Praktyczne rozważania w badaniu przerzutowej kolonizacji płuc w kostniakomięsaku przy użyciu testu przerzutów do płuc
12 marca 2018
Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu protokołu testu przerzutów do płuc (PuMA). Model ten pozwala naukowcom badać wzrost komórek kostniakomięsaka z przerzutami (OS) w tkance płucnej za pomocą szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.
Ogólnym celem tego testu przerzutów do płuc jest bezpośrednia wizualizacja i badanie wzrostu komórek kostniakomięsaka z przerzutami w żywotnej tkance płucnej. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na naprawdę kluczowe pytania w dziedzinie przerzutów kostniakomięsaka. Na przykład, w jaki sposób komórki kostniakomięsaka z przerzutami adaptują się, przeżywają i namnażają w mikrośrodowisku płuc.
Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na bezpośrednią wizualizację wzrostu komórek kostniakomięsaka z przerzutami w odpowiednim trójwymiarowym mikrośrodowisku. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z technicznymi etapami kaniulacji tchawicy i wdmuchiwania płuc. Iniekcja komórek nowotworowych do żyły ogonowej i eutanazja myszy odbywają się zgodnie ze standardowymi wytycznymi instytucjonalnymi.
Po pięciu minutach umieść uśpioną mysz w pozycji leżącej grzbietowej na sterylnej podkładce w kapturze z przepływem laminarnym i za pomocą małych, sterylnych nożyczek ostrożnie wypreparuj mostek, mijając wlot klatki piersiowej po obu stronach tchawicy, bez nakłuwania płuc. Wypreparowanie wszystkich mięśni i tkanki łącznej otaczającej tchawicę jest niezbędne do udanej kanelacji. Następnie użyj cewnika dożylnego o rozmiarze 20, aby ostrożnie kaniuflować tchawicę i użyj sterylnego szwu katgutowego, aby luźno zabezpieczyć cewnik i tchawicę.
Podłącz zestaw przedłużający kroplówkę z cewnika do 10-mililitrowej strzykawki aparatu do grawitacyjnej fuzji i wlej do strzykawki płynną agarozę o temperaturze 37 stopni Celsjusza zmieszaną z roztworem pożywki. Napełnij płuca roztworem agarozy, aż zostaną całkowicie wdmuchnięte. Następnie wyjmij kaniulę i mocno zawiąż szew, aby zapobiec wyciekowi roztworu agarozy.
Ważne jest, aby podczas wdmuchiwania płuca pozostały nienaruszone. Odpowiednie wdmuchiwanie agarozy i późniejsze schłodzenie osunięcia utrzyma płuca w stanie rozszerzonym. Zbierz oskubanie, tchawicę, serce i płuco, uważając, aby nie przebić ani nie uszkodzić powierzchni płuca.
Umieść tkanki w 30 mililitrach wstępnie schłodzonego PBS uzupełnionego antybiotykami i pozwól agarozie zestalić się. Umieść oskubanie na lodzie na 20 minut. Po 20 minutach za pomocą cienkich nożyczek i pęsety pokrój płuco na 3 x 1,5 milimetra kawałki i umieść plastry w indywidualnych dołkach 6-dołkowej płytki zawierającej 2 x 2-centymetrowe gąbki żelatynowe wstępnie namoczone w podłożu B.
W dniu obrazowania ostrożnie przenieś plastry płuc z płytki 6-dołkowej do sterylnego okrągłego naczynia o szklanym dnie o średnicy 35 milimetrów w kolumnach zgodnie z grupą eksperymentalną. Następnie w mikroskopie fluorescencyjnym o szerokim polu wybierz obiektyw 2,5x i ustaw parametry obrazowania, aby zapewnić najlepszy kontrast między fluorescencyjnymi komórkami nowotworowymi a niefluorescencyjną tkanką tła w grupie próbek tkanek kontrolnych. Zobrazować wszystkie próbki przy użyciu tych samych parametrów, co dla tkanek kontrolnych.
Jeśli oprogramowanie nie jest skalibrowane na wadze, zobrazuj mikrometr przy użyciu tego samego obiektywu, co tkanka płucna, aby uzyskać odniesienie do skali, i zapisz wszystkie obrazy jako pliki tif. Po uzyskaniu wszystkich obrazów, aby przeanalizować obrazy w ImageJ, otwórz pierwszy plik. Użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów, aby obrysować cały wycinek płuca w celu określenia obszaru całego wycinka płuca.
Wybierz proces i odejmij tło. Ustaw promień toczącej się kuli na wartość początkową 50 pikseli. Wartość ta będzie zależała od stopnia fluorescencji tła i powinna być zoptymalizowana dla każdego zestawu danych.
Upewnij się, że odznaczyłeś jasne tło. Wybierz obraz i typ, 8-bitowy, następnie obraz i właściwości, wprowadź piksele. W polu Jednostka długości wprowadź wartość 1 dla szerokości piksela, wysokości piksela i głębokości wokseli.
