Praktyczne rozważania w badaniu przerzutowej kolonizacji płuc w kostniakomięsaku przy użyciu testu przerzutów do płuc
March 12th, 2018
Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu protokołu testu przerzutów do płuc (PuMA). Model ten pozwala naukowcom badać wzrost komórek kostniakomięsaka z przerzutami (OS) w tkance płucnej za pomocą szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.
Ogólnym celem tego testu przerzutów do płuc jest bezpośrednia wizualizacja i badanie wzrostu komórek kostniakomięsaka z przerzutami w żywotnej tkance płucnej. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na naprawdę kluczowe pytania w dziedzinie przerzutów kostniakomięsaka. Na przykład, w jaki sposób komórki kostniakomięsaka z przerzutami adaptują się, przeżywają i namnażają w mikrośrodowisku płuc.
Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na bezpośrednią wizualizację wzrostu komórek kostniakomięsaka z przerzutami w odpowiednim trójwymiarowym mikrośrodowisku. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z technicznymi etapami kaniulacji tchawicy i wdmuchiwania płuc. Iniekcja komórek nowotworowych do żyły ogonowej i eutanazja myszy odbywają się zgodnie ze standardowymi wytycznymi instytucjonalnymi.
Po pięciu minutach umieść uśpioną mysz w pozycji leżącej grzbietowej na sterylnej podkładce w kapturze z przepływem laminarnym i za pomocą małych, sterylnych nożyczek ostrożnie wypreparuj mostek, mijając wlot klatki piersiowej po obu stronach tchawicy, bez nakłuwania płuc. Wypreparowanie wszystkich mięśni i tkanki łącznej otaczającej tchawicę jest niezbędne do udanej kanelacji. Następnie użyj cewnika dożylnego o rozmiarze 20, aby ostrożnie kaniuflować tchawicę i użyj sterylnego szwu katgutowego, aby luźno zabezpieczyć cewnik i tchawicę.
Podłącz zestaw przedłużający kroplówkę z cewnika do 10-mililitrowej strzykawki aparatu do grawitacyjnej fuzji i wlej do strzykawki płynną agarozę o temperaturze 37 stopni Celsjusza zmieszaną z roztworem pożywki. Napełnij płuca roztworem agarozy, aż zostaną całkowicie wdmuchnięte. Następnie wyjmij kaniulę i mocno zawiąż szew, aby zapobiec wyciekowi roztworu agarozy.
Ważne jest, aby podczas wdmuchiwania płuca pozostały nienaruszone. Odpowiednie wdmuchiwanie agarozy i późniejsze schłodzenie osunięcia utrzyma płuca w stanie rozszerzonym. Zbierz oskubanie, tchawicę, serce i płuco, uważając, aby nie przebić ani nie uszkodzić powierzchni płuca.
Umieść tkanki w 30 mililitrach wstępnie schłodzonego PBS uzupełnionego antybiotykami i pozwól agarozie zestalić się. Umieść oskubanie na lodzie na 20 minut. Po 20 minutach za pomocą cienkich nożyczek i pęsety pokrój płuco na 3 x 1,5 milimetra kawałki i umieść plastry w indywidualnych dołkach 6-dołkowej płytki zawierającej 2 x 2-centymetrowe gąbki żelatynowe wstępnie namoczone w podłożu B.
W dniu obrazowania ostrożnie przenieś plastry płuc z płytki 6-dołkowej do sterylnego okrągłego naczynia o szklanym dnie o średnicy 35 milimetrów w kolumnach zgodnie z grupą eksperymentalną. Następnie w mikroskopie fluorescencyjnym o szerokim polu wybierz obiektyw 2,5x i ustaw parametry obrazowania, aby zapewnić najlepszy kontrast między fluorescencyjnymi komórkami nowotworowymi a niefluorescencyjną tkanką tła w grupie próbek tkanek kontrolnych. Zobrazować wszystkie próbki przy użyciu tych samych parametrów, co dla tkanek kontrolnych.
Jeśli oprogramowanie nie jest skalibrowane na wadze, zobrazuj mikrometr przy użyciu tego samego obiektywu, co tkanka płucna, aby uzyskać odniesienie do skali, i zapisz wszystkie obrazy jako pliki tif. Po uzyskaniu wszystkich obrazów, aby przeanalizować obrazy w ImageJ, otwórz pierwszy plik. Użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów, aby obrysować cały wycinek płuca w celu określenia obszaru całego wycinka płuca.
