Name: Praktyczne rozważania w badaniu przerzutowej kolonizacji płuc w kostniakomięsaku przy użyciu testu przerzutów do płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Poznaj metodę PuMA do wizualizacji wzrostu komórek kostniakomięsaka w płucach myszy. Technika ta pozwala badać adaptację i proliferację komórek nowotworowych w trójwymiarowym mikrośrodowisku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Dr. Arnulfo Mendozie, który przeprowadził szkolenie z techniki PuMA. Ponadto chcielibyśmy podziękować dr Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH) i Samowi Aparicio (BC Cancer Agency) za udostępnienie swoich mikroskopów w trakcie tego badania. Badania te były wspierane (częściowo) przez Intramural Research Program National Institutes of Health, Center for Cancer Research, Pediatric Oncology Branch. M.M.L. był wspierany przez National Institutes of Health Intramural Visiting Fellow Program (nagroda 15335), a obecnie jest wspierany przez stypendium Joan Parker w badaniach nad przerzutami. P.H.S. jest wspierany przez British Columbia Cancer Foundation.

Wszystkie protokoły na zwierzętach, z których uzyskano dane obrazowe, zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt National Cancer Institute, National Institutes of Health. Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt omówione i przedstawione w artykule wideo zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej.
1. Przygotowanie komórek nowotworowych do iniekcji i materiałów do modelu PuMA
UWAGA: Ilość roztworów i komórek wystarczy na 1 mysz. W razie potrzeby zwiększ skalę, jeśli w badaniu wykorzystano więcej myszy. Przepisy dotyczące pożywek znajdują się w Tabeli 1 i Tabeli 2.
<ol>
	<li>Podgrzej 5 ml A-Media w stożkowej probówce o pojemności 15 ml w łaźni wodnej o temperaturze 37 oC.</li>
	<li>Rozpuść 1,2% niskotopliwy roztwór agarozy (w sterylnej wodzie) za pomocą laboratoryjnej kuchenki mikrofalowej.</li>
	<li>Przenieść 5 ml stopionej agarozy do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i przechowywać w cieple w łaźni wodnej o temperaturze 37 oC. Upewnij się, że stopiona agaroza ma temperaturę 37 oC i płyn przed etapem wdmuchiwania płuc.</li>
	<li>Wstępnie schłodzić 30 ml PBS klasy hodowli komórkowej uzupełnionej 1X długopisem/paciorkowcami w wiadrze na lód.</li>
	<li>W jednym dołku na 6-dołkowej płytce namocz wstępnie gąbkę żelatynową w 1,5 ml pożywki z roztworem B. Gąbka będzie kotwicą podporową dla plastrów płuc.</li>
	<li>Upewnij się, że komórki OS są zlewające się w około 70-90% w dniu zabiegu. Nie używaj komórek, które nadmiernie się zlewają lub jeśli podłoże jest pomarańczowe do żółtego, ponieważ komórki są zwykle zestresowane i mają w tym momencie zmniejszoną żywotność. W przypadku linii komórkowych kostniakomięsaka, MNNG i HOS, 5 x 105 w objętości 100 μl zostanie użyte do wstrzyknięcia do żyły ogonowej 1 myszy. Odpowiednio przeskaluj, jeśli do badania użyto więcej myszy.</li>
	<li>Zbierz komórki nowotworowe za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA (3 ml dla kolby T75 lub 2 ml w 10 cm naczyniu hodowlanym). Kiedy komórki zaczną odrywać się od płytki, zneutralizuj trypsynę-EDTA za pomocą kompletnego podłoża. Odwiruj komórki i spłucz raz PBS klasy hodowli komórkowej. Zawiesić osad w 5 ml PBS.</li>
	<li>Zliczanie komórek należy wykonywać metodami standardowymi. Najlepiej jest wykonać więcej zawiesiny komórek niż jest to faktycznie potrzebne, ponieważ utrata zawiesiny komórek często występuje podczas pobierania igły i nieudanych prób wstrzyknięcia.</li>
	<li>Wykonać test wykluczający trypan-błękit na próbce zawiesiny komórek, aby ocenić żywotność komórek. Kontynuuj tylko wtedy, gdy komórka wykazuje 90% lub wyższą żywotność.</li>
	<li>Wstrzyknąć 5 x 105 komórek w objętości 100 μl. Aby przygotować nadmiar 2X tej ilości, 1 x 106 komórek należy odwirować i ponownie zawiesić w 0,2 ml HBSS.</li>
	<li>Umieść zawiesinę komórek w wiaderku z lodem, przygotowując myszy do wstrzyknięcia.</li>
</ol>
2. Iniekcja do żyły ogonowej i wdmuchiwanie płuc
UWAGA: Ilość roztworów i komórek w tej sekcji wystarczy dla 1 myszy. W razie potrzeby zwiększ skalę, jeśli w badaniu wykorzystano więcej myszy. Wykaz sprzętu, materiałów i narzędzi chirurgicznych używanych w poniższych krokach znajduje się w Tabeli 3 i Tabeli 4.
<ol>
	<li>Ogrzej samicę myszy (w wieku 6-8 tygodni) pod lampą grzewczą przez 5 minut, aby bardziej uwidocznić żyłę ogonową. W przypadku mysich komórek K7M2 lub K12 użyj myszy Balb / c; w przypadku ludzkich komórek MG63.3, MG63, MNNG i HOS należy użyć myszy z ciężkim złożonym niedoborem odporności.</li>
	<li>Upewnij się, że zawiesina komórek jest jednolita, delikatnie potrząsając rurką. Ostrożnie pobrać zawiesinę komórek do strzykawki o pojemności 1 ml bez igły. Owinąć strzykawkę igłą o rozmiarze 27. Upewnij się, że skos igły znajduje się po tej samej stronie, co oznaczenia objętości na igle.</li>
	<li>Umieść mysz w uchwycie i przetrzyj ogon wacikiem nasączonym alkoholem.</li>
	<li>Przystąp do wykonania iniekcji do żyły ogonowej i wstrzyknij 100 μl zawiesiny komórek. 5 minut po wstrzyknięciu umieść mysz w komorze CO2 i rozpocznij standardową procedurę operacyjną eutanazji (zgodnie z zaleceniami instytucjonalnej komisji ds. opieki nad zwierzętami). Zwichnięcie szyjki macicy nie powinno być stosowane jako środek eutanazji, ponieważ zabieg uszkodzi tchawicę.</li>
	<li>Po ueutanazji myszy rozpocznij przygotowanie okapu z przepływem laminarnym do wdmuchiwania płuca myszy roztworem agarozy/pożywki A. W okapie z przepływem laminarnym ustaw obszar roboczy ze sterylną podkładką. Na tej podkładce umieścisz wysterylizowane narzędzia, cewnik dożylny, zestaw do przedłużania kroplówek i aparat do perfuzji grawitacyjnej (patrz rysunek uzupełniający 1).</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej grzbietowej. Sterylnymi małymi nożyczkami ostrożnie wypreparuj mostek, aby odsłonić jamę klatki piersiowej. Należy uważać, aby nie przebić płuca, ponieważ do wdmuchiwania płuc zostanie użyty roztwór agarozy/A-media.</li>
	<li>Podczas wycinania mostka należy przeprowadzić sekcję obok wlotu klatki piersiowej po obu stronach tchawicy. Odsłoń tchawicę, wycinając otaczającą tkankę miękką.</li>
	<li>Kankalować tchawicę za pomocą cewnika dożylnego o rozmiarze 20. Luźno zawiąż węzeł chirurgiczny za pomocą sterylnego szwu katgutowego wokół kaniulowanej tchawicy.</li>
	<li>Podłącz zestaw przedłużający dożylnie z cewnikowanej tchawicy do strzykawki 10 ml aparatu do perfuzji grawitacyjnej.</li>
	<li>Połącz wstępnie podgrzaną agarozę o temperaturze 37 oC (5 ml) i pożywkę A (5 ml) w mieszaninę w stosunku 1:1. Wlać płynny roztwór agarozy/pożywki A do strzykawki o pojemności 10 ml urządzenia do perfuzji grawitacyjnej. Przed insuflacją płuc roztworem agarozy/pożywki A-pożywki należy upewnić się, że cała długość zestawu przedłużającego została zagruntowana agarozą/pożywką A, zapobiegając w ten sposób niezamierzonemu wdmuchiwaniu próbek płuc powietrzem.</li>
	<li>Napełnij płuca roztworem agarozy/A-media, aż płuca zostaną całkowicie wdmuchiwane.</li>
	<li>Gdy płuco zostanie całkowicie wdmuchnięte, wyjmij kaniulę i mocno zawiąż węzeł chirurgiczny, aby zapobiec wyciekowi roztworu agarazy/A-media przez tchawicę.</li>
	<li>Przystąp do wycinania wyrywki (tchawicy, serca i płuca) z jamy klatki piersiowej. Należy uważać, aby nie przebić ani nie uszkodzić powierzchni płuc.</li>
	<li>Umieść oskubanie (w dowolnej orientacji) we wstępnie schłodzonych 30 ml PBS uzupełnionych 1X długopisem / paciorkowcami i pozwól agarozie/pożywce A zestalić się przez 20 minut.</li>
	<li>Za pomocą cienkich nożyczek i pęsety odetnij małe kawałki płuca (3 mm x 1,5 mm), jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1A. Mniejsze wycinki płuc można łatwo zobrazować za pomocą obiektywu 2,5X. W jednym warunku eksperymentalnym można pokroić wiele plasterków, zwykle 4-10 plasterków na grupę. 
