Duże objętościowe, behawioralnie istotne oświetlenie dla optogenetyki u naczelnych innych niż ludzie
3 października 2017
Przedstawiono protokół budowy iluminatora penetrującego tkanki, który dostarczałby światło na duże objętości o minimalnej średnicy.
Ogólnym celem tego protokołu jest stworzenie iluminatora tkanek o dużej objętości, który dobrze nadaje się do manipulacji optogenetycznych u naczelnych innych niż ludzie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak to, w jaki sposób populacje neuronów w różnych regionach mózgu przyczyniają się do zachowania i jak czasowo określone wzorce wypalania neuronów w jednym regionie mogą wpływać na inny region? Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje światło, a tym samym umożliwia optogenetyczną manipulację dużymi, istotnymi behawioralnie objętościami mózgu przy minimalnym uszkodzeniu tkanek.
Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku medycyny translacyjnej ze względu na podobieństwa między mózgami naczelnych ludzi i innych niż ludzie. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ potrzeba trochę praktyki, aby zastosować odpowiednią siłę nacisku podczas ciągnięcia tych włókien. Aby rozpocząć tę procedurę, użyj ostrych nożyc, aby przeciąć odcinek plastikowego światłowodu o średnicy 250 mikrometrów, który jest co najmniej 10 centymetrów dłuższy niż pożądana całkowita długość oświetlacza.
Następnie usuń od 15 do 20 centymetrów folii polietylenowej z jednego końca plastikowego światłowodu za pomocą ściągacza izolacji o średnicy 22 mm. Następnie zabezpiecz najbardziej dystalnie od trzech do pięciu centymetrów odizolowanego końca włókna w zacisku imadła stołowego. Trzymaj napięty koniec włókna z osłoną w jednej ręce, stale ciągnąc.
Włókno powinno być równoległe do podłogi, odciągnięte od imadła. Utrzymuj to stałe napięcie włókna przez cały czas ogrzewania i chłodzenia, tak aby włókno pozostało proste i napięte w miarę rozrzedzania. Używając najniższego ustawienia opalarki o podwójnej temperaturze, podgrzej odizolowaną część włókna, aż zostanie rozrzedzona do średnicy od 60 do 100 mikrometrów, czyli mniej więcej średnicy ludzkiego włosa.
Utrzymuj stałe napięcie włókna, pozwalając mu ostygnąć. Nieutrzymanie napięcia lub przegrzanie włókna może spowodować jego zwijanie się i/lub pękanie. Aby pomóc utrzymać stałe napięcie włókna podczas jego podgrzewania, używaj niedominującej ręki, aby nie musieć puszczać go podczas używania opalarki.
Możesz także delikatnie owinąć włókno wokół dłoni, aby uzyskać jeszcze lepszy chwyt. Gdy włókno całkowicie ostygnie i zostanie osiągnięta pożądana średnica, ściśnij włókno trzy centymetry od najwęższego punktu po obu stronach. Szybkim, ostrym pociągnięciem wzdłuż osi włókna oddziel boki, aby utworzyć zwężającą się końcówkę.
Następnie zbadaj stożkową końcówkę przy małej mocy pod mikroskopem preparacyjnym. Jeśli końcówka jest rozwidlona lub zwinięta , wyrzuć włókno. Nawet przy dużej praktyce około jedna trzecia włókien będzie miała rozwidlone lub zwinięte końcówki.
Po prostu wyrzucamy te włókna, zamiast próbować je naprawić, ponieważ tak szybko i tanio jest wyciągnąć kolejne. Przygotuj się do wytrawienia stożkowej końcówki, umieszczając kawałek taśmy laboratoryjnej w pobliżu końca końcówki, pozostawiając odsłoniętą żądaną długość końcówki. Tutaj naświetlone jest ostatnie pięć milimetrów.
Taśma zabezpiecza włókno przed wytrawieniem powyżej pożądanej długości emisji światła. Następnie złóż mały kwadrat z pięciomikrometrowego arkusza docierającego z węglika krzemu między kciukiem a palcem wskazującym. Umieść końcówkę włókna między dwiema stronami arkusza docierającego i delikatnie wytraw włókno małymi okrężnymi ruchami.
Często obracaj włókno, aby wszystkie boki były równomiernie wytrawione. Następnie usuń około pięciu milimetrów kurtki polietylenowej z przeciwległego końca iluminatora za pomocą ściągacza izolacji o średnicy 22 mm. Następnie odetnij przeciwległy koniec na płasko gorącym nożem, aby wygładzić powierzchnię.
