Name: Produkcja i walidacja systemu Organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego ilościowego określania przezśródbłonkowej rezystancji elektrycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Poznaj metodę produkcji mikrofluidycznego chipu z zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego pomiaru rezystancji TEER w modelu bariery krew-mózg. Technika umożliwia badanie funkcji barierowej endotelium.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdecznie dziękujemy Johanowi Bomerowi za wykonanie formy i Mathijsowi Bronkhorstowi za owocne dyskusje i pomoc w reprezentacji danych.
To badanie zostało sfinansowane przez: SRO Biomedical Microdevices of L.I. Segerink, MIRA Institute for Biomedical Engineering and Technical Medicine, University of Twente; SRO Organs-on-Chips A.D. van der Meera, Instytut Inżynierii Biomedycznej i Medycyny Technicznej MIRA, Uniwersytet Twente; oraz VESCEL, ERC Advanced Grant dla A. van den Berga (grant nr 669768).

1. Wykonanie urządzenia organ-on-chip
<ol>
	<li>Wykonaj replikę formy z kanałami o określonej geometrii z PDMS, sporządzoną przy użyciu standardowych technik fotolitografii, a następnie uzyskaj elementy chipa mikrofluidycznego z PDMS.
	<ol>
		<li>Odważ około 27 g bazy PDMS oraz 2,7 g utwardzacza; stosunek mas musi wynosić 10:1. Ilość ta jest odpowiednia do przygotowania warstwy PDMS o grubości 3 mm na formie o średnicy 130 mm (5 cali). Dokładnie wymieszaj oba składniki.</li>
		<li>Odpowietrz mieszaninę w eksykatore przez około 45 min, aby usunąć pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>W tym czasie należy przygotować formę dla ciekłej mieszaniny PDMS, przyklejając przezroczystą taśmę wokół formy lub umieszczając formę w odpowiednim uchwycie do wafli.</li>
		<li>Wlej odgazowaną mieszaninę PDMS na formę. Jeśli w mieszaninie PDMS lub na powierzchni formy pozostały pęcherzyki powietrza, poddaj ją ponownemu odgazowaniu przez około 30 min.</li>
		<li>Utwardzać mieszaninę PDMS w piekarniku w temperaturze 60 &#176;C przez 4 h. Pozostawić do ostygnięcia.</li>
		<li>W dygestorium z przepływem laminarnym wyjmij utwardzony PDMS z formy; formę można natychmiast wykorzystać ponownie do przygotowania kolejnych replik z PDMS.</li>
		<li>Wyciąć replikę z PDMS na oddzielne górne i dolne części chipa, korzystając z linii cięcia wykonanych w PDMS.</li>
		<li>W górnych częściach wykonaj cztery otwory za pomocą ostrego biopsyjnika o średnicy 1 mm, aby stworzyć wloty i wyloty. Wykonaj nakłucie od wewnątrz na zewnątrz, aby zapobiec gromadzeniu się resztek PDMS wewnątrz chipa. Przykryj części chipa przezroczystą taśmą, aby zabezpieczyć je przed kurzem.</li>
		<li>Wytnij z wkładek Transwell kwadratowe fragmenty membran poliwęglanowych o boku około 3&#215;3 mm2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamontuj porowatą membranę szczelnie pomiędzy dwiema częściami z PDMS, aby złożyć dwuwarstwowe urządzenie zintegrowane z porowatą membraną. 
	UWAGA: Niniejszy protokół został opracowany na podstawie metody Griepa i wsp..19 oraz Chueh i wsp..26
	<ol>
		<li>Przygotuj zaprawę PDMS/toluen, używając 0,7 g bazy PDMS, 0,07 g utwardzacza oraz 540 &#181;L toluenu, co daje stosunek masowy 5:3. Dokładnie wymieszać zawartość moździerza za pomocą wstrząsarki wortex.</li>
		<li>Naniesienie metodą spin-coatingu 200 &#181;L zaprawy na szkiełko nakrywowe przy 1500 obr./min przez 60 s (z przyspieszeniem 1000 obr./min/s), aby uzyskać cienką, jednorodną warstwę zaprawy.</li>
		<li>Przenieś cienką warstwę zaprawy z szkiełka nakrywkowego na dolną i górną część chipa za pomocą wałka do tuszu. Umieść dolną część w naczyniu odpornym na temperaturę w piekarniku.</li>
		<li>Za pomocą pęsety zanurzyć krawędzie membrany w moździerzu pokrytym warstwą naniesioną metodą spin-coatingu, a następnie ostrożnie umieścić ją na środku dna.</li>
		<li>Ostrożnie nałóż górną część na dolną, zwracając uwagę na ich dopasowanie. 
		UWAGA: Nie wywierać nacisku na chip i nie przesuwać górnej części względem dolnej, aby zapobiec dostawaniu się zaprawy do kanałów i zapchaniu membrany.</li>
		<li>Zakryć wloty chipów przezroczystą taśmą, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu do wnętrza chipa, a następnie wypiekać je w temperaturze 60 &#176;C przez 3 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zintegrować elektrody w kanałach bocznych. 
	UWAGA: Niniejszy protokół został opracowany na podstawie publikacji Griepa i in..19 oraz Douville i wsp..18
	<ol>
		<li>Potnij drut platynowy na kawałki o długości około 2 cm. Oczyść je, zanurzając w acetonie na 30 min. Przepłucz wodą i etanolem, a następnie pozostaw do wyschnięcia.</li>
		<li>W dygestorium o przepływie laminarnym umieść chip na plastikowej płytce. Za pomocą pęsety wprowadź cztery platynowe druty do kanałów elektrod chipa, a następnie zegnij je w stronę płytki, aby umożliwić ich utrwalenie na niej w kolejnym kroku. Wprowadź druty na głębokość 0,7–1 mm do kanału hodowlanego, poza T-kształtne rozgałęzienie kanałów.</li>
		<li>Nanieść kroplę kleju utwardzanego promieniami UV do otworu kanału elektrody i pozwolić klejowi wypełnić kanał wokół elektrody pod wpływem sił kapilarnych.</li>
		<li>Włączyć lampę UV i utwardzić klej w momencie, gdy dotrze on do końca kanału elektrody. 
		Uwaga: Nie należy patrzeć bezpośrednio na źródło światła UV, ponieważ może to uszkodzić wzrok.</li>
		<li>Przymocuj cztery zintegrowane elektrody do plastikowejy szalki za pomocą dwuskładnikowego kleju epoksydowego. Pozwala to na łatwiejszą manipulację elektrodami podczas pomiarów, bez ryzyka ich wyrwania z układu.</li>
		<li>Przykryć płytki przezroczystą taśmą i wypiekać w temperaturze 60 &#176;C przez 2 h. Pozostawić do ostygnięcia i przechowywać w warunkach zapobiegających zapyleniu do momentu użycia. W ten sposób można je bezpiecznie przechowywać przez maksymalnie miesiąc.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla pochodnych komórek śródbłonka mózgu na chipie
<ol>