	UWAGA: Dla każdej grupy eksperymentalnej umieść plastry płuc w oddzielnym dołku (płytka 6-dołkowa) zawierającym gąbkę żelatynową o wymiarach 2 x 2 cm wstępnie nasączoną pożywką B. Ilość pożywki na studzienkę powinna wynosić 1,5 ml. Zmieniaj nośnik co 2-3 dni. W przypadku badań nad lekami częstotliwość zmiany pożywki/leku jest określana przez użytkownika.</li>
</ol>
3. Szerokokątne obrazowanie fluorescencyjne wycinków płuc i analiza
UWAGA: W przypadku obrazowania fluorescencyjnego szerokokątnego, mniejsze plastry są wycinane (3 mm x 1,5 mm x 1 mm) w celu dopasowania sekcji płuc do 1 obrazu za pomocą obiektywu 2,5x.
Akwizycja obrazu pod mikroskopem fluorescencyjnym o szerokim polu:
<ol>
	<li>Wycinki płuc są zwykle obrazowane po 0, 3, 7 i 14 dniach po wstrzyknięciu. W sterylnym środowisku szafki biologicznej ostrożnie przenieś plastry płuc z gąbek żelatynowych do sterylnego okrągłego naczynia o średnicy 35 mm ze szklanym dnem. Uważaj, aby usunąć nadmiar płynu z wycinka płuca, ponieważ nadmiar płynu będzie działał jak lustro i odbijał światło fluorescencyjne pochodzące z komórek nowotworowych.</li>
	<li>Ułóż plastry płuc w podobny sposób przedstawiony na <silna klasa="xfig">Rysunek 1A. Każda kolumna reprezentowałaby inny warunek eksperymentalny. Uważaj, aby nie zanieczyścić krzyżowo płuc pęsetą. Spłucz 70% etanolem i wysusz przed kontaktem z plastrami płuc z innej grupy eksperymentalnej.</li>
	<li>Zoptymalizuj parametry obrazowania (tj. wzmocnienie, przesunięcie, czas ekspozycji, binning), aby zapewnić najlepszy kontrast między fluorescencyjnymi komórkami nowotworowymi a tłem tkanki płucnej w grupie kontrolnej (nośnik nieleczony). Użyj tych samych parametrów z grupy kontrolnej, aby zobrazować grupy eksperymentalne. Zapisz jako format obrazu tiff.</li>
	<li>Aby uzyskać odniesienie do skali, zrób cyfrowe zdjęcie mikrometru przy tym samym obiektywie.</li>
	<li>Ponieważ autofluorescencja płuc zmienia się w czasie, parametry obrazowania muszą być dostosowywane do płuc kontrolnych podczas każdej sesji obrazowania. Parametry obrazowania dla jednej sesji niekoniecznie muszą być optymalne dla kolejnych sesji obrazowania.</li>
</ol>
Analiza obrazu: 
UWAGA: Poniższe kroki przetwarzania obrazu są wykonywane za pomocą pakietu oprogramowania ImageJ 1.51h 17.
<ol>
	<li>Otwórz plik obrazu w ImageJ (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
	<li>Odejmij tło: Przetwarzaj > Odejmij tło > Promień toczącej się piłki (zacznij od 50 pikseli), odznacz "Jasne tło" (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3B).</li>
	<li>Konwertuj obraz do formatu 8-bitowego: Typ > obrazu > 8-bitowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C).</li>
	<li>Ustaw jednostki na piksele: Obraz > Wpisz "Piksele" w Jednostce długości, wprowadź 1 w "Szerokość pikseli", "Wysokość piksela", "Głębokość woksela". Zaznacz pole "Globalne", aby zastosować do kolejnych obrazów.</li>
	<li>Za pomocą narzędzia Zaznaczanie wielokątów obrysuj kształt całego wycinka płuc i określ obszar (piksel2) całego wycinka płuca. Wartość ta zostanie wykorzystana do obliczenia procentowego obciążenia guzem płuc.</li>
	<li>Obraz progowy: Obraz > Dostosuj próg > > podświetl "Domyślny" i "Czarno-biały" > użyj suwaka, aby ustawić próg obrazu w taki sposób, aby większość komórek nowotworowych była dokładnie podświetlona. Naciśnięcie przycisku "Zastosuj" spowoduje wyświetlenie czarno-białego obrazu, na którym płuco jest całe czarne, a zmiany fluorescencyjne są białe (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3D). Naciśnięcie przycisku "Zastosuj" po raz drugi spowoduje odwrócenie obrazu, na którym wszystkie struktury fluorescencyjne są teraz czarnymi kształtami (<silna klasa="xfig">Rysunek 3E).</li>
	<li>Kwantyfikacja liczby i kształtu zmian chorobowych: 
	Analizuj > ustaw pomiary > zaznacz "Obszar". Odznacz wszystkie inne pola. 
	Analizuj cząstki > rozmiar (piksel2): 0-nieskończoność reprezentuje zakres kształtów, które zostanie wyliczony przez ImageJ. Empirycznie określ najmniejszą zmianę, która jest uważana za pojedynczą komórkę nowotworową na obrazach nośników dnia 0. Użyj obszaru tej pojedynczej komórki nowotworowej jako dolnego limitu dla pozostałych obrazów w zestawie danych. W przypadku pracy przedstawionej w tym artykule jako dolną granicę ustawiono 11 pikseli2. W przypadku pracy przedstawionej w przykładzie wideo jako dolny limit ustawiono 24 piksele2. Pozostaw zakres "Cyrkularność" jako 0-1. "Pokaż" można ustawić na "Nic". Alternatywnie, jeśli wybrano opcje "Pokaż" i "Kontury", generowany jest rysunek wszystkich konturów kształtów. Zaznacz "Wyświetl wyniki", aby wyświetlić osobne okno pomiarów. Opcjonalnie zaznaczenie pola "Dodaj do menedżera" spowoduje zapisanie wszystkich kształtów określonych ilościowo w menedżerze ROI, które można zapisać do wykorzystania w przyszłości. Po naciśnięciu OK pojawi się okno "Wyniki" zawierające wszystkie wyliczone kształty i pomiary powierzchni (<silna klasa="xfig">Rysunek 3F).</li>
	<li>Skopiuj i wklej dane z okna "Wyniki" do arkusza kalkulacyjnego. Użyj funkcji matematycznej SUMA w programie Excel, aby zsumować wszystkie obszary zmian przerzutowych dla tego konkretnego wycinka płuca. Aby ocenić procentowe obciążenie guzem płuca w wycinku płuca, podziel sumę obszarów zmian przerzutowych przez całkowitą powierzchnię wycinka płuca. Ten parametr jest również znany jako ułamek powierzchni (AA), który jest szczegółowo opisany przez Underwooda 18. 
	Obciążenie guzem płuc = Suma obszarów zmian przerzutowych/całkowita powierzchnia wycinka płuca</li>
	<li>Oblicz obciążenie guzem płuc dla pozostałych odcinków płuc w grupie kontrolnej i pozostałych grupach. Wykreśl średnie obciążenie guzem płuc na grupę w ciągu 0, 3, 7 i 14 dni. Pokazano reprezentatywne szerokokątne obrazy fluorescencyjne ludzkich komórek OS o wysokim i niskim przerzutach rosnących w modelu PuMA w progresywnych punktach czasowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A). Pokazano wykres liniowy przedstawiający zmianę krotności (znormalizowanej do dnia 0) procentowego obciążenia guzem z przerzutami w czasie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4B).</li>
</ol>
4. Konfokalne obrazowanie fluorescencyjne modelu PuMA
UWAGA: W przypadku obrazowania konfokalnego, przetwarzanie tkanek jest podobne do tego w poprzedniej sekcji, z wyjątkiem tego, że wycinane są większe wycinki płuc (pełne przekroje poprzeczne, grubość 1-2 mm), aby umożliwić obrazowanie większej liczby ROI.
Oznaczanie miąższu płuc za pomocą DAR4M:
<ol>
	<li>Zanurzyć plastry płuc w 10 μμM DAR4M (w HBSS) na 45 minut w temperaturze 37 °C. DAR4M znakuje reaktywne formy azotu w komórkach płuc.</li>
	<li>Po 45 minutach inkubacji przepłukać plastry płuc świeżym HBSS.</li>
	<li>Umieść plasterek płuca w okrągłym naczyniu o średnicy 35 mm ze szklanym dnem i umieść go w mikroskopie konfokalnym.</li>
	<li>Parametry obrazowania dla przykładowych obrazów pokazanych w Rysunek 5 są wymienione w Tabeli 5.</li>
	<li>Zdobądź stos Z dla interesującego Cię regionu. Użyj sugerowanej grubości warstwy Z do pobierania próbek Nyquista. Reprezentatywny film stosu 3D pokazujący zielone fluorescencyjne komórki systemu operacyjnego w tkance płucnej znakowanej DAR4M znajduje się w filmie 1 i filmie uzupełniającym 1.</li>
</ol>
Dla przykładowych obrazów konfokalnych pokazanych w Rysunek 5, sesja obrazowania była terminalna. Jeśli wymagane jest obrazowanie podłużne, zaleca się użycie konfokalnego mikroskopu LSM wyposażonego w 2 lub wiele fotonów do obrazowania, ponieważ istnieje mniej fotouszkodzeń żywych tkanek19,20. 
Obrazowanie mito-RFP z ekspresją komórek MG63 w modelu PuMA:
<ol>
	<li>Wykonaj protokół PuMA zgodnie z konspektem w krokach 1 i 2 przy użyciu komórek MG63 wyrażających konstrukcję mito-RFP.</li>
	<li>Umieść plasterek płuca w okrągłym naczyniu o średnicy 35 mm ze szklanym dnem i umieść go w mikroskopie konfokalnym.</li>
	<li>Parametry obrazowania dla przykładowych obrazów pokazanych w Rysunek 6 są wymienione w Tabeli 6. Reprezentatywny film stosu 3D przedstawiający zielone fluorescencyjne komórki systemu operacyjnego z mitochondriami z czerwoną fluorescencyjną mitochondriami znajduje się w filmie 2 i filmie uzupełniającym 2.</li>
</ol>

