Produkcja i walidacja systemu Organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego ilościowego określania przezśródbłonkowej rezystancji elektrycznej
26 września 2017
Ta publikacja opisuje produkcję urządzenia typu organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego oznaczania oporu elektrycznego przezśródbłonka (TEER). W celu walidacji bariera krew-mózg została naśladowana wewnątrz tego urządzenia mikroprzepływowego i monitorowano jego funkcję bariery. Przedstawione metody integracji elektrod i bezpośredniego oznaczania ilościowego TEER mają ogólne zastosowanie.
Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, jak wytwarzać i używać mikroprzepływowych chipów ze zintegrowanymi elektrodami do pomiarów przezśródbłonkowej lub transepitelowej rezystancji elektrycznej lub pomiarów TEER. Wykazano to za pomocą bariery krew-mózg w chipie mikroprzepływowym. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie narządów na chipach, umożliwiając bezpośredni pomiar funkcji barierowej, na przykład tkanki bariery krew-mózg za pomocą zintegrowanych elektrod.
Główną zaletą naszej techniki jest to, że elektrody można łatwo zintegrować z systemami Organ-on-Chip, a wyniki tego można porównać między różnymi systemami. Implikacje tej technologii rozciągają się w kierunku zrozumienia funkcji bariery krew-mózg w zdrowiu i chorobie, odkrywania leków i medycyny spersonalizowanej. Chociaż metoda ta może być wykorzystana do uzyskania wglądu w funkcję bariery krew-mózg, może być również stosowana w kontekście innych systemów Organ-on-Chip, takich jak Lung-on-Chip i Gut-on-Chip.
Aby rozpocząć tę procedurę, dokładnie wymieszaj 27 gramów środka bazowego PDMS i 2,7 grama utwardzacza. Następnie odgazowywać mieszaninę w eksykatorze przez około 45 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. W międzyczasie przygotuj formę na płynną mieszaninę PDMS, przyklejając przezroczystą taśmę wokół formy lub umieść formę w odpowiednim uchwycie na wafel.
Wlej odgazowaną mieszaninę PDMS na formę. Następnie utwardź mieszaninę PDMS w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez cztery godziny, a następnie pozwól jej ostygnąć. W okapie z przepływem krzyżowym wyciągnij utwardzony PDMS z formy.
Pokrój replikę PDMS na oddzielne górne i dolne części chipa za pomocą linii cięcia w PDMS. Następnie przebij cztery otwory w górnych częściach za pomocą ostrego stempla biopsyjnego o średnicy jednego milimetra, aby utworzyć wloty i wyloty. Przebijaj od wewnątrz na zewnątrz, aby zapobiec gromadzeniu się zanieczyszczeń PDMS w chipie.
Następnie przykryj części wiórów przezroczystą taśmą, aby chronić je przed kurzem. Następnie pokrój membrany poliwęglanowe z wkładek transwell na kwadraty o wymiarach około trzech na trzy milimetry kwadratowe. Następnie zamontuj szczelną membranę porowatą pomiędzy dwiema częściami PDMS, aby zmontować dwuwarstwowe urządzenie połączone z porowatą membraną.
W tym celu przygotuj zaprawę toluenową PDMS, używając 0,7 grama środka bazowego PDMS, 07 gramów utwardzacza i 540 mikrolitrów toluenu. Dokładnie wymieszaj zaprawę, a następnie rozłóż 200 mikrolitrów zaprawy na szklanym szkiełku nakrywkowym z prędkością 1500 obr./min przez 60 sekund, aby uzyskać cienką, jednolitą warstwę zaprawy. Następnie przenieś cienką warstwę zaprawy z szkiełka nakrywkowego na dolną część wióra za pomocą wałka farbowego.
Dolną część umieść w naczyniu żaroodpornym, a następnie przenieś moździerz na górną część wióra. Za pomocą zestawu pęsety zanurz krawędzie membrany w zaprawie pokrytej spincoated i ostrożnie umieść ją na środku dolnej części. Następnie ostrożnie umieść górną część na dolnej części, zwracając uwagę na wyrównanie.