	<li>Powleczone chipy w celu promowania adhezji komórek.
	<ol>
		<li>Wypełnij oba kanały solą fizjologiczną buforowaną fosforanowo (PBS), aby je zwilżyć przed wprowadzeniem odczynników. Sprawdź pod mikroskopem, czy w kanałach znajdują się pęcherzyki powietrza. Jeśli tak, usuń je, przepłukując dodatkowym PBS.</li>
		<li>Wypełnij oba kanały 30 µL ludzkiej fibronektyny w stężeniu 20 µg/mL w PBS. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 3 godziny. Sprawdź obecność pęcherzyków powietrza i w razie potrzeby przepłucz kanały PBS, a następnie ponownie wypełnij roztworem fibronektyny.</li>
		<li>Przepłucz chipy pożywką do wzrostu komórek śródbłonka i inkubuj je w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze przez 2 h.</li>
		<li>Zmierz TEER pustych chipów zgodnie z opisem w kroku 3, aby upewnić się, że wszystkie elektrody są w bezpośrednim kontakcie z cieczą w kanałach. W pustych chipach typowe wartości TEER wynoszą 0-1 Ω cm2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zasiej komórki w górnym kanale.
	<ol>
		<li>Usuń pożywkę hodowlaną z kolby hodowlanej (powierzchnia hodowli 75 cm2) z konfluencyjną monowarstwą ludzkich komórek śródbłonka mikro naczyniowych mózgu (hCMEC/D3).</li>
		<li>Umyj komórki za pomocą PBS. Dodaj 2 mL 0,05% trypsyny-EDTA i inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2-5 minut, aż komórki odkleją się od kolby hodowlanej.</li>
		<li>Zneutralizuj trypsynę pożywką hodowlaną uzupełnioną o 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Policz komórki i oblicz całkowitą liczbę komórek w zawiesinie.</li>
		<li>W międzyczasie odwiruj komórki hCMEC/D3 przy 390 x g przez 5 min i usuń nadosad. </li>
		<li>Resuspenduj pellet komórkowy w odpowiedniej objętości pożywki do wzrostu komórek śródbłonka (EGM-2), aby uzyskać stężenie 5 x 106 komórek/mL. Pozwala to uzyskać gęstość zasiewu 2 x 105 komórek/cm2 w chipie.</li>
		<li>Powoli nanieś pipetą 30 µL dobrze wymieszanej zawiesiny komórkowej do górnego kanału, a następnie płynnym ruchem wyjmij pipetę z wlotu, wciąż wywierając nacisk.</li>
		<li>Sprawdź gęstość zasiewu pod mikroskopem. Należy uzyskać jednorodne rozmieszczenie komórek w całym górnym kanale.</li>
		<li>Inkubuj chipy w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 1 h. Wypłucz niezwiązane komórki pożywką do hodowli śródbłonka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymuj hodowlę śródbłonka na chipie.
	<ol>
		<li>Dwa razy dziennie wkładaj końcówki pipet wypełnione pożywką hodowlaną jako zbiorniki w wlotach i wymieniaj pożywkę wewnątrz chipa za pomocą przepływu grawitacyjnego. 
		UWAGA: Aby zapobiec przedostaniu się pęcherzyków powietrza do mikrokanałów i zniszczeniu warstwy komórek, upewnij się, że przed włożeniem końcówki do wlotu istnieje kontakt ciecz-ciecz między końcówką pipety a cieczą na górze chipa. Można to ułatwić, dodając małą kroplę w miejscu wlotu/wylotu przed włożeniem pipety.</li>
		<li>Dodaj również końcówki pipet jako zbiorniki w wylotach, aby zapobiec wysychaniu kanałów.</li>
		<li>Inkubuj chipy w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pomiary TEER na chipie
<ol>
	<li>Przygotować aparat do pomiaru TEER, składający się z wzmacniacza lock-in i obwodu kabla pomiarowego, zgodnie z opisem w pracy Van der Helm et al.16 Alternatywnie do tych pomiarów TEER opartych na impedancji można zastosować potencjostaty lub analizatory impedancji.</li>
	<li>Wyjąć chip z inkubatora i pozostawić go do osiągnięcia temperatury pokojowej przez co najmniej 10 min. Usunąć wszelkie ciecze z plastikowej szalki wokół elektrod, aby zapobiec zwarciu elektrod poza obszarem chipa.</li>
	<li>Zarejestrować widmo impedancji w zakresie od 200 Hz do 1 MHz dla każdej kombinacji dwóch elektrod, co daje 6 widm impedancji na chip w czasie zaledwie 5-10 min. Sprawdzić, czy widma impedancji mają oczekiwane wartości i kształty, aby zwalidować pomiar TEER, zgodnie z opisem w sekcji wyników.</li>
	<li>Po zakończeniu pomiaru umieścić chip z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.</li>
	<li>Przetworzyć uzyskane widma impedancji, aby wyznaczyć znormalizowaną wartość TEER.
	<ol>
		<li>Odczytać zmierzoną rezystancję <img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq1.jpg" /> pomiędzy elektrodami <img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq2.jpg" /> oraz <img alt="Równanie 3" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq3.jpg" />, zgodnie z oznaczeniami na Rysunku 2B i D, z plateau rezystancyjnego przy 10 kHz w odpowiadających im widmach impedancji.</li>
		<li>Obliczyć TEER, wykorzystując sześć zmierzonych rezystancji odpowiadających jednemu chipowi w jednym punkcie czasowym, stosując równanie z Rysunku 2G16: 
		<img alt="Równanie 20" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq20.jpg" /> 
		W powyższym równaniu <img alt="Równanie 4" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq4.jpg" /> oznacza powierzchnię hodowli, przez którą mierzono rezystancję, <img alt="Równanie 5" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg" /> to rezystancja bariery komórkowej i membrany, <img alt="Równanie 6" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq6.jpg" />, <img alt="Równanie 7" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq7.jpg" />, <img alt="Równanie 8" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq8.jpg" /> oraz <img alt="Równanie 9" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq9.jpg" /> to wartości rezystancji zmierzone przez barierę komórkową, a <img alt="Równanie 10" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq10.jpg" /> i <img alt="Równanie 11" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq11.jpg" /> to wartości rezystancji zmierzone w kanałach prostych.16 Równanie to zostało wyprowadzone z obwodu zastępczego przedstawionego na Rysunku 2C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odjąć wartość TEER próbki kontrolnej (blank) od wartości TEER we wszystkich punktach czasowych, aby uzyskać dynamikę zmian TEER w czasie.</li>
</ol>