<ol><li>Khanna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+drug+development+path+that+targets+metastatic+progression+in+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma.</a> Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).</li>
<li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective%3A+The+right+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Perspective: The right trials.</a> Nature. 485 (7400), S58-S59 (2012).</li>
<li>Mendoza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metastasis+biology+and+therapy+in+real+time+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung.</a> J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).</li>
<li>Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+resistance+and+PKC+signaling%3A+distinguishing+features+of+high+and+low+metastatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells.</a> Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).</li>
<li>Lizardo, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+Glucose-Regulated+Protein+78+in+Metastatic+Cancer+Cells+Is+Necessary+for+Lung+Metastasis+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression.</a> Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).</li>
<li>Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPouliot%2C+N+%22Metastatic+Cancer%3A+Clinical+and+Biological+Perspectives%22">Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives</a>. , Landes Bioscience. Austin, Texas. (2012).</li>
<li>Cameron, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+progression+of+metastasis+in+lung%3A+cell+survival%2C+dormancy%2C+and+location+dependence+of+metastatic+inefficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency.</a> Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).</li>
<li>Morrow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+inhibition+mitigates+enhanced+mRNA+translation+associated+with+the+metastatic+phenotype+of+osteosarcoma+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo.</a> Clinical Cancer Research. , (2016).</li>
<li>Varghese, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+videomicroscopy+reveals+differential+effects+of+the+vascular-targeting+agent+ZD6126+and+the+anti-angiogenic+agent+ZD6474+on+vascular+function+in+a+liver+metastasis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model.</a> Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).</li>
<li>Khanna, C., Hunter, K. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/7085/128aafb639e92c1df8f0212bfe53757e9cbd.pdf">Modeling metastasis in vivo.</a> Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).</li>
<li>Welch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+considerations+for+studying+cancer+metastasis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo.</a> Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).</li>
<li>Somasekharan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YB-1+regulates+stress+granule+formation+and+tumor+progression+by+translationally+activating+G3BP1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1.</a> J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).</li>
<li>El-Naggar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+Activation+of+HIF1alpha+by+YB-1+Promotes+Sarcoma+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis.</a> Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).</li>
<li>MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+spread+and+micrometastasis+development%3A+quantitative+approaches+for+in+vivo+models%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models.</a> Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cancer+cell+extravasation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantification of cancer cell extravasation in vivo.</a> Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Underwood, E. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aUnderwood%2C+EE+%22Quantitative+stereology%22">Quantitative stereology</a>. , Addison-Wesley Pub. Co. (1970).</li>
<li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+optical+imaging+of+cancer+metastasis+using+multiphoton+microscopy%3A+a+short+review%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review.</a> Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).</li>
<li>Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+laser+scanning+microscopy+as+a+tool+for+Xenopus+oocyte+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research.</a> Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).</li>
<li>Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+Live+Imaging+of+Lung+Metastasis+and+Their+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment.</a> J Vis Exp. (108), e53741(2016).</li>
<li>Guha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+retrograde+signaling+induces+epithelial-mesenchymal+transition+and+generates+breast+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells.</a> Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).</li>
<li>Ren, L., Morrow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+Positively+selected+enhancer+elements+endow+osteosarcoma+cells+with+metastatic+competence%5BTitle%5D)+AND+%22.+Nat+Med%22%5BJournal%5D)"> Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence.</a> . Nat Med. , (2018).</li>
<li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+Metabolomics+uncovers+a+link+between+inositol+metabolism+and+osteosarcoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22+Oncotarget%22%5BJournal%5D)"> Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis.</a> Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).</li>
<li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+metastatic+phenotype+of+a+panel+of+established+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells.</a> Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Poniższy artykuł techniczny opisuje niektóre praktyczne aspekty modelu PuMA w badaniu kolonizacji płuc w OS. Niektóre krytyczne kroki w protokole, w których badacze powinni zachować szczególną ostrożność, obejmują:
a) Kaniulacja tchawicy. Tchawica może zostać łatwo uszkodzona podczas preparowania otaczających mięśni i tkanki łącznej. Ponadto igłę cewnika można łatwo przepchnąć przez tchawicę. Zwróć szczególną uwagę na to, jak skos igły wchodzi do tchawicy podczas wprowadzania kaniuli.
<p c...

