Podział komórek ssaków w matrycach 3D za pomocą ilościowej konfokalnej mikroskopii refleksyjnej
29 listopada 2017
Ten protokół skutecznie bada podział komórek ssaków w matrycach kolagenowych 3D poprzez integrację synchronizacji podziału komórek, monitorowanie zdarzeń podziału w matrycach 3D za pomocą techniki obrazowania żywych komórek, czasowo-rozdzielczą konfokalną mikroskopię refleksyjną i ilościową analizę obrazowania.
Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie podziału komórek ssaków i interakcji macierzy komórkowej w fizjologicznie istotnym środowisku 3D. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona skuteczne i ogólne podejście do badania podziałów komórek ssaków i interakcji macierzy komórkowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii komórki, takie jak molekularne podstawy rozwoju tkanek prawidłowych i chorobowych.
Dzień przed transfekcją umieść pięć milionów limfocytów T HEK-293 w 100-mililitrowym naczyniu do hodowli komórkowej w 10 mililitrach normalnej pożywki do hodowli komórkowych. Inkubuj te komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia, tuż przed rozpoczęciem transfekcji, wyjmij fiolkę z odczynnikiem do transfekcji z czterech stopni Celsjusza i pozostaw ją do osiągnięcia temperatury pokojowej.
Następnie, aby rozpocząć, dodaj jeden mililitr zredukowanej pożywki surowicy do sterylnej probówki do mikrofuge. Do tego dodać określone ilości plazmidów wektorowych lentiwirusowych używanych do transfekcji i wymieszać przez pipetowanie. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut.
Po pięciu minutach dodać 48 mikrolitrów odczynnika do transfekcji do tej probówki i delikatnie wymieszać pipetując. Następnie inkubuj tę mieszaninę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut. Po zakończeniu inkubacji wyjmij płytkę z limfocytami T HEK-293 z inkubatora.
Dodaj przygotowaną mieszaninę odczynników do transfekcji DNA kroplami na komórki i delikatnie obracaj płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie na płytce. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze. Po około sześciu godzinach od transfekcji należy usunąć płytkę i odessać pożywkę.
Dodać 10 mililitrów świeżej pożywki hodowlanej i przenieść płytkę z powrotem do inkubatora. W wielu punktach czasowych, 24, 48 i 72 godziny po transfekcji, zbierz pożywkę hodowlaną zawierającą cząstki lentiwirusa w oddzielnych probówkach. Następnie przefiltruj zebraną pożywkę hodowlaną przez sterylny filtr 0,45 mikrona, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe.
Zastąp świeżą pożywką hodowlaną po każdym zbiorze. Przesącz zawierający cząstki lentiwirusa może być od razu wykorzystany do transdukcji lub może być przechowywany w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Płytki z ludzkimi komórkami raka piersi MDA-MB-231 w 35-milimetrowym naczyniu hodowlanym w normalnej pożywce hodowlanej.
Inkubuj te komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia odessać pożywkę hodowlaną z płytki i dodać jeden mililitr cząstek lentiwirusa razem z jednym mililitrem świeżej pożywki hodowlanej. Inkubować komórki w inkubatorze przez około 16 godzin.
Po zakończeniu inkubacji z cząstkami wirusa należy zdjąć płytkę, aby zassać pożywkę. Następnie dodaj dwa mililitry świeżej pożywki i przenieś z powrotem do inkubatora na 24 do 72 godzin. Sprawdź ekspresję H2B-mCherry w tych transdukowanych komórkach za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.
Aby rozpocząć eksperymenty synchronizacyjne, najpierw płytkie komórki MDA-MB-231 wyrażające H2B-mCherry przy 50 do 60% konfluencji w 24-dołkowej płytce. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Następnego dnia zastąp pożywkę hodowlaną 0,5 mililitra pożywki zawierającej dwumilimolową tymidynę.