Następnie zaznacz opcję globalne, aby zastosować te parametry do wszystkich kolejnych obrazów. Następnie wybierz obraz, a następnie dostosuj, a następnie próg. Podświetl domyślne i czarno-białe, a następnie użyj suwaka, aby ustawić próg obrazu, aby większość komórek nowotworowych była dokładnie podświetlona.
Kliknij przycisk Zastosuj jeden raz, aby zmienić kolor płuc na, a zmiany fluorescencyjne na białe. Następnie kliknij Zastosuj po raz drugi, aby odwrócić obraz, tak aby wszystkie struktury fluorescencyjne zmieniły kolor na. Aby określić ilościowo liczbę i kształt zmian, wybierz opcję Analizuj i ustaw pomiary, a następnie sprawdź obszar.
Odznacz wszystkie inne pola. Następnie wybierz opcję analizuj cząstki i w polu rozmiar użyj obszaru najmniejszej zmiany określonej jako pojedyncza komórka przez ImageJ, aby ustawić zakres kształtów, które program wyliczy. Użyj obrazu z grupy nośników dnia zero, aby wybrać najmniejszy obszar, który jest uważany za pojedynczą komórkę nowotworową.
Po ustawieniu dolnego limitu kliknij przycisk OK. Pojawi się okno wyników zawierające wszystkie wyliczone kształty i pomiary powierzchni. Następnie skopiuj i wklej dane z okna wyników do arkusza kalkulacyjnego i użyj funkcji matematycznej sumy, aby dodać wszystkie obszary zmian przerzutowych dla tego konkretnego wycinka płuca.
Skłonności przerzutowe do linii komórkowych o wysokich i niskich przerzutach są wizualnie widoczne w postępujących punktach czasowych. Mówiąc dokładniej, te obrazy mikroskopowe pokazują, jak wysoce przerzutowe komórki są w stanie kolonizować płuca bardziej efektywnie niż linie komórkowe o niskich przerzutach. Analiza obrazu, kwantyfikacja i analiza statystyczna danych obrazowych potwierdza, że wysoce przerzutowe komórki nowotworowe mogą skutecznie kolonizować tkankę płucną.
Podczas gdy niskie komórki przerzutowe nie mogą w ogóle rosnąć. Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna o dużym powiększeniu umożliwia wizualizację komórek miąższu płuc z dużą szczegółowością przestrzenną w porównaniu z komórkami nowotworowymi wykazującymi ekspresję EGFP. Jak również ułatwia analizę struktur subkomórkowych, takich jak te mitochondria.
W zależności od liczby użytych myszy, technika ta może zostać wykonana w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tego zabiegu należy pamiętać o pracy z czystym, sterylnym sprzętem chirurgicznym. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad rakiem do zbadania progresji przerzutów w płucach myszy.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak testy hodowli komórkowych in vitro i western blot, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące wpływu knockdownu genu lub leczenia farmakologicznego na komórki rakowe. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać test przerzutów do płuc. Nie zapominaj, że praca z ludzkimi komórkami rakowymi może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak praca w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje protokół badania przerzutów do płuc (pulmonary metastasis assay, PuMA), który umożliwia wizualizację i badanie wzrostu przerzutowych komórek osteosarkoma w tkance płucnej. Metoda ta dostarcza informacji na temat tego, w jaki sposób komórki te adaptują się i proliferują w trójwymiarowym mikrośrodowisku.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Onkologia
- Badania nad przerzutami
Wstęp
- Przerzutowy kostniak jest nowotworem trudnym do badania.
- Zrozumienie zachowania komórek w mikrośrodowisku płuc jest kluczowe.
- Model PuMA oferuje odpowiednią platformę do takich badań.
- Podczas wykonywania testu występują wyzwania techniczne.
Cel badania
- W celu wizualizacji wzrostu przerzutowych komórek osteosarcoma.
- W celu zbadania adaptacji i przeżywalności komórek w tkance płucnej.
- W celu pogłębienia zrozumienia procesu przerzutowania osteosarcoma.
Zastosowane metody
- Kanulacja tchawicy w celu insuflacji płuc.
- Wstrzykiwanie komórek nowotworowych do żyły ogonowej.
- Zastosowanie szerokokątowej fluorescencji lub konfokalnej mikroskopii laserowej.
- Przestrzeganie instytucjonalnych wytycznych dotyczących eutanazji zwierząt.
Główne wyniki
- Osiągnięto bezpośrednią wizualizację wzrostu komórek przerzutowych.
- Uzyskano wgląd w proliferację komórek w środowisku trójwymiarowym.
- Zidentyfikowano kluczowe mechanizmy przetrwania w płucach.
- Wskazano wyzwania techniczne dla nowych badaczy.
Wnioski
- Test PuMA jest cennym narzędziem do badania przerzutów osteosarcoma.
