Name: Duże objętościowe, behawioralnie istotne oświetlenie dla optogenetyki u naczelnych innych niż ludzie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj metodę budowy dużego oświetlacza objętościowego do optogenetyki u naczelnych. Technika minimalizuje uszkodzenia tkanek podczas manipulacji neuronalnych w badaniach behawioralnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LCA dziękuje za finansowanie ze stypendium NDSEG, NSF GRFP oraz Friends of the McGovern Institute. PE potwierdza finansowanie Funduszu UROP Harry'ego i Eunice Noharów, Funduszu UROP Klasy MIT z 1995 r. oraz Funduszu MIT UROP. ESB potwierdza finansowanie z NIH 2R44NS070453-03A1, IET Harvey Prize oraz New York Stem Cell Foundation-Robertson Award. RD potwierdza finansowanie z NIH EY017292. Michael Williams pomógł ekipie zorganizować i zebrać zapasy przed rozpoczęciem zdjęć.

Uwaga: Wszystkie procedury na zwierzętach były zgodne z wytycznymi NIH i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Massachusetts Institute of Technology.
1. Produkcja iluminatorów
<ol>
	<li>Użyj pary ostrych nożyc, aby przeciąć odcinek światłowodu z tworzywa sztucznego o średnicy 250 μm, który jest co najmniej 10 cm dłuższy niż żądana całkowita długość oświetlacza.</li>
	<li>Usuń 15 - 20 cm płaszcza polietylenowego z jednego końca plastikowego światłowodu za pomocą ściągacza izolacji o średnicy 22</li>.
	<li>Zabezpiecz dystalną część 3-5 cm odizolowanego końca włókna w zacisku imadła stołowego.</li>
	<li>Trzymaj napięty koniec włókna z osłoną jedną ręką, ciągnąc go równomiernie. Włókno powinno być równoległe do podłogi, prostopadłe do imadła. Utrzymuj to stałe napięcie włókna przez cały czas ogrzewania i chłodzenia (kroki 1.5 i 1.6 poniżej), aby włókno pozostało proste i napięte w miarę rozrzedzania.</li>
	<li>Używając najniższego ustawienia opalarki o podwójnej temperaturze (570/1,000 °F), podgrzej odizolowaną część włókna, aż zostanie rozrzedzona do średnicy 60 - 100 μm, czyli mniej więcej średnicy ludzkiego włosa.</li>
	<li>Utrzymuj stałe napięcie włókna, pozwalając włóknu ostygnąć. Nieutrzymanie napięcia może spowodować zwijanie się włókna.</li>
	<li>Potwierdź średnicę rozcieńczonej końcówki pod mikroskopem preparacyjnym. Alternatywnie można zamiast tego użyć suwmiarki.
	<ol>
		<li>Jeśli włókno nie jest wystarczająco cienkie, powtórz kroki od 1,4 do 1,6 w razie potrzeby, aby uzyskać żądaną średnicę końcówki.</li>
		<li>Opcjonalnie w przypadku ponownego wyciągania umieść mały znak w najwęższej części włókna, jeśli zostanie ono ponownie podgrzane, tak aby środek opalarki celował w najwęższą część włókna.</li>
		<li>Jeśli włókno jest zbyt cienkie, zacznij od nowa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy włókno całkowicie ostygnie i zostanie osiągnięta pożądana średnica, ściśnij włókno 3 cm od najwęższego punktu po obu stronach. Szybkim, ostrym pociągnięciem wzdłuż osi włókna oddziel boki, aby utworzyć zwężającą się końcówkę.</li>
	<li>Zbadaj stożkową końcówkę pod małą mocą (np. 4X) pod mikroskopem preparacyjnym. Jeśli końcówka jest rozwidlona lub zwinięta (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1f), wyrzuć włókno.</li>
	<li>Przygotuj się do wytrawienia stożkowej końcówki, umieszczając kawałek taśmy laboratoryjnej w pobliżu końca końcówki, pozostawiając ostatnie 5 mm odsłonięte. Taśma zabezpiecza włókno przed wytrawieniem powyżej pożądanej długości emisji światła. Ta długość końcówki została wybrana na podstawie grubości kory naczelnych w regionie docelowym. Dłuższa lub krótsza długość może być naświetlona w zależności od pożądanej długości oświetlenia. Jeśli pożądana jest inna długość końcówki wytrawiającej, krawędź taśmy laboratoryjnej można przesunąć bliżej lub dalej od stożkowej końcówki.</li>
	<li>Złóż mały (~1 cal x 2 cale) kwadrat arkusza docierającego z węglika krzemu o grubości 5 μm między kciukiem a palcem wskazującym. Umieść końcówkę włókna między dwiema stronami arkusza docierającego i delikatnie wytrawiaj włókno małymi okrężnymi ruchami, tak jakby toczył kulkę między kciukiem a palcem wskazującym. Często obracaj włókno, aby wszystkie boki były równomiernie wytrawione. Końcówka z włókna będzie wydawać się "szorstka" gołym okiem w obszarach, które zostały wytrawione, podczas gdy obszary niewytrawione zazwyczaj wydają się gładkie.</li>
	<li>Powtórz krok 1.11 z arkuszem docierania tlenku glinu o grubości 3 μm.</li>
	<li>Zamocuj złącze na końcu iluminatora naprzeciwko wytrawionej końcówki. Dzięki temu oświetlacz może podłączyć się do optycznego lub lasera. 
