Sygnały generacji drugiej harmonicznej w twardówce królika jako narzędzie do oceny terapeutycznego sieciowania tkanek (TXL) w przypadku krótkowzroczności

Ogólnym celem tego protokołu jest zademonstrowanie zastosowania mikroskopii drugiej generacji do wizualizacji i pomiaru efektu sieciowania kolagenu w tkance twardówki, wywołanego przez wstrzyknięcie sub-tenonu środka uwalniającego formaldehyd i potwierdzonego różnicową kalorymetrią skaningową. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie terapeutycznego sieciowania tkanek poprzez zapewnienie nieinwazyjnej metody oceny indukowanych efektów sieciowania. Główną zaletą tej techniki jest to, że sygnały generowane przez drugą harmoniczną są wysoce specyficzne dla włókienek kolażowych i jako takie nie jest wymagane żadne specjalne przygotowanie tkanki, takie jak barwienie przeciwciał.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy przeczytaliśmy o procedurze stosowanej do terapeutycznego sieciowania tkanki rogówki. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ udana mikroskopia drugiej harmonicznej wymaga starannego umieszczenia tkanki i ustawienia prawidłowych warunków obrazowania, aby zapobiec uszkodzeniom tkanek i artefaktom podczas pomiaru sygnału. Leczenie należy rozpocząć od wstrzyknięcia sub-tenonu w gałki oczne królika zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Pokaż tutaj jest schematycznym przedstawieniem miejsca iniekcji podczopowy. Wybierz wziernik o optymalnej wielkości w zależności od wielkości oka. Po trzech i pół godzinach inkubacji cofnij powieki za pomocą wziernika powiek, aby zoptymalizować dostęp do kuli ziemskiej.

Oddziel spojówkę otaczającą rąbek i przetnij mięśnie dodatkowe oka w miejscach ich przyczepu twardówkowego. Wytnij górną część twardówki za pomocą nożyczek lub ostrza, aby utworzyć obszar jeden na jeden centymetr z miejscem wstrzyknięcia umieszczonym centralnie. Zeskrobać pozostałe warstwy siatkówki i naczyniówki i przemyć dwukrotnie świeżym PBS, za każdym razem pozostawiając kawałki w roztworze na około 10 sekund.

Umieść tkankę w jednej mililitrowej probówce wypełnionej roztworem PBS w celu transportu do zakładu obrazowania. Aby zmaksymalizować sygnał i rozdzielczość podczas wykonywania mikroskopii SHG, należy użyć soczewki obiektywowej zoptymalizowanej pod kątem przepuszczania światła podczerwonego o dużej aperturze numerycznej. Wyreguluj kołnierz korekcyjny obiektywu, aby dopasować go do głębokości próbki.

W tym przypadku 0,17 milimetra. Zamontuj 25-krotną soczewkę obiektywu na mikroskopie i dodaj dużą ilość żelu zanurzeniowego na bazie wody, aby pokryć powierzchnię soczewki. Ważne jest, aby wykonać obrazowanie tkanek w ciągu 30 minut od zamontowania próbki na mikroskopie, aby utrzymać nawodnienie tkanki i zapobiec wysuszeniu żelu zanurzeniowego między obiektywem soczewki a szkiełkiem, ponieważ spowodowałoby to zmiany w sygnale SHG.

Zmontuj komorę komórki, umieszczając 25-milimetrową okrągłą szkiełko nakrywkowe w dolnej części komory. Umieść kawałek tkanki twardówki na szkiełku nakrywkowym i dodaj od 50 do 100 mikrolitrów buforu. Przykryj chusteczkę drugim okrągłym szkiełkiem nakrywkowym i przykręć górną część komory, nie dociskając ani nie spłaszczając chusteczki.

Następnie zamontuj komorę komórkową z próbką tkanki na stoliku mikroskopu. Ustaw stolik i wyreguluj wysokość obiektywu tak, aby dolna powierzchnia próbki była ostra, zgodnie z kontrolą w jasnym polu przez okular. Wyłącz wszystkie światła z wyjątkiem monitora komputera i zablokuj jak najwięcej światła z monitora za pomocą arkuszy folii aluminiowej udrapowanych na stoliku mikroskopu.