- Dostarcza on kluczowych informacji na temat mechanizmów przerzutowania.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodologii, aby lepiej zrozumieć przerzuty nowotworowe.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Test przerzutów do płuc (PuMA) umożliwia bezpośrednią wizualizację kolonizacji tkanki płucnej przez komórki osteosarkoma, zapewniając fizjologicznie istotny model do oceny potencjału przerzutowego i interwencji terapeutycznej. Ten system ex vivo wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie oceny w czasie rzeczywistym adaptacji, przeżywalności i proliferacji komórek nowotworowych w trójwymiarowym mikrośrodowisku. Zwiększa on pewność prognostyczną w walidacji celów i identyfikacji wiodących związków, łącząc wyniki fenotypowe z efektami działania leków w systemie istotnym dla przebiegu choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację tego, w jaki sposób przerzutowe komórki osteosarcoma adaptują się i przetrwają w mikrośrodowisku płuc.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez bezpośrednią obserwację zachowania komórek nowotworowych w odpowiednim kontekście tkankowym.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność co do wyboru celu terapeutycznego poprzez powiązanie zaburzeń genetycznych lub farmakologicznych z mierzalnymi zmianami w kolonizacji przerzutowej.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Zapewnia ilościowe odczyty obrazowe powierzchni i liczby zmian, umożliwiając standaryzowaną ocenę wzrostu przerzutów w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Wartość operacyjna: Kompatybilna z mikroskopią fluorescencyjną szerokopolową i konfokalną, co pozwala na skalowalne procesy obrazowania w badaniach przesiewowych związków.
- Wartość strategiczna: Wspiera gotowość testową poprzez generowanie powtarzalnych, mierzalnych wyników, które mogą być wykorzystane do oceny terapeutyków przeciwprzerzutowych w czasie.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zachowuje istotność kliniczną choroby poprzez wykorzystanie tkanki płuc myszy do modelowania niszy przerzutowej osteosarcoma, co umożliwia badanie oddziaływań mikrośrodowiskowych.
- Wartość operacyjna: Pozwala na obrazowanie podłużne w celu oceny dynamicznych zmian w wzroście guza i odpowiedzi na interwencję.
- Wartość strategiczna: Łączy odkrycia z fazy wstępnej z walidacją przedkliniczną, stanowiąc pomost między modelami in vitro a przerzutami in vivo.
Integracja potoków i przepływów pracy
Model PuMA wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną – oferując platformę do priorytetyzacji kandydatów na podstawie fenotypu przerzutowego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez umożliwienie wizualizacji sposobu, w jaki komórki osteosarcoma kolonizują tkankę płucną i reagują na sygnały z mikrośrodowiska.
- Przesiew: Dostarcza wyników ilościowych, takich jak powierzchnia zmian przerzutowych, które można mierzyć i porównywać pomiędzy grupami badawczymi za pomocą narzędzi do analizy obrazu, takich jak ImageJ.
- Analityka: Generuje mierzalne dane dotyczące proliferacji komórek nowotworowych i ich rozkładu przestrzennego, co wspiera analizę statystyczną w celu potwierdzenia różnic między liniami o wysokim i niskim potencjale przerzutowym.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez wykorzystanie nienaruszonych eksplantów płuc do badania funkcji genów, aktywności promotorów oraz struktur subkomórkowych w komórkach przerzutowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi platformę wielokrotnego użytku do oceny wielu kandydatów terapeutycznych lub modyfikatorów genetycznych w spójnym, ustandaryzowanym systemie.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności w ocenie potencjału przerzutowego dzięki bezpośredniej, wizualnej potwierdzeniu kolonizacji.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji przygotowania tkanek, parametrów obrazowania oraz protokołów kwantyfikacji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczanie wczesnych, mechanistycznych informacji o skuteczności przeciwnowotworowej w zakresie hamowania przerzutów, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ich zdolność do hamowania kolonizacji w istotnym dla przebiegu choroby mikrośrodowisku płuc.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w sekcji tkanek mysich, kaniulacji tchawicy oraz insuflacji agarozy w celu zachowania integralności płuc.
- Zależne od dostępu do systemów mikroskopii fluorescencyjnej (szerokopolowej lub konfokalnej) oraz oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ, w celu przeprowadzenia kwantyfikacji.
- Wymaga standaryzacji w zakresie krojenia tkanek, ich rozmieszczania na szalkach oraz warunków obrazowania pomiędzy zespołami badawczymi, aby zapewnić porównywalność wyników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania modelu przy zastosowaniu go do różnych linii komórkowych lub tła genetycznego, szczególnie w zakresie definiowania progów dla pojedynczych komórek podczas analizy cząstek.
- Ograniczone przez techniczną złożoność sekcji płuc i insuflacji, co może wpływać na przepustowość i wymagać przeszkolenia w celu zapewnienia spójności wykonania procedury.