	nuta: Ta metoda różni się od preferowanej metody mocowania światłowodów szklanych / krzemionkowych w tulejkach. Ponieważ metalowa skuwka jest twardsza niż światłowód z tworzywa sztucznego, polerowanie włókna i skuwki jako jednostki po sklejeniu może uszkodzić światłowód z tworzywa sztucznego, ponieważ drobne odłamki metalu powstałe podczas procesu polerowania mogą osadzać się w płaskim włóknie.
	<ol>
		<li>Usuń około 5 mm płaszcza polietylenowego z przeciwległego końca iluminatora za pomocą ściągacza izolacji o średnicy 22</li>.
		<li>Przytnij przeciwległy koniec płasko gorącym nożem, aby wygładzić powierzchnię.</li>
		<li>Przeciwległy koniec wypolerować na płasko za pomocą kolejno drobniejszych arkuszy docierających: 5 μm, 3 μm, 1 μm i 0,3 μm.</li>
		<li>Włóż płaski przeciwległy koniec do tulejki ze stali nierdzewnej o średnicy wewnętrznej 260 μm, aż zrówna się z końcem tulejki.</li>
		<li>Wizualnie potwierdź, że przeciwległy koniec jest gładko i równomiernie wypolerowany za pomocą mikroskopu z włókien.</li>
		<li>Usuń włókno z tulejki i przyklej ją pionowo do krawędzi stołu, tak aby światłowód był skierowany w dół.</li>
		<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml plastikową żywicą epoksydową i przymocuj igłę o rozmiarze 18 do strzykawki.</li>
		<li>Użyj igły, aby nałożyć żywicę epoksydową w dół do tulejki. Całkowicie wypełnij skuwkę żywicą epoksydową.</li>
		<li>Włóż włókno do tulejki.</li>
		<li>W razie potrzeby wytrzyj nadmiar żywicy epoksydowej z polerowanej powierzchni włókna wilgotną, niestrzępiącą się ściereczką przed wysuszeniem. W przeciwnym razie nadmiar żywicy epoksydowej można usunąć po 12 - 24 godzinach.</li>
		<li>Delikatnie przechowuj włókno do momentu kalibracji i umieść nasadkę przeciwpyłową na skuwce.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kalibracja iluminatora i kontrola jakości
Uwaga: Te metody kalibracji oceniają nieliniowość strumienia świetlnego w różnych odległościach od końcówki światłowodu. Nierównomierny rozkład światła wynika zazwyczaj z "wyboistego" lub "falistego" stożka.
<ol>
	<li>Utwórz membranę chroniącą przed światłem dla górnej części kuli integrującej za pomocą folii pochłaniającej światło (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
	nuta: Noś rękawice za każdym razem, gdy masz do czynienia z folią pochłaniającą światło, aby zapobiec tworzeniu smug odbijających światło przez oleje skórne.
	<ol>
		<li>Złóż na siebie kawałek folii pochłaniającej światło o wymiarach 2 na 4 cale, aby utworzyć kwadrat o wymiarach 2 x 2 cale. Alternatywną metodą jest wycięcie kwadratu o wymiarach 2 x 2 cale z jedną stroną pochłaniającą światło i jedną stroną odbijającą światło (tj. stroną standardowej folii aluminiowej); jednak Metoda składania jest bezpieczniejsza, ponieważ zapewnia krawędź do obsługi membrany w następnym kroku. </li>
		<li>Złóż taśmę laboratoryjną lub taśmę izolacyjną wzdłuż krawędzi kwadratu, aby związać niezagięte krawędzie. To zarówno utrzymuje boki razem, jak i chroni przed skaleczeniami ostrymi krawędziami.</li>
		<li>Nakłuć otwór w środku kwadratu za pomocą igły o rozmiarze 26.</li>
		<li>Zdejmij dużą nakrętkę z kuli integrującej i zakryj otwór membraną. Umieść otwór nad środkiem. Jeśli membrana została utworzona z jednej strony pochłaniającej światło i jednej odbijającej światło, należy umieścić stronę pochłaniającą światło do góry, a stronę odbijającą światło do dołu, skierowaną do wnętrza kuli całkującej. 
		nuta: Aby zapobiec przedostawaniu się kurzu i zanieczyszczeń do kuli integrującej i utrzymać otwór wyśrodkowany, przymocuj membranę na zewnątrz kuli integrującej za pomocą taśmy laboratoryjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mierz strumień świetlny wzdłuż końcówki w krokach co 500 μm za pomocą mikromanipulatora lub ramienia stereotaktycznego i kuli całkującej. 
	nuta: Okulary ochronne o odpowiedniej długości fali należy nosić zawsze, gdy laser jest włączony.
	<ol>
		<li>Podłącz przeciwległy koniec światłowodu do lasera lub źródła światła, ale nie wyzwalaj jeszcze strumienia światła.</li>
		<li>Przymocuj iluminator do uchwytu stereotaktycznego (najlepiej za pomocą taśmy laboratoryjnej) końcówką 7 - 10 mm poniżej dolnej części uchwytu.</li>
		<li>Przykręć uchwyt stereotaktyczny do ramienia stereotaktycznego.</li>
		<li>Dopasuj końcówkę iluminatora do otworu w środku membrany. Wyzeruj mikromanipulator, gdy końcówka znajduje się dokładnie na tym samym poziomie co membrana.</li>
