Name: Alternatywna metoda hodowli w celu utrzymania genomowej hipometylacji embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu inhibitora MEK PD0325901 i witaminy C (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Poznaj metodę hodowli komórek macierzystych myszy z zachowaniem hipometylacji genomowej przy użyciu PD0325901 i witaminy C. Protokół utrzymuje pluripotencję i doskonałą morfologię komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (21435008 i 21327006 do H.W.) oraz Strategiczny Priorytetowy Program Badawczy Chińskiej Akademii Nauk (XDB14030200 do H.W.).

1. Przygotowania
<ol>
	<li>Przygotować roztwór 1,0 mM PD0325901 (inhibitor MEK) i 3,0 mM CHIR99021 (inhibitor GSK3).
	<ol>
		<li>Odważyć 2 mg PD0325901 i dodać 4,15 ml DMSO do fiolki ze szkła bursztynowego.</li>
		<li>Odważyć 2 mg CHIR99021 i dodać 1,43 ml DMSO do fiolki z bursztynowego szkła.</li>
		<li>Po rozpuszczeniu podwielokrotności (50 μl/probówkę w probówkach PCR o pojemności 200 μl) należy przechowywać w temperaturze -20 °C i chronić przed światłem. Przed użyciem wyjmij tubkę zawierającą zamrożony bulion z zamrażarki i rozmroź w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odważyć 0,0176 g Vc w 1 ml probówki wirówkowej i rozpuścić ją w 1 ml sterylnej wody do końcowego stężenia 100 mM przed użyciem.</li>
	<li>Inaktywacja FBS: inkubować 500 ml FBS w łaźni wodnej w temperaturze 56 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Przygotować 600 ml podłoża zasadowego do hodowli mysich komórek ES.
	<ol>
		<li>Użyj butelki DMEM/pożywki o wysokiej zawartości glukozy (500 ml) i usuń 40 ml.</li>
		<li>Uzupełnienie 460 ml DMEM/pożywki o wysokiej zawartości glukozy 20% inaktywowanym FBS (120 ml), 1000 U/ml LIF (60 μL 107 U/ml roztworu podstawowego), 0,1 mM aminokwasów endogennych (NEAA) (6 ml 10 mM roztworu podstawowego), 1 mM pirogronianu sodu (6 ml 100 mM roztworu podstawowego), 2 mM L-glutaminy (6 ml 200 mM roztworu podstawowego), 0,1 mM β-merkaptoenolu (600 μl 100 mM roztworu podstawowego) oraz 33 j.m./ml penicyliny i 33 μg/ml streptomycyny (2 ml mieszaniny penicyliny i streptomycyny (10 000 j.m./ml penicyliny i 10 000 μg/ml streptomycyny)). Zdefiniuj podłoże podstawowe jako podłoże surowicy.</li>
		<li>Odpipetować 50 μl roztworu podstawowego odpowiednio PD0325901 (1,0 mM) i Vc (100 mM) do 50 ml pożywki surowicy (stężenie końcowe: 1,0 μM PD0325901 i 100 μM Vc) i zdefiniować pożywkę jako Vc/PD0325901 pożywkę. 
		UWAGA: Przed użyciem przygotuj podłoże Vc/PD0325901 świeże ze względu na niestabilność Vc.</li>
		<li>Za pomocą pipety przenieść 50 μl roztworu podstawowego odpowiednio PD0325901 (1,0 mM) i CHIR99021 (3,0 mM) do 50 ml pożywki surowicy (stężenie końcowe: PD0325901 1,0 μM i CHIR99021 3,0 μM) i zdefiniować pożywkę jako pożywkę 2i.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj naczynia pokryte żelatyną.
	<ol>
		<li>Przygotować 0,1% roztwór żelatyny: rozpuścić 0,3 g żelatyny w 300 ml ultraczystej wody w szklanej butelce z odczynnikiem z nakrętką i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min. Sterylny roztwór przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować szalki do hodowli komórkowych (o średnicy 6 cm) z 2 ml 0,1% roztworu żelatyny przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odessać żelatynę. Wysuszyć naczynia na powietrzu i zużyć je w ciągu 12 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 10 ml mysiej pożywki do zamrażania komórek ES w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml: 90% FBS (9 ml) i 10% DMSO (1 ml). Zużyć podłoże w ciągu 1 dnia.</li>
	<li>Przygotuj pojemnik do zamrażania: dodaj 100% alkoholu izopropylowego do linii napełniania pojemnika do zamrażania i wyrzuć stary alkohol izopropylowy. Dodaj nowy alkohol izopropylowy bezpośrednio po co piątym użyciu.</li>
	<li>Przygotować bufor do wytrawiania enzymatycznego: odważyć 1,2114 g proszku Tris w 100 ml ultraczystej wody, aby przygotować 100 mM roztwór Tris i dodać stężony roztwór HCl (około 12 M) do roztworu Tris, aby dostosować pH do 7,6 (około 0,6 ml stężonego roztworu HCl).</li>
	<li>Przygotować 50 ml buforu do oznaczania radioimmunoprecypitacji (bufor RIPA): 20 mM Tris, pH 7,4, 1 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 20% glicerolu, 0,5% NP40, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA. Przed użyciem uzupełnij 1 mM DTT, koktajl inhibitorów proteazy 1X i 1 mM PMSF. Po dodaniu PMSF należy zużyć bufor w ciągu 30 minut.</li>
</ol>
2. Hoduj mysie komórki ES na naczyniach pokrytych żelatyną
<ol>
	<li>Wstępnie ogrzej mysie komórki ES (typ dziki, 129 SvEv) pożywkę hodowlaną, trypsynę i roztwór buforowany fosforanem (PBS) w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przejdź przez komórki. Całkowicie odessać pożywkę z naczynia i odpipetować 2 ml PBS do szalek w celu przepłukania komórek.
	<ol>
		<li>Usunąć PBS za pomocą pipety i ponownie umyć komórki 2 ml PBS.</li>
		<li>Usuń PBS i dodaj 0,3 ml trypsyny-EDTA (0,25%) do każdego naczynia.</li>
		<li>Szybko przykryj całe naczynie trypsyną, a następnie natychmiast ją wyjmij.</li>
		<li>Umieścić naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 minutę w celu odłączenia komórek od naczynia. Wyjmij szalki z inkubatora i dodaj 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki surowicy, aby zakończyć działanie trypsyny.</li>
		<li>Oddzielić kolonie komórkowe do zawiesiny pojedynczej komórki, ponownie zawieszając ją pipetą (końcówka pipety 5 ml) 10 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś 150 μl z 2 ml roztworu komórkowego (około 190 000 komórek przez zliczenie za pomocą hemocytometru) do nowego naczynia pokrytego żelatyną i uzupełnij 3 ml świeżo przygotowanej pożywki Vc/PD0325901 na 6 cm naczynie hodowlane. Hodować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Co 24 godziny podczas inkubacji usuwaj starą pożywkę hodowlaną i dodawaj 3 ml świeżej pożywki Vc/PD0325901 do naczynia hodowlanego ze względu na niestabilność Vc. Spodziewaj się 70-80% konfluencji po 2-3 dniach.</li>
	<li>Po osiągnięciu 70-80% konfluencji należy przejść komórki i kontynuować ich hodowlę zgodnie z opisem w krokach 2.2–2.4.</li>
</ol>
3. Zamroź i rozmroź komórki ES myszy
<ol>
	<li>Zamroź komórki ES myszy.
	<ol>
		<li>Odłącz komórki od naczyń z trypsyną, wykonując krok 2.2.</li>