Poprawa wyników dla pacjentów pediatrycznych z kostniakomięsakiem z przerzutami (OS) nadal pozostaje krytyczną, niezaspokojoną potrzebą kliniczną 1. Podkreśla to znaczenie opracowywania nowych terapii ukierunkowanych molekularnie. Konwencjonalne chemioterapeutyki, które są ukierunkowane na proliferację komórek nowotworowych, nie okazały się skuteczne w leczeniu choroby przerzutowej, a zatem nowe strategie muszą być ukierunkowane na sam proces przerzutowy 2. W niniejszym artykule omówiono praktyczne aspekty stosunkowo nowego typu modelu przerzutów do płuc ex vivo, testu przerzutów do płuc (PuMA) opracowanego przez Mendozę i współpracowników3, który stanowi przydatne narzędzie w odkrywaniu nowych czynników molekularnych w progresji przerzutów do płuc w OS 4,5. Zanim jednak przejdziemy dalej, rozsądnie byłoby pokrótce omówić kilka obecnych modeli przerzutów oraz to, w jaki sposób model PuMA oferuje kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnymi testami in vitro.
Większość eksperymentalnych modeli używanych do badania przerzutów składa się z systemów in vitro i in vivo, które podsumowują albo konkretny krok, albo kilka etapów kaskady przerzutów. Etapy te obejmują: 1) migrację komórek nowotworowych z guza pierwotnego, 2) wynaczynienie do pobliskich naczyń (krwi lub limfy) i tranzyt w krążeniu, 3) zatrzymanie w miejscu wtórnym, 4) wynaczynienie i przeżycie w miejscu wtórnym, 5) tworzenie mikroprzerzutów i 6) wzrost do unaczynionych przerzutów (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1). Modele in vitro przerzutów mogą obejmować dwuwymiarową (2D) migrację i trójwymiarowe (3D) testy inwazji Matrigel, które są szczegółowo analizowane w innym miejscu 6. W przypadku modeli in vivo dwa powszechnie stosowane systemy modelowe obejmują: 1) model spontanicznych przerzutów polega na tym, że komórki nowotworowe są ortotopowo wstrzykiwane do określonego typu tkanki w celu utworzenia lokalnego guza, który spontanicznie zrzuca komórki przerzutowe do odległych miejsc; 2) Eksperymentalny model przerzutów polega na tym, że komórki nowotworowe są wstrzykiwane do naczynia krwionośnego przed narządem docelowym. Na przykład wstrzyknięcie komórek nowotworowych do żyły ogonowej powoduje rozwój przerzutów do płuc5,7,8. Inne eksperymentalne modele przerzutów obejmują wstrzyknięcie komórek nowotworowych do śledziony lub żyły krezkowej, co powoduje rozwój przerzutów do wątroby9,10. Praktyczne rozważania dotyczące tych modeli in vivo zostały szczegółowo omówione przez Welch 11. Innym modelem in vivo wykorzystywanym do badania przerzutów w mięsakach dziecięcych jest model implantacji guza podtorebkowego nerki nerki, który powoduje miejscowe powstawanie guza i spontaniczne przerzuty do płuc 12,13. Bardziej wymagająca technicznie technika, taka jak wideomikroskopia przyżyciowa, może bezpośrednio wizualizować w czasie rzeczywistym interakcje między przerzutowymi komórkami rakowymi a mikrokrążeniem miejsca przerzutowego (np. płuc lub wątroby), zgodnie z opisem MacDonald14 i Entenberg15, lub wynaczynienia komórek rakowych w błonie kosmówkowo-omoczniowej, jak opisano przez Kim 16.
Model PuMA to ex vivo, eksplantat tkanki płucnej, zamknięty system hodowlany, w którym wzrost fluorescencyjnych komórek nowotworowych może być obserwowany długoterminowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przez okres miesiąca (zobacz Rysunek 2A). Model ten podsumowuje początkowe etapy kolonizacji płuc (kroki od 3 do 5) w kaskadzie przerzutowej. Niektóre główne zalety modelu PuMA w porównaniu z konwencjonalnymi modelami in vitro to: 1) daje on możliwość podłużnego pomiaru wzrostu przerzutowych komórek rakowych w mikrośrodowisku 3D, które zachowuje wiele cech mikrośrodowiska płuc in vivo <klasa sup="xref">3; 2) PuMA pozwala badaczowi ocenić, czy knockdown genu kandydującego lub leczenia farmakologicznego ma działanie przeciwprzerzutowe w kontekście mikrośrodowiska płuc 3D; 3) model PuMA jest elastyczny z wieloma typami platform mikroskopii fluorescencyjnej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B), takich jak szerokopolowa mikroskopia fluorescencyjna lub laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna, przykłady każdego z nich są pokazane odpowiednio w <silnej klasie = "xfig" > rysunek 2C i D. W tym artykule omówimy, jak wykorzystać model PuMA do uzyskania danych obrazowania podłużnego dotyczących przerzutowego wzrostu ludzkich komórek kostniakomięsaka o wysokiej i niskiej przerzutowości z ekspresją wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (eGFP), przy użyciu fluorescencji szerokokątnej o niskim powiększeniu. Omówiono również przykłady obrazowania barwnika fluorescencyjnego, który znakuje miąższ płuc, oraz reportera genetycznego białka czerwonofluorescencyjnego, który znakuje mitochondria w komórkach OS w modelu PuMA za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej laserowej.