<ol><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Van der Meer, A. D., Van den Berg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-chips%3A+breaking+the+in+vitro+impasse%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse.</a> Integr Biol. 4 (5), 461-470 (2012).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).</li>
<li>Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-on-a-Chip+microenvironment+induces+human+intestinal+cells+to+undergo+villus+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation.</a> Integr Biol. 5 (9), 1130-1140 (2013).</li>
<li>Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerotic+geometries+exacerbate+pathological+thrombus+formation+poststenosis+in+a+von+Willebrand+factor-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (4), 1357-1362 (2013).</li>
<li>Van der Helm, M. W., Van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., Van den Berg, A., Segerink, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organ-on-chip+technology+for+blood-brain+barrier+research%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+barriers%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research.</a> Tissue barriers. 4 (1), e1142493(2016).</li>
<li>Abbott, N. J., Dolman, D. M., Yusof, S., Reichel, A. Chapter 6. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/book/10.1007%2F978-1-4614-9105-7">Drug Delivery to the Brain Vol. 10 AAPS Advances in the Pharmaceutical Sciences Series</a>. Hammarlund-Udenaes, M., de Lange, E., Thorne, R. G. , Springer. New York. 163-197 (2014).</li>
<li>Odijk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+direct+current+trans-epithelial+electrical+resistance+in+organ-on-a-chip+microsystems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems.</a> Lab Chip. 15 (3), 745-752 (2015).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+Measurement+Techniques+for+In+Vitro+Barrier+Model+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems.</a> J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Brown, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recreating+blood-brain+barrier+physiology+and+structure+on+chip%3A+A+novel+neurovascular+microfluidic+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor.</a> Biomicrofluidics. 9 (5), 054124(2015).</li>
<li>Deosarkar, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Dynamic+Neonatal+Blood-Brain+Barrier+on+a+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Novel Dynamic Neonatal Blood-Brain Barrier on a Chip.</a> PLoS ONE. 10 (11), e0142725(2015).</li>
<li>Ferrell, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+bioreactor+with+integrated+transepithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+measurement+electrodes+for+evaluation+of+renal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+bioeng%22%5BJournal%5D)">A microfluidic bioreactor with integrated transepithelial electrical resistance (TEER) measurement electrodes for evaluation of renal epithelial cells.</a> Biotechnol bioeng. 107 (4), 707-716 (2010).</li>
<li>Kilic, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-on-a-chip+model+enables+analysis+of+human+neuronal+differentiation+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis.</a> Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).</li>
<li>Partyka, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+regulates+transport+in+a+compliant+3D+model+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress regulates transport in a compliant 3D model of the blood-brain barrier.</a> Biomaterials. 115, 30-39 (2017).</li>
<li>Van der Helm, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+quantification+of+transendothelial+electrical+resistance+in+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectr%22%5BJournal%5D)">Direct quantification of transendothelial electrical resistance in organs-on-chips.</a> Biosens Bioelectr. 85, 924-929 (2016).</li>
<li>Booth, R., Kim, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22422217">Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (mu BBB).</a> Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).</li>
<li>Douville, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+two-layered+channel+system+with+embedded+electrodes+to+measure+resistance+across+epithelial+and+endothelial+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+chemi%22%5BJournal%5D)">Fabrication of two-layered channel system with embedded electrodes to measure resistance across epithelial and endothelial barriers.</a> Anal chemi. 82 (6), 2505-2511 (2010).</li>
<li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BBB+ON+CHIP%3A+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li>
<li>Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+blood-brain+barrier+model+provides+in+vivo-like+barrier+properties+for+drug+permeability+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening.</a> Biotechnol Bioeng. , (2016).</li>
<li>Wang, J. D., Khafagy, E. -S., Khanafer, K., Takayama, S., El Sayed, M. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+Endothelial+Cells%2C+Pericytes%2C+and+Astrocytes+into+a+3D+Microfluidic+in+Vitro+Model+of+the+Blood%E2%80%93Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood–Brain Barrier.</a> Mol Pharm. 13 (3), 895-906 (2016).</li>
<li>Walter, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400515301672">A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers.</a> Sens Actuators B Chem. 222, 1209-1219 (2016).</li>
<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0969996109002083">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).</li>
<li>Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+the+blood-brain+barrier%3A+molecular+anatomy+and+possible+investigation+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches.</a> Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).</li>
<li>Weksler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).</li>
<li>Chueh, B. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leakage-free+bonding+of+porous+membranes+into+layered+microfluidic+array+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+chem%22%5BJournal%5D)">Leakage-free bonding of porous membranes into layered microfluidic array systems.</a> Anal chem. 79 (9), 3504-3508 (2007).</li>
<li>Golowasch, J., Nadim, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGolowasch%2C+J+%22Encyclopedia+of+Computational+Neuroscience%22">Encyclopedia of Computational Neuroscience</a>. Jaeger, D., Jung, R. , Springer. New York. 555-558 (2015).</li>
<li>Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance-based+cell+monitoring%3A+barrier+properties+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond.</a> Fluids Barriers CNS. 10 (5), (2013).</li>
<li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. -O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hCMEC%2FD3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule przedstawiono inżynierię urządzenia typu organ-on-chip oraz bezpośrednie określenie przezśródbłonkowego oporu elektrycznego (TEER) bariery komórkowej hodowanej w urządzeniu. Przedstawiona metoda integracji elektrod bez wyposażenia pomieszczeń czystych oraz bezpośredniego oznaczania TEER za pomocą czterech elektrod ma zastosowanie do każdego urządzenia typu organ-on-chip z dwoma komorami mikroprzepływowymi. Układ i geometria chipa mogą być dostosowane do wymagań przewidywanych eksperymentów, o ile cztery elektrody są oddzielone w dwóch komorach. Cztery elektrody można nawet wygodnie umieścić we wlotach istniejących chipów, pod warunkiem, że są one zamocowane na czas trwania sześciu pomiarów. Metoda klejenia bez wycieków może być zoptymalizowana dla różnych geometrii membran i kanałów poprzez zmianę stosunku PDMS do toluenu. Wyższa zawartość toluenu powoduje powstanie cieńszej warstwy zaprawy26 pokrytej wirowo i może być bardziej odpowiednia dla płytszych i węższych kanałów w częściach PDMS. Niższa zawartość toluenu skutkuje grubszą warstwą zaprawy26 i może być bardziej odpowiednia do zamykania grubszych membran między częściami PDMS.
Jak widać na schematycznych widmach impedancji na rysunku 2A i widmach eksperymentalnych na rysunkach 2E i 2F, na pomiary impedancji ma wpływ pojemność warstwy podwójnej na granicy faz elektroda-medium. Ze względu na mały rozmiar elektrod wewnątrz mikrokanałów, pojemność dwuwarstwowa może dominować nad rezystancyjnym plateau bariery komórkowej w widmach impedancji, komplikując kwantyfikację TEER. Aby temu zaradzić, elektrody można wprowadzić dalej do kanałów hodowlanych przed utrwaleniem. Zwiększy to powierzchnię elektrody wystawionej na działanie pożywki hodowlanej, a wraz z nią zwiększy się również pojemność podwójnej warstwy. Powoduje to przesunięcie nachylenia pojemnościowego na niższe częstotliwości, dzięki czemu płaskowyż rezystancyjny bariery komórkowej może być łatwiej rozpoznany i określony ilościowo. Chociaż rezystancja mierzonej ścieżki między dwiema elektrodami będzie się zmniejszać, nie wpłynie to na kwantyfikację TEER zgodnie z przedstawioną metodą.
Podczas pomiaru przez barierę komórkową możliwe jest, że nie można rozpoznać plateau dodatkowego oporu. Może to być wynikiem płynnego połączenia między dwoma kanałami, na przykład, jeśli membrana jest słabo zamknięta przez zaprawę, co prowadzi do zmierzonej ścieżki wokół bariery komórkowej. Ponadto na zewnątrz chipa może wystąpić mostek elektryczny, jeśli elektrody są połączone kroplą pożywki hodowlanej. Jest to zwykle połączone z niższą zmierzoną impedancją i można to rozwiązać, usuwając ten mostek pożywki hodowlanej. Wreszcie, jeśli nie ma plateau rezystancyjnego, a zmierzona impedancja jest o rzędy wielkości wyższa niż oczekiwano, może to oznaczać luźne połączenie w przewodzie elektrycznym lub w źródle zasilania.
W przyszłości fizjologiczne znaczenie obecnego BBB-on-chip może zostać zwiększone poprzez wystawienie komórek śródbłonka na naprężenia ścinające na poziomie fizjologicznym, co według doniesień sprzyja różnicowaniu BBB i zwiększa szczelność bariery i jest trudne do osiągnięcia w konwencjonalnych modelach in vitro . 29 Ponadto dolny kanał prezentowanego urządzenia zapewnia odpowiednią komorę dla komórek pochodzących z mózgu, które mają być hodowane wspólnie ze śródbłonkiem. Oczekuje się również, że zwiększy to funkcję bariery, a także umożliwi badanie złożonych interakcji między odpowiednimi typami komórek w warunkach patologicznych. 29
Podsumowując, opisane w tej publikacji urządzenie typu organ-on-chip może być wytwarzane przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego i zapewnia bezpośrednie pomiary TEER przy użyciu czterech zintegrowanych elektrod, które nie utrudniają wizualnej kontroli badanej warstwy komórkowej. Możliwość zastosowania tego urządzenia w dziedzinie narządów na chipach została wykazana poprzez naśladowanie BBB w tym chipie i monitorowanie TEER w okresie hodowli. Wiele innych narządów (barierowych) można naśladować, włączając inne odpowiednie typy komórek do tego chipa. Ponadto metodę pomiaru TEER można łatwo zastosować w innych dwóch urządzeniach typu organ-on-chip opartych na kompartmentach, aby uzyskać powtarzalne i miarodajne wartości TEER, które można porównać między urządzeniami i systemami.

