Name: Wykrywanie rzadkich mutacji w ctDNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Poznaj metodę ER-Seq do wykrywania rzadkich mutacji w ctDNA z wysoką czułością i specyficznością. Dwukierunkowa korekcja błędów umożliwia precyzyjną diagnostykę onkologiczną i monitorowanie terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez Geneplus-Beijing Institute.

Próbki guza i próbki krwi zostały pobrane zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komisję Etyki Szpitala Ludowego Uniwersytetu Pekińskiego. Uzyskano pisemną świadomą zgodę pacjentów na wykorzystanie ich próbek. Uczestnicy zostali poddani badaniom przesiewowym według następujących kryteriów: kobieta, zaawansowany niedrobnokomórkowy rak płuca, mutacja EGFR p.L858R wskazywana przez wcześniejsze sekwencjonowanie Sangera, progresja choroby po dwóch sesjach terapii celowanej EGFR z erlotynibem oraz ER-Seq, który zastosowano do ctDNA w celu analizy przyczyny oporności i znalezienia nowych leków docelowych.
1. Ekstrakcja DNA z krwi obwodowej dla cfDNA i genomowego DNA (gDNA)
<ol>
	<li>Zbierz 10 ml krwi obwodowej do probówki zbiorczej, delikatnie odwróć w górę iw dół 6-8 razy, aby wymieszać. Unikaj ścinania komórek. Próbki krwi można przechowywać w probówce zbiorczej w temperaturze 6-37 °C przez okres do 72 godzin.</li>
	<li>Odwirować probówkę zbiorczą w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 1600 (±150) x g.</li>
	<li>Przenieść supernatant (osocze) z probówki zbiorczej do czterech czystych, odpowiednio oznakowanych probówek wirówkowych o pojemności 2 ml za pomocą jednorazowej pipety, nie naruszając warstwy osadu (białych krwinek).</li>
	<li>Przenieść 1 ml komórek za pomocą czystej jednorazowej pipety do odpowiednio oznakowanej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml. Komórki można przechowywać w temperaturze -20 °C lub niższej przed krokiem 1.8.</li>
	<li>Odwirować osocze (od kroku 1.3) przez 10 minut w temperaturze 4 °C i 16000 (±150) x g.</li>
	<li>Przenieś osocze do czystych probówek wirówkowych odpowiednio oznaczonych jako "osocze", pozostaw ~0,1 ml resztkowej objętości na dnie, aby uniknąć zanieczyszczenia. Przechowywać osocze w temperaturze -80 °C do kroku 1.7.</li>
	<li>Użyj 3 ml osocza z kroku 1.6, aby wyizolować cfDNA (zawiera ctDNA) za pomocą dostępnego w handlu zestawu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Użyj 200 μl białych krwinek z kroku 1.3, aby wyizolować gDNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Zarówno cfDNA, jak i gDNA mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przed użyciem.</li>
	<li>Stosować różne kontrole jakości dla cfDNA i gDNA (Tabela 2). Przeprowadzić kontrolę jakości za pomocą znormalizowanej metody dla bioanalizatora w celu określenia poziomów degradacji próbki i/lub zanieczyszczenia gDNA. Analiza szczytowa jakości ekstrakcji cfDNA powinna wyglądać podobnie do <silna klasa="xfig">Rysunek 1. 
	UWAGA: Wielkość piku cfDNA wynosi około 170 pz. Należy pamiętać, że zwiększenie ilości DNA spowoduje wyższą jakość biblioteki do skutecznego wykrywania rzadkich mutacji w cfDNA. Zalecamy użycie co najmniej 30 ng cfDNA (30 000 kopii).</li>
</ol>
2. Przygotowanie biblioteki
UWAGA: Jeśli chodzi o konstrukcję biblioteki bazowej na fragmentaryzowanym DNA, cfDNA występuje we fragmentach o wielkości piku ~170 pz i dlatego nie musi być fragmentowany.
<ol>
	<li>Fragmentację próbki kontrolnej (gDNA) metodą sonikacji w celu uzyskania fragmentów o długości 200-250 pz.
	<ol>
		<li>Przygotować 1 μg próbki gDNA w 100 μl buforu Tris-EDTA w czystej probówce sonicyjnej.</li>
		<li>Ustaw program sonikacji na 30 s włączony i 30 s wyłączony na 12 cykli, w sumie 12 minut.</li>
		<li>Po sonikacji potwierdź, że produkt (5 μl) zawiera 200-250 pz fragmentów, przeprowadzając analizę z 2% żelem agarozowym.</li>
		<li>Przenieś wszystkie produkty rozdrobnienia do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i inkubuj ze 150 μl kulek magnetycznych przez 5 minut, aby wybrać właściwe fragmenty.</li>
		<li>Usunąć supernatant, umieszczając probówkę na stojaku magnetycznym na 30 s.</li>
		<li>Umyj koraliki 200 μl 80% etanolu (świeżo przygotowanego) z probówką pozostającą na stojaku magnetycznym. Inkubować przez 30 s przed usunięciem supernatantu. Powtórz raz.</li>
		<li>Wysuszyć koraliki na powietrzu przy otwartej pokrywie tuby, pozostając na stojaku magnetycznym. Unikaj przesuszonych kulek, aby upewnić się, że cel DNA dobrze się regeneruje. Eluować fragmenty DNA z kulek, dodając 32 μl 10 mM Tris-HCl (pH 8) do kulek w celu rozdzielenia fragmentów DNA, a następnie określić ilościowo za pomocą spektroskopii UV/Vis. 
		UWAGA: Do poniższych eksperymentów potrzebne jest co najmniej 200 ng.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reakcja zakończenia przygotowania 
	UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta i zmodyfikuj w razie potrzeby. Użyj 30 ng cfDNA; i 1 μg gDNA jako kontrola.
	<ol>
		<li>Dodać 7 μl buforu reakcyjnego, 3 μl mieszaniny enzymów, 30 ng cfDNA do sterylnej probówki wolnej od nukleaz i dodać ddH2O do całkowitej objętości 60 μL. W osobnej probówce dodaj powyższe składniki, ale z 1 μg gDNA zamiast cfDNA.</li>
		<li>Wymieszać i inkubować mieszaninę w temperaturze 20 °C przez 30 minut, a następnie w temperaturze 65 °C przez 30 minut w termocyklerze bez podgrzewanej pokrywy. Przejdź od razu do następnego kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podwiązanie adaptera
	<ol>
		<li>Dodać 30 μl głównej mieszanki do ligacji, 1 μl wzmacniacza ligacji i 4 μl unikalnych adapterów do sekwencjonowania do mieszaniny z kroku 2.2.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 20 °C przez 15 minut w termocyklerze bez podgrzewanej pokrywy.</li>
		<li>Wiruj, aby ponownie zawiesić kulki magnetyczne i pozostaw je w temperaturze pokojowej na co najmniej 30 minut przed następnym krokiem.</li>
		<li>Dodać 87 μl zawieszonych kulek magnetycznych do wyżej wymienionej mieszaniny; dobrze wymieszać pipetując w górę i w dół, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Umyj i wysusz koraliki na powietrzu zgodnie z opisem w kroku 2.1.</li>
		<li>Eluuj cel DNA z kulek, dodając 20 μl 10 mM Tris-HCl (pH 8).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzbogacanie fragmentów DNA ligowanych za pomocą adaptera
	<ol>
		<li>Dodać 20 μl ligowanych fragmentów DNA z adapterem, 5 μl Index Primer/i7 (2,5 μl Primer-P7 (10 pM) i 2,5 μl Primer-P5 (10 pM) do celów sekwencjonowania), 25 μl biblioteki amplifikacji master mix i ddH2O do całkowitej objętości 50 μL.</li>
		<li>PCR amplifikuje zligowane DNA adaptera i cykl termiczny w następujący sposób: początkowa denaturacja w temperaturze 98 °C przez 45 s, następnie 8 cykli (cfDNA) lub 4 cykle (gDNA) wyżarzania w temperaturze °C przez 15 s, 65 °C przez 30 s, 72 °C przez 30 s) i końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 60 s, następnie utrzymując temperaturę na poziomie 4 °C.</li>