Wybierz proces i odejmij tło. Ustaw promień toczącej się kuli na wartość początkową 50 pikseli. Wartość ta będzie zależała od stopnia fluorescencji tła i powinna być zoptymalizowana dla każdego zestawu danych.
Upewnij się, że odznaczyłeś jasne tło. Wybierz obraz i typ, 8-bitowy, następnie obraz i właściwości, wprowadź piksele. W polu Jednostka długości wprowadź wartość 1 dla szerokości piksela, wysokości piksela i głębokości wokseli.
Następnie zaznacz opcję globalne, aby zastosować te parametry do wszystkich kolejnych obrazów. Następnie wybierz obraz, a następnie dostosuj, a następnie próg. Podświetl domyślne i czarno-białe, a następnie użyj suwaka, aby ustawić próg obrazu, aby większość komórek nowotworowych była dokładnie podświetlona.
Kliknij przycisk Zastosuj jeden raz, aby zmienić kolor płuc na, a zmiany fluorescencyjne na białe. Następnie kliknij Zastosuj po raz drugi, aby odwrócić obraz, tak aby wszystkie struktury fluorescencyjne zmieniły kolor na. Aby określić ilościowo liczbę i kształt zmian, wybierz opcję Analizuj i ustaw pomiary, a następnie sprawdź obszar.
Odznacz wszystkie inne pola. Następnie wybierz opcję analizuj cząstki i w polu rozmiar użyj obszaru najmniejszej zmiany określonej jako pojedyncza komórka przez ImageJ, aby ustawić zakres kształtów, które program wyliczy. Użyj obrazu z grupy nośników dnia zero, aby wybrać najmniejszy obszar, który jest uważany za pojedynczą komórkę nowotworową.
Po ustawieniu dolnego limitu kliknij przycisk OK. Pojawi się okno wyników zawierające wszystkie wyliczone kształty i pomiary powierzchni. Następnie skopiuj i wklej dane z okna wyników do arkusza kalkulacyjnego i użyj funkcji matematycznej sumy, aby dodać wszystkie obszary zmian przerzutowych dla tego konkretnego wycinka płuca.
Skłonności przerzutowe do linii komórkowych o wysokich i niskich przerzutach są wizualnie widoczne w postępujących punktach czasowych. Mówiąc dokładniej, te obrazy mikroskopowe pokazują, jak wysoce przerzutowe komórki są w stanie kolonizować płuca bardziej efektywnie niż linie komórkowe o niskich przerzutach. Analiza obrazu, kwantyfikacja i analiza statystyczna danych obrazowych potwierdza, że wysoce przerzutowe komórki nowotworowe mogą skutecznie kolonizować tkankę płucną.
Podczas gdy niskie komórki przerzutowe nie mogą w ogóle rosnąć. Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna o dużym powiększeniu umożliwia wizualizację komórek miąższu płuc z dużą szczegółowością przestrzenną w porównaniu z komórkami nowotworowymi wykazującymi ekspresję EGFP. Jak również ułatwia analizę struktur subkomórkowych, takich jak te mitochondria.
W zależności od liczby użytych myszy, technika ta może zostać wykonana w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tego zabiegu należy pamiętać o pracy z czystym, sterylnym sprzętem chirurgicznym. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad rakiem do zbadania progresji przerzutów w płucach myszy.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak testy hodowli komórkowych in vitro i western blot, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące wpływu knockdownu genu lub leczenia farmakologicznego na komórki rakowe. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać test przerzutów do płuc. Nie zapominaj, że praca z ludzkimi komórkami rakowymi może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak praca w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje protokół badania przerzutów do płuc (PuMA), który pozwala na wizualizacje i badania wzrostu przerzutowych komórek osteosarcoma w tkance płucnej. Metoda ta daje wgląd w sposób, w jaki te komórki adaptują się i rozmnażają w trójwymiarowym mikrośrodowisku.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurologia
- Onkologia
- Badania nad przerzutami
Tło
- Przerzutowe osteosarcoma jest trudnym rakiem do badania.
- Zrozumienie zachowania komórek w mikrośrodowisku płucnym jest kluczowe.