Zamocuj złącze na końcu iluminatora naprzeciwko wytrawionej końcówki. Dzięki temu oświetlacz może podłączyć się do optycznego lub lasera. Następnie wypoleruj przeciwległy koniec na płasko za pomocą kolejno drobniejszych arkuszy docierających.
Następnie włóż płaski przeciwległy koniec do tulejki ze stali nierdzewnej o średnicy wewnętrznej 260 mikrometrów, aż zrówna się z końcem tulejki. Wizualnie potwierdź, że przeciwległy koniec jest gładko i równomiernie wypolerowany za pomocą mikroskopu z włókien. Przyklej tuleję pionowo do krawędzi stołu, tak aby mniejszy otwór skuwki był skierowany w dół.
Następnie napełnij strzykawkę o pojemności jednego mililitra plastikową żywicą epoksydową i przymocuj igłę o rozmiarze 18 do strzykawki. Następnie użyj igły, aby nałożyć żywicę epoksydową na skuwkę. Całkowicie wypełnij skuwkę żywicą epoksydową.
Włóż włókno do tulejki tak, aby zlicowało się z dolną częścią tulejki. W razie potrzeby przed wysuszeniem wytrzyj nadmiar żywicy epoksydowej z polerowanej powierzchni włókna wilgotną, niestrzępiącą się ściereczką. Na tym etapie należy przygotować mikronapęd w obudowie typu tower przed każdą sesją testową.
Następnie przymocuj rurę prowadzącą o rozmiarze 25 ze ściętą końcówką do dolnego zacisku na napędzie. Zamocuj iluminator o dużej głośności w górnym clamp na tym samym napędzie. Ten zacisk jest przymocowany do silnika napędowego.
Następnie całkowicie przeciągnij iluminator o dużej objętości przez rurkę prowadzącą i upewnij się, że końcówka iluminatora wystaje poza końcówkę rurki prowadzącej. Alternatywnie, taśma laboratoryjna może być nałożona na włókno, tak aby taśma, a nie samo włókno, była zaciśnięta, aby chronić włókno. Następnie namocz rurkę prowadzącą i iluminator w roztworze antyseptycznym w celu sterylizacji.
Umieść niestandardową wysterylizowaną siatkę z odstępem jednego milimetra między otworami wewnątrz czystej komory i zabezpiecz ją w określonej orientacji śrubą z boku komory. Wycofaj wysterylizowany iluminator z rurki prowadzącej, pociągając iluminator do góry za pomocą sterylnych kleszczy. Końcówka iluminatora powinna znajdować się od pięciu do 10 milimetrów nad końcówką rurki prowadzącej.
Przymocuj mikronapęd do uchwytu i umieść rurkę prowadzącą w docelowym otworze siatki. Następnie opuść stopień mikronapędu, aż rura prowadząca znajdzie się tuż przez poziom opony twardej. W tym samym czasie opuść iluminator ręcznie za pomocą sterylnych kleszczy.
Jeśli wystąpi jakikolwiek opór, cofnij oświetlacz na pięć do 10 milimetrów, odczekaj 10 minut i spróbuj ponownie. Jeśli przy drugiej próbie nadal występuje opór, wsuń końcówkę iluminatora do rurki prowadzącej, opuść rurkę prowadzącą o 0,25 milimetra i spróbuj ponownie. Podłącz tuleję na drugim końcu oświetlacza do większego zestawu optycznego lub lasera.
Rysunek ten pokazuje, że poziomy błędów znacznie wzrosły wraz z oświetleniem. Wykresy rastrowe pokazują hamowanie neuronów o grubości 2,5 milimetra w korze mózgowej. A potencjał lokalnego pola pokazuje artefakt świetlny o rozpiętości 4,5 milimetra.
Po opanowaniu, iluminator o dużej objętości może zostać zbudowany przy użyciu tej techniki w ciągu 10 do 15 minut, plus czas schnięcia żywicy epoksydowej. Kalibracja dodaje kolejne pół godziny, więc aby zmaksymalizować wydajność, zwykle wykonujemy kilka oświetlaczy jednocześnie. Uczestnicząc w tej procedurze, należy pamiętać, że wiele oświetlaczy nie spełnia standardów kontroli jakości.
W porządku. Jeśli nie przejdą kontroli końcówki, wyrzucamy je. Ale jeśli nie uda nam się skalibrować, zwykle polerujemy je ponownie i powtarzamy kalibrację.
