Podział komórek ssaków w matrycach 3D za pomocą ilościowej konfokalnej mikroskopii refleksyjnej

Ten protokół skutecznie bada podział komórek ssaków w matrycach kolagenowych 3D poprzez integrację synchronizacji podziału komórek, monitorowanie zdarzeń podziału w matrycach 3D za pomocą techniki obrazowania żywych komórek, czasowo-rozdzielczą konfokalną mikroskopię refleksyjną i ilościową analizę obrazowania.

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie podziału komórek ssaków i interakcji macierzy komórkowej w fizjologicznie istotnym środowisku 3D. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona skuteczne i ogólne podejście do badania podziałów komórek ssaków i interakcji macierzy komórkowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii komórki, takie jak molekularne podstawy rozwoju tkanek prawidłowych i chorobowych.

Dzień przed transfekcją umieść pięć milionów limfocytów T HEK-293 w 100-mililitrowym naczyniu do hodowli komórkowej w 10 mililitrach normalnej pożywki do hodowli komórkowych. Inkubuj te komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia, tuż przed rozpoczęciem transfekcji, wyjmij fiolkę z odczynnikiem do transfekcji z czterech stopni Celsjusza i pozostaw ją do osiągnięcia temperatury pokojowej.

Następnie, aby rozpocząć, dodaj jeden mililitr zredukowanej pożywki surowicy do sterylnej probówki do mikrofuge. Do tego dodać określone ilości plazmidów wektorowych lentiwirusowych używanych do transfekcji i wymieszać przez pipetowanie. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Po pięciu minutach dodać 48 mikrolitrów odczynnika do transfekcji do tej probówki i delikatnie wymieszać pipetując. Następnie inkubuj tę mieszaninę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut. Po zakończeniu inkubacji wyjmij płytkę z limfocytami T HEK-293 z inkubatora.

Dodaj przygotowaną mieszaninę odczynników do transfekcji DNA kroplami na komórki i delikatnie obracaj płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie na płytce. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze. Po około sześciu godzinach od transfekcji należy usunąć płytkę i odessać pożywkę.

Dodać 10 mililitrów świeżej pożywki hodowlanej i przenieść płytkę z powrotem do inkubatora. W wielu punktach czasowych, 24, 48 i 72 godziny po transfekcji, zbierz pożywkę hodowlaną zawierającą cząstki lentiwirusa w oddzielnych probówkach. Następnie przefiltruj zebraną pożywkę hodowlaną przez sterylny filtr 0,45 mikrona, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe.

Zastąp świeżą pożywką hodowlaną po każdym zbiorze. Przesącz zawierający cząstki lentiwirusa może być od razu wykorzystany do transdukcji lub może być przechowywany w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Płytki z ludzkimi komórkami raka piersi MDA-MB-231 w 35-milimetrowym naczyniu hodowlanym w normalnej pożywce hodowlanej.

Inkubuj te komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia odessać pożywkę hodowlaną z płytki i dodać jeden mililitr cząstek lentiwirusa razem z jednym mililitrem świeżej pożywki hodowlanej. Inkubować komórki w inkubatorze przez około 16 godzin.

Po zakończeniu inkubacji z cząstkami wirusa należy zdjąć płytkę, aby zassać pożywkę. Następnie dodaj dwa mililitry świeżej pożywki i przenieś z powrotem do inkubatora na 24 do 72 godzin. Sprawdź ekspresję H2B-mCherry w tych transdukowanych komórkach za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.

Aby rozpocząć eksperymenty synchronizacyjne, najpierw płytkie komórki MDA-MB-231 wyrażające H2B-mCherry przy 50 do 60% konfluencji w 24-dołkowej płytce. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Następnego dnia zastąp pożywkę hodowlaną 0,5 mililitra pożywki zawierającej dwumilimolową tymidynę.

Pozostawić płytkę w inkubatorze na 24 godziny. Po zakończeniu inkubacji należy trzykrotnie przemyć komórki PBS, aby uwolnić je z leczenia tymidyną. Następnie pozostaw komórki w 0,5 mililitra normalnej pożywki hodowlanej na pięć godzin w inkubatorze.

Następnie, aby zablokować te komórki w mitozie, dodaj nokodazol do pożywki hodowlanej. Pozostaw komórki w inkubatorze na 12 godzin. Po zakończeniu leczenia nokodazolem należy wyjąć płytkę i za pomocą wytrząsarki orbitalnej wstrząsać komórkami przez 45 sekund do jednej minuty, aby uwolnić komórki mitotyczne.