		<li>Przenieś komórki do plastikowej probówki o pojemności 15 ml i odwiruj w temperaturze 800 x g i temperaturze pokojowej przez 3 minuty.</li>
		<li>Delikatnie wsypać supernatant do zlewki i ponownie zawiesić osad komórek z 1 ml świeżo przygotowanej pożywki do zamrażania. Przygotuj pożywkę do zamrażania 30 minut przed tym krokiem, aby przed użyciem upewnić się, że ma temperaturę pokojową.</li>
		<li>Przenieść komórki w pożywce zamrażającej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,8 ml za pomocą pipety o pojemności 1 ml i umieścić probówkę mikrowirówki w pojemniku do zamrażania. Dodaj alkohol izopropylowy do linii napełniania pojemnika do zamrażania i utrzymuj go w temperaturze pokojowej przed użyciem.</li>
		<li>Pozostaw pojemniki do zamrażania na noc w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Probówki do mikrowirówek należy przenieść do pojemnika z ciekłym azotem na okres do 2–3 lat. 
		UWAGA: Nie trzymaj komórek w zamrażarce przez długi czas i szybko przenieś komórki do zamrażarki o temperaturze -80 °C ze względu na toksyczność DMSO.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmrozić komórki ES myszy.
	<ol>
		<li>Podgrzej 50 ml pożywki surowicy w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wyjąć fiolkę zawierającą komórki z pojemnika z ciekłym azotem i zanurzyć nakrętkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Wstrząśnij szybko w łaźni wodnej do rozmrożenia. Przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Dodać 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli surowicy do probówki, aby rozcieńczyć pożywkę zamrażającą, a następnie odwirować przy 800 x g i temperaturze pokojowej przez 3 minuty.</li>
		<li>Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić granulki komórek z 3 ml świeżej pożywki Vc/PD0325901 za pomocą pipety o pojemności 5 ml.</li>
		<li>Przenieść komórki z probówki o pojemności 15 ml do naczynia pokrytego żelatyną i hodować komórki przez 24 godziny. Ponownie wyhodować komórki, jak opisano w kroku 2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ekstrakcja białka całkowitego z komórek
<ol>
	<li>Przepłukać zebrane komórki 1 ml PBS, a następnie odwirować w temperaturze 800 x g i temperaturze pokojowej przez 3 minuty.</li>
	<li>Odessać supernatant i dokładnie zawiesić osad komórkowy za pomocą buforu RIPA uzupełnionego DTT, koktajlem inhibitorów proteazy i PMSF, delikatnie pipetując. Objętość bufora RIPA jest około 5 razy większa niż granulki komórki. 
	UWAGA: Zawiesinę komórek należy przeprowadzić na lodzie.</li>
	<li>Przechowywać komórki w buforze RIPA przez 30 minut na lodzie i odwirowywać w temperaturze 13 000 x g i 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Określ stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek Bradforda.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja DNA z komórek i trawienie DNA do pojedynczego nukleozydu za pomocą enzymów
<ol>
	<li>Zbierz komórki z trypsyną zgodnie z opisem w krokach 3.1.1 i 3.1.2.</li>
	<li>Wykonaj ekstrakcję DNA za pomocą zestawu do oczyszczania genomowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przechowuj wyekstrahowane DNA w probówkach wirówkowych o pojemności 1 ml. Dodać 100 μl ultraczystej wody do probówki wirówkowej i rozpuścić DNA, pipetując około 15 razy. Określ stężenie i oceń jakość DNA, mierząc absorbancję przy 260 nm i 280 nm15. Stężenie DNA wynosi około 500 ng/μL.</li>
	<li>Trawić 5 μg DNA w roztworze o objętości 50 μl: dodać 5 μl 100 mM roztworu Tris-HCl o pH 7,6 (stężenie końcowe: 10 mM), 2 U fosfatazy jelitowej cielęcia, 1 U DNazy I, 0,005 U fosfodiesterazy jadu węża I i 5 μg DNA (obliczyć dodaną objętość zgodnie ze zmierzonym stężeniem DNA, ~10 μL) do probówki wirówkowej i zwiększyć objętość roztworu do 50 μL wodą ultraczystą. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez noc. Odwirować strawiony roztwór DNA w temperaturze 1 000 g i temperaturze pokojowej przez 1 minutę, aby zebrać roztwór na dno probówek.</li>
	<li>Przenieść strawiony roztwór DNA z probówek wirówkowych do probówek ultrafiltracyjnych (granica masy cząsteczki: 3 kDa) i odwirować w temperaturze 13 000 g i 4 °C przez 30 minut w celu usunięcia enzymów wytrawiających.</li>
	<li>Przygotuj próbki do analizy 5mC i 5hmC.
	<ol>
		<li>Do analizy 5hmC: odpipetować 36 μl roztworu filtracyjnego do nowej probówki wirówkowej (1 ml) i dodać 4 μl 5'-(hydroksymetylo-d3)-2'-deoksycytydyny ([D3]-5hmC) o końcowym stężeniu 3 nM.</li>
		<li>W przypadku analizy 5 mC: dodać 196 μl ultraczystej wody do nowej probówki wirówkowej i odpipetować 4 μl roztworu filtrującego do probówki (50-krotne rozcieńczenie), ze względu na wysoką gęstość 5 mC w genomowym DNA. Przenieść 36 μl rozcieńczonego roztworu do nowej probówki wirówkowej i dodać 4 μl (5'-(metylo-d3)-2'-deoksycytydyny ([D3]-5mC) o końcowym stężeniu 50 nM. Użyj [D3]-5hmC i [D3]-5mC jako wzorca wewnętrznego do kalibracji odpowiednio 5hmC i 5mC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść roztwór próbki do probówek miarowych i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przeprowadzić analizę 5mC i 5hmC za pomocą ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej - potrójna kwadrupolowa spektrometria mas z monitorowaniem wielu reakcji (UHPLC-MS/MS (MRM)) zgodnie z opisem w poprzednim raporcie15.</li>
</ol>
6. Analiza 5mC i 5hmC za pomocą UHPLC-MS/MS15
<ol>
	<li>Skonfiguruj różne parametry do analizy 5mC i 5hmC za pomocą oprogramowania UHPLC-MS.
	<ol>
		<li>Ustal nową metodę. Otwórz oprogramowanie i kliknij "Plik | Nowość | Metoda". Wyświetl okno komunikatu "Edytor metody" z treścią "Czy chcesz zapisać zmiany dla bieżącej metody" i kliknij "Nie".</li>
		<li>Zbuduj parametry próbnika. Kliknij "Sampler | Konfiguracja | Wtrysk". Wybierz "Wtrysk standardowy" i wprowadź "5 μl przy objętości wtrysku".</li>
		<li>Zbuduj parametry pompy w UHPLC.
		<ol>
			<li>Kliknij "BinPump2 | Konfiguracja", aby zbudować parametry pompy. Ustaw "Przepływ" na "0.25 ml/min" i "Czas zatrzymania" na "15 min".</li>
			<li>Ustaw "Rozpuszczalnik B na 5%" i "Limity ciśnienia" na "Max 600 bar".</li>
			<li>Kliknij "BinPump2 | Harmonogram" w celu zbudowania izokratycznych parametrów elucji dla analizy 5mC. Kliknij "Dołącz", aby dodać wiersz. Wprowadź "0.00" w "Czas" i "5.0" w "B%". Kliknij "Dołącz" jeszcze raz, aby dodać nowy wiersz. Wprowadź "15.00" w "Godzinie" i "5.0" w "B%".</li>