		<li>Wyłącz światła w pomieszczeniu i wyzeruj kulę całkującą.</li>
		<li>Uruchom laser (lub inne źródło światła) i zmierz całkowitą moc wyjściową światła za pomocą kuli całkującej. 
		nuta: Do testów kalibracyjnych należy używać najniższego możliwego strumienia świetlnego.</li>
		<li>Opuść włókno o wielkości 500 μm do kuli całkującej i powtórz krok 2.2.6.</li>
		<li>Kontynuuj opuszczanie światłowodu do kuli integrującej i mierzenie całkowitego strumienia świetlnego w krokach co 500 μm, aż całkowita moc światła wyrówna się. 
		ostrożność: Całkowita moc światła powinna się wyrównać, gdy cała końcówka znajdzie się w kuli. Nie obniżaj włókna o więcej niż 1 - 2 mm poza wytrawioną długość końcówki. Jeśli końcówka zetknie się z dnem kuli integrującej, może stopić się i/lub zniszczyć kulę integrującą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdź równomiernie wytrawione światłowód, wykreślając całkowitą moc wyjściową światła w funkcji tego, jak daleko światłowód został opuszczony do kuli całkującej, aby potwierdzić liniowość.</li>
</ol>
3. Oświetlenie in vivo
Uwaga: Tutaj te metody są pokazane przy użyciu plastikowego modelu, a nie naczelnego.
<ol>
	<li>Wszczepienie komory rejestracyjnej o średnicy 25 mm zostało wszczepione w obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania przed eksperymentami.</li>
	<li>Wykonaj anatomiczne obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) przed eksperymentami. Umieść niestandardową siatkę rejestracyjną w komorze i wypełnij ją sterylnym smarem chirurgicznym, aby umożliwić wizualizację siatki i określenie poziomu opony twardej i docelowych struktur mózgu.</li>
	<li>Przygotuj mikronapęd w obudowie typu tower przed każdą sesją testową.
	<ol>
		<li>Przymocuj rurę prowadzącą o rozmiarze 25 ze ściętą końcówką do środkowego i dolnego zacisku na napędzie. Dwa zaciski służą do zapewnienia, że rura prowadząca pozostaje prosta. W razie potrzeby oba te zaciski można przesuwać ręcznie. 
		nuta: Rurka prowadząca może być epoksydowana lub przylutowana do zacisków.</li>
		<li>Zamocuj iluminator o dużej głośności w górnym clamp na tym samym napędzie. Ten zacisk jest przymocowany do silnika napędowego.</li>
		<li>Całkowicie przeciągnij oświetlacz o dużej objętości przez rurkę prowadzącą i upewnij się, że końcówka iluminatora wystaje poza końcówkę rurki prowadzącej. 
		nuta: Długość iluminatora, który wystaje poza końcówkę rurki prowadzącej, jest równa odległości od opony twardej do dolnego marginesu docelowego obszaru mózgu, określonej za pomocą rezonansu magnetycznego.</li>
		<li>Namocz rurkę prowadzącą i iluminator w roztworze antyseptycznym (np. chloroheksydynie) w celu sterylizacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść niestandardową wysterylizowaną siatkę w czystej komorze i zabezpiecz ją we wcześniej określonej orientacji śrubą z boku komory. Pokazana tutaj siatka ma rozstaw 1 mm; Jednak odstępy można dostosować w razie potrzeby. 
	nuta: Powinna być ona identyczna z siatką i orientacją stosowaną w anatomicznym rezonansie magnetycznym.</li>
	<li>Zamocuj stereotaktyczny uchwyt mikronapędu na komorze nagrywania w ustalonej wcześniej orientacji.</li>
	<li>Wycofaj wysterylizowany iluminator z rurki prowadzącej, pociągając iluminator do góry za pomocą sterylnych, kleszczyków. Końcówka oświetlacza powinna znajdować się 5 - 10 mm powyżej końcówki rurki prowadzącej. 
	nuta: Iluminator wygina się na zewnątrz między rurą prowadzącą a zaciskiem. Nie spowoduje to uszkodzenia elastycznego iluminatora.</li>
	<li>Przymocuj mikronapęd do uchwytu i umieść rurkę prowadzącą w docelowym otworze siatki.</li>
	<li>Obniż stopień mikronapędu, aż rura prowadząca znajdzie się tuż przez poziom dura. 
	nuta: W razie potrzeby drugi mikronapęd z elektrodą można umieścić na stoliku i opuścić do innego otworu siatki. Potencjał pola lokalnego na tej elektrodzie będzie pokazywał artefakt świetlny zależny od odległości, który można wykorzystać do potwierdzenia umiejscowienia oświetlacza.</li>
	<li>Spróbuj ręcznie opuścić iluminator za pomocą sterylnych kleszczy.
	<ol>
		<li>Jeśli występuje opór, wycofaj iluminator na 5 - 10 mm, odczekaj 10 minut, aby tkanka się uspokoiła i spróbuj ponownie.</li>
		<li>Jeśli przy drugiej próbie nadal występuje opór, wsuń końcówkę iluminatora do rurki prowadzącej, opuść rurkę prowadzącą o 0.25 mm i spróbuj ponownie.</li>
		<li>Powtarzaj, aż iluminator przesunie się przez rurkę prowadzącą bez żadnego oporu.</li>
		<li>Opuść iluminator, aż będzie napięty. 