W oprogramowaniu wyłącz tryb Eye Port. W panelu TI Pad sprawdź, czy definicja obiektywu jest prawidłowa. W panelu Kompaktowy graficzny interfejs użytkownika A1 wybierz laser na podczerwień do obrazowania, wybierz detektory bez deskanowania i wybierz kanał DAPI, który jest wyposażony w filtr pasma przepustowego od 400 do 450 nanometrów.

W panelu A1 Multi Photon Graphical User Interface (Graficzny interfejs użytkownika A1) ustaw długość fali lasera na podczerwień na 860 nanometrów i otwórz migawkę. Poczekaj, aż długość fali emisji zmieni się, zgodnie ze stałym zielonym światłem. Aby ustawić warunki skanowania laserowego w panelu Kompaktowy graficzny interfejs użytkownika A1, wybierz skaner Galvano, skanowanie kierunkowe urządzenia, rozmiar klatki 1024 na 1024 piksele, czas przebywania pikseli 6,2 mikrosekundy i uśrednianie linii 2X.

Następnie włącz obrazowanie na żywo w trybie wyszukiwania i ustaw warunki obrazowania w panelu kompaktowego graficznego interfejsu użytkownika AI, dostosowując moc lasera i wzmocnienie detektora. Ustaw moc lasera w zakresie od 50 miliwatów do 150 miliwatów, czyli od dwóch procent do sześciu procent dla lasera o długości 860 nanometrów. Powyżej tego zakresu może dojść do uszkodzenia tkanek.

Otwórz panel Tabela odnośników, w którym wyświetlany jest histogram wartości intensywności pikseli na bieżącym obrazie, a następnie dostosuj wzmocnienie detektora na pasku oznaczonym HV, aby zmaksymalizować zakres wartości pikseli, unikając nasycenia. Użyj próbki o najwyższym sygnale SHG, aby znaleźć optymalne ustawienia lasera i wzmocnienia. Zachowaj identyczne ustawienia dla wszystkich próbek, które mają być porównywane w jednym eksperymencie.

Ta praktyka gwarantuje, że żadna próbka w eksperymencie nie nasyci detektora. Aby zeskanować tkanki w trybie podglądu, otwórz narzędzie podglądu XYZ. Ustaw obrazowanie na niższą rozdzielczość, aby przyspieszyć akwizycję obrazów w tym trybie.

W panelu podglądu XYZ kliknij prawym przyciskiem myszy bieżącą pozycję i wybierz skanowanie pięć na pięć, trzy na trzy lub przechwytywanie pojedynczego widoku. Po zakończeniu skanowania przejdź do nowej lokalizacji, klikając dwukrotnie obszar poza bieżącym podglądem. Włącz tryb Live Scan, a następnie ustaw ostrość na tkance, ponieważ różne obszary tkanki mogą mieć nieco inne położenie w kierunku osiowym.

Uchwyć nowe pola widzenia pięć na pięć, trzy na trzy lub pojedyncze. Powtarzaj ten proces, aż pojawi się podgląd dużego obszaru tkanki. W narzędziu podglądu XYZ kliknij dwukrotnie pozycję, w której włókna kolagenowe są widoczne w całym polu widzenia, aby przesunąć stolik w to konkretne miejsce.

Ustaw obrazowanie w wysokiej rozdzielczości, 1024 na 1024 piksele i 2-krotne uśrednianie linii. Włącz tryb Live Find, dostosuj położenie obiektywu tak, aby dolna płaszczyzna była ostra, a następnie w TI Pad użyj napędu Z Drive, aby przesunąć płaszczyznę optyczną o 10 mikrometrów powyżej tej dolnej warstwy. Uzyskaj obraz za pomocą przycisku przechwytywania, zapisz lokalizację za pomocą przycisku plusa w narzędziu do przeglądania XYZ.