			<li>Kliknij "BinPump2 | Harmonogram" w celu zbudowania gradientowych parametrów elucji dla analizy 5hmC. Kliknij "Dołącz, aby dodać wiersz. Wprowadź 0.00 w czasie i 5.0 w "B%". Kliknij "Dołącz" jeszcze raz, aby dodać nowy wiersz. Wprowadź "3.00" w "Czas" i "5.0" w "B%". Kliknij "Dołącz" przez kolejne 6 razy, aby dodać 6 wierszy. Wprowadź "3.01" na "Czas" i "15.0" na "B%", "6.00" na "Czas" i "15.0" na "B%", "6.01" na "Czas" i "100" na "B%", "10.00" na "Czas" i "100.0" na "B%", "10.01" na "Czas" i "5.0" na "B%", "15.00" na "Czas" i "5.0" na "B%" kolejno. 
			UWAGA: Analizę 5mC i 5hmC należy przeprowadzić indywidualnie ze względu na różne warunki separacji UHPLC.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zbuduj parametry temperatury komory kolumny (TCC) w UHPLC. 
		Kliknij "TCC | Konfiguracja | temperatura (po lewej)" i wprowadź "30 °C".</li>
		<li>Ustal parametry QQQ-MS/MS.
		<ol>
			<li>Kliknij "MS QQQ | Czas zatrzymania | Bez limitu/Jako pompa", "Źródło jonów | ESI", "Filtrowanie czasu | Szerokość piku: 0,07 min". Ustaw "Segmenty czasu: Czas rozpoczęcia: 0"; "Typ skanowania: MRM"; "Wartość działu: do MS"; "Delta EMV (+): 200" i "Delta EMV (-): 0".</li>
			<li>Zbuduj parametry monitorowania przejść 5mC, D 3-5mC, dC, 5hmC i D 3-5hmC
			<ol>
				<li>Kliknij "MS QQQ | Akwizycja | Segmenty skanowania: Zatrzymanie: 90"; "Fragmentor: 90"; "Energia zderzenia: 5"; "Napięcie akceleratora ogniwa: 4" i "Polaryzacja: dodatnia".</li>
				<li>Wejście "5mC" w "Nazwa związku", "242" w "Jon prekursorowy", "126" w "Jon produktu" do analizy 5mC. Kliknij prawy przycisk i wybierz "Dodaj wiersz", aby dodać nowy wiersz. Wprowadź "D 3-5mC" w "Nazwa związku", "245" w "Jon prekursorowy", "129" w "Jon produktu" do analizy D3-5mC.</li>
				<li>Uzupełnij kolejne trzy rzędy w tym samym trybie. Wprowadź "dC" w "Nazwa związku", "228" w "Jon prekursorowy", "112" w "Jon produktu" do analizy DC. Wprowadź "5hmC" w "Nazwa związku", "258" w "Jon prekursorowy", "142" w "Jon produktu" dla analizy 5hmC. Wejście D 3-5hmC w nazwie związku, "261" w "Jon prekursorowy", "145" w "Jon produktu" do analizy D3-5hmC.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Zbuduj parametry źródła gazu. Kliknij "MS QQQ | Źródło | Parametry źródła: Temp. gazu: 300 °C"; "Przepływ gazu: 11 l/min"; "Nebulizator: 15 psi"; "Kapilara dodatnia: 3500 V".</li>
			<li>Zapisz proponowaną metodę. Kliknij "MS QQQ | Instrument | Zapisz metodę jako". Wybierz ścieżkę dla proponowanej metody za pomocą "Katalogu" i nadaj nazwę metodzie, wprowadzając zawartość w polu "Metoda", na przykład: analiza 5mC i 5hmC.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Separacja UHPLC i analiza MS/MS mononukleozydów
	<ol>
		<li>Przygotować fazę ruchomą do analizy 5 mC i cytozyny (C): uformować fazę ruchomą roztworu A i B. Roztwór A: 500 ml ultraczystej wody z 500 μl kwasu mrówkowego (stężenie końcowe: 0,1%) i roztwór B: 500 ml 100% metanolu. Wymieszaj roztwór A i B w stosunku 95:5 (v:v) jako fazę ruchomą, aby wymyć 5mC i C (ustawione w kroku 6.1.3.3). Ustaw natężenie przepływu na 0.25 ml/min (ustawione w kroku 6.1.3.1).</li>
		<li>Przygotować fazę ruchomą za pomocą rozpuszczalnika A i B do analizy 5hmC. Rozpuszczalnik A to 2,0 mM NH4HCO3 roztwór wodny (pH 9,0) (500 ml), a rozpuszczalnik B to 100% metanol (500 ml). Oddzielić 5hmC za pomocą zoptymalizowanej elucji gradientowej: 0-3 min, 5,0% B i 95% A (v:v); 3-6 min, 15,0% B i 85% A; 6-10 min, 100% B; 10-15 min, 5,0% B i 95% A (ustawione w kroku 6.1.3.4). Ustaw natężenie przepływu na 0.25 ml/min (ustawione w kroku 6.1.3.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj elektrorozpylania MS / MS z trybem MRM (ustawionym w kroku 6.1.5.1) do analizy elucji z kolumny i przyjmij tryb jonów dodatnich (ustawiony w kroku 6.1.5.2.1).
	<ol>
		<li>Monitorowanie przejść: 5mC, m/z 242→126 (energia zderzenia, 5 eV); [D3]-5mC, m/z 245→129 (5 eV); prąd stały, m/z 228→112 (5 eV); 5hmC, m/z 258→142 (5 eV); [D3]-5hmC, m/z 261→145 (5 eV) (ustawiane w kroku 6.1.5.2.2).</li>
		<li>Ustaw napięcia kapilary i fragmentu odpowiednio na +3 500 V (ustawione w kroku 6.1.5.3) i 90 V (ustawione w kroku 6.1.5.2.1).</li>
		<li>Ustawić objętość iniekcji na 5 μl i przeanalizować każdą próbkę 3 razy (ustawione w kroku 6.1.2). Zastosuj odpowiednie krzywe standardowe, aby ocenić ilość 5mC i 5hmC.
		<ol>
			<li>Ustalić krzywą wzorcową 5mC: przenieść 1–50 nM (1, 5, 10, 20, 50 nM, stężenie końcowe) roztworu wzorca o temperaturze 5 mC do probówek wirówkowych i dodać 50 nM [D3]-5mC do probówek. Uzupełnić całkowitą objętość do 50 μl. Przeprowadzić analizę wzorca 5mC zgodnie z instrukcjami dla próbki 5mC (krok 6).</li>
			<li>Zbuduj krzywą wzorcową 5hmC: przenieś 1–20 nM (1, 2, 5, 10, 20 nM, stężenie końcowe) roztwór wzorcowy 5hmC do probówek wirowych i dodaj 3 nM [D3]-5hmC do probówek. Uzupełnić całkowitą objętość do 50 μl. Przeprowadzić analizę wzorca 5hmC zgodnie z instrukcjami dla próbki 5hmC (krok 6).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Analizuj istotność statystyczną
<ol>
	<li>Wykonaj analizę statystyczną za pomocą oprogramowania.
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie i wybierz "Kolumna" w "Nowa tabela i wykres". Ustaw parametry w następujący sposób: "Przykładowe dane | Zacznij od pustej tabeli danych"; "Wybierz wykres - pierwszy tryb"; "Wykresy replik lub słupków błędów | Fabuła | Średnia z SEM".</li>
		<li>Kliknij "Utwórz", aby wprowadzić trzy powtórzenia grupy kontrolnej i grupy Vc/PD0325901 traktowanej odpowiednio w wierszu "A" i "B". Wybierz sześć danych i kliknij "Analizuj" w "Analizie".</li>
		<li>Wybierz "testy t (i testy nieparametryczne)" w "Analizach kolumnowych" i kliknij "OK", aby przejść do następnego interfejsu.</li>
		<li>Ustaw parametry w następujący sposób: "Wybierz test | Nazwa testu | Niesparowany test t; Opcje | Dwustronny"; "Przedziały ufności: 95%"; "Cyfry znaczące | Pokaż 4 cyfry znaczące". Kliknij "OK", aby uzyskać wartość p między kontrolą a obróbką Vc/PD0325901.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń istotność statystyczną między grupą kontrolną a grupą eksperymentalną stosującą dwustronny i niesparowany test t-test Studenta16. 
	UWAGA: p <0,05 oznacza różnicę o istotności statystycznej. *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001.</li>
</ol>