		ostrożność: Nie popychaj oświetlacza na siłę pod kątem oporu. W takich przypadkach rura prowadząca zazwyczaj nie przeniknęła w pełni do opony twardej. Mocne popychanie włókna spowoduje, że wygina się ono na sobie, zapobiegając przedostawaniu się włókna do mózgu i możliwemu zniszczeniu końcówki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1g).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłącz skuwkę na drugim końcu oświetlacza do większego zestawu optycznego lub lasera.</li>
	<li>Upewnij się, że żadne światło nie jest widoczne dla naczelnych, które nie są ludźmi.
	<ol>
		<li>Użyj ekranu zaciemniającego lub folii pochłaniającej światło, aby w pełni objąć wieże nagraniowe.</li>
		<li>Wszystkie połączenia optyczne należy umieścić w ekranowanych kopertach wykonanych z folii pochłaniającej światło.</li>
		<li>Wszystkie krosowe należy ekranować folią pochłaniającą światło lub czarną taśmą izolacyjną.</li>
		<li>Jako dodatkowy środek ostrożności umieść wabik z diodami elektroluminescencyjnymi (LED) o tej samej barwie światła, co w eksperymencie, za naczelnymi innymi niż człowiek i diodami LED w sposób ciągły z częstotliwością 2.5 Hz. Dzięki temu oczy nie mogą w pełni przyzwyczaić się do ciemności. Gdyby doszło do niezamierzonego wycieku światła, to światło pomogłoby zapobiec wyciekowi jako wyzwalacz behawioralny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+numbers%3A+a+linearly+scaled-up+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Hum+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain.</a> Front Hum Neurosci. 3, 31(2009).</li>
<li>Tamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glass-coated+tungsten+microelectrode+enclosing+optical+fibers+for+optogenetic+exploration+in+primate+deep+brain+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">A glass-coated tungsten microelectrode enclosing optical fibers for optogenetic exploration in primate deep brain structures.</a> J Neurosci Meth. 211 (1), 49-57 (2012).</li>
<li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nat Neurosci. 14 (3), 387-397 (2011).</li>
<li>Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+and+Electrical+Microstimulation+Systematically+Bias+Visuospatial+Choice+in+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic and Electrical Microstimulation Systematically Bias Visuospatial Choice in Primates.</a> Curr biol. 24 (1), 63-69 (2014).</li>
<li>Ozden, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coaxial+optrode+as+multifunction+write-read+probe+for+optogenetic+studies+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">A coaxial optrode as multifunction write-read probe for optogenetic studies in non-human primates.</a> J Neurosci Meth. 219 (1), 142-154 (2013).</li>
<li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> J Neurophysiol. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li>
<li>Chuong, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+optical+inhibition+with+a+red-shifted+microbial+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Noninvasive optical inhibition with a red-shifted microbial rhodopsin.</a> Nat Neurosci. 17 (8), 1123-1129 (2014).</li>
<li>Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FEF+inactivation+with+improved+optogenetic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FEF inactivation with improved optogenetic methods.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 7297-7306 (2016).</li>
<li>Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccadic+eye+movements+evoked+by+optogenetic+activation+of+primate+V1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1.</a> Nat Neurosci. 15 (10), 1368-1370 (2012).</li>
<li>Gerits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetically+Induced+Behavioral+and+Functional+Network+Changes+in+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetically Induced Behavioral and Functional Network Changes in Primates.</a> Curr Biol. 22 (18), 1722-1726 (2012).</li>
<li>Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccade+modulation+by+optical+and+electrical+stimulation+in+the+macaque+frontal+eye+field%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field.</a> J Neurosci. 33 (42), 16684-16697 (2013).</li>
<li>Cavanaugh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+inactivation+modifies+monkey+visuomotor+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetic inactivation modifies monkey visuomotor behavior.</a> Neuron. 76 (5), 901-907 (2012).</li>
</ol>