Przykryj wloty frytek przezroczystą taśmą, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu do frytki i piecz je w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Na tym etapie bardzo ważna jest ostrożność. Nie wywieraj nacisku na wiór i nie przesuwaj górnej części po dolnej części, aby zapobiec przedostawaniu się zaprawy do kanałów i zatykaniu membrany.
Aby zintegrować elektrody z kanałami bocznymi, pokrój platynowy drut na kawałki o długości dwóch centymetrów. Następnie zanurz je w acetonie na 30 minut. Następnie spłucz je wodą i etanolem i pozostaw do wyschnięcia.
W okapie z przepływem krzyżowym połóż frytek na plastikowym naczyniu. Włóż cztery platynowe druty do kanałów elektrod chipa za pomocą pęsety i zegnij je na plastikowej misce, aby umożliwić przymocowanie do naczynia w następnym kroku. Włóż przewody o średnicy od 0,7 do jednego milimetra do kanału hodowlanego za złączem kanału w kształcie litery T.
Następnie nałóż kroplę kleju utwardzanego promieniami UV na wejście do kanału elektrody i pozwól, aby klej wypełnił kanał za pomocą sił kapilarnych. Następnie włącz UV i utwardź klej, gdy dotrze do końca kanału elektrody. Przymocowano cztery zintegrowane elektrody do plastikowej naczynia za pomocą dwuskładnikowego kleju epoksydowego.
Następnie przykryj frytki przezroczystą taśmą i piecz je w 60 stopniach Celsjusza przez dwie godziny. Pozwól im ostygnąć i przechowuj je w stanie wolnym od kurzu do czasu użycia. Aby pokryć chipy w celu ułatwienia przyczepiania komórek, najpierw wypełnij oba kanały PBS przed wprowadzeniem odczynników.
Sprawdź pod mikroskopem, czy w kanałach nie ma pęcherzyków powietrza. Jeśli tak, usuń je, przepłukując dodatkowym PBS. Następnie wypełnij oba kanały 30 mikrolitrami po 20 mikrogramów na mililitr ludzkiej fibronektyny w PBS.
Inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Następnie przepłucz frytki śródbłonkowym podłożem wzrostowym i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie zmierz TEER ślepych chipów, aby upewnić się, że wszystkie elektrody mają bezpośredni kontakt z płynem w kanałach.
W tym celu należy wyjąć chip z inkubatora i pozostawić go do osiągnięcia temperatury pokojowej przez co najmniej dziesięć minut. Usuń płyn z plastikowego naczynia wokół elektrod, aby zapobiec mostkowaniu prądu na zewnątrz chipa. Następnie weź widmo impedancji od 200 Hz do jednego megaherca dla każdej kombinacji dwóch elektrod, co daje sześć widm impedancji na chip w ciągu pięciu do dziesięciu minut, na podstawie których można bezpośrednio określić TEER.
Sprawdź, czy widma impedancji mają oczekiwane wielkości i kształty, aby potwierdzić poprawność pomiaru TEER. Teraz przygotuj zawiesinę komórkową, która zostanie umieszczona w górnym kanale, usuwając pożywkę hodowlaną z kolby hodowlanej z konfluencyjną monowarstwą komórek hcMEC/D3. Następnie umyj komórki PBS.
Usunąć PBS, a następnie dodać dwa mililitry 05% trypsyny EDTA i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do pięciu minut, aż komórki odłączą się od kolby hodowlanej. Następnie dezaktywuj trypsynę za pomocą pożywki hodowlanej uzupełnionej 20% FBS. Policz komórki i oblicz ich całkowitą liczbę w zawiesinie.
W międzyczasie odwiruj komórki hcMEC/D3 w temperaturze 390 razy g przez pięć minut. Następnie usuń supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości pożywki do wzrostu śródbłonka, aby uzyskać stężenie pięciu milionów komórek na mililitr, co odpowiada gęstości wysiewu 200 tysięcy komórek na centymetr kwadratowy w chipie. Następnie powoli odpipetuj 30 mikrolitrów dobrze wymieszanej zawiesiny komórek do górnego kanału i wyjmij pipetę z wlotu płynnym ruchem, nadal wywierając nacisk.