		<li>Dodaj 45 μl zawieszonych kulek magnetycznych do DNA wzbogaconego PCR, aby uzyskać pozyskane fragmenty.</li>
		<li>Eluować fragmenty DNA za pomocą adapterów w 30 μL 10 mM Tris-HCl (pH 8).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontrola jakości biblioteki
	<ol>
		<li>Postępuj zgodnie z protokołem producenta dla komercyjnego zestawu do pomiaru stężenia DNA podwiązanego adapterem. Użyj bioanalizatora, aby określić jakość DNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ukierunkowane wychwytywanie DNA
UWAGA: Wzbogacanie celu zostało przeprowadzone za pomocą niestandardowej sondy do przechwytywania sekwencji, która jest specjalnie zaprojektowana dla regionu wzbogacania celu o długości 1021 kb, obejmującego znane mutacje związane z nowotworem z 12 różnych typów nowotworów. Modyfikacje protokołu producenta są szczegółowo opisane w poniższych krokach.
<ol>
	<li>Blokowanie
	<ol>
		<li>Dodaj 1,5 μg bibliotek pulujących (maksymalna liczba bibliotek do puli dla cfDNA to 6, gDNA to 20) z kroku 2, 8 μl bloku P5 (100P), 8 μl bloku P7 (100P) i 5 μl DNA Cot-1 (1 μg / μL) w sterylnej probówce. Wysuszyć zawartość probówki za pomocą koncentratora próżniowego ustawionego na 60 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zhybrydyzuj sondy wychwytujące DNA z biblioteką.
	<ol>
		<li>Dodaj następujące składniki do probówki z kroku 3.1: 8,5 μl buforu hybrydyzacyjnego 2X, 2,7 μl wzmacniacza hybrydyzacji i 1,8 μl ddH2O, wolnego od nukleaz</li>.
		<li>Mieszać pipetując w górę i w dół i inkubować w termomikserze w temperaturze 95 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Po inkubacji natychmiast dodać 4 μl sondy niestandardowej. Próbki należy inkubować w termocyklerze w temperaturze 65 °C z pokrywką podgrzaną do temperatury 75 °C przez 4 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wychwytywanie fragmentów DNA
	<ol>
		<li>Inkubuj zhybrydyzowane docelowe DNA za pomocą kulek streptawidyny, a następnie umyj kulki w celu usunięcia niezwiązanego DNA. Użyj zestawu komercyjnego zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać ostatnie 20 μl zawieszonych kulek z przechwyconymi fragmentami DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Amplifikacja wychwyconych fragmentów DNA
	<ol>
		<li>Wykonaj PCR przy użyciu komercyjnego zestawu z oligonukleotydami szkieletowymi 2 μM, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Po zakończeniu reakcji PCR dodać 45 μl zawieszonych kulek bezpośrednio do produktu PCR i wzbogacić amplifikowane docelowe fragmenty DNA związane z kulkami przez elucję 30 μl 10 mM Tris-HCl (pH 8).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ ilościowo fragmenty DNA za pomocą zestawu do kwantyfikacji biblioteki i określ średnią długość fragmentu za pomocą Bioanalyzera (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>
4. Sekwencjonowanie
<ol>
	<li>Biblioteki multipleksowane sekwencjonami przy użyciu sparowanych końców 75 bp są uruchamiane na sekwenatorze laboratoryjnym przez 18 godzin. Całkowita ilość wytworzonych danych wynosi do 60 gigabajtów, 15 GB jest wymagane dla próbki cfDNA pacjenta i 1G dla próbki kontrolnej gDNA.</li>
</ol>
5. Przepływ pracy analizy danych
UWAGA: Rysunek 3 przedstawia ogólny przepływ pracy i proces analizy danych. Parametry i polecenia analizy danych są pokazane poniżej.
<ol>
	<li>Filtruj odczyty niskiej jakości i koryguj błędy i maskowanie UID za pomocą NCfilter. 
	NCfilter(własny) 
	NCfilter filter -l 5 -q 0.5 -n 0.1 -T 3 -G -1 fastq1 -2 fastq2 
	realSeq(own) 
	python bin/realRealSeq MaskUID -1 fq1 -2 fq2 -o output dir -p prefix -u 4 -s 7 -m 3 -i uidFile -f.</li>
	<li>Odwołując się do genomu hg19 (ludzki genom 19), zlokalizuj wyniki sekwencjonowania za pomocą BWA (wersja 0.7.12-r1039) mem i dopasuj do zestawu narzędzi do analizy genomu (GATK) (wersja 3.4-46-gbc02625). 
	BWA MEM -t 3 HG19 FASTQ1 FASTQ2 
	java -d64 -server -XX:+UseParallelGC -XX:ParallelGCThreads=8 -Xms2g -Xmx10g - 
	Djava.io.tmpdir=/tmp/ -jar 
	GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L region_docelowy -znany dbsnp — 
	allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 -I cancerBam -I normalBam 
	java -d64 -server -XX:+UseParallelGC -XX:ParallelGCThreads=8 -Xms2g -Xmx10g — 
	Djava.io.tmpdir=/tmp/ -jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19 -known dbsnp 
	-allowPotentiallyMisencodedQuals — interwały targetIntervals -I cancerBam -I normalBam</li>
	<li>Grupuj duplikaty zgodnie z UID i pozycją fragmentów szablonu, co poprawi podstawy błędów wprowadzone przez PCR/sekwencjonowanie i zmodyfikuje jakość podstawy. 
	realSeq(own) 
	python realSeq/bin/realSeq CLUSTER -b unmarkdup_sort_merge.bam -r chipRegion -o output_dir -p 
	prefiks -m 6</li>
	<li>Ponownie wyrównaj zgrupowane duplikaty za pomocą BWA mem. 
	BWA MEM -T 3 HG19 FASTQ1 FASTQ2</li>
	<li>Wykonaj lokalne wyrównanie, a następnie ponowną kalibrację podstawowego wyniku jakości przy użyciu GATK (wersja 3.4-46-gbc02625). 
	Wyrównanie lokalizacji: java -d64 -server -XX:+UseParallelGC -XX:ParallelGCThreads=8 -Xms2g -Xmx10g -Djava.io.tmpdir=/tmp/ -jar GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion -known dbsnp -allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 -I cancerBam -I normalBam 
	java -d64 -server -XX:+UseParallelGC -XX:ParallelGCThreads=8 -Xms2g -Xmx10g -Djava.io.tmpdir=/tmp/ -jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19 -known dbsnp -allowPotentiallyMisencodedQuals -targetIntervals intervals -I cancerBam -I normalBam 
	rekalibracja podstawowej oceny jakości: java -d64 -server -XX:+UseParallelGC -XX:ParallelGCThreads=8 -Xms2g -Xmx10g -Djava.io.tmpdir=/tmp/ -jar GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -R hg19 -L targetRegion -knownSites dbsnp -knownSites cosmic -allowPotentiallyMisencodedQuals -nct 10 -I bam -o grp java -d64 -server -XX:+UseParallelGC -XX:ParallelGCThreads=8 -Xms2g -Xmx10g -Djava.io.tmpdir=/tmp/ -jar GenomeAnalysisTK.jar -T PrintReads -I bam -BQSR grp -o outbam -R hg19 -nct 8 -allowPotentiallyMisencodedQuals</li>
	<li>W przypadku wywoływania SNV (wariant pojedynczego nukleotydu) i INDEL (małe insercje lub delecje) dokładność mutacji o niskiej częstotliwości jest dodatkowo potwierdzana przez GSR (Good Support Reads) z parami odczytu nici do przodu i do tyłu oraz filtracją przez grupę kontrolną (mutacje linii zarodkowej) i bazową bazę danych. 
	realDcaller(własny) 
	python realDcaller -f hg19 -r chipRegion -C baselineDB -O -L 2 cancerBam normalBam -p 30</li>
	<li>Użyj próbek linii bazowej jako kontrolki dla wywołania CNV (wariantu numeru kopii). 
	NCcnv(własny) 
	python NCcnv -o cnvdir -t tmpdir -r chipRegion cnv --normgt normalBam --tumgt cancerBam --repdb repeatMarsk</li>
	<li>Wyrównane niezmapowane, klipy i niezgodna para odczytują wywołanie SV (Structural Variations). 
	NCsv(własny) 
	python NCsv -t tmpdir -r hg19 -o outputdir -x transkrypt -w bwapath -n 4 normalBam cancerBam</li>
</ol>

