Alternatywna metoda hodowli w celu utrzymania genomowej hipometylacji embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu inhibitora MEK PD0325901 i witaminy C

Opisaliśmy szczegółowo dwa protokoły chemiczne do hodowli embrionalnych komórek macierzystych myszy. Ta nowa metoda wykorzystuje synergiczne mechanizmy promowania utleniania za pośrednictwem Tet (przez witaminę C) i tłumienia syntezy de novo 5-metylocytozyny (przez PD0325901) w celu utrzymania hipometylacji DNA i pluripotencji embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Ogólnym celem tego protokołu jest wykorzystanie związków małocząsteczkowych PD0325901 i witaminy C do utrzymania stanu hipometylowanego i pluripotencjalnego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie hodowlanych mysich embrionalnych komórek macierzystych myszy z hodowlą FBS, takie jak heterogeneracja morfologii i dehipermetylacja. Tak więc główną zaletą tej techniki jest to, że embrionalne komórki macierzyste myszy są w stanie utrzymać doskonałą morfologię oraz stan hipometylowany i niezróżnicowany.

Po przygotowaniu płytek i, zgodnie z protokołem tekstowym, należy podgrzać mysie komórki ES, pożywkę hodowlaną, trypsynę i PBS w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby przejść przez komórki, odessać pożywkę z naczynia i użyć dwóch mililitrów PBS do dwukrotnego przepłukania komórek. Następnie usuń PBS i dodaj 0,3 mililitra trypsonu EDTA do komórek i szybko przechyl naczynie, aby przykryć komórki w roztworze.

Natychmiast usuń trypsynę i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę, aby oderwać komórki. Dodaj dwa mililitry wstępnie podgrzanej pożywki surowicy, aby dezaktywować trypsynę i użyj pięciomililitrowej pipety, aby ponownie zawiesić kolonie komórkowe 10 razy w zawiesinie pojedynczej komórki. Umieść 150 mikrolitrów roztworu komórkowego w nowym sześciocentymetrowym naczyniu pokrytym żelatyną i uzupełnij trzema mililitrami świeżo przygotowanego podłoża VCPD0325901.

Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach CO2. Ze względu na niestabilność Vc, co 24 godziny podczas inkubacji usuń starą pożywkę hodowlaną i dodaj trzy mililitry świeżej pożywki Vcpd0325901. Po osiągnięciu 70 do 80 procent konfluencji, przejdź komórki i kontynuuj ich hodowlę, jak właśnie pokazano.

Aby przeprowadzić ekstrakcję DNA, zbierz komórki z trypsyną, jak pokazano wcześniej, i użyj zestawu do oczyszczania genomowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Dodaj 100 mikrolitrów ultra czystej wody do probówki z DNA i rozpuść DNA, pipetując około 15 razy. Następnie użyj spektrofotometru, aby zmierzyć stosunek Od260 do 280, aby określić stężenie i jakość DNA.

Stężenie DNA powinno wynosić około 500 nonogramów na mikrolitr. Następnie strawić pięć mikrogramów DNA, łącząc je z pięcioma mikrolitrami 100-milimolowego chlorowodorku tris PH7,6, dwiema jednostkami fosfatazy jelitowej cielęcej, jedną jednostką Dnazy i 0,005 jednostki jadu węża, fosfodyesterazy jeden. Następnie użyj ultra czystej wody, aby zwiększyć objętość do 50 mikrolitrów.

Inkubuj reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka pobrać próbkę przez odwirowanie w temperaturze 1 000 x g w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Następnie przenieś roztwór do probówek ultrafiltracyjnych i wiruj próbki w temperaturze 13 000 x g i 4 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby usunąć enzymy trawiące.

Aby przygotować próbki do analizy 5HMC, przenieś 36 mikrolitrów filtratu do nowej jednomililitrowej probówki i dodaj cztery mikrolitry D35HMC, aby uzyskać końcowe stężenie trzech nanomolowców. Do analizy 5MC odpipeuj 196 mikrolitrów ultra czystej wody do nowej probówki wirówkowej i dodaj cztery mikrolitry filtratu ze względu na wysoką gęstość 5MC w genomowym DNA. Przenieś 36 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu 5MC do nowej probówki wirówkowej i dodaj cztery mikrolitry D35MC, aby uzyskać końcowe stężenie 50 nanomolowych.

Użyj D35HMC i D35MC jako wzorców wewnętrznych do kalibracji odpowiednio 5HMC i 5MC. Po skonfigurowaniu parametrów do analizy 5MC i 5HMC w oprogramowaniu UHPLCMS, zgodnie z protokołem tekstowym, ustal parametry dla QQQMSMSMS, klikając MS QQQ. Jako czas zatrzymania wybierz opcję Bez limitu/Jako pompa.