Podczas gdy narzędzia optogenetyczne są szeroko stosowane do badania chorób i fizjologii gryzoni, wyzwanie techniczne, jakim jest oświetlanie dużych objętości mózgu, ograniczyło zastosowanie optogenetyki u naczelnych innych niż ludzie. Pionierskie badania na małpach wykorzystywały duże gęstości mocy światła (~100 mW / mm2 do 20 W / mm2) do oświetlania małych objętości, być może < 1 mm3, i wykazały umiarkowane efekty behawioralne z pobudzającymi opsynami w korze 4,9,10,11<sup cl...

Narzędzia optogenetyczne, które pozwalają na precyzyjną kontrolę neuronów z dokładnością do milisekund, są szeroko stosowane do badania fizjologii funkcjonalnej i zachowania u gryzoni i bezkręgowców. Jednak wyzwania techniczne ograniczyły zastosowanie optogenetyki w mózgu naczelnych innych niż człowiek, który ma objętość ~100 razy większą niż mózg gryzoni 1.
Aby ułatwić badania optogenetyczne na naczelnych innych niż ludzie, zaprojektowano oświetlacz, który miał spełniać dwa konkurencyjne cele: duże oświetlenie objętościowe i minimalne uszkodzenia penetracji. Poprzednie próby rozwiązania jednego z tych problemów wiązały się z kosztem drugiego. Wiązki włókien oświetlają większe objętości, ale o zwiększonej średnicy, a zatem uszkodzenia2,3. Zwężające się włókna szklane zmniejszają uszkodzenia penetracyjne, ale wąsko skupiają światło na powierzchni emitującej światło <100 μm2 4,5. Zewnętrzne oświetlenie mózgu przez okno w oponie twardej omija wyzwanie związane z uszkodzeniem penetracyjnym i może pozwolić na oświetlenie o dużej objętości, ale może być używane tylko do kilku powierzchownych obszarów mózgu6.
Aby stworzyć oświetlacz o dużej objętości i małej średnicy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1a), końcówka plastikowego światłowodu jest zwężana termicznie, a rdzeń i okładzina są trawione (<silna klasa="xfig">Rysunek 1b,c). W przeciwieństwie do innych zwężających się włókien, które skupiają światło w wąskim punkcie, trawienie pozwala światłu równomiernie uciekać po bokach końcówki, rozprowadzając w ten sposób światło szeroko na dużym obszarze (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1d,e). Ponieważ uszkodzenia penetracyjne są proporcjonalne do średnicy penetracji, ten oświetlacz nie ma więcej uszkodzeń penetracji niż konwencjonalne światłowód, ale ma >100 razy większą powierzchnię emitującą światło i dostarcza światło szerzej z 1/100 gęstości mocy światła w fantomie mózgu (1,75% agarozy) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1e). Model Monte Carlo (<silna klasa="xfig">Rysunek 1f) ilustruje różnicę w rozproszeniu światła między konwencjonalnym światłowodem a oświetlaczem o dużej objętości, gdy mają one taką samą gęstość mocy świetlnej jak ich powierzchnie emitujące światło. Każdy oświetlacz jest indywidualnie kalibrowany za pomocą kuli całkującej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2a,b), aby zapewnić równomierny rozkład światła wzdłuż końcówki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2c).
Ten oświetlacz o dużej objętości został zweryfikowany za pomocą optogenetycznej manipulacji zarówno zachowania, jak i odpalania neuronów u naczelnych innych niż ludzie. Długość końcówki włókna można dostosować do dowolnego obszaru mózgu i do indywidualnej mapy pola recepcyjnego każdego zwierzęcia. Iluminator może być sparowany z elektrodą penetrującą w celu uzyskania zapisów neuronalnych, które obejmują długość oświetlenia. Ponadto, ponieważ włókno może przenosić dowolny kolor światła widzialnego, można je sparować z dowolną z dostępnych cząsteczek optogenetycznych.