<ol><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li>
<li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo-derived+stem+cells%3A+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Eiselleova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+mouse+and+human+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.</a> Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).</li>
<li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).</li>
<li>Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+protocols+for+mouse+embryonic+stem+cell+culturing%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing.</a> Plos One. 8 (12), e81156(2013).</li>
<li>Yamaji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRDM14+ensures+naive+pluripotency+through+dual+regulation+of+signaling+and+epigenetic+pathways+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).</li>
<li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+inhibition+in+ESCs+drives+rapid+genome-wide+demethylation+to+the+epigenetic+ground+state+of+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).</li>
<li>Smith, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+regulatory+phase+of+DNA+methylation+in+the+early+mammalian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo.</a> Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).</li>
<li>Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+induction+of+Id+proteins+suppresses+differentiation+and+sustains+embryonic+stem+cell+self-renewal+in+collaboration+with+STAT3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3.</a> Cell. 115 (3), 281-292 (2003).</li>
<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+pluripotency+is+associated+with+global+DNA+hypomethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).</li>
<li>Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+low-dose+toxicity+of+the+universal+solvent+DMSO%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO.</a> FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).</li>
<li>Yin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+enhances+Tet-mediated+5-methylcytosine+oxidation+and+promotes+DNA+demethylation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).</li>
<li>Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+modulates+NF%CE%BAB+phosphorylation+and+enhances+antimicrobial+activity+against+Staphylococcus+aureus+in+mesenchymal+stromal%2Fstem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells.</a> Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171(2017).</li>
<li>Blaschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+induces+Tet-dependent+DNA+demethylation+and+a+blastocyst-like+state+in+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells.</a> Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+Tet+protein-mediated+5-methylcytosine+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation.</a> Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).</li>
<li>Inoue, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-dependent+loss+of+5-hydroxymethylcytosine+in+mouse+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos.</a> Science. 334 (6053), 194(2011).</li>
<li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li>
<li>Maiti, A., Drohat, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymine+DNA+glycosylase+can+rapidly+excise+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine%3A+Potential+implications+for+active+demethylation+of+CpG+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites.</a> J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).</li>
<li>Habibi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+bisulfite+sequencing+of+two+distinct+interconvertible+DNA+methylomes+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).</li>
<li>von Meyenn, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+DNA+methylation+maintenance+is+the+main+cause+of+global+demethylation+in+naive+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells.</a> Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).</li>
<li>Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEK+inhibitor+PD0325901+and+vitamin+C+synergistically+induce+hypomethylation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells.</a> Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).</li>
<li>Hackett, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+mechanisms+of+DNA+demethylation+during+transition+to+ground-state+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency.</a> Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).</li>
<li>Nakaki, F., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRDM14%3A+a+unique+regulator+for+pluripotency+and+epigenetic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming.</a> Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).</li>
<li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22855723">Pluripotency in the embryo and in culture.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawniają potencjalnych konfliktów interesów.