Pozostawić płytkę w inkubatorze na 24 godziny. Po zakończeniu inkubacji należy trzykrotnie przemyć komórki PBS, aby uwolnić je z leczenia tymidyną. Następnie pozostaw komórki w 0,5 mililitra normalnej pożywki hodowlanej na pięć godzin w inkubatorze.
Następnie, aby zablokować te komórki w mitozie, dodaj nokodazol do pożywki hodowlanej. Pozostaw komórki w inkubatorze na 12 godzin. Po zakończeniu leczenia nokodazolem należy wyjąć płytkę i za pomocą wytrząsarki orbitalnej wstrząsać komórkami przez 45 sekund do jednej minuty, aby uwolnić komórki mitotyczne.
Następnie przenieś pożywkę zawierającą wyekstrahowane komórki mitotyczne do nowej probówki wirówkowej. Następnie dodaj 0,5 mililitra świeżej pożywki do każdej studzienki. Następnie powtórz potrząsanie i ekstrakcję komórek jeszcze dwa razy.
Zebrać całą zebraną pożywkę, a następnie odwirować ją w celu osadzenia komórek mitotycznych. Po wirowaniu ponownie zawieś osad komórkowy w 0,25 mililitra świeżej pożywki do hodowli komórkowych. Za pomocą hemocytometru policz liczbę komórek.
Na początku tego kroku przygotuj 50 mililitrów 10x roztworu DMEM i wysterylizuj go z filtrem. Następnie określ objętości wszystkich składników, które zostaną użyte do wykonania matrycy kolagenu 3D, jak określono w protokole tekstowym. Wstępnie schłodź wszystkie te składniki na lodzie, aby spowolnić żelowanie kolagenu.
Teraz do wstępnie schłodzonej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej dodaj wymaganą liczbę komórek w pożywce, a następnie 10x DMEM, FBS, wodę dejonizowaną, kolagen i na koniec wodorotlenek sodu. Dokładnie wymieszaj za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra. Gdy roztwór jest dobrze wymieszany, dodaj 500 mikrolitrów mieszaniny do każdego dołka 24-dołkowej płytki.
Umieść 24-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 30 minutach wyjmij płytkę i dodaj 500 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej na wierzch żelu. Przed przystąpieniem do obrazowania należy włączyć żywe komórki mikroskopu kontrastowego i konfokalnego.
Aby uchwycić dzielące się komórki, umieść 24-dołkową płytkę zawierającą komórki osadzone w matrycach kolagenowych w jednostce żywych komórek mikroskopu fluorescencyjnego. Za pomocą obiektywu 10X znajdź spód płytki, a następnie przesuń ją w górę, aż mikroskop ustawi ostrość na około 500 mikrometrach od dna płytki. Przesuń stolik, aby znaleźć komórki w różnych stadiach mitozy i wybierz wiele pozycji do obrazowania.
Skonfiguruj eksperyment poklatkowy z dwuminutowymi interwałami. Następnie, aby zobrazować sieć kolagenową, skonfiguruj mikroskop konfokalny tak, aby wychwytywał tylko światło odbite od lasera o długości 488 nanometrów. Następnie umieść płytkę zawierającą komórki w matrycach kolagenowych w jednostce żywych komórek tego mikroskopu.
Znajdź spód płytki, a następnie przesuń soczewkę obiektywu do góry, aż ustawi ostrość na około 100 mikrometrach od spodu płytki. Przesuwaj stół montażowy, aby znaleźć komórki i wybrać wiele pozycji do obrazowania. Skonfiguruj eksperyment poklatkowy z pięciominutowymi interwałami.
Pokazano tutaj obrazy fluorescencyjne dzielącej się komórki H2B-mCherry z ekspresją MDA-MB-231 osadzonej w macierzy kolagenowej. Różne fazy mitozy są łatwo obserwowane zgodnie z oczekiwaniami. Rozmieszczenie włókien kolagenowych w kolorze białym uwidocznione jednocześnie za pomocą konfokalnej mikroskopii refleksyjnej zmienia się bardzo niewiele w przebiegu mitozy.