Sprawdź gęstość wysiewu pod mikroskopem. Należy osiągnąć równomierny rozkład komórek w całym górnym kanale. Następnie inkubuj chipsy w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowego dwutlenku węgla przez co najmniej godzinę.
Następnie wypłucz wszelkie nieprzyłączone komórki za pomocą pożywki hodowlanej śródbłonka. Należy pamiętać, że TEER jest monitorowany w okresie hodowli. Są to typowe schematyczne widmo impedancji pokazujące impedancję, wielkość i przesunięcie fazowe w funkcji częstotliwości dla spektroskopii impedancji elektrycznej na chipach bez ogniw i z komórkami.
Istnieją cztery główne obszary, które są zdominowane przez pojemność dwuwarstwową elektrod, rezystancję pożywki hodowlanej, rezystancję bariery komórkowej lub pojemność błony komórkowej. Obszar zainteresowania wskazuje, gdzie można określić ilościowo udział warstwy komórkowej. A to jest wzór na obliczenie TEER na podstawie zmierzonych rezystancji między wszystkimi sześcioma kombinacjami czterech elektrod.
Pokazano tutaj średni TEER czterech BBB na chipach podczas trzydniowego okresu hodowli, osiągając plateau 22 plus minus 1,3 oma centymetra kwadratowego. Dla porównania uwzględniono dane dotyczące czystych chipów, pokazujące marginalną zmienność i odchylenie od zera omów kwadratowych centymetra kwadratowego w tym samym okresie w porównaniu ze zmianą wartości TEER chipów z komórkami. Mikrokopia fluorescencyjna barwionych jąder ujawniła ciągłą monowarstwę śródbłonka zarówno na PDMS, jak i na błonie w miejscu wskazanym we wstawce.
Immunofluorescencja wykazała obecność białka szczelnego połączenia zonula occludens, co wskazuje, że specyficzne dla BBB ścisłe połączenia między komórkami powodują powstanie mierzonego TEER. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć wytwarzanie i stosowanie chipów ze zintegrowanymi elektrodami do pomiarów TEER w Organs-on-Chips. Technika ta może być stosowana w dziedzinie badań nad barierą krew-mózg w celu zbadania bezpośredniego dostarczania i charakterystyki choroby, na przykład w chorobie Alzheimera.
Po tej procedurze można również monitorować funkcję barierową śródbłonka mózgu różnicowaną z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych pod kątem zastosowań w medycynie spersonalizowanej.
Przegląd
Niniejsza publikacja przedstawia metodę wytwarzania urządzenia typu organ-on-chip z zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego pomiaru transendotelialnego oporu elektrycznego (TEER). W tym urządzeniu mikroprzepływowym odtworzono barierę krew-mózg, co umożliwia monitorowanie jej funkcji barierowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Mikrofluidyka
- Inżynieria biomedyczna
Wprowadzenie
- Transendoteliczna oporność elektryczna (TEER) jest kluczowym parametrem oceny funkcji barierowej komórek śródbłonka.
- Organy na chipach (organs-on-chips) to innowacyjne narzędzia służące do badania fizjologii i patologii człowieka.
- Integracja elektrod w urządzeniach mikroprzepływowych zwiększa możliwości pomiarowe.
- Bariera krew-mózg ma krytyczne znaczenie dla ochrony mózgu i stanowi istotny punkt zainteresowania w procesie odkrywania leków.
Cel badania
- Opracowanie chipa mikroprzepływowego umożliwiającego bezpośrednie pomiary TEER.
- Walidacja urządzenia z wykorzystaniem modelu bariery krew-mózg.
- Przedstawienie metody możliwej do zastosowania w różnych systemach organ-on-chip.
Zastosowane metody
- Wytwarzanie mikroprzepływowych chipów na bazie PDMS z zintegrowanymi elektrodami.
- Przygotowanie membrany porowatej do naśladowania bariery krew-mózg.
- Bezpośredni pomiar TEER przy użyciu spektroskopii impedancyjnej.
- Techniki hodowli komórkowych w celu przygotowania komórek śródbłonka na chip.