W pracy zademonstrowaliśmy nową metodę łączenia Vc i PD0325901 w celu utrzymania mysich komórek ES w stanie niezróżnicowanym i hipometylowanym, co osiągnięto dzięki synergicznemu działaniu promującemu demetylację DNA przez Vc i hamującemu metylację DNA de novo przez PD0325901. Co więcej, mysie komórki ES wykazywały doskonałą morfologię w systemie hodowli Vc/PD0325901.
Aby lepiej utrzymać stan mysich komórek ES w systemie hodowli Vc/PD0325901, należy wykonać kilka krytycznych kroków. P...

Komórki ES pochodzą z ICM blastocysty1. Komórki są w stanie pluripotencji i mogą tworzyć wszystkie linie somatyczne i komórki linii rozrodczej2. Stworzenie komórek ES daje możliwość zbadania procesów rozwojowych in vitro i może generować komórki o znaczeniu medycznym dla medycyny regeneracyjnej w oparciu o ich pluripotencję3.
Dwie grupy stworzyły linie komórkowe ES myszy w 1981 roku, a następnie gdy komórki pochodzące z wczesnego zarodka myszy były hodowane w pożywce zawierającej płodową surowicę bydlęcą (FBS) z mysimi fibroblastami embrionalnymi (MEF) jako warstwą zasilającą1,4. MEF były inaktywowane mitotycznie i były wstępnie hodowane w szalkach przed hodowlą komórek ES. MEF zapewniają wsparcie dla przyłączania się mysich komórek ES i wytwarzają czynniki wzrostu, które promują propagację i hamują różnicowanie5, podczas gdy FBS oferuje niezbędne czynniki troficzne i hormony do proliferacji komórek. Późniejsze badania wykazały, że LIF wytwarzany przez komórki karmicielskie był kluczową cytokiną dla samoodnawiania i utrzymywania pluripotencji w mysich komórkach ES, a dodanie LIF do pożywki może zastąpić komórki karmiące6. Obecnie utrzymywanie mysich komórek ES w pożywce FBS/LIF na karmnikach jest nadal standardową metodą stosowaną przez wielu badaczy. Z tym klasycznym podejściem kulturowym wiążą się jednak pewne problemy. Po pierwsze, komórki żywicielskie wydzielają nadmiar i niekontrolowane czynniki i mogą powodować zanieczyszczenie chorobotwórcze7. Aby uniknąć tej interferencji, powlekanie powierzchni szalek żelatyną i dodanie LIF w pożywce zawierającej surowicę są alternatywnymi metodami utrzymywania mysich komórek ES bez komórek warstwy zasilającej. Dodatkowo, mysie komórki ES hodowane w warunkach surowicy/LIF wykazują niejednorodność morfologiczną w populacjach komórek, a nawet w poziomie ekspresji czynników związanych z pluripotencją8. Ostatnie badania sugerują, że w warunkach surowicy/LIF podstawowe czynniki transkrypcyjne związane z pluripotencją (w tym SOX2, Nanog i OCT4) mogą podtrzymywać pluripotencję poprzez sygnalizację LIF i WNT; jednakże, co warto zauważyć, aktywują one również sygnał czynnika wzrostu fibroblastów (FGF), aby wywołać różnicowanie8. Ze względu na ambiwalentne podwójne działanie podstawowych czynników transkrypcyjnych, mysie komórki ES hodowane w surowicy wykazują niejednorodność, składającą się z dwóch wymiennych populacji, jednej podobnej do ICM, a drugiej przypominającej stan primed epiblast 8. Co więcej, mysie komórki ES w surowicy często wykazują globalną hipermetylację9, podczas gdy ICM i PGC są w globalnym stanie hipometylacji, co jest ściśle związane z ich pluripotencją9,10.
Istnieje duże zapotrzebowanie na opracowanie nowych metod hodowli mysich komórek ES. Od 2003 roku ustanowiono kilka ulepszonych protokołów11, ale nadal istnieją pewne ograniczenia i niedociągnięcia7. Od 2008 r. łączne zastosowanie dwóch małocząsteczkowych inhibitorów kinaz, PD0325901 (inhibitora kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK)/kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) (MEK)) i CHIR99021 (inhibitora kinazy syntazy glikogenu 3 (GSK3)), w pożywce N2B27 z LIF i bez surowicy, otworzyło nowe perspektywy hodowli mysich komórek ES12. To nowo zdefiniowane podłoże charakteryzuje się zastosowaniem dwóch inhibitorów (2i). Mysie komórki ES hodowane w pożywce 2i/LIF są bardziej jednorodne pod względem populacji komórkowych i ekspresji czynników pluripotencjencji. Ponadto, mysie komórki ES hodowane metodą 2i/LIF wykazują globalnie hipometylację DNA, która jest bliższa komórkom podobnym do ICM9,13. Mimo to kultura 2i ma swoje wady. PD0325901 i CHIR99021 są nierozpuszczalne w wodzie i na ogół rozpuszcza się je w roztworze podstawowym na bazie dimetylosulfotlenku (DMSO) w celu dodania ich do pożywki hodowlanej. Badania wykazały, że długotrwała i niska dawka ekspozycji komórek na DMSO może prowadzić do cytotoksyczności14.
Tutaj wykorzystaliśmy dwa związki małocząsteczkowe i opracowaliśmy nową metodę hodowli mysich komórek ES. Nowatorska metoda hodowli łączy PD0325901 inhibitorów Vc i MEK w celu szybkiego i skutecznego promowania hipometylacji DNA do porównywalnego poziomu PGC, nazwanego protokołem hodowli Vc/PD0325901. Mysie komórki ES w pożywce zawierającej surowicę z dodatkiem Vc/PD0325901 wykazują jednorodność morfologii i utrzymują się w stanie podstawowym. W porównaniu z hodowlą 2i, mysie komórki ES hodowane w warunkach Vc/PD0325901 wykazują szybszą kinetykę demetylacji DNA i mogą osiągnąć poziom hipometylacji porównywalny z PGC. Ponadto zastosowanie pojedynczego inhibitora (PD0325901) zmniejsza ilość wprowadzaną DMSO do pożywki w porównaniu do tej stosowanej w 2i (PD0325901/CHIR99021) i zmniejsza uszkodzenia komórek.