<table><tbody><tr><td>Tabela 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki do hodowli komórkowych dla pożywek A, B-pożywki i pożywek kompletnych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MNNG-HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1547</td><td>wysoce przerzutowa linia komórkowa OS</td></tr><tr><td>HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td>słabo przerzutowa linia komórkowa OS</td></tr><tr><td>MG63.3</td><td>Laboratorium Amy LeBlanc (NCI)</td><td>N/A</td><td>wysoce przerzutowa linia komórkowa OS</td></tr><tr><td>MG63</td><td>ATCC</td><td>CRL-1427</td><td>słabo przerzutowa linia komórkowa OS</td></tr><tr><td>10X M199 media</td><td>Thermofisher</td><td>11825015</td><td>Podłoże bazowe dla pożywki A i B-pożywki</td></tr><tr><td>Woda destylowana (sterylizowana)</td><td>Thermofisher</td><td>15230-147</td><td>Składnik pożywki A i B-media</td></tr><tr><td>7,5% roztwór wodorowęglanu sodu</td><td>Thermofisher</td><td>25080094</td><td>Składnik A-media & B-media</td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma-Alrich</td><td>H6909</td><td>Składnik A-media & B-media</td></tr><tr><td>Octan retinolu - rozpuszczalny w wodzie</td><td>Sigma-Alrich</td><td>R0635-5MG</td><td>Składnik A-media & B-media</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna 10X skoncentrowany (10000 U/ml) roztwór</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td>Składnik A-pożywki & B-media, kompletne media.</td></tr><tr><td>Roztwór insuliny bydlęcej (10 mg / ml)</td> <td>Sigma-Alrich</td><td>I0516-5ML</td><td>Składnik A-media i B-pożywka</td></tr><tr><td>DMEM, wysoka zawartość glukozy</td><td>Thermofisher</td><td>11965092</td><td>Pożywka bazowa Complete</td></tr><tr><td>Podłoże L-glutamina (200 mM)</td><td>Thermofisher</td><td>25030081</td><td>Składnik pożywki kompletnej</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td> płodu <td></td><td>Thermofisher 16000044</td><td>Składnik pożywki Complete</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Buforowany fosforanem sól fizjologiczna</td><td>Thermofisher</td><td>14190144</td><td>Stosowany w hodowli komórkowej.</td></tr><tr><td>Hank' s Roztwór soli buforowych, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermofisher</td><td>14175095</td><td>Służy do ponownego zawieszenia osadu komórkowego przed wstrzyknięciem</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>Thermofisher</td><td>25200114</td><td>Stosowany w hodowlach komórkowych.</td></tr><tr><td>DAR4M</td><td>Enzo</td><td>ALX-620-069-M001</td><td>Służy do oznaczania miąższu płuc.</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Tabela 3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiały dla PuMA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 Confocal LSM</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Pionowy LSM konfokalny mikroskop</td></tr><tr><td>Zeiss 780 Konfokalny LSM</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Odwrócony mikroskop konfokalny LSM</td></tr><tr><td>Myszy SCID</td><td>Charles River</td><td>N/A</td><td>NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, kobieta, wiek 6-8 tygodni</td></tr><tr><td>GelFoam</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-9863</td><td>Stosowany jako podparcie dla skrawków tkanki płucnej.</td></tr><tr><td>SeaPlaque Agarose</td><td>Lonza</td><td>50100</td><td>Stosowany podczas wdmuchiwania płuc.</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml z igłą o rozmiarze 27 Fisherscientific</td><td></td><td>14-826-87</td><td>Służy do wstrzykiwania żyły ogonowej.</td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td>Służy do wdmuchiwania płuc.</td></tr><tr><td>Cewnik o rozmiarze 20</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2032CA</td><td>Stosowany podczas wdmuchiwania płuc.</td></tr><tr><td>Zestaw przedłużający Abbott IV (30", sterylny)</td><td>Medisca</td><td>8342</td><td>Używany podczas wdmuchiwania płuc.</td></tr><tr><td>Waciki nasączone alkoholem</td><td>BD</td><td>326895</td><td>Do wycierania żyły ogonowej przed wstrzyknięciem</td></tr><tr><td>Sterylne rękawice chirurgiczne</td><td>Fisherscientific</td><td>Różni się rozmiarem</td><td>Sceptyczne podawanie płuc myszy</td></tr><tr><td>Linijka 30 cm</td><td>Zszywki</td><td></td><td>Służy do wdmuchiwania płuc.</td></tr><tr><td>Podstawka podporowa do linijki</td><td>Pipette.com</td><td>HS29022A</td><td>Służy do wdmuchiwania płuc.</td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane ze szklanym dnem 35 mm</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td>Używane podczas obrazowania plastrów płuc</td></tr><tr><td>Chłonne podkładki z wodoodporną barierą przeciwwilgociową</td><td>VWR</td><td>56617-014</td><td>Służy do wykładania sterylnego obszaru roboczego w okapie biologicznym.</td></tr><tr><td>Catgut Zwykły wchłanialny szew</td><td>Braun</td><td>N/A</td><td>Służy do wiązania kaniulowanej tchawicy.</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Tabela 4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia chirurgiczne do PuMA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro nożyczki preparacyjne 3,5" proste ostre/ostre</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td>Do cięcia odcinków płuc</td></tr><tr><td>4" (10 cm) Długa ząbkowana, prosta, bardzo delikatna końcówka 0,5 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5132</td><td>Do manipulowania/przytrzymywania sekcji płuc.</td></tr><tr><td>4" (10 cm) Długa ząbkowana lekka krzywa końcówka 0,8 mm</td><td>Roboz</td><td>RS5135</td><td>Do manipulowania / przytrzymywania odcinków płuc.</td></tr><tr><td>kleszcze opatrunkowe do kciuka; Ząbkowane; Delikatny; 4,5" Długość; Szerokość końcówki 1,3 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-8120</td><td>Do ogólnego rozwarstwienia.</td></tr><tr><td>Kleszcze opatrunkowe do kciuków 4,5 "ząbkowane 2,2 mm Szerokość końcówki</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td>Do ogólnego rozwarstwienia.</td></tr><tr><td>Bardzo drobne mikronożyczki preparacyjne 3,5" proste ostre / ostre, ostrze 20 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5880</td><td>Do ogólnego rozwarstwienia.</td></tr><tr><td>Nożyczki Knappa; Prosty; ostry-; 27mm Długość ostrza; 4 "Całkowita długość</td><td>Roboz</td><td>RS-5960</td><td>Do ogólnego rozwarstwienia.</td></tr></tbody></table>

