Wykrywanie rzadkich mutacji w ctDNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Ogólnym celem tej techniki jest wykrycie mutacji o niskiej częstotliwości w krążącym guzie lub ctDNA, aby zapewnić lekarzom klinicznym potężne narzędzie do diagnozowania guzów i monitorowania dynamiki guza w odpowiedzi na terapię. Metoda badania ctDNA może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące rodzajów mutacji, które nosi pacjent, takich jak pojedyncza zmienność typu jądrowego, delecja insercji, zmienność liczby kopii i zmienność strukturalna. Główną zaletą tej technologii jest wysoka czułość i swoistość, która precyzyjnie wykrywa mutacje o niskiej częstotliwości w ctDNA.

Procedury zademonstruje Yuliang Yang, technik z mojego laboratorium. Na początek pobierz 10 mililitrów krwi obwodowej do probówki zbiorczej i delikatnie odwróć probówkę w górę iw dół sześć do ośmiu razy, aby wymieszać zawartość. Próbki krwi należy przechowywać w probówkach w temperaturze od sześciu do 37 stopni Celsjusza przez okres do 72 godzin.

Odwirować probówkę zbiorczą o stężeniu 1 600 g w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie za pomocą pipety do utylizacji przenieś supernatant lub osocze z probówki do czterech czystych, odpowiednio oznakowanych probówek wirówkowych o pojemności dwóch mililitrów, nie naruszając osadu. Użyj czystej pipety do utylizacji, aby przenieść jeden mililitr komórek do odpowiednio oznakowanej probówki wirówkowej o pojemności dwóch mililitrów.

Przechowuj komórki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub niższej przed izolacją genomiczną lub gDNA. Następnie odwiruj osocze o temperaturze 1 600 razy g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie przenieś osocze do czystych probówek wirówkowych odpowiednio oznaczonych jako osocze, pozostawiając około 0,1 mililitra resztkowej objętości na dnie, aby uniknąć zanieczyszczenia.

Podczas procesu separacji należy unikać kożuchy z plazmy. W przeciwnym razie duże fragmenty DNA wyekstrahowane z komórek mogą rozcieńczyć ctDNA i wpłynąć na czułość testu. Korzystając z dostępnego na rynku zestawu, wyizoluj cfDNA z trzech mililitrów pobranego osocza zgodnie z instrukcjami producenta.

Następnie również za pomocą zestawu wyizoluj gDNA z 200 mikrolitrów białych krwinek zgodnie z instrukcjami producenta. Aby rozdrobnić próbkę kontrolną gDNA za pomocą sonikacji, należy przygotować jeden mikrogram próbki gDNA w 100 mikrolitrach buforu Tris-EDTA w czystej probówce sonicyjnej. Ustaw program sonikacji na 30 sekund włączenia i 30 sekund wyłączenia na 12 cykli, co daje łącznie 12 minut.

Po potwierdzeniu, że produkt zawiera od 200 do 250 fragmentów par zasad, przenieś wszystkie produkty fragmentacji do nowej 1,5-mililitrowej probówki zawierającej 150 mikrolitrów kulek magnetycznych i inkubuj próbkę przez pięć minut, aby wybrać właściwe fragmenty. Następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 30 sekund i usuń supernatant. Następnie, trzymając rurkę na ruszcie, dodaj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego 80% etanolu, aby umyć koraliki.

Inkubować kulki przez 30 sekund przed usunięciem supernatantu i powtórzyć pranie. Trzymaj rurkę na stojaku z otwartą pokrywą, aby wysuszyć koraliki na powietrzu. Następnie eluuj fragmenty DNA, dodając 32 mikrolitry 10-milimolowego Tris-HCL do kulek.

Aby przeprowadzić reakcję przygotowania końcowego zgodnie z instrukcjami producenta, do sterylnej probówki wolnej od nukleaz dodać siedem mikrolitrów buforu reakcyjnego, trzy mikrolitry mieszanki enzymatycznej, 30 nanogramów cfDNA i podwójnie destylowaną wodę o łącznej objętości 60 mikrolitrów. W osobnej probówce dodaj te same składniki, ale z jednym mikrogramem gDNA zamiast cfDNA. Inkubować mieszaninę w termocyklerze w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 30 minut, a następnie w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 minut bez podgrzewania pokrywki.

Bezpośrednio po inkubacji dodaj do probówki 30 mikrolitrów głównej mieszanki ligacji, jeden mikrolitr wzmacniacza ligacji i cztery mikrolitry unikalnego adaptera do sekwencjonowania. Inkubować reakcję w termocyklerze w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 15 minut bez podgrzewania pokrywy. Wirować, aby ponownie zawiesić kulki magnetyczne i pozostawić je w temperaturze pokojowej na co najmniej 30 minut.