<table><tbody><tr><td>płodowa surowica bydlęca Australia źródło</td><td>Corning</td><td>35-076-CV</td><td>Składnik pożywki dla mysich komórek ES</td></tr><tr><td>DMEM/hyklon o wysokiej zawartości glukozy</td><td></td><td>SH30022</td><td>Składnik mysiej pożywki z komórek ES</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Milipore</td><td>ESG1107</td><td>Składnik mysiej pożywki z komórek ES</td></tr><tr><td>aminokwasy endogenne (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>Składnik pożywki</td></tr> <tr>z mysich komórek ES<td>pirogronian sodu</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Składnik mysiego podłoża komórkowego ES</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>Składnik mysich pożywki z komórek ES</td></tr><tr><td>penicylina roztwór streptomycyny</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Składnik mysiej pożywki z komórek ES</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td>Płukanie komórek</td></tr><tr><td>trypsyna</td><td>Hycon</td><td>SH30042</td><td>Dysocjacja komórek</td></tr><tr><td>żelatyna</td><td>Sigma</td><td>48722</td><td>Powlekanie naczyń</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemolecule</td><td>04-0006-10</td><td>drobnocząsteczkowa substancja chemiczna do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemolecule</td><td>04-0004</td><td>drobnocząsteczkowa substancja chemiczna do hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>witamina C</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd&nbsp;</td><td>XW00508171</td><td>małocząsteczkowa substancja chemiczna do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>System oczyszczania wody Ultra Bioscience</td><td>Purelab</td><td>Ultra</td><td>Ultra water</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Wirówka do zamrażania komórek</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td> Koktajl inhibitorów proteazy <td>do ekstrakcji DNA i białek</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>Składnik buforu</td></tr> <tr>RIPA<td>PMSF Inhibitor proteazy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>36978</td><td>Składnik buforu RIPA</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>Składnik bufora RIPA</td></tr><tr><td>EGTA</td><td></td><td>Sigma E3889</td><td>Składnik buforu RIPA</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania genomowego DNA&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A1125</td><td>Ekstrakcja genomowego DNA</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Oznaczanie stężenia DNA</td></tr><tr><td>fosfatazy jelitowej cielęcia</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290</td><td>Trawienie DNA</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303</td><td>Trawienie DNA</td></tr><tr><td>fosfodiesteraza jadu węża I</td><td>Sigma</td><td>P4506</td><td>Trawienie DNA</td></tr><tr><td>Nanosep 3K Omega</td><td>Pall</td><td>OD003C35</td><td>filtracja strawionego DNA</td></tr><tr><td>1290 System UHPLC</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>1290</td><td>Separacja UHPLC</td></tr><tr><td>G6410B potrójny kwadrupolowy spektrometr masowy</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>G6410B</td><td>Analiza MS/MS</td></tr><tr><td>Kolumna Zorbax Eclipse Plus C18</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>Zorbax Eclipse Plus</td><td>colume do separacji UHPLC</td></tr><tr><td>5-metylocytozyna</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>SM8900&nbsp;</td><td>norma 5mC</td></tr><tr><td>5-hydroksymetylocytozyna (standard)</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>M295900</td><td>standard 5hmC</td></tr><tr><td>Prdm14</td><td>przeciwciało bioworld</td><td>BS7634</td><td>Analiza Western blot - przeciwciało pierwotne</td></tr><tr><td>Przeciwciało Dnmt3a</td><td>bioworld</td><td>BS6587</td><td>Analiza Western blot - przeciwciało pierwotne</td></tr><tr><td>Przeciwciało Dnmt3b</td><td>abcam ab13604</td><td></td><td>Analiza Western blot - przeciwciało pierwotne</td></tr><tr><td>Przeciwciało Dnmt3l</td><td>abcam</td><td>ab3493</td><td>Analiza Western blot - przeciwciało pierwotne</td></tr><tr><td>Przeciwciało Dnmt1</td><td>abcam</td><td>ab13537</td><td>Analiza Western blot - przeciwciało pierwotne</td></tr> <tr><td>i przeciwciało beta;-tubulina</td><td>bioworld</td><td>BS1482MH</td><td>Analiza Western blot - przeciwciało pierwotne</td></tr><tr><td>koza anty-królik IgG</td><td>abcam</td><td>ab6721</td><td>Analiza Western blot - przeciwciało</td></tr> <tr><td>wtórnekozia anty-mysia IgG</td><td>abcam</td><td>ab6789</td><td>Analiza Western blot - przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>System odwrotnej transkrypcji ekstrakcji</td> RNA <td>Promega</td><td>A3500</td><td>Odwrotna transkrypcja RNA</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6001</td><td>RT-PCR</td></tr><tr><td>StemTAG zestaw do barwienia i aktywności fosfatazy alkalicznej</td><td>Komórki Biolabs, Inc.</td><td>CBA-302</td><td>&nbsp; analiza barwienia fosfatazą alkaliczną</td></tr><tr><td>mysie komórki ES: WT, 129 SvEv</td><td>Dostarczone przez profesora Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China)</td><td></td> <td>szczep komórkowy mysich komórek ES</td></tr><tr><td>mikroskop</td><td>Obserwacja komórek</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5.0</td><td>GraphPad Prism Software Inc.</td><td>5.0</td><td>Analiza statystyczna</td></tr></tbody></table>

alternatywna metoda hodowli w celu utrzymania genomowej hipometylacji embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu inhibitora mek pd0325901 i witaminy c

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

Embrionalne komórki macierzyste (ES) mają potencjał do różnicowania się w dowolną z trzech listków zarodkowych (endodermę, mezodermę, lub ektodermę) i mogą generować wiele linii dla medycyny regeneracyjnej. Hodowla komórek ES in vitro od dawna jest przedmiotem powszechnych obaw. Klasycznie mysie komórki ES są utrzymywane w surowicy i pożywce zawierającej czynnik hamujący białaczkę (LIF). Jednak w warunkach surowicy/LIF komórki wykazują niejednorodność w morfologii i profilu ekspresji genów związanych z pluripotencją i są w większości w stanie metastabilnym. Co więcej, hodowane komórki ES wykazują globalną hipermetylację, ale naiwne komórki ES wewnętrznej masy komórkowej (ICM) i pierwotne komórki rozrodcze (PGC) są w stanie globalnej hipometylacji. Stan hipometylacji ICM i PGC jest ściśle związany z ich pluripotencją. Aby ulepszyć metody hodowli mysich komórek ES, opracowaliśmy niedawno nową metodę opartą na selektywnie połączonym wykorzystaniu dwóch drobnocząsteczkowych związków w celu utrzymania stanu hipometylowanego i pluripotencjalnego DNA. Tutaj prezentujemy, że jednoczesne leczenie witaminą C (Vc) i PD0325901 może usunąć około 90% 5-metylocytozyny (5mC) w ciągu 5 dni w mysich komórkach ES. Generowana zawartość 5mC jest porównywalna do tej w PGC. Badania mechanistyczne pokazują, że PD0325901 zwiększa ekspresję Prdm14 w celu stłumienia Dnmt3b (metylotransferazy DNA de novo) i Dnmt3l (kofaktora Dnmt3b), poprzez zmniejszenie syntezy de novo 5mC. Vc ułatwia konwersję 5mC do 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC) katalizowanej głównie przez Tet1 i Tet2, co wskazuje na udział zarówno biernych, jak i aktywnych demetylacji DNA. Co więcej, w warunkach Vc/PD0325901 mysie komórki ES wykazują jednorodną morfologię i stan pluripotencjalny. Wspólnie proponujemy nowatorską i chemiczno-synergiczną metodę hodowli w celu osiągnięcia hipometylacji DNA i utrzymania pluripotencji w mysich komórkach ES. Małocząsteczkowa metoda zależna od substancji chemicznych przezwycięża główne niedociągnięcia hodowli surowicy i daje nadzieję na wygenerowanie jednorodnych komórek ES do dalszych zastosowań klinicznych i badań.

Vc/PD0325901 synergistycznie indukuje globalne wymazanie metylacji w komórkach ES myszy. Komórki ES myszy w surowicy wykazują hipermetylację DNA, podczas gdy pluripotencjalne komórki ICM i PGC wykazują globalne wymazanie metylacji DNA, a stan hipometylacji jest ściśle powiązany z ich pluripotencjalnością9,10.
Wcześniej my oraz inni badacze stwierdziliśmy, że Vc może nasi...