praktyczne rozważania w badaniu przerzutowej kolonizacji płuc w kostniakomięsaku przy użyciu testu przerzutów do płuc

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Test przerzutów do płuc (PuMA) to system eksplantacji płuc ex vivo i hodowli komórek zamkniętych, który pozwala badaczom badać biologię kolonizacji płuc w kostniakomięsaku (OS) za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Niniejszy artykuł zawiera szczegółowy opis protokołu i omawia przykłady uzyskiwania danych obrazowych dotyczących wzrostu przerzutów za pomocą platform mikroskopii fluorescencyjnej szerokopolowej lub konfokalnej. Elastyczność modelu PuMA pozwala naukowcom nie tylko badać wzrost komórek OS w mikrośrodowisku płuc, ale także oceniać efekty terapii przeciwprzerzutowych w czasie. Mikroskopia konfokalna pozwala na bezprecedensowe obrazowanie w wysokiej rozdzielczości interakcji komórek OS z miąższem płuca. Co więcej, gdy model PuMA zostanie połączony z barwnikami fluorescencyjnymi lub fluorescencyjnymi reporterami genetycznymi białek, naukowcy mogą badać mikrośrodowisko płuc, struktury komórkowe i subkomórkowe, funkcję genów i aktywność promotora w przerzutowych komórkach OS. Model PuMA stanowi nowe narzędzie dla badaczy kostniakomięsaka do odkrywania nowej biologii przerzutów i oceny aktywności nowych leków przeciwprzerzutowych, celowanych.

