurgicznym na dwa do pięciu milimetrowych kawałków. Umieść fragmenty jelita cienkiego w 50-mililitrowej probówce zawierającej 10 mililitrów lodowatego PBS.Oczyść fragmenty tkanki, usuwając wszelkie pozostałe zanieczyszczenia, pipetując je w górę iw dół w PBS. Odrzucić supernatant i powtarzać ten krok, aż PBS będzie całkowicie czysty. Następnie dodaj 15 mililitrów zimnego PBS, aby całkowita końcowa objętość PBS wyniosła 25 mililitrów.Dodaj dwa milimolowe EDTA i inkubuj przez 45 minut na walcu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wyrzuceniu PBS EDTA, dodaj 10 mililitrów PBS i odłącz krypty, ostro pipetując fragmenty tkanki w górę iw dół. Następnie zbierz supernatant.Powtórz ten krok cztery razy. Dodaj pożywkę hodowlaną, aby osiągnąć końcową objętość 50 mililitrów. Osadzać komórki przez odwirowanie.Na koniec ponownie zawieś osad w 10 mililitrach pożywki hodowlanej przed granulowaniem krypt przez odwirowanie. W przypadku przygotowania jednokomórkowego należy najpierw wyrzucić supernatant z granulowanych krypt i ponownie zawiesić je w jednym mililitrze enzymów podobnych do trypsyny wraz z 50 mikrolitrami DNazy. Inkubuj komórki w łaźni wodnej w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez dwie minuty.Po dodaniu 10 mililitrów pożywki hodowlanej, rozdziel krypty na pojedyncze komórki, ostro pipetując w górę iw dół co najmniej pięć razy. Przefiltruj roztwór przez sitko o średnicy 40 mikronów, aby wyeliminować grudki i inne zanieczyszczenia. Następnie granuluj pojedyncze komórki pod ciśnieniem 300-krotności grawitacji przez pięć minut.W przypadku cytometrii przepływowej ponownie zawieś osad w jednym mililitrze jednego buforowanego roztworu soli X Hanka z 2% płodową surowicą krowią na każdy milion komórek. Do zawiesiny komórkowej dodać przeciwciała znakowane Brilliant Violet 421 dla markera linii CD31, CD45 i Ter119 w stężeniu od jednego do 100. Dodaj również anty-CD24 APC i anty-CD117 PE w stężeniu od 1 do 250.Po 30 minutach posortuj Lgr5-dodatnie komórki macierzyste i komórki Panetha do oddzielnych probówek o niskim stopniu wiązania. Odwiruj posortowane komórki pod 300-krotnością grawitacji przez pięć minut. Następnie ponownie zawieś komórki w 100 mikrolitrach pożywki ze składnikami opisanymi w protokole tekstowym.Do leczenia komórek należy użyć pięciu mikrolitrów odczynnika do transfekcji za pośrednictwem liposomów w łącznej objętości 100 mikrolitrów pożywki hodowlanej i małego interferującego RNA o stężeniu 100 nanomolowców. Inkubuj komórki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w przypadku małego interferującego RNA lub przez czas niezbędny do wybranej modyfikacji. Umyj komórki dwukrotnie w 500 mikrolitrach pożywki hodowlanej.Po odwirowaniu komórek przy 300-krotności grawitacji przez pięć minut, ponownie zasmów je w 10 mikrolitrach pożywki hodowlanej. Następnie połącz dwa składniki komórkowe w całkowitej objętości 20 mikrolitrów, a następnie odwiruj przy 300-krotności grawitacji przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Współinkubować komórki Paneth i Lgr5-dodatnie przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Usunąć 10 mikrolitrów supernatantu i pozostawić je w nartach z płynem, aby uniknąć zasysania osadu komórkowego. Następnie dodaj 30 mikrolitrów odtworzonej błony podstawnej do komórek, aby uzyskać łączną objętość 40 mikrolitrów. Ponownie zawieś komórki i umieść je we wstępnie podgrzanej 96-dołkowej płytce.Po 10 minutach dodaj 200 mikrolitrów kompletnego podłoża. Zmieniaj podłoże co 48 godzin. Na koniec policz liczebność organoidów w piątym dniu.Małe interferencyjne RNA za pośrednictwem knockdown mysiego genu APC w Lgr5-dodatnich komórkach macierzystych i wynikająca z tego aktywacja kanonicznego szlaku sygnałowego Wnt / beta-kateniny pozytywnie wpływa na mnogość organoidów w porównaniu z ich nieleczonymi odpowiednikami lub kontrolą zakodowanej sekwencji. Skład aktywacji Wnt ratuje również zapotrzebowanie na komórki Panetha, jak wcześniej informowano. Co więcej, organoidy te wyglądają jak puste kule, dobrze opisany fenotyp dla organoidów z mutacją APC lub stymulowanych przez Wnt w porównaniu z morfologią tych uzyskanych z dubletów komórkowych Paneth-Lgr5.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując tej techniki, ważne jest, aby przestrzegać wszystkich kroków i czasów inkubacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyodrębnić kryptę jelitową, przygotować trawienie pojedynczej komórki i odtworzyć komórki niszowe i macierzyste w celu wytworzenia organoidów.Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się jelitowymi komórkami macierzystymi do przeanalizowania specyficznych efektów komórek macierzystych lub niszowych w jelicie cienkim lub jelicie grubym myszy. Chociaż metoda ta została opracowana do analizy funkcjonalnej niszy jelitowych komórek macierzystych, można ją również zastosować do innych nisz somatycznych komórek macierzystych, takich jak gruczoł sutkowy lub mieszek włosowy. Po tej procedurze można przeprowadzić dodatkowe eksperymenty w celu analizy ekspresji białek genomu w organoidach, takich jak QPCR lub Western blotting.