Opisaliśmy szczegółowo dwa protokoły chemiczne do hodowli embrionalnych komórek macierzystych myszy. Ta nowa metoda wykorzystuje synergiczne mechanizmy promowania utleniania za pośrednictwem Tet (przez witaminę C) i tłumienia syntezy de novo 5-metylocytozyny (przez PD0325901) w celu utrzymania hipometylacji DNA i pluripotencji embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Alternatywna metoda hodowli w celu utrzymania genomowej hipometylacji embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu inhibitora MEK PD0325901 i witaminy C

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

Ogólnym celem tego protokołu jest wykorzystanie związków małocząsteczkowych PD0325901 i witaminy C do utrzymania stanu hipometylowanego i pluripotencjalnego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie hodowlanych mysich embrionalnych komórek macierzystych myszy z hodowlą FBS, takie jak heterogeneracja morfologii i dehipermetylacja. Tak więc główną zaletą tej techniki jest to, że embrionalne komórki macierzyste myszy są w stanie utrzymać doskonałą morfologię oraz stan hipometylowany i niezróżnicowany.Po przygotowaniu płytek i, zgodnie z protokołem tekstowym, należy podgrzać mysie komórki ES, pożywkę hodowlaną, trypsynę i PBS w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby przejść przez komórki, odessać pożywkę z naczynia i użyć dwóch mililitrów PBS do dwukrotnego przepłukania komórek. Następnie usuń PBS i dodaj 0,3 mililitra trypsonu EDTA do komórek i szybko przechyl naczynie, aby przykryć komórki w roztworze.Natychmiast usuń trypsynę i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę, aby oderwać komórki. Dodaj dwa mililitry wstępnie podgrzanej pożywki surowicy, aby dezaktywować trypsynę i użyj pięciomililitrowej pipety, aby ponownie zawiesić kolonie komórkowe 10 razy w zawiesinie pojedynczej komórki. Umieść 150 mikrolitrów roztworu komórkowego w nowym sześciocentymetrowym naczyniu pokrytym żelatyną i uzupełnij trzema mililitrami świeżo przygotowanego podłoża VCPD0325901.Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach CO2. Ze względu na niestabilność Vc, co 24 godziny podczas inkubacji usuń starą pożywkę hodowlaną i dodaj trzy mililitry świeżej pożywki Vcpd0325901. Po osiągnięciu 70 do 80 procent konfluencji, przejdź komórki i kontynuuj ich hodowlę, jak właśnie pokazano.Aby przeprowadzić ekstrakcję DNA, zbierz komórki z trypsyną, jak pokazano wcześniej, i użyj zestawu do oczyszczania genomowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Dodaj 100 mikrolitrów ultra czystej wody do probówki z DNA i rozpuść DNA, pipetując około 15 razy. Następnie użyj spektrofotometru, aby zmierzyć stosunek Od260 do 280, aby określić stężenie i jakość DNA.Stężenie DNA powinno wynosić około 500 nonogramów na mikrolitr. Następnie strawić pięć mikrogramów DNA, łącząc je z pięcioma mikrolitrami 100-milimolowego chlorowodorku tris PH7,6, dwiema jednostkami fosfatazy jelitowej cielęcej, jedną jednostką Dnazy i 0,005 jednostki jadu węża, fosfodyesterazy jeden. Następnie użyj ultra czystej wody, aby zwiększyć objętość do 50 mikrolitrów.Inkubuj reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka pobrać próbkę przez odwirowanie w temperaturze 1 000 x g w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Następnie przenieś roztwór do probówek ultrafiltracyjnych i wiruj próbki w temperaturze 13 000 x g i 4 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby usunąć enzymy trawiące.Aby przygotować próbki do analizy 5HMC, przenieś 36 mikrolitrów filtratu do nowej jednomililitrowej probówki i dodaj cztery mikrolitry D35HMC, aby uzyskać końcowe stężenie trzech nanomolowców. Do analizy 5MC odpipeuj 196 mikrolitrów ultra czystej wody do nowej probówki wirówkowej i dodaj cztery mikrolitry filtratu ze względu na wysoką gęstość 5MC w genomowym DNA. Przenieś 36 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu 5MC do nowej probówki wirówkowej i dodaj cztery mikrolitry D35MC, aby uzyskać końcowe stężenie 50 nanomolowych.Użyj D35HMC i D35MC jako wzorców wewnętrznych do kalibracji odpowiednio 5HMC i 5MC. Po skonfigurowaniu parametrów do analizy 5MC i 5HMC w oprogramowaniu UHPLCMS, zgodnie z protokołem tekstowym, ustal parametry dla QQQMSMSMS, klikając MS QQQ. Jako czas zatrzymania wybierz opcję Bez limitu/Jako pompa.Jako źródło jonów wybierz ESI. Aby filtrować czas, zaznacz opcję Szerokość szczytu i wprowadź 0,07 minuty. Aby skonfigurować segmenty czasu, jako godzinę rozpoczęcia wybierz zero.Aby ustawić tryb skanowania w MRM w celu przeanalizowania aluzji z kolumny, jako typ skanowania wybierz MRM. W polu Wartość działki wybierz opcję Do MS. W polu Delta EMV plus wprowadź wartość 200, a w polu Delta EMV minus wprowadź zero. Zbuduj parametry monitorowania przejść, klikając najpierw MSQQQ one akwizycja.Aby ustawić segmenty skanowania, w polu Zatrzymanie wprowadź wartość 90. Aby ustawić napięcia fragmentu dla Fragmentora, wprowadź 90. W polu Energia zderzenia wprowadź pięć.W polu Cell Accelerator Voltage (Napięcie akceleratora ogniwa) wprowadź cztery. Aby ustawić tryb jonów dodatnich, w polu Polaryzacja wybierz dodatni. Aby przeprowadzić separację mononukleozydów UHPLC, przygotuj roztwory a i b do aluzji 5MC i cytozyny, mieszając 500 mililitrów ultra czystej wody z 500 mikrolitrami kwasu mrówkowego dla roztworu a.Następnie odmierz 500 mililitrów 100-procentowego metanolu i roztworu b. Wymieszaj roztwór a i roztwór b w stosunku 95 do pięciu objętości jako fazę ruchomą, aby wymyć 5MC i C. Następnie ustaw natężenie przepływu na 0,25 mililitra na minutę. Oddziel 5HMC za pomocą zoptymalizowanej alluzji gradientu.Następnie ustaw natężenie przepływu na 0,25 mililitra na minutę. Monitoruj przejścia dla 5MC, D35MC, DC, 5HMC i D35HMC. Ustaw napięcie kapilarne na 3 500 woltów.Następnie ustaw objętość wtrysku na 5 mikrolitrów i trzykrotnie przeanalizuj każdą próbkę. Zastosuj odpowiednie krzywe standardowe, aby ocenić ilość 5MC i 5HMC zgodnie z protokołem tekstowym. Jak widać w tej analizie genomowego DNA w mysich komórkach ES za pomocą UHPLC MSMS, leczenie VcPD0325901 spowodowało szybszy spadek metylacji DNA i osiągnęło stały poziom pięciu MC po pięciu dniach, podczas gdy leczenie Vc 2i spowodowało porównywalny poziom w dniu 11.Ten wykres pokazuje, że leczenie zawierające Vc dramatycznie zwiększyło częstość występowania 5HMC po jednym dniu, a następnie poziomy 5HMC stopniowo spadały z powodu postępującego zmniejszania substratu 5MC. Analiza Western blot wykazała, że Prdm14 był znacznie podwyższony, podczas gdy Dnmt3b i jego kofaktor, Dnmt3l, były znacznie obniżone, gdy komórki wycofały się z PD0325901, co wskazuje na działanie PD0325901 w usuwaniu 5MC. W tym teście fosfatazy alkalicznej wszystkie mysie komórki ES były zabarwione na fioletowo z morfologią przypominającą kulę, gdy były hodowane przez 26 dni w VcPD032590, co wskazuje na stan niezróżnicowany.W przeciwieństwie do tego, komórki wyhodowane w FBS zawierające samą pożywkę wydawały się mieć jasny kolor z częściowym rozprzestrzenianiem się wskazującym na częściowe różnicowanie. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że FBS musi być wstępnie sprawdzony.Należy również unikać nadmiernego pipetowania komórek przez pasaż i codziennej wymiany pożywki hodowlanej VcPDO325901. Po tym opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się hodowlą mysich komórek ES in vitro w celu zbadania rozwoju i procesów zarodków in vitro oraz wygenerowanych komórek o znaczeniu medycznym dla medycyny regeneracyjnej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś lepiej zrozumieć, jak utrzymać morfologię wzrostu oraz hipermetylowany i mnogi silny stan dla mysich komórek ES przy użyciu dwóch małych składników molekularnych, inhibitora MEK PD0325901.Nie zapominaj, że praca z Trisol, DMS lub PMS i DTT może być bardzo niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, maski i okularów, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania tej procedury.