<ol><li>Kennedy, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+ultralow-frequency+mutations+by+Duplex+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing.</a> Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li>
<li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Sci. Transl. Med. 6, (2014).</li>
<li>Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+clinical+utility+of+ultrasensitive+circulating+tumor+DNA+detection+with+CAPP-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq.</a> Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).</li>
<li>Diaz, L. A. Jr, Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsies%3A+genotyping+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA.</a> J. Clin. Oncol. 32, 579-586 (2014).</li>
<li>Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsy%3A+monitoring+cancer-genetics+in+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013).</li>
<li>Su, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+rapid+detection+of+multiple+oncogenic+mutations+with+relevance+to+targeted+therapy+in+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer.</a> J. Mol. Diagn. 13, 74-84 (2011).</li>
<li>Kukita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+target+sequencing+of+individual+molecules+identified+using+barcode+sequences%3A+de+novo+detection+and+absolute+quantitation+of+mutations+in+plasma+cell-free+DNA+from+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients.</a> DNA Res. 22, 269-277 (2015).</li>
<li>Schmitt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+small+genomic+targets+with+high+efficiency+and+extreme+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy.</a> Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).</li>
<li>Schmitt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+ultra-rare+mutations+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).</li>
<li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nat. Med. 20, 548-554 (2014).</li>
<li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+digital+error+suppression+for+improved+detection+of+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).</li>
<li>Alix-Panabières, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Catherine_Alix-Panabieres/publication/51770394_Circulating_Tumor_Cells_and_Circulating_Tumor_DNA/links/00b4953b6621e29429000000.pdf">Circulating tumor cells and circulating tumor DNA.</a> Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).</li>
<li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 368, 1199-1209 (2013).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short-read+alignment+with+Burrows-+Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short-read alignment with Burrows- Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>Youn, A., Simon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+cancer+driver+genes+in+tumor+genome+sequencing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies.</a> Bioinformatics. 27, 175-181 (2011).</li>
<li>Forshew, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+identification+and+monitoring+of+cancer+mutations+by+targeted+deep+sequencing+of+plasma+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li>
<li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+mutation+and+resistance+of+non-small-cell+lung+cancer+to+gefitinib%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib.</a> N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).</li>
<li>Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Jänne, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+detection+of+EGFR+T790M+in+gefitinib+or+erlotinib+resistant+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer.</a> Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).</li>
<li>Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+detection+of+EGFR+mutations+in+circulating+tumor+DNA+derived+from+lung+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas.</a> Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).</li>
<li>Leary, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+personalized+tumor+biomarkers+using+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing.</a> Sci. Transl. Med. 2, (2010).</li>
<li>Forshew, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+identification+and+monitoring+of+cancer+mutations+by+targeted+deep+sequencing+of+plasma+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li>
<li>Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+clinical+utility+of+ultrasensitive+circulating+tumor+DNA+detection+with+CAPP-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq.</a> Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnienie krążącego DNA guza (ctDNA) zostało odkryte ponad 30 lat temu, jednak stosowanie analiz ctDNA nadal nie jest rutynowe w praktyce klinicznej. Zainteresowanie praktycznym zastosowaniem metod ctDNA wzrosło wraz z rozwojem technologii wykrywania i analizy ctDNA. Monitorowanie guza za pomocą ctDNA oferuje minimalnie inwazyjne podejście do oceny mikroskopijnej choroby resztkowej, odpowiedzi na terapię i profili molekularnych guza na tle ewolucji guza i heterogeniczności wewnątrznowotworowej13,14</sup...