Po jej opracowaniu technika ta pomogła utorować drogę naukowcom w dziedzinie neurobiologii do wykorzystania optogenetyki do tłumienia odpalania neuronów i modulowania zachowania u naczelnych innych niż ludzie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonstruować oświetlacz tkanek o dużej objętości.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje konstrukcję iluminatora przenikającego tkankę, zaprojektowanego do manipulacji optogenetycznych u nie-ludzkich naczelnych. Technika ma na celu oświetlenie dużych objętości mózgu, minimalizując uszkodzenie tkanki, ułatwiając badania nad zachowaniem neuronów i ich interakcjami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Optogenetyka
- Neurobiologia
Tło
- Rozumienie populacji neuronów jest kluczowe dla neuronauki.
- Optogenetyka umożliwia precyzyjną kontrolę aktywności neuronowej.
- Modele nie-ludzkich naczelnych są istotne dla medycyny translacyjnej.
- Minimalizowanie uszkodzenia tkanki jest istotne dla etycznych praktyk badawczych.
Cel badania
- Stworzyć iluminator dużej objętości do badań optogenetycznych.
- Zbadać, jak różne regiony mózgu przyczyniają się do zachowania.
- Zbadać wpływ wzorców wyładowań neuronów w różnych regionach.
Zastosowane metody
- Cięcie sekcji plastikowego włókna optycznego na żądaną długość.
- Stosowanie odpowiedniego ciśnienia podczas pociągania włókien.
- Używanie ostrych nożyczek do precyzyjnych cięć.
- Montaż iluminatora dla optymalnego dostarczania światła.
Główne wyniki
- Iluminatur efektywnie dostarcza światło do dużych objętości mózgu.
- Minimalne uszkodzenie tkanki osiąga się podczas procedury.
- Ułatwia manipulację optogenetyczną w badaniach behawioralnych.
- Dostarcza wglądu w interakcje i zachowania neuronów.
Wnioski
- Protokół poprawia zdolności badawcze w dziedzinie optogenetyki.
- Ma znaczące implikacje dla zrozumienia funkcji mózgu.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę technikę do badań translacyjnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables optogenetic manipulation of large, behaviorally relevant brain volumes in non-human primates with minimal tissue damage, supporting translational neuroscience research. By delivering light over ~10 mm³ tissue volumes, it bridges preclinical target validation and behavioral phenotyping in a phylogenetically relevant model. The approach reduces biological risk in target de-risking by enabling circuit-level interrogation with improved spatial specificity over conventional fiber optics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neuronal population contributions to behavior across distributed brain circuits.
- Operational Value: Supports causal target validation through temporally precise optogenetic modulation in ethologically relevant contexts.
- Predictive Value: Enhances confidence in target mechanism by linking neuronal activity patterns to behavioral outputs in a translationally predictive model.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized light delivery system for consistent optogenetic dosing across experimental sessions.
- Operational Value: Facilitates reproducible behavioral assays through stable, large-volume illumination without electrode coupling constraints.
- Assay Readiness: Enables high-fidelity optogenetic control in freely moving subjects, supporting longitudinal behavioral screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Leverages anatomical and physiological similarities between non-human primate and human brains to improve predictive validity of target engagement.
- Preclinical De-risking: Allows assessment of target modulation effects on complex behaviors relevant to neuropsychiatric disease models.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by demonstrating target modulation efficacy in a behaviorally complex, gyrencephalic species.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by enabling circuit-level target validation following initial target identification and preceding lead optimization, particularly for CNS targets requiring behavioral phenotype confirmation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of neural circuits implicated in disease-related behaviors.
- Screening: Enables standardized optogenetic perturbation in behavioral assays for compound effect validation.
- Analytics: Generates quantifiable behavioral and electrophysiological readouts (e.g., error rates, neuronal firing suppression, LFP artifacts) to assess target engagement.
- Translational Research: Connects molecular target modulation to systems-level behavioral outcomes in a model with high translational relevance to human cognition.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable platform for repeated use across multiple targets and behavioral paradigms after initial fabrication and QC.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by enabling cell-type-specific control over large neuronal populations during behavior.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized fabrication, QC calibration, and sterilization procedures.
- Strategic Value: De-risks target advancement by providing causal evidence of target-behavior relationships in a preclinical model.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted target prioritization by validating functional relevance of targets in complex behavioral domains.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques, fiber optic handling, and sterile procedures for neural implantation.
- Depends on specialized instrumentation including microdrives, guide tubes, sterilization chambers, and laser coupling systems.
- Necessitates cross-team standardization between neuroscience, engineering, and animal care teams for consistent illuminator production and use.
- Involves adaptation considerations for different target depths (superficial vs. deep structures) and illumination volumes based on experimental goals.
- Includes practical limitations such as variable success rates in fiber pulling and tip formation, necessitating batch fabrication and QC screening.