Następnie dodaj 87 mikrolitrów zawieszonych kulek magnetycznych do reakcji ligacji. Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół, a następnie inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po umyciu i wysuszeniu kulek na powietrzu, wymyj cel DNA z kulek, dodając 20 mikrolitrów 10-milimolowego Tris-HCL.

Dodaj 20 mikrolitrów ligowanych fragmentów DNA z adapterem, pięć mikrolitrów startera indeksowego i7, 25 mikrolitrów głównej mieszanki amplifikacji bibliotecznej i podwójnie destylowaną wodę do całkowitej objętości 50 mikrolitrów. PCR amplifikuje adapter ligowany cfDNA lub gDNA. Następnie dodaj 45 mikrolitrów zawieszonych kulek magnetycznych do DNA wzbogaconego PCR.

Wymieszać próbkę, pipetując w górę i w dół, a następnie inkubować przez pięć minut. Po usunięciu supernatantu i umyciu kulek należy użyć 30 mikrolitrów 10-milimolowego Tris-HCL do wymycia fragmentów DNA za pomocą adapterów. Aby przeprowadzić ukierunkowane wychwytywanie DNA, w sterylnej probówce zablokuj próbkę, dodając 1,5 mikrograma bibliotek pulowych, po osiem mikrolitrów bloku P5 100P i bloku P7 100P oraz pięć mikrolitrów po jednym mikrogramie na mikrolitr jednego DNA.

Wysuszyć zawartość probówki za pomocą koncentratora próżniowego ustawionego na 60 stopni Celsjusza. Hybrydyzuj sondy wychwytywania DNA z biblioteką, dodając 8,5 mikrolitra buforu hybrydyzacyjnego 2X, 2,7 mikrolitra wzmacniacza hybrydyzacji i 1,8 mikrolitra podwójnie destylowanej wody bez nukleaz. Mieszać pipetując w górę i w dół i inkubować w mieszalniku termicznym w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Następnie natychmiast dodaj cztery mikrolitry niestandardowej sondy. Próbki inkubować w mieszalniku termicznym w temperaturze 65 stopni Celsjusza z pokrywką podgrzaną do 75 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Inkubuj zhybrydyzowane docelowe DNA za pomocą kulek streptawidyny, a następnie umyj kulki, aby usunąć niezwiązane DNA.

Użyj zestawu komercyjnego zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać ostatnie 20 mikrolitrów zawieszonych kulek z przechwyconymi fragmentami DNA. Etap płukania niezwiązanego DNA z kulek streptawidyny powinien być szybki. W przeciwnym razie może to mieć wpływ na skuteczność wychwytywania docelowego DNA.

Amplifikuj wychwycone fragmenty DNA, wykonując PCR przy użyciu komercyjnego zestawu z dwoma oligonukleotydami szkieletu mikromolowego zgodnie z instrukcjami producenta. Na koniec dodaj 45 mikrolitrów zawieszonych kulek bezpośrednio do produktu PCR i wzbogać amplifikowane docelowe fragmenty DNA związane z kulkami przez elucję 30 mikrolitrami 10-milimolowego Tris-HCL. Określ ilościowo fragmenty i przeprowadź sekwencjonowanie oraz analizę danych zgodnie z protokołem tekstowym.

Poniższa tabela przedstawia, w jaki sposób sekwencja ER-seq zwiększa głębokość pokrycia o 23% w porównaniu z tradycyjną metodą. Wynika to z efektywnego odzyskiwania cząsteczek cfDNA, co znacznie usprawnia analizę rzadkich mutacji. Oczywiste jest również, że unikalne adaptery sekwencjonowania stosowane w ER-seq umożliwiają łatwe różnicowanie duplikacji naturalnych i indukowanych przez PCR.

Jak wyszczególniono w tej tabeli dotyczącej wyników połączeń, analiza oparta na ER-seq była w 100% spójna pod kątem wykrywania EGFR pL858R, a częstotliwość wykrywania była nieco wyższa w porównaniu z tradycyjną analizą. Co ważne, analiza sekwencyjna ER-seq umożliwiła wykrycie innych mutacji o stosunkowo niskiej częstotliwości, w tym EGFR pT790M, który nie został rozpoznany przez tradycyjną analizę ze względu na wysoki szum tła. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 48 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując tej procedury, należy pamiętać, aby uniknąć utraty bardzo małej ilości cfDNA podczas ekstrakcji, przygotowania biblioteki i mycia kulek po hybrydyzacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób ctDNA od pacjenta zostało pobrane, przygotowane i ukierunkowane na podstawie unikalnych identyfikatorów do sekwencjonowania. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się płynną biopsją do zbadania lepszych praktyk w podejmowaniu decyzji klinicznych.