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS), potężne narzędzie do badania tajemnic genomu, może dostarczyć dużej ilości informacji, które mogą ujawnić zmiany genetyczne. Zastosowanie analizy NGS w klinice stało się bardziej powszechne, zwłaszcza w medycynie spersonalizowanej. Jednym z największych ograniczeń NGS jest jednak wysoki poziom błędów. Chociaż uważa się, że nadaje się do badania mutacji dziedzicznych, analiza rzadkich mutacji jest znacznie ograniczona1,2, zwłaszcza podczas analizy DNA uzyskanego z "płynnej biopsji".
Krążące DNA nowotworowe (ctDNA) to bezkomórkowe DNA (cfDNA) we krwi, które jest wydalane z komórek nowotworowych. W większości przypadków ilość ctDNA jest bardzo niska, co sprawia, że jego wykrycie i analiza są bardzo trudne. Jednak ctDNA ma wiele atrakcyjnych cech: jego izolacja jest minimalnie inwazyjna, można go wykryć we wczesnych stadiach wzrostu guza, poziom ctDNA odzwierciedla skuteczność terapeutyczną, a ctDNA zawiera mutacje DNA znalezione zarówno w zmianach pierwotnych, jak i przerzutowych3,4,5. Dlatego, biorąc pod uwagę szybki rozwój techniki i analizy NGS, zastosowanie detekcji ctDNA stało się bardziej atrakcyjne.
Do wykrywania ctDNA stosowano różne podejścia do sekwencjonowania równoległego, ale żadne z tych podejść nie zostało zaakceptowane do rutynowego użytku w klinikach ze względu na ich ograniczenia: niską czułość, brak wszechstronności i stosunkowo wysoki koszt6,7,8. Na przykład sekwencjonowanie dupleksowe, oparte na znaczniku unikalnego identyfikatora (UID), wielokrotnie koryguje błędy w konsensusie dwukierunkowo, korygując większość błędów sekwencjonowania. Jednak wykonalność tej metody została utracona ze względu na jej wysoki koszt i niskie wykorzystanie danych9,10. Podobnie, CAPP-Seq i jego ulepszona wersja, CAPP-IDES11,12, mają większą praktyczność w wykrywaniu cfDNA, chociaż dokładność i uniwersalność tych metod wymaga poprawy.
Aby sprostać obecnej potrzebie dokładnego wykrywania i analizy ctDNA, opracowaliśmy nową strategię, Wzbogacanie Sekwencjonowania Rzadkich Mutacji (ER-Seq). Podejście to łączy w sobie: unikalne adaptery sekwencjonowania do skutecznego odzyskiwania cząsteczek ctDNA, z dwukierunkową korekcją błędów i możliwością odróżnienia pojedynczej mutacji spośród > 1 × 107 nukleotydów typu dzikiego; Sondy 1021 kb, które wzbogacają pomiar regionów docelowych, które obejmują ponad 95% mutacji związanych z nowotworem z 12 nowotworów, w tym raka płuc, raka jelita grubego, raka żołądka, raka piersi, raka nerki, raka trzustki, raka wątroby, raka tarczycy, raka szyjki macicy, raka przełyku i raka endometrium (Tabela 1); oraz podstawowe badania przesiewowe w bazie danych, dzięki czemu skuteczne i łatwe jest precyzyjne wykrywanie rzadkich mutacji w ctDNA.
Aby zbudować bazową bazę danych, znajdź wszystkie mutacje genów za pomocą ER-Seq z wielu próbek tego samego typu (~1000 na początku). Te rzeczywiste mutacje muszą zostać zweryfikowane za pomocą kilku innych wiarygodnych metod wykrywania i analizy. Następnie podsumuj wzorzec fałszywych mutacji i zgrupuj wszystkie fałszywe mutacje, aby zbudować początkową bazową bazę danych. Kontynuuj dodawanie fałszywych mutacji znalezionych w kolejnych eksperymentach sekwencjonowania do tej bazy danych. W związku z tym ta bazowa baza danych staje się dynamicznie rozszerzoną bazą danych, co znacznie poprawia dokładność sekwencjonowania.
Aby promować postęp w diagnozowaniu i monitorowaniu nowotworów, prezentujemy ER-Seq, tanią i wykonalną metodę pozyskiwania uniwersalnych danych. Przedstawiamy studium przypadku, które zostało poddane analizie ER-Seq, wykazując jego dokładność w wykrywaniu rzadkich mutacji i możliwość zastosowania w klinice.