Narządy na chipach szybko wyłaniają się jako nowa i obiecująca klasa modeli tkanek in vitro. 1 W tych modelach, komórki są hodowane w urządzeniach mikroprzepływowych, które są zaprojektowane w taki sposób, aby naśladowały fizjologiczne mikrośrodowisko tych komórek. 1,2 Skutkuje to bardziej realistycznym fizjologicznym lub patologicznym zachowaniem tych komórek, niż można oczekiwać od konwencjonalnych modeli in vitro o prostej konstrukcji i podstawowej funkcji. 3,5,6 Ponadto narządy na chipach zapewniają lepiej kontrolowane środowisko niż modele in vivo i mogą zawierać zarówno zdrowe, jak i chore tkanki pochodzenia ludzkiego, aby wiernie odwzorować zarówno ludzką fizjologię, jak i patologię. Niedawno podsumowane postępy w rozwoju barier krew-mózg na chipach (BBBs-on-chips) pokazują, że dziedzina ta szybko się do przodu. 7
Kolejną zaletą organów na chipach jest to, że umożliwiają one ciągłe monitorowanie w czasie rzeczywistym tkanki hodowanej wewnątrz urządzenia za pomocą mikroskopii, analiz biochemicznych on-line i zintegrowanych czujników. 1,2 Na przykład, pomiar przezśródbłonkowego lub transepitelialnego oporu elektrycznego (TEER) jest skuteczną metodą nieinwazyjnego monitorowania rozwoju i uszkodzenia tkanek tworzących barierę. 8,9,10 TEER to opór elektryczny na barierze komórkowej, a zatem wskazuje na integralność i przepuszczalność bariery. 10 W organach na chipach, bariery komórkowe są zazwyczaj hodowane na błonie, która oddziela dwa kanały płynowe, reprezentujące wierzchołkowe i podstawno-boczne przedziały tej tkanki barierowej. W takich układach pomiary TEER można wygodnie przeprowadzać za pomocą elektrod umieszczonych we wlotach i wylotach dwóch kanałów. 3,4,11,12,13,14,15 Jednak ręczne wkładanie i ponowne wkładanie elektrod może łatwo spowodować błędy umieszczenia, a tym samym zmiany mierzonej rezystancji, jak np. Różnice w oporności dłuższych lub krótszych ścieżek przez mikrokanały są znaczące w porównaniu z opornością bariery komórkowej. 16 Aby wyeliminować błędy ponownego wstawiania, zaproponowano urządzenia ze zintegrowanymi elektrodami. Jednak większość z tych zintegrowanych elektrod zasłania widok podczas inspekcji hodowli tkankowej17,18,19,20,21 i/lub wymagają specjalistycznych procesów w pomieszczeniu czystym do produkcji. 17,22
Urządzenie typu organ-on-chip opisane w tej publikacji, po raz pierwszy zastosowane we wcześniejszej publikacji,16 łączy stabilność zintegrowanych elektrod z widocznością mierzonej warstwy komórek i łatwą produkcją. Projekt i wykonanie tego chipa przedstawiono na Rysunek 1. Krótko mówiąc, urządzenie to składa się z dwóch części z polidimetylosiloksanu (PDMS) z odciskami kanałów, które są połączone ze sobą bez wycieków za pomocą membrany poliwęglanowej z porami 0,4 μm pomiędzy nimi. Cztery elektrody z drutu platynowego są wprowadzane i mocowane na miejscu za pomocą fotoutwardzalnego kleju daleko poza obszarem hodowli. Wszystkie te etapy produkcji można przeprowadzić przy użyciu ogólnego sprzętu laboratoryjnego, bez konieczności stosowania środowiska w pomieszczeniu czystym. Ponadto za pomocą tych czterech elektrod można wykonać sześć pomiarów impedancji, co pozwala na bezpośrednią izolację mierzonego TEER, niezależnie od rezystancji mikrokanałów prowadzących do przekroju poprzecznego, a tym samym minimalizuje wpływ niebiologicznych zmian w systemie, takich jak błędy (ponownego) wstawienia. 16
Aby pokazać możliwość zastosowania tego urządzenia i bezpośrednie pomiary TEER, bariera krew-mózg (BBB) została zreplikowana w tym chipie. Ta bariera biologiczna składa się z wyspecjalizowanych komórek śródbłonka i reguluje transport między krwią a mózgiem, aby zapewnić homeostazę mózgu. 23,24 Aby naśladować barierę krew-mózg, górny kanał urządzenia mikroprzepływowego został wyłożony ludzkimi komórkami śródbłonka mikrokrążenia mózgowego z linii komórkowej hCMEC/D3 (dzięki uprzejmości dostarczonej przez Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paryż, Francja). 25 Przedstawiona metoda jest jednak bardziej ogólnie stosowana do każdego urządzenia typu organ-on-chip z dwoma komorami, umożliwiając bezpośrednie określenie TEER za pomocą łatwo zintegrowanych elektrod.
W tym manuskrypcie najpierw opisany jest proces produkcji urządzenia typu organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami. Następnie wyjaśniona jest procedura wysiewu i hodowla komórek śródbłonka mózgu wewnątrz urządzenia, a także pomiary TEER na chipie. W sekcji wyników pokazane są reprezentatywne pomiary TEER i wyjaśnione jest przetwarzanie danych. Na koniec przedstawiono funkcję barierową BBB-on-chip, monitorowaną przez 3 dni, pokazującą możliwość zastosowania prezentowanego urządzenia i metod monitorowania TEER.