Następnie przenieś pożywkę zawierającą wyekstrahowane komórki mitotyczne do nowej probówki wirówkowej. Następnie dodaj 0,5 mililitra świeżej pożywki do każdej studzienki. Następnie powtórz potrząsanie i ekstrakcję komórek jeszcze dwa razy.

Zebrać całą zebraną pożywkę, a następnie odwirować ją w celu osadzenia komórek mitotycznych. Po wirowaniu ponownie zawieś osad komórkowy w 0,25 mililitra świeżej pożywki do hodowli komórkowych. Za pomocą hemocytometru policz liczbę komórek.

Na początku tego kroku przygotuj 50 mililitrów 10x roztworu DMEM i wysterylizuj go z filtrem. Następnie określ objętości wszystkich składników, które zostaną użyte do wykonania matrycy kolagenu 3D, jak określono w protokole tekstowym. Wstępnie schłodź wszystkie te składniki na lodzie, aby spowolnić żelowanie kolagenu.

Teraz do wstępnie schłodzonej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej dodaj wymaganą liczbę komórek w pożywce, a następnie 10x DMEM, FBS, wodę dejonizowaną, kolagen i na koniec wodorotlenek sodu. Dokładnie wymieszaj za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra. Gdy roztwór jest dobrze wymieszany, dodaj 500 mikrolitrów mieszaniny do każdego dołka 24-dołkowej płytki.

Umieść 24-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 30 minutach wyjmij płytkę i dodaj 500 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej na wierzch żelu. Przed przystąpieniem do obrazowania należy włączyć żywe komórki mikroskopu kontrastowego i konfokalnego.

Aby uchwycić dzielące się komórki, umieść 24-dołkową płytkę zawierającą komórki osadzone w matrycach kolagenowych w jednostce żywych komórek mikroskopu fluorescencyjnego. Za pomocą obiektywu 10X znajdź spód płytki, a następnie przesuń ją w górę, aż mikroskop ustawi ostrość na około 500 mikrometrach od dna płytki. Przesuń stolik, aby znaleźć komórki w różnych stadiach mitozy i wybierz wiele pozycji do obrazowania.

Skonfiguruj eksperyment poklatkowy z dwuminutowymi interwałami. Następnie, aby zobrazować sieć kolagenową, skonfiguruj mikroskop konfokalny tak, aby wychwytywał tylko światło odbite od lasera o długości 488 nanometrów. Następnie umieść płytkę zawierającą komórki w matrycach kolagenowych w jednostce żywych komórek tego mikroskopu.

Znajdź spód płytki, a następnie przesuń soczewkę obiektywu do góry, aż ustawi ostrość na około 100 mikrometrach od spodu płytki. Przesuwaj stół montażowy, aby znaleźć komórki i wybrać wiele pozycji do obrazowania. Skonfiguruj eksperyment poklatkowy z pięciominutowymi interwałami.

Pokazano tutaj obrazy fluorescencyjne dzielącej się komórki H2B-mCherry z ekspresją MDA-MB-231 osadzonej w macierzy kolagenowej. Różne fazy mitozy są łatwo obserwowane zgodnie z oczekiwaniami. Rozmieszczenie włókien kolagenowych w kolorze białym uwidocznione jednocześnie za pomocą konfokalnej mikroskopii refleksyjnej zmienia się bardzo niewiele w przebiegu mitozy.

Komórka zsynchronizowana z fazą G2-M i osadzona w macierzy kolagenowej kończy podział komórek w ciągu pierwszych dwóch godzin, podczas gdy komórki asynchroniczne kontrolne dzielą się losowo. Kwantyfikacja rozmieszczenia włókien kolagenowych podczas faz interfazowych i mitotycznych sugeruje, że deformacja macierzy jest minimalna podczas podziału komórki i wyższa w komórkach interfazowych. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu siedmiu dni, począwszy od wygenerowania stabilnej linii komórkowej do analizy podziału komórek wideo w matrycy 3D.

Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu dobrze rozumiesz, jak synchronizować i monitorować podział komórek ssaków w matrycach 3D za pomocą obrazowania żywych komórek oraz jak określić deformację matrycy za pomocą konfokalnej mikroskopii refleksyjnej i technik analizy obrazowania ilościowego.