<table><tbody><tr><td>QIAamp Zestaw krążących kwasów nukleinowych</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>Ekstrakcja DNA z krwi obwodowej dla cfDNA</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51105</td><td>Ekstrakcja DNA z krwi obwodowej dla gDNA</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>Pomiar stężenia cfDNA</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA BR Zestaw testowy</td><td>Invitrogen</td><td>Q32853</td><td>Pomiar koncentracja biblioteki</td></tr><tr><td>Odczynniki Agilent DNA 1000</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td>Pomiar cfDNA i fragmentów biblioteki</td></tr><tr><td>Zestaw NEBNext UltraII do przygotowania biblioteki Illumina</td><td>NEB</td><td>E7645L</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Agencourt SPRIselect</td><td>Beckman</td><td>B23317</td> Badania <td>przesiewowe i oczyszczanie fragmentów DNA</td></tr><tr><td>Tris-HCl (10 mM, pH 8,0)-100ML</td><td>Sigma</td><td>93283</td><td>rozpad</td></tr><tr><td>Sondy blokujące xGen IDT</td><td></td><td>&mdash; &mdash;</td><td>Niestandardowa sonda xGen</td></tr><tr><td>Ludzkie Cot-1 DNA</td><td>Life</td><td>15279-011</td><td>Ukierunkowane wychwytywanie DNA</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 Streptawidin</td><td>Life</td><td>65305</td><td>Ukierunkowane wychwytywanie DNA</td></tr><tr><td>xGen Odczynniki blokujące</td><td>IDT</td><td>1072281</td><td>Ukierunkowane wychwytywanie DNA</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>KAPA</td><td>KK2602</td><td>biblioteki wzbogacania PCR po wychwyceniu</td></tr><tr><td>Zestaw kwantyfikacyjny biblioteki KAPA</td><td></td><td>KK4602</td><td>Biblioteka pomiarów stężenia</td></tr><tr><td>NextSeq 500 High Output Kit v2 ((150 cykli)</td><td>illumina</td><td>FC-404-2002</td><td>Wirówka sekwencyjna5810</td></tr><tr><td></td><td>eppendorf</td><td>5810</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop8000</td><td>Thermo Scientific</td><td>8000</td><td>Pomiar stężenia gDNA</td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Quantify</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalizator</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>eppendorf</td><td></td><td>Inkubacja</td></tr><tr><td>16-rurkowy DynaMagTM-2 Magnet Life</td><td></td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator plus</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>AB</td><td>simplyamp</td><td></td></tr><tr><td>QPCR</td><td>AB</td><td>7500Dx</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500</td><td>illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie rzadkich mutacji w ctdna za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