<table><tbody><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS) środek bazowy i utwardzacz: Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Magic tape</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji, średnica 1,0 mm</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31AA-P/25</td><td></td></tr><tr><td>Membrana poliwęglanowa, 0,4 i mikro; m wielkość porów</td><td>Corning</td><td>3401</td><td>Wycięty z wkładek hodowlanych Transwell</td></tr><tr><td>Toluen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Drut platynowy, 200 &mikro; średnica m</td><td>Klej utwardzany promieniami UV Alfa Aesar</td><td>10287</td><td></td></tr>: <tr><td>Norland Optical Adhesive 81</td><td>Norland Products</td><td>NOA 81</td><td></td></tr><tr><td>Klej epoksydowy: Loctite M-31 CL Hysol</td><td>Henkel</td><td>30673</td><td></td></tr><tr><td>hCMEC / D3 Ludzka</td><td></td><td></td><td>linia komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, uprzejmie dostarczona przez dr P.-O. Couraud, INSERM, Paryż, Francja</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna z ludzkiego osocza, 20 i mikro; g/ml</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial growth medium-2 (EGM-2)</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Endothelial basal medium-2 (EBM-2) uzupełnione EGM-2 SingleQuots</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0,05%</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma </td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>oven</td><td>Binder</td><td>9010-0190</td><td></td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa: Spin 150</td><td>Polos</td><td>SPIN150-NPP</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła UV, 365 nm przez 5 s przy 350 mW/cm2</td><td>Wyprodukowano we własnym zakresie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka: Wirówka Allegra X-12R</td> Inkubator <td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Binder</td><td></td><td>CB E2 150</td><td></td></tr><tr><td>Boxense</td><td>LocSense</td><td></td><td>Wzmacniacz blokujący z obwodem sondy, przeznaczony do pomiarów TEER na chipie</td></tr></tbody></table>

produkcja i walidacja systemu organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego ilościowego określania przezśródbłonkowej rezystancji elektrycznej

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Narządy na chipach, modele in vitro polegające na hodowli (ludzkich) tkanek wewnątrz urządzeń mikroprzepływowych, szybko się rozwijają i obiecują dostarczyć użytecznych narzędzi badawczych do badania ludzkiego zdrowia i chorób. Aby scharakteryzować funkcję barierową warstw komórkowych hodowanych wewnątrz urządzeń typu narząd na chipie, często mierzy się przezśródbłonkową lub przeznabłonkową oporność elektryczną (TEER). W tym celu elektrody są zwykle integrowane z chipem za pomocą metod mikroobróbki, aby zapewnić bardziej stabilne pomiary niż osiąga się to przy ręcznym wprowadzaniu elektrod do wlotów chipa. Jednak elektrody te często utrudniają wizualną kontrolę badanej warstwy ogniw lub wymagają kosztownych procesów produkcyjnych w pomieszczeniach czystych. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opisywane tutaj urządzenie zawiera cztery łatwe do zintegrowania elektrody, które są umieszczane i mocowane poza obszarem hodowli, co umożliwia kontrolę wzrokową. Za pomocą tych czterech elektrod można określić ilościowo rezystancję sześciu ścieżek pomiarowych, od których można bezpośrednio odizolować TEER, niezależnie od rezystancji mikrokanałów wypełnionych pożywką hodowlaną. Bariera krew-mózg została zreplikowana w tym urządzeniu, a jego TEER był monitorowany, aby wykazać możliwość zastosowania urządzenia. Układ ten, zintegrowane elektrody i metoda oznaczania TEER są powszechnie stosowane w narządach na chipach, zarówno do naśladowania innych narządów, jak i do włączenia do istniejących systemów narząd na chipie.