Kliknij dwukrotnie nową lokalizację i powtórz proces regulacji głębi i przechwytywania obrazu. Dla każdego kawałka tkanki zrób 10 obrazów. Pola widzenia nie powinny się na siebie nakładać, jak pokazano w lokalizacjach zapisanych w narzędziu podglądu XYZ.

Na koniec umieść kawałki twardówki w jednomililitrowej probówce z PBS natychmiast po zakończeniu mikroskopii, przygotowując się do późniejszej analizy różnicowej kalorymetrii skaningowej. Na początek wytnij środkową część kontroli i potraktuj twardówkę nożyczkami. Osusz każdy kwadrat twardówki chłonną chusteczką i połóż go płasko na dnie patelni DSC za pomocą kleszczy zębatych.

Gdy chusteczka znajduje się w środku, a warga jest zaciśnięta i zakryta, zważ szalkę, aby uzyskać mokrą masę tkanki. Następnie umieść zważoną próbkę w wyznaczonym miejscu na tacy automatycznego podajnika próbek DSC. Utwórz metodę za pomocą oprogramowania do zarządzania instrumentami, określając masę tkanki i uruchom analizę termiczną przy użyciu obwodów wymienionych w protokole tekstowym.

Po zakończeniu przeanalizuj dane dla każdej próbki, wyodrębniając pik temperatury przejścia, przy którym następuje denaturacja termiczna, za pomocą oprogramowania do obrazowania instrumentu. Obrazy SHG twardówki analizowano na Fidżi pod kątem średniej jasności pikseli. Po otwarciu obrazu i wybraniu menu analizy, a następnie pomiaru, otwiera się tabela z wynikami zawierająca średnią jasność sygnału.

Alternatywnie w menu Analizuj wybierany jest histogram, aby utworzyć histogram wartości intensywności pikseli, który zawiera informacje o średniej jasności i zmienności sygnału na obrazie. Pomiar ten powtórzono dla wszystkich obrazów z próbek kontrolnych i usieciowanych. Przedstawiono tutaj reprezentatywne obrazy SHG twardówki wraz z towarzyszącą analizą histogramu, w tym średnią jasność.

Próbka kontrolna charakteryzuje się falistym układem włókienek. Pokazano tutaj próbkę usieciowaną 400-milimolowym SMG o zwiększonej intensywności pikseli, odsłaniając włókna kolagenowe, które wydają się prostsze. Wyniki analizy termicznej wskazują na wyższy szczyt temperatury denaturacji i potwierdzają efekt sieciowania.

Pokazano próbkę kontrolną i 400-milimolową krzywą denaturacji próbki usieciowanej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować usieciowaną próbkę i jak wykonać mikroskopię SHG na próbkach twardówki. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie mają problemy z precyzyjnym wstrzykiwaniem w przestrzeni pod czopem, chirurgicznie usuwając kwadrat wokół miejsca wstrzyknięcia i ustawiając warunki obrazu, aby zeskanować tkankę w trybie podglądu.

Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak autoluorescencja, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak analiza elastyny, w tym kwantyfikacja i morfologia. Implikacje tej techniki dostarczania czynnika sieciującego rozciągają się na terapię wysokiej krótkowzroczności i gronkowca tylnego, ponieważ zapewnia łatwiejszy dostęp do tylnego bieguna w celu stabilizacji twardówki. Implikacje tej techniki mikroskopowej rozciągają się w kierunku diagnozy wysokiej krótkowzroczności i powikłań spowodowanych osłabieniem kolagenu poprzez pomiar stanu usieciowania kolagenu w chorej twardówce lub poprzez pomiar wyniku po zakończeniu pożądanej procedury sieciowania.

Tak więc ta metoda sieciowania i mikroskopia drugiej generacji harmonicznej mogą zapewnić wgląd w sieciowanie twardówki, można ją również zastosować do innych tkanek, takich jak rogówka, skóra, chrząstki, ścięgna, zastawki serca i naczynia krwionośne.