Analiza krążącego DNA guza (ctDNA) za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (NGS) stała się cennym narzędziem dla rozwoju onkologii klinicznej. Zastosowanie tej metody jest jednak trudne ze względu na jej niską czułość w analizie śladowej ilości ctDNA we krwi. Ponadto metoda może generować fałszywie dodatnie i ujemne wyniki z tego sekwencjonowania i późniejszej analizy. Aby poprawić wykonalność i wiarygodność wykrywania ctDNA w klinice, przedstawiamy tutaj technikę, która wzbogaca rzadkie mutacje do sekwencjonowania, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq może odróżnić pojedynczą mutację spośród 1 x 107 nukleotydów typu dzikiego, co czyni go obiecującym narzędziem do wykrywania zmian genetycznych o bardzo niskiej częstotliwości, a tym samym będzie bardzo przydatny w badaniu heterogeniczności choroby. Dzięki unikalnej ligacji adaptera sekwencjonowania, metoda ta umożliwia skuteczne odzyskiwanie cząsteczek ctDNA, przy jednoczesnej korekcji błędów dwukierunkowych (sens i antysens). Nasz wybór sond o długości 1021 kb wzbogaca pomiar regionów docelowych, które obejmują ponad 95% mutacji związanych z nowotworem w 12 nowotworach. Ta ekonomiczna i uniwersalna metoda umożliwia wyjątkowo udaną akumulację danych genetycznych. Po skutecznym odfiltrowaniu błędu tła, ER-seq może precyzyjnie wykryć rzadkie mutacje. Korzystając ze studium przypadku, przedstawiamy szczegółowy protokół demonstrujący projekt sondy, konstrukcję biblioteki i metodologie wychwytywania docelowego DNA, a także proces analizy danych. Proces przeprowadzania tej metody trwa zwykle 1-2 dni.