Wideopoleowa mikroskopia fluorescencyjna przy niskim powiększeniu
W przypadku szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej przekrojów płuc PuMA, reprezentatywne obrazy i dane ilościowe przedstawiono na Ryc. 2C oraz na Ryc. 4A i B. Zdolności do przerzutowania linii komórkowych o wysokim i niskim potencjale metastatycznym są wyraź...

Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu protokołu testu przerzutów do płuc (PuMA). Model ten pozwala naukowcom badać wzrost komórek kostniakomięsaka z przerzutami (OS) w tkance płucnej za pomocą szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.

Praktyczne rozważania w badaniu przerzutowej kolonizacji płuc w kostniakomięsaku przy użyciu testu przerzutów do płuc

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Ogólnym celem tego testu przerzutów do płuc jest bezpośrednia wizualizacja i badanie wzrostu komórek kostniakomięsaka z przerzutami w żywotnej tkance płucnej. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na naprawdę kluczowe pytania w dziedzinie przerzutów kostniakomięsaka. Na przykład, w jaki sposób komórki kostniakomięsaka z przerzutami adaptują się, przeżywają i namnażają w mikrośrodowisku płuc.Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na bezpośrednią wizualizację wzrostu komórek kostniakomięsaka z przerzutami w odpowiednim trójwymiarowym mikrośrodowisku. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z technicznymi etapami kaniulacji tchawicy i wdmuchiwania płuc. Iniekcja komórek nowotworowych do żyły ogonowej i eutanazja myszy odbywają się zgodnie ze standardowymi wytycznymi instytucjonalnymi.Po pięciu minutach umieść uśpioną mysz w pozycji leżącej grzbietowej na sterylnej podkładce w kapturze z przepływem laminarnym i za pomocą małych, sterylnych nożyczek ostrożnie wypreparuj mostek, mijając wlot klatki piersiowej po obu stronach tchawicy, bez nakłuwania płuc. Wypreparowanie wszystkich mięśni i tkanki łącznej otaczającej tchawicę jest niezbędne do udanej kanelacji. Następnie użyj cewnika dożylnego o rozmiarze 20, aby ostrożnie kaniuflować tchawicę i użyj sterylnego szwu katgutowego, aby luźno zabezpieczyć cewnik i tchawicę.Podłącz zestaw przedłużający kroplówkę z cewnika do 10-mililitrowej strzykawki aparatu do grawitacyjnej fuzji i wlej do strzykawki płynną agarozę o temperaturze 37 stopni Celsjusza zmieszaną z roztworem pożywki. Napełnij płuca roztworem agarozy, aż zostaną całkowicie wdmuchnięte. Następnie wyjmij kaniulę i mocno zawiąż szew, aby zapobiec wyciekowi roztworu agarozy.Ważne jest, aby podczas wdmuchiwania płuca pozostały nienaruszone. Odpowiednie wdmuchiwanie agarozy i późniejsze schłodzenie osunięcia utrzyma płuca w stanie rozszerzonym. Zbierz oskubanie, tchawicę, serce i płuco, uważając, aby nie przebić ani nie uszkodzić powierzchni płuca.Umieść tkanki w 30 mililitrach wstępnie schłodzonego PBS uzupełnionego antybiotykami i pozwól agarozie zestalić się. Umieść oskubanie na lodzie na 20 minut. Po 20 minutach za pomocą cienkich nożyczek i pęsety pokrój płuco na 3 x 1,5 milimetra kawałki i umieść plastry w indywidualnych dołkach 6-dołkowej płytki zawierającej 2 x 2-centymetrowe gąbki żelatynowe wstępnie namoczone w podłożu B.W dniu obrazowania ostrożnie przenieś plastry płuc z płytki 6-dołkowej do sterylnego okrągłego naczynia o szklanym dnie o średnicy 35 milimetrów w kolumnach zgodnie z grupą eksperymentalną. Następnie w mikroskopie fluorescencyjnym o szerokim polu wybierz obiektyw 2,5x i ustaw parametry obrazowania, aby zapewnić najlepszy kontrast między fluorescencyjnymi komórkami nowotworowymi a niefluorescencyjną tkanką tła w grupie próbek tkanek kontrolnych. Zobrazować wszystkie próbki przy użyciu tych samych parametrów, co dla tkanek kontrolnych.Jeśli oprogramowanie nie jest skalibrowane na wadze, zobrazuj mikrometr przy użyciu tego samego obiektywu, co tkanka płucna, aby uzyskać odniesienie do skali, i zapisz wszystkie obrazy jako pliki tif. Po uzyskaniu wszystkich obrazów, aby przeanalizować obrazy w ImageJ, otwórz pierwszy plik. Użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów, aby obrysować cały wycinek płuca w celu określenia obszaru całego wycinka płuca.Wybierz proces i odejmij tło. Ustaw promień toczącej się kuli na wartość początkową 50 pikseli. Wartość ta będzie zależała od stopnia fluorescencji tła i powinna być zoptymalizowana dla każdego zestawu danych.Upewnij się, że odznaczyłeś jasne tło. Wybierz obraz i typ, 8-bitowy, następnie obraz i właściwości, wprowadź piksele. W polu Jednostka długości wprowadź wartość 1 dla szerokości piksela, wysokości piksela i głębokości wokseli.Następnie zaznacz opcję globalne, aby zastosować te parametry do wszystkich kolejnych obrazów. Następnie wybierz obraz, a następnie dostosuj, a następnie próg. Podświetl domyślne i czarno-białe, a następnie użyj suwaka, aby ustawić próg obrazu, aby większość komórek nowotworowych była dokładnie podświetlona.Kliknij przycisk Zastosuj jeden raz, aby zmienić kolor płuc na, a zmiany fluorescencyjne na białe. Następnie kliknij Zastosuj po raz drugi, aby odwrócić obraz, tak aby wszystkie struktury fluorescencyjne zmieniły kolor na. Aby określić ilościowo liczbę i kształt zmian, wybierz opcję Analizuj i ustaw pomiary, a następnie sprawdź obszar.Odznacz wszystkie inne pola. Następnie wybierz opcję analizuj cząstki i w polu rozmiar użyj obszaru najmniejszej zmiany określonej jako pojedyncza komórka przez ImageJ, aby ustawić zakres kształtów, które program wyliczy. Użyj obrazu z grupy nośników dnia zero, aby wybrać najmniejszy obszar, który jest uważany za pojedynczą komórkę nowotworową.Po ustawieniu dolnego limitu kliknij przycisk OK. Pojawi się okno wyników zawierające wszystkie wyliczone kształty i pomiary powierzchni. Następnie skopiuj i wklej dane z okna wyników do arkusza kalkulacyjnego i użyj funkcji matematycznej sumy, aby dodać wszystkie obszary zmian przerzutowych dla tego konkretnego wycinka płuca.Skłonności przerzutowe do linii komórkowych o wysokich i niskich przerzutach są wizualnie widoczne w postępujących punktach czasowych. Mówiąc dokładniej, te obrazy mikroskopowe pokazują, jak wysoce przerzutowe komórki są w stanie kolonizować płuca bardziej efektywnie niż linie komórkowe o niskich przerzutach. Analiza obrazu, kwantyfikacja i analiza statystyczna danych obrazowych potwierdza, że wysoce przerzutowe komórki nowotworowe mogą skutecznie kolonizować tkankę płucną.Podczas gdy niskie komórki przerzutowe nie mogą w ogóle rosnąć. Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna o dużym powiększeniu umożliwia wizualizację komórek miąższu płuc z dużą szczegółowością przestrzenną w porównaniu z komórkami nowotworowymi wykazującymi ekspresję EGFP. Jak również ułatwia analizę struktur subkomórkowych, takich jak te mitochondria.W zależności od liczby użytych myszy, technika ta może zostać wykonana w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tego zabiegu należy pamiętać o pracy z czystym, sterylnym sprzętem chirurgicznym. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad rakiem do zbadania progresji przerzutów w płucach myszy.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak testy hodowli komórkowych in vitro i western blot, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące wpływu knockdownu genu lub leczenia farmakologicznego na komórki rakowe. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać test przerzutów do płuc. Nie zapominaj, że praca z ludzkimi komórkami rakowymi może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak praca w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego.