Schematyczne wyniki spektroskopii impedancyjnej mierzonej przez chip bez komórek (linia ciągła) oraz przez barierę komórkową (linia przerywana) przedstawiono na Ryc. 2A. Można zidentyfikować cztery główne obszary, z których każdy jest zdominowany przez konkretny element elektryczny. Poniżej około 1 kHz dominuje pojemność warstwy podwójnej na styku elektrody i pożywki hodowlanej, co objawia się ujemnym nachyleniem modułu impedancji oraz przesunięciem fazowym zbliżającym się do -90°. Częstotliwość, przy której dominuje pojemność warstwy podwójnej, zależy od powierzchni elektrody wystawionej na działanie pożywki. Plateau rezystancyjne powyżej 1 kHz (bez komórek) lub 100 kHz (z komórkami), z przesunięciem fazowym bliskim 0°, odpowiada rezystancji pożywki wewnątrz kanałów mikrofluidycznych (zależnie od długości kanału i powierzchni przekroju poprzecznego) oraz wewnątrz membrany (zależnie od porowatości i grubości). Podczas pomiaru przez barierę komórkową widoczne jest dodatkowe plateau rezystancyjne między 1 a 10 kHz, a także lokalne maksimum na wykresie fazowym. Obszar ten ma krytyczne znaczenie dla wyznaczania TEER, ponieważ obecność komórek na ścieżce pomiarowej powoduje wyraźny wzrost impedancji, dlatego określa się go mianem „obszaru zainteresowania” (region of interest). Dodatkowy spadek między 10 a 100 kHz odpowiada pojemności bariery komórkowej, która wynika z obecności elektrycznie izolujących lipidowych dwuwarstw błonowych i zależy od całkowitej powierzchni warstwy komórek.27 Granice tych obszarów, jak i wartości impedancji, zależą od badanego układu i zmieniają się m.in. w zależności od wymiarów kanałów, przewodności pożywki, położenia elektrody oraz rodzaju komórek. W celu pogłębienia wiedzy na temat teorii i praktyki spektroskopii impedancyjnej w odniesieniu do tkanek tworzących bariery zaleca się lekturę artykułu przeglądowego autorstwa Bensona et al.28
Reprezentatywne dane pomiarów TEER przedstawiono zarówno dla pustego chipa, jak i dla chipa z warstwą komórek śródbłonka mózgu hCMEC/D3 w Rycina 2E oraz 2Fodpowiednio. W skrócie, spektroskopię impedancyjną przeprowadzono, wykonując sześć pomiarów z użyciem czterech elektrod: dwa pomiary przez kanały wypełnione pożywką do hodowli komórkowej (linie ciągłe) oraz cztery pomiary przez kanały, membranę i – jeśli występowała – barierę komórkową (linie przerywane). Te sześć ścieżek pomiarowych można zidentyfikować w ekwiwalentnym obwodzie rezystancyjnym Rycina 2B, co wynika ze schematycznego przekroju poprzecznego (Rysunek 2C) oraz widok z góry (Rysunek 2D). Pomiary pustego chipa (Rysunek 2E) przedstawia typowy kształt widm impedancyjnych bez komórek, co zilustrowano w Rysunek 2APomiary przez barierę komórkową (linie przerywane w Rysunek 2F) przypominają typowe widma impedancyjne dla komórek w Rysunek 2ANależy zauważyć, że zarówno moduł impedancji, jak i przesunięcie fazowe zwiększają się w kierunku 1 MHz. Jest to typowa odpowiedź układu pomiarowego przy wysokich częstotliwościach i nie wynika z przebiegu eksperymentu.
Aby wyznaczyć TEER na podstawie tych eksperymentalnych widm impedancji, w pierwszej kolejności określa się zmierzony opór chipa, który stanowi sumaryczny opór warstwy komórkowej, kanałów i membrany. W tym celu wybrano odpowiednią częstotliwość odczytu w obszarze zainteresowania, która odpowiada lokalnemu maksimum na wykresie fazy z komórkami i wartości bliskiej 0° przesunięcia fazy bez komórek: 10 kHz. Mając sześć zmierzonych oporów przy 10 kHz, wyznaczonych pomiędzy czterema elektrodami, wartość TEER oblicza się bezpośrednio za pomocą równania przedstawionego na Rysunku 2F.
Aby wykazać, że przedstawione urządzenie nadaje się do wyznaczania TEER w układach organ-on-chip, wewnątrz chipa odtworzono barierę krew-mózg (BBB), a następnie monitorowano jej TEER przez 3 dni hodowli. Na Rysunku 3A przedstawiono średnią wartość TEER ± błąd standardowy średniej (SEM) dla czterech układów BBB-on-chip, co pozwoliło na uzyskanie plateau na poziomie 22 ± 1,3 Ω cm2, co jest porównywalne z wartościami TEER dla tej linii komórkowej raportowanymi w literaturze.29 Co więcej, po zakończeniu eksperymentu i barwieniu fluorescencyjnym jąder komórkowych zaobserwowano, że śródbłonek mózgowy utworzył ciągłą warstwę jednowarstwową wewnątrz urządzenia (Rysunek 3B). Barwienie immunofluorescencyjne białka połączeń ścisłych Zonula Occludens-1 (ZO-1) wykazało, że komórki śródbłonka mózgowego zachowały swój fenotyp specyficzny dla BBB i utworzyły kompleksy połączeń ścisłych.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Projekt i montaż urządzenia organ-on-chip z zintegrowanymi elektrodami. 
(A) Widok rozłożony chipa mikroprzepływowego, składającego się z górnej części z PDMS z kanałem górnym (TC), membrany (M) i dolnej części z PDMS z kanałem dolnym (BC). Cztery elektrody z drutu platynowego (E1-4) są włożone i zamocowane w kanałach bocznych. W kanale górnym, na membranie, hodowano komórki endotelialne mózgu hCMEC/D3 w celu odtworzenia BBB. (B) Zmontowany chip przymocowany do plastikowej płytki. Przedruk i adaptacja za zgodą Elsevier.16 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Reprezentatywne dane impedancyjne i wyznaczenie TEER. 
(A) Schematyczny widmo impedancji przedstawiający moduł impedancji (&#8486;) i przesunięcia fazowego (&#176;) w funkcji częstotliwości (Hz), typowy dla spektroskopii impedancji elektrycznej na chipach bez komórek (linia ciągła) oraz z komórkami (linia przerywana). Wyróżnia się cztery główne obszary, z których każdy jest zdominowany przez: pojemność warstwy podwójnej na elektrodach, oporność medium hodowlanego, oporność bariery komórkowej oraz pojemność błony komórkowej. &#34;obszar zainteresowania&#34; wskazuje miejsce, w którym można określić ilościowy udział warstwy komórkowej (czerwona strzałka). (B) Równoważny obwód rezystancyjny układu, przedstawiający rezystory górnego kanału R1 oraz R3, rezystory kanału dolnego R2 oraz R4 oraz rezystor bariery błony i EC Rm. (C) Schematyczny przekrój poprzeczny przedstawiający komórki śródbłonka (EC) hodowane w górnym kanale. (D) Schematyczny rzut z góry chipa BBB, przedstawiający konfigurację elektrod oraz obszar hodowli o wymiarach 0,25 mm2 przez który mierzona jest impedancja. (E) Reprezentatywne widma impedancyjne pustego chipa wypełnionego pożywką do hodowli komórkowych. (F) Reprezentatywne widma impedancji chipa, na którym hodowano komórki endotelialne mózgu hCMEC/D3 przez 3 dni. (G) Wzór do obliczenia TEER na podstawie pomiarów oporności pomiędzy wszystkimi sześcioma kombinacjami czterech elektrod. Przedrukowano i zaadaptowano za zgodą wydawnictwa Elsevier.16 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Reprezentatywny przebieg TEER w układzie BBB-on-chip. 
(A) Średni TEER ± błąd standardowy średniej (SEM) dla czterech układów BBB-on-chip w okresie hodowli trwającym trzy dni, osiągający plateau na poziomie 22 ± 1.3 Ω cm2 (średnia ± SEM). Dla porównania zamieszczono dane dla pustych chipów, wykazujące marginalną zmienność i odchylenia od 0 Ω cm2 w tym samym okresie w stosunku do zmienności i wartości TEER w chipach z komórkami. (B) Mikroskopia fluorescencyjna barwionych jąder wykazała ciągłą monowarstwę śródbłonka, zarówno na PDMS, jak i na membranie w miejscu wskazanym na wstawce. (C) Immunofluorescencja ujawniła obecność białka połączeń szczelnych Zonula Occludens-1, co wskazuje, że specyficzne dla BBB połączenia szczelne między komórkami są odpowiedzialne za zmierzone wartości TEER. Przedrukowano i zaadaptowano za zgodą Elsevier.16 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ta publikacja opisuje produkcję urządzenia typu organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego oznaczania oporu elektrycznego przezśródbłonka (TEER). W celu walidacji bariera krew-mózg została naśladowana wewnątrz tego urządzenia mikroprzepływowego i monitorowano jego funkcję bariery. Przedstawione metody integracji elektrod i bezpośredniego oznaczania ilościowego TEER mają ogólne zastosowanie.

Produkcja i walidacja systemu Organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego ilościowego określania przezśródbłonkowej rezystancji elektrycznej