Sondy o długości 1021 kb służące do wzbogacania regionów docelowych stosowane w metodzie ER-Seq przedstawiono w Tabeli 1, która obejmuje ponad 95% mutacji genetycznych w 12 powszechnych typach nowotworów. Szeroki zakres tych sond sprawia, że proces ten jest możliwy do zastosowania u większości pacjentów onkologicznych. Ponadto nasze unikalne adaptery do sekwencjonowania oraz przesiewowa analiza bazy danych bazowej umożliwiają precyzyjne wykrywanie rzadkic...

Ten manuskrypt opisuje technikę wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości w ctDNA, ER-Seq. Metoda ta wyróżnia się unikalnym zastosowaniem dwukierunkowej korekcji błędów, specjalnego filtra tła i wydajnej akwizycji molekularnej.

Wykrywanie rzadkich mutacji w ctDNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Ogólnym celem tej techniki jest wykrycie mutacji o niskiej częstotliwości w krążącym guzie lub ctDNA, aby zapewnić lekarzom klinicznym potężne narzędzie do diagnozowania guzów i monitorowania dynamiki guza w odpowiedzi na terapię. Metoda badania ctDNA może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące rodzajów mutacji, które nosi pacjent, takich jak pojedyncza zmienność typu jądrowego, delecja insercji, zmienność liczby kopii i zmienność strukturalna. Główną zaletą tej technologii jest wysoka czułość i swoistość, która precyzyjnie wykrywa mutacje o niskiej częstotliwości w ctDNA.Procedury zademonstruje Yuliang Yang, technik z mojego laboratorium. Na początek pobierz 10 mililitrów krwi obwodowej do probówki zbiorczej i delikatnie odwróć probówkę w górę iw dół sześć do ośmiu razy, aby wymieszać zawartość. Próbki krwi należy przechowywać w probówkach w temperaturze od sześciu do 37 stopni Celsjusza przez okres do 72 godzin.Odwirować probówkę zbiorczą o stężeniu 1 600 g w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie za pomocą pipety do utylizacji przenieś supernatant lub osocze z probówki do czterech czystych, odpowiednio oznakowanych probówek wirówkowych o pojemności dwóch mili