Komórka zsynchronizowana z fazą G2-M i osadzona w macierzy kolagenowej kończy podział komórek w ciągu pierwszych dwóch godzin, podczas gdy komórki asynchroniczne kontrolne dzielą się losowo. Kwantyfikacja rozmieszczenia włókien kolagenowych podczas faz interfazowych i mitotycznych sugeruje, że deformacja macierzy jest minimalna podczas podziału komórki i wyższa w komórkach interfazowych. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu siedmiu dni, począwszy od wygenerowania stabilnej linii komórkowej do analizy podziału komórek wideo w matrycy 3D.
Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu dobrze rozumiesz, jak synchronizować i monitorować podział komórek ssaków w matrycach 3D za pomocą obrazowania żywych komórek oraz jak określić deformację matrycy za pomocą konfokalnej mikroskopii refleksyjnej i technik analizy obrazowania ilościowego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół umożliwia efektywne badanie podziałów komórek ssaków w trójwymiarowych macierzach kolagenowych poprzez integrację synchronizacji podziałów komórkowych z monitorowaniem zdarzeń podziału przy użyciu technik obrazowania żywych komórek. Metoda ta pozwala na uzyskanie informacji o oddziaływaniach między komórkami a macierzą w środowisku istotnym fizjologicznie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Obrazowanie żywych komórek
- Trójwymiarowa hodowla komórek
Wprowadzenie
- Technika ta umożliwia obserwację podziałów komórek ssaków w kontekście 3D.
- Pomaga ona w zrozumieniu molekularnych podstaw rozwoju tkanek i chorób.
- Do transfekcji i obserwacji powszechnie wykorzystuje się komórki HEK-293 T.
- Metoda ta podkreśla znaczenie środowiska istotnego fizjologicznie w badaniu zachowania komórek.
Cel badania
- Badanie dynamiki podziału komórek ssaków.
- Analiza oddziaływań między komórkami a macierzą w środowiskach 3D.
- Rozwiązanie fundamentalnych problemów biologii komórki związanych z rozwojem tkanek zdrowych i chorobowych.
Zastosowane metody
- Synchronizacja podziałów komórkowych.
- Techniki obrazowania żywych komórek.
- Mikroskopia konfokalna w odbiciu z rozdzielczością czasową.
- Ilościowa analiza obrazowania.
Główne wyniki
- Efektywne monitorowanie zdarzeń podziału komórek w macierzach 3D.
- Wgląd w oddziaływania między komórkami a ich macierzą pozakomórkową.
- Potencjalne zastosowania w zrozumieniu rozwoju tkanek i patologii.
- Wykazana skuteczność metody w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.
Wnioski
- Niniejszy protokół stanowi cenne narzędzie do badania podziałów komórkowych w kontekście 3D.
- Umożliwia on lepsze zrozumienie zachowania komórek w relacji do ich otoczenia.
- Uzyskane wyniki mogą mieć znaczenie dla badań w dziedzinie biologii rozwoju oraz patologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Badanie podziału komórek ssaków w fizjologicznie istotnych środowiskach 3D pozwala wypełnić krytyczną lukę w przedklinicznej walidacji celów terapeutycznych, w której modele 2D często nie odzwierciedlają zachowań in vivo. Metoda ta umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do hipotez terapeutycznych poprzez kwantyfikację oddziaływań komórka-macierz podczas mitozy, która jest kluczowym procesem w rozwoju tkanek i progresji chorób. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną we wczesnej fazie odkrywania leków poprzez powiązanie fenotypów komórkowych z dynamiką macierzy zewnątrzkomórkowej w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez monitorowanie przebiegu mitozy w trójwymiarowej matrycy kolagenowej, która naśladuje sztywność i architekturę tkanki fizjologicznej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia uniwersalny schemat postępowania w zakresie synchronizacji i śledzenia podziałów komórkowych w liniach komórek nowotworowych i stromalnych w celu walidacji funkcji celu w odpowiednim kontekście.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia uzyskanie ilościowych, rozdzielczych w czasie odczytów z konfokalnej mikroskopii refleksyjnej dotyczących deformacji włókien kolagenowych jako bezpośredniej miary siły wywieranej przez komórkę na macierz podczas podziału.