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, jak wytwarzać i używać mikroprzepływowych chipów ze zintegrowanymi elektrodami do pomiarów przezśródbłonkowej lub transepitelowej rezystancji elektrycznej lub pomiarów TEER. Wykazano to za pomocą bariery krew-mózg w chipie mikroprzepływowym. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie narządów na chipach, umożliwiając bezpośredni pomiar funkcji barierowej, na przykład tkanki bariery krew-mózg za pomocą zintegrowanych elektrod.Główną zaletą naszej techniki jest to, że elektrody można łatwo zintegrować z systemami Organ-on-Chip, a wyniki tego można porównać między różnymi systemami. Implikacje tej technologii rozciągają się w kierunku zrozumienia funkcji bariery krew-mózg w zdrowiu i chorobie, odkrywania leków i medycyny spersonalizowanej. Chociaż metoda ta może być wykorzystana do uzyskania wglądu w funkcję bariery krew-mózg, może być również stosowana w kontekście innych systemów Organ-on-Chip, takich jak Lung-on-Chip i Gut-on-Chip.Aby rozpocząć tę procedurę, dokładnie wymieszaj 27 gramów środka bazowego PDMS i 2,7 grama utwardzacza. Następnie odgazowywać mieszaninę w eksykatorze przez około 45 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. W międzyczasie przygotuj formę na płynną mieszaninę PDMS, przyklejając przezroczystą taśmę wokół formy lub umieść formę w odpowiednim uchwycie na wafel.Wlej odgazowaną mieszaninę PDMS na formę. Następnie utwardź mieszaninę PDMS w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez cztery godziny, a następnie pozwól jej ostygnąć. W okapie z przepływem krzyżowym wyciągnij utwardzony PDMS z formy.Pokrój replikę PDMS na oddzielne górne i dolne części chipa za pomocą linii cięcia w PDMS. Następnie przebij cztery otwory w górnych częściach za pomocą ostrego stempla biopsyjnego o średnicy jednego milimetra, aby utworzyć wloty i wyloty. Przebijaj od wewnątrz na zewnątrz, aby zapobiec gromadzeniu się zanieczyszczeń PDMS w chipie.Następnie przykryj części wiórów przezroczystą taśmą, aby chronić je przed kurzem. Następnie pokrój membrany poliwęglanowe z wkładek transwell na kwadraty o wymiarach około trzech na trzy milimetry kwadratowe. Następnie zamontuj szczelną membranę porowatą pomiędzy dwiema częściami PDMS, aby zmontować dwuwarstwowe urządzenie połączone z porowatą membraną.W tym celu przygotuj zaprawę toluenową PDMS, używając 0,7 grama środka bazowego PDMS, 07 gramów utwardzacza i 540 mikrolitrów toluenu. Dokładnie wymieszaj zaprawę, a następnie rozłóż 200 mikrolitrów zaprawy na szklanym szkiełku nakrywkowym z prędkością 1500 obr./min przez 60 sekund, aby uzyskać cienką, jednolitą warstwę zaprawy. Następnie przenieś cienką warstwę zaprawy z szkiełka nakrywkowego na dolną część wióra za pomocą wałka farbowego.Dolną część umieść w naczyniu żaroodpornym, a następnie przenieś moździerz na górną część wióra. Za pomocą zestawu pęsety zanurz krawędzie membrany w zaprawie pokrytej spincoated i ostrożnie umieść ją na środku dolnej części. Następnie ostrożnie umieść górną część na dolnej części, zwracając uwagę na wyrównanie.Przykryj wloty frytek przezroczystą taśmą, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu do frytki i piecz je w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Na tym etapie bardzo ważna jest ostrożność. Nie wywieraj nacisku na wiór i nie przesuwaj górnej części po dolnej części, aby zapobiec przedostawaniu się zaprawy do kanałów i zatykaniu membrany.Aby zintegrować elektrody z kanałami bocznymi, pokrój platynowy drut na kawałki o długości dwóch centymetrów. Następnie zanurz je w acetonie na 30 minut. Następnie spłucz je wodą i etanolem i pozostaw do wyschnięcia.W okapie z przepływem krzyżowym połóż frytek na plastikowym naczyniu. Włóż cztery platynowe druty do kanałów elektrod chipa za pomocą pęsety i zegnij je na plastikowej misce, aby umożliwić przymocowanie do naczynia w następnym kroku. Włóż przewody o średnicy od 0,7 do jednego milimetra do kanału hodowlanego za złączem kanału w kształcie litery T.Następnie nałóż kroplę kleju utwardzanego promieniami UV na wejście do kanału elektrody i pozwól, aby klej wypełnił kanał za pomocą sił kapilarnych. Następnie włącz UV i utwardź klej, gdy dotrze do końca kanału elektrody. Przymocowano cztery zintegrowane elektrody do plastikowej naczynia za pomocą dwuskładnikowego kleju epoksydowego.Następnie przykryj frytki przezroczystą taśmą i piecz je w 60 stopniach Celsjusza przez dwie godziny. Pozwól im ostygnąć i przechowuj je w stanie wolnym od kurzu do czasu użycia. Aby pokryć chipy w celu ułatwienia przyczepiania komórek, najpierw wypełnij oba kanały PBS przed wprowadzeniem odczynników.Sprawdź pod mikroskopem, czy w kanałach nie ma pęcherzyków powietrza. Jeśli tak, usuń je, przepłukując dodatkowym PBS. Następnie wypełnij oba kanały 30 mikrolitrami po 20 mikrogramów na mililitr ludzkiej fibronektyny w PBS.Inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Następnie przepłucz frytki śródbłonkowym podłożem wzrostowym i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie zmierz TEER ślepych chipów, aby upewnić się, że wszystkie elektrody mają bezpośredni kontakt z płynem w kanałach.W tym celu należy wyjąć chip z inkubatora i pozostawić go do osiągnięcia temperatury pokojowej przez co najmniej dziesięć minut. Usuń płyn z plastikowego naczynia wokół elektrod, aby zapobiec mostkowaniu prądu na zewnątrz chipa. Następnie weź widmo impedancji od 200 Hz do jednego megaherca dla każdej kombinacji dwóch elektrod, co daje sześć widm impedancji na chip w ciągu pięciu do dziesięciu minut, na podstawie których można bezpośrednio określić TEER.Sprawdź, czy widma impedancji mają oczekiwane wielkości i kształty, aby potwierdzić poprawność pomiaru TEER. Teraz przygotuj zawiesinę komórkową, która zostanie umieszczona w górnym kanale, usuwając pożywkę hodowlaną z kolby hodowlanej z konfluencyjną monowarstwą komórek hcMEC/D3. Następnie umyj komórki PBS.Usunąć PBS, a następnie dodać dwa mililitry 05% trypsyny EDTA i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do pięciu minut, aż komórki odłączą się od kolby hodowlanej. Następnie dezaktywuj trypsynę za pomocą pożywki hodowlanej uzupełnionej 20% FBS. Policz komórki i oblicz ich całkowitą liczbę w zawiesinie.W międzyczasie odwiruj komórki hcMEC/D3 w temperaturze 390 razy g przez pięć minut. Następnie usuń supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości pożywki do wzrostu śródbłonka, aby uzyskać stężenie pięciu milionów komórek na mililitr, co odpowiada gęstości wysiewu 200 tysięcy komórek na centymetr kwadratowy w chipie. Następnie powoli odpipetuj 30 mikrolitrów dobrze wymieszanej zawiesiny komórek do górnego kanału i wyjmij pipetę z wlotu płynnym ruchem, nadal wywierając nacisk.Sprawdź gęstość wysiewu pod mikroskopem. Należy osiągnąć równomierny rozkład komórek w całym górnym kanale. Następnie inkubuj chipsy w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowego dwutlenku węgla przez co najmniej godzinę.Następnie wypłucz wszelkie nieprzyłączone komórki za pomocą pożywki hodowlanej śródbłonka. Należy pamiętać, że TEER jest monitorowany w okresie hodowli. Są to typowe schematyczne widmo impedancji pokazujące impedancję, wielkość i przesunięcie fazowe w funkcji częstotliwości dla spektroskopii impedancji elektrycznej na chipach bez ogniw i z komórkami.Istnieją cztery główne obszary, które są zdominowane przez pojemność dwuwarstwową elektrod, rezystancję pożywki hodowlanej, rezystancję bariery komórkowej lub pojemność błony komórkowej. Obszar zainteresowania wskazuje, gdzie można określić ilościowo udział warstwy komórkowej. A to jest wzór na obliczenie TEER na podstawie zmierzonych rezystancji między wszystkimi sześcioma kombinacjami czterech elektrod.Pokazano tutaj średni TEER czterech BBB na chipach podczas trzydniowego okresu hodowli, osiągając plateau 22 plus minus 1,3 oma centymetra kwadratowego. Dla porównania uwzględniono dane dotyczące czystych chipów, pokazujące marginalną zmienność i odchylenie od zera omów kwadratowych centymetra kwadratowego w tym samym okresie w porównaniu ze zmianą wartości TEER chipów z komórkami. Mikrokopia fluorescencyjna barwionych jąder ujawniła ciągłą monowarstwę śródbłonka zarówno na PDMS, jak i na błonie w miejscu wskazanym we wstawce.Immunofluorescencja wykazała obecność białka szczelnego połączenia zonula occludens, co wskazuje, że specyficzne dla BBB ścisłe połączenia między komórkami powodują powstanie mierzonego TEER. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć wytwarzanie i stosowanie chipów ze zintegrowanymi elektrodami do pomiarów TEER w Organs-on-Chips. Technika ta może być stosowana w dziedzinie badań nad barierą krew-mózg w celu zbadania bezpośredniego dostarczania i charakterystyki choroby, na przykład w chorobie Alzheimera.Po tej procedurze można również monitorować funkcję barierową śródbłonka mózgu różnicowaną z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych pod kątem zastosowań w medycynie spersonalizowanej.