detection-of-rare-mutations-in-ctdna-using-next-generation-sequencing

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisujemy przygotowanie bibliotek DNA z kodami kreskowymi i późniejsze przechwytywanie eksonów oparte na hybrydyzacji do wykrywania kluczowych mutacji związanych z rakiem w klinicznych próbkach guzów poprzez masowo równoległe sekwencjonowanie "nowej generacji". Celowane sekwencjonowanie eksonów oferuje korzyści w postaci wysokiej przepustowości, niskich kosztów i głębokiego pokrycia sekwencji, zapewniając w ten sposób wysoką czułość wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości.

Wykrywanie somatycznych zmian genetycznych w próbkach nowotworowych poprzez wychwytywanie eksonów i masowo równoległe sekwencjonowanie

Ten manuskrypt opisuje protokoły kliniczne dla dwóch paneli sekwencjonowania nowej generacji. Jeden panel bada nowotwory hematologiczne, podczas gdy drugi panel koncentruje się na genach powszechnie zmutowanych w guzach litych. Klasyfikacja molekularna mutacji powodujących nowotwory złośliwe u ludzi dostarcza cennych informacji prognostykujących i predykcyjnych.

Sekwencjonowanie nowej generacji do wykrywania mutacji, które można podjąć w celu działania, w guzach litych i płynnych

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Blokowanie PCR typu dzikiego, a następnie sekwencjonowanie bezpośrednie, oferuje bardzo czułą metodę wykrywania mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości w różnych typach próbek.

PCR blokujący typu dzikiego w połączeniu z sekwencjonowaniem bezpośrednim jako wysoce czuła metoda wykrywania mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości

Rękopis opisuje cyfrowy test PCR oparty na chipie, który wykrywa rzadki wariant transkryptu CDH1 (CDH1a) w świeżo zamrożonych tkankach normalnych i nowotworowych pobranych od pacjentów z rakiem żołądka.

Wykrywanie rzadkiego wariantu transkryptu CDH1 w świeżo mrożonych tkankach raka żołądka za pomocą cyfrowego PCR opartego na chipie

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to potężne narzędzie do charakterystyki genomu, które jest ograniczone przez wysoki poziom błędów platformy (~0,5–2,0%). Opisujemy nasze metody sekwencjonowania z korekcją błędów, które pozwalają nam wyeliminować wskaźnik błędów NGS i wykryć mutacje przy frakcjach alleli wariantów tak rzadkich, jak 0,0001.

Wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego ilościowego oznaczania wielu zmian genetycznych regionu docelowego w jednej reakcji za pomocą drop-off ddPCR i unikalnej pary sond hydrolizy.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

Przedstawiono tutaj endonukleazę sgRNA/CAS9 oraz protokół sekwencjonowania nowej generacji, który może być wykorzystany do identyfikacji mutacji związanych z naprawą pęknięć podwójnej nici w pobliżu promotora CD4.

Wykorzystanie sekwencjonowania nowej generacji do identyfikacji mutacji związanych z naprawą wywołanego przez CAS9 pęknięcia podwójnej nici w pobliżu promotora CD4

Protokół ten opisuje zautomatyzowany, akredytowany przez ISO15189 proces sekwencjonowania nowej generacji do wykrywania celowanych zmian genomowych w tkankach formalinowych osadzonych w parafinie tkankach raka płuc niedrobnokomórkowych (NSCLC).

Wykrywanie celowalnych zmian w niedrobnokomórkowym raku płuc za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Poznaj metodę ER-Seq do wykrywania rzadkich mutacji w ctDNA z wysoką czułością i specyficznością. Dwukierunkowa korekcja błędów umożliwia precyzyjną diagnostykę onkologiczną i monitorowanie terapii.

Wykrywanie rzadkich mutacji w ctDNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Przeglądaj więcej filmów