the-organoid-reconstitution-assay-ora-for-functional-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W tym protokole wideo krok po kroku wyjaśniamy transdukcję lentiwirusową w organoidach pierwotnego nabłonka jelitowego oraz przetwarzanie i dalszą analizę tych kultur za pomocą ilościowego RT-PCR, RNA-mikromacierzy i immunohistochemii.

Protokół transdukcji lentiwirusowej i dalszej analizy organoidów jelitowych

Tutaj opisany jest protokół zbierania, utrzymywania i leczenia organoidów jelita cienkiego myszy z wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMP) i Listeria monocytogenes, a także nacisk na ekspresję genów i właściwe techniki normalizacji białka.

Hodowla ex vivo i stymulacja receptorów rozpoznawania wzorców organoidów jelitowych myszy

Tutaj opisujemy technikę ilościowego określania integralności bariery organoidów jelita cienkiego. Fakt, że metoda opiera się na żywych organoidach, umożliwia sekwencyjne badanie różnych substancji modulujących integralność bariery lub ich kombinacji w sposób rozdzielczy w czasie.

Badanie rozpadu bariery jelitowej w żywych organoidach

Ten protokół pozwala na różnicowanie ludzkich komórek pluripotencjalnych w organoidy jelitowe. Protokół naśladuje normalny rozwój człowieka poprzez różnicowanie komórek w populację ostatecznej endodermy, endodermy jelita tylnego, a następnie nabłonka jelitowego. To sprawia, że protokół nadaje się zarówno do badania rozwoju jelit, jak i zastosowań modelowania chorób.

Generowanie organoidów jelitowych pochodzących z hiPSC do zastosowań w modelowaniu rozwoju i choroby

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Organoidy jelitowe pochodzące z biopsji oraz technologie organ-on-a-chips są połączone w platformę mikrofizjologiczną, aby podsumować funkcjonalność jelit specyficzną dla regionu.

Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego

Obecny protokół opisuje ustanowienie systemu organoidów mysiego okrężnicy do badania aktywności i funkcjonowania komórek macierzystych okrężnicy w modelu nokautu klaudyny-7.

Trójwymiarowa hodowla mysich krypt okrężnicy w celu zbadania funkcji jelitowych komórek macierzystych ex vivo

Opisujemy protokół izolowania mysich krypt jelita cienkiego i hodowania organoidów 3D jelit z krypt. Dodatkowo opisujemy metodę generowania organoidów z pojedynczej jelitowej komórki macierzystej przy braku podnabłonkowej niszy komórkowej.

Hodowla 3D organoidów z krypt jelit mysich i pojedynczej komórki macierzystej do badań nad organoidami

Tutaj prezentujemy protokół do generowania organoidów jelitowych szczurów i używania ich w kilku dalszych zastosowaniach. Szczury są często preferowanym modelem przedklinicznym, a solidny układ organoidów jelitowych wypełnia zapotrzebowanie na system in vitro towarzyszący badaniom in vivo.

Wytwarzanie i manipulowanie organoidami jelitowymi szczurów

Ludzkie okołonaczyniowe komórki macierzyste (PSCs) stanowią nową klasę komórek macierzystych do regeneracji tkanek szkieletowych, podobnie jak mezenchymalne komórki macierzyste (MSCs). PSCs można wyizolować za pomocą FACS (sortowania komórek aktywowanego fluorescencją) z tkanki tłuszczowej pobranej podczas standardowych procedur liposukcji, a następnie połączyć z rusztowaniem osteoindukcyjnym w celu uzyskania formowania kości in vivo.

Zastosowanie ludzkich peryvaskularnych komórek macierzystych w regeneracji kości

Poznaj metodę rekonstytucji organoidów jelitowych z posortowanych komórek macierzystych Lgr5+ i komórek Paneth. Ta technika umożliwia modyfikacje genetyczne oraz analizę funkcjonalną niszy komórek macierzystych jelita.

Test rekonstytucji organoidów (ORA) do analizy funkcjonalnej jelitowych komórek macierzystych i niszowych

Przeglądaj więcej filmów