- Wartość operacyjna: Ustanawia zestandaryzowany, powtarzalny test obrazowania do monitorowania zdarzeń mitotycznych i przebudowy macierzy w hodowli 3D podczas wielodniowych eksperymentów timelapse.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie istotne dla chorób, umożliwiając porównanie zachowania mitotycznego oraz profili interakcji z macierzą między komórkami prawidłowymi a komórkami pochodzącymi z tkanek chorobowych (np. raka piersi MDA-MB-231).
- Wartość operacyjna: Ułatwia ciągłość translacyjną od etapu odkryć po walidację przedkliniczną, zapewniając spójny odczyt 3D zachowania komórkowego powiązanego z wynikami na poziomie tkankowym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje proces odkrywania leków od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, gdzie zrozumienie wierności mitozy oraz odpowiedzi mikrośrodowiskowej dostarcza informacji niezbędnych do wyboru związku i określenia mechanizmu jego działania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących genów lub szlaków regulujących mitozę i adhezję, umożliwiając obrazowanie na żywo dynamiki podziałów w macierzach 3D.
- Screening: Zapewnia gotowość do analizy dzięki zsynchronizowanym populacjom komórek i mierzalnym wynikom deformacji macierzy, odpowiednim do adaptacji w obrazowaniu wysokotreściowym (high-content imaging).
- Analityka: Dostarcza ilościowych pomiarów rozkładu i deformacji włókien kolagenu w czasie, umożliwiając statystyczne porównanie warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy zachowanie mitotyczne z przebudową macierzy zewnątrzkomórkowej, która jest cechą charakterystyczną inwazji nowotworowej i włóknienia, wspierając przedkliniczne modele zorientowane na biomarkery.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy uniwersalną platformę obrazowania, którą można zastosować w różnych typach komórek, macierzach i badaniach nad perturbacjami, aby ograniczyć redundantny rozwój metod.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez ograniczenie niejednoznaczności mechanistycznej w podziale komórki i interakcjach z mikrośrodowiskiem.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki zdefiniowanym protokołom synchronizacji oraz ilościowym parametrom obrazowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, dostarczając wczesnych informacji na temat skuteczności biologicznej i aktywności celów na poziomie tkanki.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ich wpływ na wierność mitozy i interakcje z macierzą w istotnych dla choroby systemach 3D.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie synchronizacji komórek, transdukcji lentiwirusowej oraz konfokalnej mikroskopii żywych komórek.
- Zależne od dostępu do systemów mikroskopii fluorescencyjnej i konfokalnej w odbiciu z kontrolą środowiskową do długoterminowego obrazowania timelapse.
- Wymaga standaryzacji przygotowania macierzy kolagenowej i czasu żelowania pomiędzy partiami w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Adaptacja do alternatywnych macierzy 3D (np. fibryny, Matrigelu) wymaga walidacji sygnału odbicia oraz kompatybilności z procedurą synchronizacji.
- Ograniczenia praktyczne obejmują trudności techniczne związane z izolacją komórek mitotycznych metodą shake-off oraz potencjalną fototoksyczność podczas przedłużonego obrazowania.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:32
Generation of MDA-MB-231 Cells Stably Expressing Histone H2B-mCherry Using Lentiviral Vectors
4:00
Synchronization of Cells Stably Expressing H2B-mCherry
6:02
Incorporation of the Synchronized Cells into Collagen I Matrices
7:18
Live Cell Imaging and Matrix Deformation During Cell Division in 3D Collagen Matrices
8:46
Results: Insights from Imaging Mammalian Cell Division in 3D Collagen Matrices
9:45
Conclusion