practical-considerations-studying-metastatic-lung-colonization

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy artykuł opisuje procedury eksperymentalnego testu przerzutowania, który jest wykorzystywany do określania potencjału metastatycznego ludzkich linii komórkowych raka.

Test eksperymentalny przerzutowania

Nowy protokół opisany w niniejszym badaniu umożliwia selekcyjne wykrywanie przerzutów do płuc z rozdzielczością pojedynczych komórek u myszy poprzez połączenie perfuzji i fiksacji płuc in-situ oraz barwienia X-Gal komórek nowotworowych znakowanych genem lacZ.

Ulepszona wizualizacja przerzutów do płuc w rozdzielczości pojedynczych komórek u myszy poprzez połączoną perfuzję in-situ tkanki płucnej i barwienie X-Gal komórek nowotworowych znakowanych lacZ

Ten manuskrypt opisuje metodę ilościowego określania akumulacji komórek nowotworowych w płucach w zwierzęcym modelu przerzutów nowotworowych.

Test rekrutacji komórek nowotworowych płuc

Ta praca wstępnie ustawia zaawansowany protokół do dokładnej oceny obciążenia guza poprzez detekcję zielonego białka fluorescencyjnego i sygnałów bioluminescencji, a także integrację ilościowej techniki wykrywania molekularnego.

Badanie potrójnie ujemnego raka piersi przy użyciu ortotopowego modelu raka piersi

Opisane podejście łączy eksperymentalne testy przerzutów do żył ogonowych z obrazowaniem żywych zwierząt in vivo, aby umożliwić monitorowanie w czasie rzeczywistym powstawania i wzrostu przerzutów raka piersi, a także ilościowe określenie liczby i wielkości przerzutów w płucach.

Łączne wykorzystanie testów przerzutów do żył ogonowych i obrazowania in vivo w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia kolonizacji przerzutowej raka piersi i obciążenia płuc

Dożylne wstrzykiwanie komórek rakowych jest często stosowane w badaniach nad przerzutami, ale obciążenie guzem przerzutowym może być trudne do analizy. W tym artykule demonstrujemy model przerzutów do iniekcji żyły ogonowej i uwzględniamy nowatorskie podejście do analizy wynikającego z przerzutowego obciążenia guzem płuc.

Analiza patologiczna przerzutów do płuc po bocznym wstrzyknięciu komórek nowotworowych do żyły ogonowej

Modele przerzutów do kości nie rozwijają przerzutów równomiernie ani ze 100% częstością. Bezpośrednie wstrzyknięcie do komórek nowotworowych kości może spowodować embolizację płuc. Przedstawiamy naszą technikę modelowania pierwotnych guzów kości i przerzutów do kości z wykorzystaniem implantacji przeszczepu guza litego do kości, prowadzącej do powtarzalnego wszczepienia i wzrostu.

Modelowanie pierwotnych guzów kości i przerzutów do kości z implantacją przeszczepu guza litego do kości

Tutaj opisana jest syngeniczna implantacja ortotopowa, po której następuje procedura amputacji kostniakomięsaka ze spontanicznymi przerzutami do płuc, która może być wykorzystana do badań przedklinicznych biologii przerzutów i rozwoju nowych terapii.

Syngeneiczny ortotopowy kostniakomięsak Sprague Dawley Rat Model z amputacją w celu kontrolowania częstości przerzutów

Obecny protokół opisuje wstrzykiwanie komórek do kostniakomięsaka kości piszczelowej w celu wygenerowania modeli myszy z ortotopowym kostniakomięsakiem i przerzutami do płuc.

Wstrzyknięcie komórek kostniakomięsaka piszczelowego w celu wygenerowania ortotopowego kostniakomięsaka i mysich modeli przerzutów do płuc

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Ten eksperymentalny protokół zapewnia stabilną, opłacalną i efektywną metodę, łączącą knockdown lncRNA z testami tworzącymi kolonie, aby ilościowo określić wpływ lncRNA na proliferację komórek kostniaraka.

Test formowania kolonii wykrywający zdolność proliferacji komórek osteosaraka LncRNA-knockdown

Poznaj metodę PuMA do wizualizacji wzrostu komórek kostniakomięsaka w płucach myszy. Technika ta pozwala badać adaptację i proliferację komórek nowotworowych w trójwymiarowym mikrośrodowisku.

Praktyczne rozważania w badaniu przerzutowej kolonizacji płuc w kostniakomięsaku przy użyciu testu przerzutów do płuc

Przeglądaj więcej filmów