fabrication-validation-an-organ-on-chip-system-with-integrated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film przedstawia metodę oceny przezśródbłonkowego oporu elektrycznego (TEER) w komórkach śródbłonka mikronaczyniowego mózgu myszy in vitro. Wysoka wartość TEER wskazuje na nienaruszone połączenia komórek śródbłonka, podczas gdy dodanie aktywowanych limfocytów T obniża wartość TEER, odzwierciedlając przerwanie bariery połączeniowej.

Ocena przezśródbłonkowej oporności elektrycznej w modelu bariery krew-mózg in vitro

Organiczny tranzystor elektrochemiczny jest zintegrowany z żywymi komórkami i służy do monitorowania przepływu jonów przez barierę nabłonkową przewodu pokarmowego. W tym badaniu mierzony jest wzrost strumienia jonów, związany z rozerwaniem połączeń ścisłych, wywołany obecnością chelatora wapnia EGTA (glikol etylenowy-bis(beta-aminoetylowy eter)-N,N,N',N'-tetraoctowy kwas).

Wykrywanie przerwania tkanki barierowej za pomocą organicznego tranzystora elektrochemicznego

Tutaj prezentujemy protokół, który opisuje wytwarzanie rozciągliwych, dwukanałowych, mikroprzepływowych urządzeń do hodowli komórek na poziomie narządów do rekapitulacji funkcjonalności na poziomie narządów in vitro.

Skalowalna produkcja rozciągliwych, dwukanałowych, mikroprzepływowych układów narządowych

Tutaj pokazujemy, jak skonfigurować tani woltoamperomierz z programowalną częstotliwością wyjściową, który może być używany z dostępnymi na rynku elektrodami pałeczkowymi do pomiarów przezprzeznabłonkowego/śródbłonkowego oporu elektrycznego.

Proste podejście do wykonywania pomiarów TEER za pomocą samodzielnie wykonanego woltoamperomierza z programowalną częstotliwością wyjściową

Bariera krew-mózg (BBB) to wielokomórkowa jednostka nerwowo-naczyniowa ściśle regulująca homeostazę mózgu. Łącząc ludzkie iPSC i technologie narządów na chipie, stworzyliśmy spersonalizowany chip BBB, odpowiedni do modelowania chorób i przewidywania penetracji leków do OUN. Opisano szczegółowy protokół generowania i działania chipa BBB.

Generacja ludzkiego chipa bariery krew-mózg opartego na iPSC

Ten protokół opisuje techniki mikrofabrykacji wymagane do zbudowania urządzenia do elektroporacji mikroprzepływowej typu lab-on-a-chip. Konfiguracja eksperymentalna wykonuje kontrolowane transfekcje na poziomie pojedynczej komórki w ciągłym przepływie i może być rozszerzona do wyższych przepustowości dzięki kontroli populacyjnej. Przedstawiono analizę pokazującą możliwość elektrycznego monitorowania stopnia przepuszczalności błony komórkowej w czasie rzeczywistym.

Wytwarzanie i działanie systemu mikroelektroporacji o ciągłym przepływie z detekcją przepuszczalności

Organoidy jelitowe pochodzące z biopsji oraz technologie organ-on-a-chips są połączone w platformę mikrofizjologiczną, aby podsumować funkcjonalność jelit specyficzną dla regionu.

Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego

Integracja organoidów jelitowych psów i systemu mikroprzepływowego Gut-on-a-Chip oferuje odpowiednie modele translacyjne dla chorób jelit u ludzi. Przedstawione protokoły pozwalają na morfogenezę 3D i dynamiczne modelowanie jelit in vitro, pomagając w opracowaniu skutecznych metod leczenia chorób jelit u psów i ludzi z One Health.

Trójwymiarowa morfogeneza w psich jelitach na chipie przy użyciu organoidów jelitowych pochodzących od pacjentów z nieswoistymi zapaleniami jelit

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D organoidów wieprzowych pochodzących z jelita cienkiego i grubego. Wzrost tych monowarstw charakteryzuje się rosnącymi wartościami TEER, co wskazuje na solidną integralność nabłonka. Dodatkowo, te monowarstwy wykazują fizjologiczne reakcje wydzielnicze w eksperymentach w komorze Ussing po zastosowaniu forskoliny.

Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita

W tym miejscu przedstawiamy protokół wytwarzania unikalnego dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego do badania elektromechanicznej regulacji homeostazy tkanek nabłonkowych. Urządzenie aplikuje statyczne fizjologiczne prądy elektryczne prostopadłe do płaszczyzny tkanki, wpływając na adhezję, proliferację i wytłaczanie komórki. Obrazowanie żywych komórek i pomiary naprężeń mechanicznych ujawniają mechanizmy tych procesów.

Ujawnienie elektromechanicznej kontroli homeostazy tkanek za pomocą dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego

Poznaj metodę produkcji mikrofluidycznego chipu z zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego pomiaru rezystancji TEER w modelu bariery krew-mózg. Technika umożliwia badanie funkcji barierowej endotelium.

Produkcja i walidacja systemu Organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego ilościowego określania przezśródbłonkowej rezystancji elektrycznej (Wideo) | JoVE Journal

Produkcja i walidacja systemu Organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego ilościowego określania przezśródbłonkowej rezystancji elektrycznej

Przeglądaj więcej filmów