<table><tbody><tr><td>Światłowód z tworzywa</td><td>sztucznego Światłowód przemysłowy</td><td>SK-10</td><td>o średnicy 250 mikronów, linia Super Eska</td></tr><tr><td>Ściągacz izolacji</td><td>Klein Tools</td><td>11047</td> Zacisk imadła <td>o rozmiarze 22</td></tr><tr><td></td><td>Wilton</td><td>11104</td><td>Ogólny zacisk imadła do montażu na stole</td></tr><tr><td>Opalarka o podwójnej temperaturze</td><td>Milwaukee</td><td>8975-6</td><td>570 / 1,000 &deg; F</td></tr><tr><td>Marker laboratoryjny</td><td>VWR</td><td>52877</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>VistaVision</td><td>82027-156</td><td>Mikroskop stereoskopowy z podwójnym światłem żarowym, powiększenie 2X/4X, dostępny w VWR</td></tr><tr><td>Taśma laboratoryjna</td><td>VWR</td><td>89097-972</td> 4 <td>opakowania koloru fioletowego; jednak kolor taśmy nie ma znaczenia</td></tr><tr><td>Arkusz docierający z węglika krzemu</td><td>ThorLabs</td><td>LF5P</td><td>o ziarnistości 5 mikronów, opakowanie 10 sztuk</td></tr><tr><td>Arkusz docierania z tlenku glinu</td><td>ThorLabs</td><td>LF3P</td><td>o ziarnistości 3 mikronów, 10 sztuk</td></tr><tr><td>Docieranie tlenkiem glinu&nbsp; arkusz</td><td>ThorLabs</td><td>LF1P</td><td>o ziarnistości 1 mikrona, 10 sztuk</td></tr><tr><td>Kalcynowanego arkusza docierania z tlenku glinu</td><td>ThorLabs</td><td>LF03P</td><td>o ziarnistości 0,3 mikrona, 10 sztuk</td></tr><tr><td>Gorący nóż</td><td>Przemysłowe światłowody</td><td>IF370012</td><td>60 Watt, ciężki</td></tr><tr><td>zakres</td> <td>inspekcji włókienThorLabs</td><td>FS201</td><td>opcjonalna</td></tr><tr><td>skuwka ze stali nierdzewnej</td><td>Precyzyjne światłowody</td><td>MM-FER2003SS-265</td> Strzykawka o <td>średnicy wewnętrznej 265 mikronów</td></tr><tr><td>1 ml</td><td>BD</td><td>14-823-30</td><td>Końcówka Luer-lok jest preferowana, aby zmniejszyć ryzyko wycieku, ale nie jest to bezwzględnie potrzebne</td></tr><tr><td>Plastikowa żywica epoksydowa</td><td>Światłowody przemysłowe</td><td>40 0005</td><td></td></tr><tr><td>18 igła</td><td>BD</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>Niestrzępiąca się chusteczka o długości 1,5 cala (KimWipe)</td><td>ThorLabs</td><td>KW32</td><td>dostępna u wielu dostawców Folia</td></tr><tr><td>pochłaniająca światło</td><td>ThorLabs</td><td>BKF12</td><td></td></tr><tr><td>Taśma izolacyjna</td><td>3M</td><td>Temflex 1700</td><td>Opcjonalnie, może zastąpić inne marki / modele</td></tr><tr><td>Ostra igła o grubości 26&nbsp;</td><td>BD</td><td>305111</td><td>długości 0,5 cala</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Siskiyou</td><td>70750000E</td><td>może zastąpić inne marki/modele</td></tr><tr><td>Ramię steretacticalne</td><td>Kopf</td><td>1460</td><td>może zastąpić inne marki/modele</td></tr><tr><td>Laserowe okulary ochronne</td><td>KenTeK</td><td>KCM-6012</td><td>należy dobrać na podstawie koloru użytego lasera, przykład podany tutaj</td></tr><tr><td>Laser lub inne źródło światła</td><td>vortran</td><td>Stradus 473-50</td><td>przykład niebieskiego lasera</td></tr><tr><td>Kula integrująca</td><td>ThorLabs</td><td>S142C</td><td>Dołączony miernik mocy, dostępny również w ThorLabs, pozycja #PM100D</td></tr><tr><td>Komora nagraniowa Ultem Instrument</td><td>Crist firmy</td><td>6-ICO-J0</td><td>Dostosowany z wycięciem wyrównującym</td></tr><tr><td>Mikronapęd wieżowy z zaciskami</td><td>NAN</td><td>DRTBL-CMS Rura</td><td></td></tr><tr><td>prowadząca</td><td>Niestandardowa</td><td>Nie dotyczy</td><td>Wykonane z igły rdzeniowej (BD) o rozmiarze 25 (BD) lub rurki</td></tr><tr><td>System sterownika NAN</td><td></td><td>NANDrive</td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowy projekt siatki</td><td></td><td></td><td>niestandardowe plany dostępne na żądanie</td></tr><tr><td>kleszcze</td><td>FischerScientific</td><td>08-875-8A</td><td>ogólne kleszcze ze stali nierdzewnej</td></tr><tr><td>Suwmiarki cyfrowe</td><td>Neiko</td><td>01407A</td><td>Dostępne na amazon.com. Może wybrać suwmiarkę o dokładniejszej rozdzielczości, aby uzyskać bardziej precyzyjne pomiary.</td></tr><tr><td>krosowy</td><td>ThorLabs</td><td>FG200LCC-custom</td><td>Jest to jeden z wielu przykładów możliwych krosowych. Tak długo, jak średnica światłowodu jest mniejsza lub równa średnicy włókna oświetlacza o dużej objętości i tak długo, jak złącza się łączą, każdy krosowy (szklany lub plastikowy, zakupiony lub wyprodukowany przez dostawcę w laboratorium) jest odpowiedni do tego zastosowania.</td></tr><tr><td>Przezroczyste plastikowe osłony przeciwpyłowe</td><td>ThorLabs</td><td>CAPF</td><td>Pakiet 25</td></tr><tr><td>ceramicznych dzielonych tulei współpracujących</td><td>Precision Fiber Products, Inc.</td><td>SM-CS1140S</td><td></td></tr></tbody></table>