an-alternative-culture-method-to-maintain-genomic-hypomethylation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Jakość embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) zależy od wyboru odpowiedniego szczepu myszy, takiego jak CF-1. MEFs wspierające pluripotencję oraz pożywka warunkowana (CM) uzyskana z tych komórek powinny zawierać optymalne stężenia Activin A, Gremlin oraz Tgfβ1, które są niezbędne do współdziałania szlaków Activin/Nodal i FGF w celu utrzymania samoodnawiania i pluripotencji.

Przygotowanie komórek fibroblastów zarodkowych myszy odpowiednich do hodowli ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), oparte na wzroście pojedynczych komórek bez typu kolonijnego (NCM) zdysocjowanych pojedynczych komórek. Ta nowa metoda, wykorzystująca inhibitory kinaz związane z Rho lub izoformę lamininy 521 (LN-521), jest odpowiednia do wytwarzania dużych ilości jednorodnych hPSC, manipulacji genetycznych i odkrywania leków.

Alternatywne hodowle do produkcji, utrzymania i analizy genetycznej ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół zapewnia metodę pobierania pożywki kondycjonowanej przez embrionalne komórki macierzyste myszy (mESC-CM) pochodzących z surowicy (płodowej surowicy bydlęcej, FBS) i karmowiska (mysie fibroblasty embrionalne, MEFs) dla podejścia wolnego od komórek. Może mieć zastosowanie w leczeniu starzenia się i chorób związanych ze starzeniem się.

Kolekcja pożywki kondycjonowanej komórkami macierzystymi myszy bez surowicy i karmy dla podejścia bezkomórkowego

Białka często zawierają wiele domen, które mogą pełnić różne funkcje komórkowe. Nokauty genów (KO) nie uwzględniają tej różnorodności funkcjonalnej. W tym miejscu przedstawiamy podejście oparte na wymianie kasetowej za pośrednictwem rekombinacji (RMCE) oparte na strukturze i funkcji w embrionalnych komórkach macierzystych KO, które pozwala na molekularną sekcję różnych domen funkcjonalnych lub wariantów białka.

Badania strukturyczno-funkcjonalne w embrionalnych komórkach macierzystych myszy z wykorzystaniem wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinazy

Opisujemy technikę wykorzystania mysich embrionalnych komórek macierzystych do generowania dwu- lub trójwymiarowych ciał embrionalnych. Następnie wyjaśniamy, jak indukować różnicowanie neuronalne komórek ciała zarodka za pomocą kwasu retinowego i jak analizować ich stan różnicowania za pomocą immunofluorescencji markerów komórek progenitorowych i immunoblottingu.

Analiza indukowanego kwasem retinowym różnicowania neuronalnego embrionalnych komórek macierzystych myszy w dwu- i trójwymiarowych ciałach embrionalnych

Regulacja środowiska chromatyny jest niezbędnym procesem niezbędnym do prawidłowej ekspresji genów. W tym miejscu opisujemy metodę kontrolowania ekspresji genów poprzez rekrutację maszynerii modyfikującej chromatynę w sposób specyficzny dla genu i odwracalny.

Tłumienie transkrypcji genów poprzez przekierowywanie maszynerii komórkowej za pomocą chemicznych modyfikatorów epigenetycznych

Celem tego raportu jest opisanie protokołu do solidnego immunohistochemicznego wykrywania markerów epigenetycznych, 5-metylocytozyny (5mC) i 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC) w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy.

Immunohistochemiczne wykrywanie 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy

Tutaj opisujemy protokół generowania realnego modelu samicy mysiej z nielosową inaktywacją chromosomu X, tzn. chromosom X odziedziczony po matce jest nieaktywny w 100% komórek. Opisujemy również protokół testowania wykonalności, tolerancji i bezpieczeństwa farmakologicznej reaktywacji nieaktywnego chromosomu X in vivo.

Nielosowy mysi model do farmakologicznej reaktywacji Mecp2 na nieaktywnym chromosomie X

Prezentujemy tutaj metodę, która łączy użycie chemicznego usuwania epigenetycznego z sygnałami związanymi z mechanosensoryką, aby efektywnie generować komórki pluripotencjalne ssaków, bez potrzeby transfekcji genów lub wektorów retrowirusowych. Strategia ta jest zatem obiecująca dla medycyny translacyjnej i stanowi znaczący postęp w technologii organoidów komórek macierzystych.

Dwuetapowa strategia, która łączy modyfikację epigenetyczną i wskazówki biomechaniczne w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków

Protokół ten ilościowo mierzy stabilność i okres półtrwania intergenowych i intragenowych RNA wzmacniających w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą leczenia aktinomycyną D, RT-qPCR oraz analizy regresji nieliniowej. Stosuje się strategie normalizacji specyficzne dla pozycji, aby dokładnie modelować dynamikę rozpadu eRNA w sposób zależny od kontekstu.

Zoptymalizowana ilościowa ocena stabilności RNA wzmacniającego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Poznaj metodę hodowli komórek macierzystych myszy z zachowaniem hipometylacji genomowej przy użyciu PD0325901 i witaminy C. Protokół utrzymuje pluripotencję i doskonałą morfologię komórek.

Alternatywna metoda hodowli w celu utrzymania genomowej hipometylacji embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu inhibitora MEK PD0325901 i witaminy C (Wideo) | JoVE Journal

Alternatywna metoda hodowli w celu utrzymania genomowej hipometylacji embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu inhibitora MEK PD0325901 i witaminy C

Przeglądaj więcej filmów