Główne wyniki
- Wytworzone urządzenie organ-on-chip pomyślnie zintegrowano z elektrodami do pomiaru TEER.
- Uzyskane wartości TEER odzwierciedlają funkcję barierową modelu bariery krew-mózg.
- Metoda ta umożliwia porównywanie różnych systemów organ-on-chip.
- Wyniki wskazują na potencjalne zastosowania w odkrywaniu leków oraz w medycynie personalizowanej.
Wnioski
- Integracja elektrod w urządzeniach typu organ-on-chip zwiększa dokładność pomiarów.
- Technikę tę można zastosować do badania różnych układów narządowych poza barierą krew-mózg.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę do pogłębienia wiedzy na temat zdrowia i chorób.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezpośredni pomiar transendotelialnego oporu elektrycznego (TEER) w systemach organ-on-chip odpowiada na krytyczną potrzebę zastosowania solidnej, ilościowej oceny integralności bariery w modelach istotnych z punktu widzenia chorób. Możliwość ta zwiększa wiarygodność prognostyczną we wczesnych etapach poszukiwania leków oraz wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku bariery krew-mózg i innych modeli tkanek. Podejście to umożliwia standaryzowane, powtarzalne pomiary, które ułatwiają porównania międzyplatformowe oraz selekcję projektów w ramach portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę funkcji barierowej w mikrofizjologicznych systemach odpowiadających warunkom ludzkim.
- Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez ilościowe określanie szczelności połączeń ścisłych w modelach śródbłonkowych.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla związków modyfikujących barierę.
- Zapewnia ilościowe punkty końcowe dla badań nad szlakami opartych na hipotezach.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane odczyty TEER w celu zapewnienia powtarzalności analizy i benchmarkingu.
- Przygotowuje zwalidowane platformy organ-on-chip do procesów screeningu związków.
- Umożliwia skalowalne, multipleksowe pomiary rezystancji w wielu urządzeniach.
- Wspiera wiarygodną ocenę czynników modyfikujących przepuszczalność.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje in vitro modele barier do punktów końcowych istotnych dla przebiegu choroby w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Umożliwia monitorowanie funkcji śródbłonka pochodzącej od pacjenta lub z iPSC na potrzeby spersonalizowanych badań.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój kandydatów celujących w bariery OUN lub nabłonkowe.
- Zapewnia wgląd mechanistyczny w modele chorób, takich jak neurodegeneracja lub stan zapalny.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten system organ-on-chip z możliwością pomiaru TEER integruje się z kontinuum odkryć – od wczesnej walidacji celu po rozwój modeli przedklinicznych, wspierając zarówno badania mechanistyczne, jak i kampanie screeningowe.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe pomiary TEER wyjaśniają funkcję bariery i wspierają testowanie hipotez w modelach mikroprzepływowych.
- Przesiewy: Standaryzowane odczyty oparte na impedancji umożliwiają odtwarzalne opracowywanie testów w różnych urządzeniach.
- Analityka: Dane dotyczące oporności wielościeżkowej zapewniają solidne wyniki statystyczne do porównywania warunków.
- Badania translacyjne: Modele barier istotne dla przebiegu chorób ułatwiają dopasowanie biomarkerów i walidację przedkliniczną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Platforma jest dostosowalna do różnych układów narządowych, co wspiera szerokie zastosowanie w badaniach i rozwoju (R&D).
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach funkcji barierowych.
- Wartość operacyjna: Usprawnia standaryzację, powtarzalność i skalowalność pomiarów TEER.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczenie ilościowych, porównywalnych punktów końcowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów celujących w integralność barier z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrofluidyki, spektroskopii impedancyjnej oraz hodowli komórkowych.
- Wymaga dostępu do narzędzi mikrofabrykacyjnych oraz aparatury do pomiaru impedancji.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie integracji elektrod i analizy danych.
- Metoda jest adaptowalna do różnych modeli organ-on-chip przy odpowiednim doborze membrany i typu komórek.
- Ograniczenia praktyczne obejmują precyzję rozmieszczenia elektrod oraz ryzyko zapchania kanałów.