duże objętościowe, behawioralnie istotne oświetlenie dla optogenetyki u naczelnych innych niż ludzie

Large Volume, Behaviorally-relevant Illumination for Optogenetics in Non-human Primates

Ten protokół opisuje iluminator o dużej objętości, który został opracowany do manipulacji optogenetycznych w mózgu naczelnych innych niż człowiek. Oświetlacz to zmodyfikowane włókno światłowodowe z tworzywa sztucznego z wytrawioną końcówką, dzięki czemu powierzchnia emitująca światło jest > 100 razy większa niż w przypadku konwencjonalnego światłowodu. Oprócz opisu budowy oświetlacza o dużej objętości, protokół ten szczegółowo opisuje kalibrację kontroli jakości stosowaną w celu zapewnienia równomiernego rozsyłu światła. Ponadto protokół ten opisuje techniki wkładania i wyjmowania iluminatora o dużej objętości. Oświetlać mogą być zarówno powierzchowne, jak i głębokie struktury. Ten oświetlacz o dużej objętości nie musi być fizycznie sprzężony z elektrodą, a ponieważ oświetlacz jest wykonany z tworzywa sztucznego, a nie ze szkła, po prostu wygina się w warunkach, w których tradycyjne światłowody pękają. Ponieważ ten oświetlacz dostarcza światło przez behawioralnie istotne objętości tkanek (≈ 10 mm3) bez większych uszkodzeń penetracji niż konwencjonalny światłowód, ułatwia badania behawioralne z wykorzystaniem optogenetyki u naczelnych innych niż ludzie.

Oświetlanie dużych objętości mózgu u naczelnych niebędących ludźmi umożliwia optogenetyczną manipulację istotną behawioralnie. Acker et al. (2016) wykorzystali ten iluminator do dużych objętości wraz z przesuniętą w stronę czerwieni halorodopsyną, Jaws 7, aby zbadać czasowy wkład przedniego pola gałki ocznej (FEF) w sakady sterowane pamięcią u dwóch małp rhesus. W szczególności neurony FEF zostały zainfekowane wektorem wirusowym zawierającym Jaws, a następnie oświetlone czerwonym światłem...

Przedstawiono protokół budowy iluminatora penetrującego tkanki, który dostarczałby światło na duże objętości o minimalnej średnicy.

Duże objętościowe, behawioralnie istotne oświetlenie dla optogenetyki u naczelnych innych niż ludzie

This protocol describes a large-volume illuminator, which was developed for optogenetic manipulations in the non-human primate brain. The illuminator is a ...

Ogólnym celem tego protokołu jest stworzenie iluminatora tkanek o dużej objętości, który dobrze nadaje się do manipulacji optogenetycznych u naczelnych innych niż ludzie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak to, w jaki sposób populacje neuronów w różnych regionach mózgu przyczyniają się do zachowania i jak czasowo określone wzorce wypalania neuronów w jednym regionie mogą wpływać na inny region? Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje światło, a tym samym umożliwia optogenetyczną manipulację dużymi, istotnymi behawioralnie objętościami mózgu przy minimalnym uszkodzeniu tkanek.Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku medycyny translacyjnej ze względu na podobieństwa między mózgami naczelnych ludzi i innych niż ludzie. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ potrzeba trochę praktyki, aby zastosować odpowiednią siłę nacisku podczas ciągnięcia tych włókien. Aby rozpocząć tę procedurę, użyj ostrych nożyc, aby przeciąć odcinek plastikowego światłowodu o średnicy 250 mikrometrów, który jest co najmniej 10 centymetrów dłuższy niż pożądana całkowita dł

large-volume-behaviorally-relevant-illumination-for-optogenetics-non

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Neurony powstałe w wieku dorosłym w opalfaktorycznej cebulce mogą być kontrolowane optogenetycznie poprzez wstrzyknięcie lentiwirusa wykazującego ekspresję Channelrhodopsin2 do przedniego strumienia migracyjnego oraz przewlekłą fotostymulację za pomocą wszczepionej miniaturowej diody LED.

Selektywna transdukcja wirusowa neuronów węchowych pochodzenia dorosłego w celu chronicznej optogenetycznej stymulacji in vivo

Niedawny rozwój narzędzi neuronauki, które łączą genetykę i optykę, określany jako "optogenetyka", umożliwia kontrolę nad aktywnością obwodów neuronowych z niespotykanym dotąd poziomem rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół integracji zapisu in vivo z manipulacją optogenetyczną genetycznie zdefiniowanych podzbiorów neuronów przedczołowych korowych i podkostnych neuronów piramidowych.