Jako źródło jonów wybierz ESI. Aby filtrować czas, zaznacz opcję Szerokość szczytu i wprowadź 0,07 minuty. Aby skonfigurować segmenty czasu, jako godzinę rozpoczęcia wybierz zero.

Aby ustawić tryb skanowania w MRM w celu przeanalizowania aluzji z kolumny, jako typ skanowania wybierz MRM. W polu Wartość działki wybierz opcję Do MS. W polu Delta EMV plus wprowadź wartość 200, a w polu Delta EMV minus wprowadź zero. Zbuduj parametry monitorowania przejść, klikając najpierw MSQQQ one akwizycja.

Aby ustawić segmenty skanowania, w polu Zatrzymanie wprowadź wartość 90. Aby ustawić napięcia fragmentu dla Fragmentora, wprowadź 90. W polu Energia zderzenia wprowadź pięć.

W polu Cell Accelerator Voltage (Napięcie akceleratora ogniwa) wprowadź cztery. Aby ustawić tryb jonów dodatnich, w polu Polaryzacja wybierz dodatni. Aby przeprowadzić separację mononukleozydów UHPLC, przygotuj roztwory a i b do aluzji 5MC i cytozyny, mieszając 500 mililitrów ultra czystej wody z 500 mikrolitrami kwasu mrówkowego dla roztworu a.

Następnie odmierz 500 mililitrów 100-procentowego metanolu i roztworu b. Wymieszaj roztwór a i roztwór b w stosunku 95 do pięciu objętości jako fazę ruchomą, aby wymyć 5MC i C. Następnie ustaw natężenie przepływu na 0,25 mililitra na minutę. Oddziel 5HMC za pomocą zoptymalizowanej alluzji gradientu.

Następnie ustaw natężenie przepływu na 0,25 mililitra na minutę. Monitoruj przejścia dla 5MC, D35MC, DC, 5HMC i D35HMC. Ustaw napięcie kapilarne na 3 500 woltów.

Następnie ustaw objętość wtrysku na 5 mikrolitrów i trzykrotnie przeanalizuj każdą próbkę. Zastosuj odpowiednie krzywe standardowe, aby ocenić ilość 5MC i 5HMC zgodnie z protokołem tekstowym. Jak widać w tej analizie genomowego DNA w mysich komórkach ES za pomocą UHPLC MSMS, leczenie VcPD0325901 spowodowało szybszy spadek metylacji DNA i osiągnęło stały poziom pięciu MC po pięciu dniach, podczas gdy leczenie Vc 2i spowodowało porównywalny poziom w dniu 11.

Ten wykres pokazuje, że leczenie zawierające Vc dramatycznie zwiększyło częstość występowania 5HMC po jednym dniu, a następnie poziomy 5HMC stopniowo spadały z powodu postępującego zmniejszania substratu 5MC. Analiza Western blot wykazała, że Prdm14 był znacznie podwyższony, podczas gdy Dnmt3b i jego kofaktor, Dnmt3l, były znacznie obniżone, gdy komórki wycofały się z PD0325901, co wskazuje na działanie PD0325901 w usuwaniu 5MC. W tym teście fosfatazy alkalicznej wszystkie mysie komórki ES były zabarwione na fioletowo z morfologią przypominającą kulę, gdy były hodowane przez 26 dni w VcPD032590, co wskazuje na stan niezróżnicowany.

W przeciwieństwie do tego, komórki wyhodowane w FBS zawierające samą pożywkę wydawały się mieć jasny kolor z częściowym rozprzestrzenianiem się wskazującym na częściowe różnicowanie. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że FBS musi być wstępnie sprawdzony.

Należy również unikać nadmiernego pipetowania komórek przez pasaż i codziennej wymiany pożywki hodowlanej VcPDO325901. Po tym opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się hodowlą mysich komórek ES in vitro w celu zbadania rozwoju i procesów zarodków in vitro oraz wygenerowanych komórek o znaczeniu medycznym dla medycyny regeneracyjnej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś lepiej zrozumieć, jak utrzymać morfologię wzrostu oraz hipermetylowany i mnogi silny stan dla mysich komórek ES przy użyciu dwóch małych składników molekularnych, inhibitora MEK PD0325901.

Nie zapominaj, że praca z Trisol, DMS lub PMS i DTT może być bardzo niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, maski i okularów, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania tej procedury.