- Model PuMA oferuje odpowiedni model do takich badań.
- Istnieją wyzwania techniczne w realizacji badania.
Cel badania
- Wizualizacja wzrostu przerzutowych komórek osteosarcoma.
- Badanie adaptacji i przetrwania komórek w tkance płucnej.
- Zgłębienie rozumienia przerzutów osteosarcoma.
Zastosowane metody
- Kannulacja tchawicy dla insufflacji płuc.
- Wstrzyknięcie komórek nowotworowych do żyły ogonowej.
- Wykorzystanie fluorescencji szerokokątnej lub konfokalnej mikroskopii skanującej laserowo.
- Przestrzeganie wytycznych instytucjonalnych dotyczących eutanazji zwierząt.
Główne wyniki
- Uzyskano bezpośrednią wizualizacje wzrostu komórek przerzutowych.
- Wgląd w proliferację komórek w trójwymiarowym środowisku.
- Identyfikacja kluczowych mechanizmów przetrwania w płucach.
- Podkreślono wyzwania techniczne dla nowych badaczy.
Konkluzje
- Badanie PuMA jest cennym narzędziem do badania przerzutów osteosarcoma.
- Daje kluczowe informacje na temat zachowania przerzutów.
- Przyszłe badania mogą budować na tej metodologii, aby lepiej zrozumieć przerzuty nowotworowe.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The pulmonary metastasis assay (PuMA) enables direct visualization of osteosarcoma cell colonization in lung tissue, providing a physiologically relevant model for evaluating metastatic potential and therapeutic intervention. This ex vivo system supports mechanistic de-risking by allowing real-time assessment of tumor cell adaptation, survival, and proliferation in a three-dimensional microenvironment. It enhances predictive confidence in target validation and lead identification by linking phenotypic outcomes to drug effects in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing how metastatic osteosarcoma cells adapt and survive in the lung microenvironment.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of tumor cell behavior in a relevant tissue context.
- Strategic Value: Facilitates target confidence by linking genetic or pharmacological perturbations to measurable changes in metastatic colonization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative image-based readouts of lesion area and number, enabling standardized assessment of metastatic growth across experimental conditions.
- Operational Value: Compatible with widefield and confocal fluorescence microscopy, allowing scalable imaging workflows for compound screening.
- Strategic Value: Supports assay readiness by generating reproducible, quantifiable outputs that can be used to evaluate anti-metastatic therapeutics over time.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by using murine lung tissue to model the osteosarcoma metastatic niche, enabling study of microenvironmental interactions.
- Operational Value: Permits longitudinal imaging to assess dynamic changes in tumor growth and response to intervention.
- Strategic Value: Connects discovery-phase findings to preclinical validation by providing a bridge between in vitro models and in vivo metastasis.
Pipeline & Workflow Integration
The PuMA model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment, offering a platform to prioritize candidates based on metastatic phenotype.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling visualization of how osteosarcoma cells colonize lung tissue and respond to microenvironmental cues.
- Screening: Delivers quantitative outputs such as metastatic lesion area, which can be measured and compared across treatment groups using image analysis tools like ImageJ.
- Analytics: Generates measurable data on tumor cell proliferation and spatial distribution, supporting statistical analysis to confirm differences between high and low metastatic lines.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by using intact lung explants to study gene function, promoter activity, and subcellular structures in metastatic cells.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform for evaluating multiple therapeutic candidates or genetic modifiers in a consistent, standardized system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in metastatic potential through direct, visual confirmation of colonization.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized tissue preparation, imaging parameters, and quantification protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, mechanistic insight into anti-metastatic efficacy, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to inhibit colonization in a disease-relevant lung microenvironment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine tissue dissection, tracheal cannulation, and agarose insufflation to maintain lung integrity.
- Depends on access to fluorescence microscopy systems (widefield or confocal) and image analysis software such as ImageJ for quantification.
- Necessitates standardization across teams in tissue slicing, plating, and imaging conditions to ensure comparability of results.
- Involves adaptation considerations when applying the model to different cell lines or genetic backgrounds, particularly in defining single-cell thresholds for particle analysis.
- Limited by the technical complexity of lung dissection and insufflation, which may affect throughput and require training for consistent execution.