Metoda wysokiej wierności optogenetycznej kontroli pojedynczych neuronów piramidowych in vivo

Optogenetyka stała się potężnym narzędziem do wykorzystania w eksperymentach neuronauki behawioralnej. Protokół ten oferuje przewodnik krok po kroku po projektowaniu i konfiguracji systemów laserowych oraz zapewnia pełny protokół przeprowadzania wielokrotnych i jednoczesnych stymulacji optogenetycznych in vivo zgodnych z większością paradygmatów testów behawioralnych gryzoni.

In vivo (in vivo) Stymulacja optogenetyczna ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Tutaj opisujemy naszą strategię uzyskiwania stabilnych, dobrze izolowanych pojedynczych nagrań jednostkowych ze zidentyfikowanych interneuronów hamujących w znieczulonej korze myszy. Neurony wyrażające ChR2 są identyfikowane na podstawie ich reakcji na niebieskie światło. Metoda wykorzystuje standardowy zewnątrzkomórkowy sprzęt rejestrujący i służy jako niedroga alternatywa dla obrazowania wapnia lub wizualnie sterowanego łatania.

Przewodnik po jednojednostkowym zapisie in vivo z optogenetycznie zidentyfikowanych korowych interneuronów hamujących

Ten protokół opisuje kroki i analizę danych wymaganych do pomyślnego przeprowadzenia optogenetycznego funkcjonalnego rezonansu magnetycznego (ofMRI). ofMRI to nowatorska technika, która łączy odczyt fMRI w wysokim polu ze stymulacją optogenetyczną, pozwalając na specyficzne dla typu komórki mapowanie funkcjonalnych obwodów nerwowych i ich dynamiki w całym żywym mózgu.

Optogenetyczny funkcjonalny rezonans magnetyczny

Tutaj pokazujemy wspomagane dostarczanie wektorów wirusowych do kory mózgowej za pomocą rezonansu magnetycznego (MR) jako skuteczne i uproszczone podejście do osiągnięcia ekspresji optogenetycznej w dużych obszarach korowych w mózgu makaka.

Konwekcja wzmocniła dostarczanie optogenetycznego wektora wirusowego związanego z adenowirusem do kory mózgowej makaka rezusa pod nadzorem obrazów MRI online

Dzięki optogenetycznej manipulacji określonych populacji neuronów lub obszarów mózgu, zachowanie może być modyfikowane z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną u swobodnie poruszających się zwierząt. Stosując różne narzędzia optogenetyczne w połączeniu z przewlekle wszczepionymi światłowodami, można przeprowadzić różnorodne modulacje neuronalne i testy behawioralne.

Optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w celu modulacji zachowania u swobodnie poruszających się myszy

Opisana poniżej metoda ma na celu dostarczenie kompleksowego protokołu do przygotowania neurochirurgii na naczelnych (NHP) przy użyciu nowatorskiego połączenia metod drukowania trójwymiarowego (3D) i ekstrakcji danych MRI.

Zestaw narzędzi oparty na rezonansie magnetycznym do planowania neurochirurgicznego u naczelnych

Zgodnie z obecną implementacją, optogenetyka u naczelnych wymaga wstrzyknięcia wektorów wirusowych do mózgu. Optymalna metoda iniekcji powinna być niezawodna i, w przypadku wielu zastosowań, zdolna do celowania w pojedyncze miejsca o dowolnej głębokości, które można łatwo i jednoznacznie zidentyfikować w histologii pośmiertnej. Przedstawiono metodę iniekcji o tych właściwościach.

Wstrzyknięcia wektorów AAV do optogenetyki w znieczulonym i przytomnym, zachowującym się mózgu naczelnych innych niż człowiek

Bioluminescencja - światło emitowane przez enzym lucyferazy utleniający substrat o małych cząsteczkach, lucyferynę - może być wykorzystane do aktywacji białek fotosensorycznych, dodając w ten sposób kolejny wymiar do stymulacji świetlnej i umożliwiając manipulowanie wieloma funkcjami zależnymi od światła w komórkach w skalach czasowych i przestrzennych.

Optogenetyka bioluminescencyjna 2.0: wykorzystanie bioluminescencji do aktywacji białek fotosensorycznych in vitro i in vivo

Ten artykuł przedstawia zautomatyzowane procesy planowania neurochirurgicznego u naczelnych na podstawie skanów rezonansu magnetycznego (MRI). Techniki te wykorzystują etapy proceduralne w programowaniu i projektowaniu platform w celu wspierania niestandardowego projektowania implantów dla NHP. Ważność każdego komponentu można następnie potwierdzić za pomocą trójwymiarowych (3D) wydrukowanych modeli anatomicznych naturalnej wielkości.

Zestaw narzędzi do projektowania implantów neuronowych dla naczelnych

Poznaj metodę budowy dużego oświetlacza objętościowego do optogenetyki u naczelnych. Technika minimalizuje uszkodzenia tkanek podczas manipulacji neuronalnych w badaniach behawioralnych.

Duże objętościowe, behawioralnie istotne oświetlenie dla optogenetyki u naczelnych innych niż ludzie

Przeglądaj więcej filmów