Przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe zbadanie metabolizmu wielu źródeł składników odżywczych przy użyciu znakowanych substratów. Taki przebieg pracy pozwala na określenie losów spożywanych składników odżywczych oraz pochodzenia metabolicznego związków syntetyzowanych przez drożdże. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie metabolizmu drobnoustrojów, takie jak to, jak działa cały metabolizm w zależności od warunków środowiskowych.

Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wyjaśnienie i ilościowe określenie białka dystrybucji składników odżywczych z wielu źródeł. Metoda ta została wykorzystana do zbadania metabolizmu azotu w drożdżach, ale może być również stosowana do innych metabolizmów i mikroorganizmów. Kluczem do sukcesu w tym eksperymencie jest powtarzalność fermentacji.

Użytkownicy muszą zwrócić szczególną uwagę na pobranie komórek w tym samym określonym stadium fizjologicznym. Procedurę zademonstrują Christian Picou z naszego personelu technicznego, Pauline Seguinot, doktorantka z laboratorium oraz Stephanie Rollero, doktorantka z laboratorium i Stephanie Rollero, doktorantka z naszego zespołu. W autoklawie pasteryzować każde podłoże syntetyczne przygotowane dla każdego źródła azotu w jednolitrowej kolbie zawierającej mieszadło magnetyczne.

Rozpuść odpowiednią ilość znakowanej cząsteczki, aby osiągnąć pożądane stężenie końcowe w pożywce. Wysterylizuj pożywkę za pomocą jednorazowego systemu filtracji próżniowej. Za pomocą sterylnego cylindra miarowego podziel pożywkę między dwa wstępnie wysterylizowane fermentory, które zawierają magnetyczny pręt mieszający i są wyposażone w blokady fermentacyjne, aby uniknąć przedostawania się tlenu, ale umożliwić uwolnienie dwutlenku węgla.

Po wyhodowaniu szczepu cerevisiae w pożywce YPD, należy zebrać podwielokrotność hodowli wstępnej pod przepływem laminarnym i określić ilościowo populację komórek za pomocą elektronicznego licznika cząstek, który jest wyposażony w aperturę o średnicy 100 mikrometrów. Po odwirowaniu kultury wstępnej zawiesić osad w odpowiedniej objętości sterylnej wody, aby uzyskać końcowe stężenie 2,5 razy 10 do 9 komórek na mililitr. Następnie zaszczepić każdy fermentor jednym mililitrem zawiesiny komórkowej.

Następnie przygotuj platformę fermentacyjną, instalując fermentory w prowadnicach wsporczych, które są odpowiednio umieszczone na 21-pozycyjnych płytach mieszających i ustaw szybkość mieszania na 270 obr./min. Aby rozpocząć monitorowanie online każdej fermentacji, uruchom aplikację sterującą robotem, kliknij przycisk Rozpocznij test i wybierz objętość fermentacji, którą chcesz przeprowadzić. Aby upewnić się, że wyświetlany interfejs pozwala na wskazanie liczby i położenia fermentorów na platformie, kliknij prawym przyciskiem myszy lokalizację slotu i wybierz opcję Wyłącz, aby dezaktywować monitorowanie pustych pozycji.

Aby zainicjować oprogramowanie obliczeniowe, kliknij przycisk Inicjator i zatwierdź za pomocą OK. Następnie kliknij przycisk Start w aplikacji do sterowania robotem, aby rozpocząć akwizycję masy. Następnie odwirować dwie sześciomililitrowe próbki pobrane z fermentorów w temperaturze 2000 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zakończeniu przenieś każdy zamrożony supernatant do dwóch probówek i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Umyj każdą osadkę dwukrotnie pięcioma mililitrami wody destylowanej i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu pomiaru wzbogacenia izotopowego. Dodaj 200 mikrolitrów 25% roztworu kwasu sulfosalicylowego, który zawiera 2,5 milimolową norleucynę jako wzorzec wewnętrzny, do 800 mikrolitrów próbki w celu usunięcia cząsteczek o dużej masie cząsteczkowej. Po inkubacji i odwirowaniu przefiltrować mieszaninę przez membranę nitrocelulozową o wielkości porów 0,22 mikrometra i umieścić próbkę w systemie analizy aminokwasów.

W programie lub oprogramowaniu systemu analitycznego należy kliknąć przycisk Uruchom, aby rozpocząć analizy chromatografii cieczowej z analizatorem wyposażonym w kolumnę kationowymienną. Następnie przygotuj utleniony ekstrakt, zawieszając wcześniej przygotowany oznakowany osad komórkowy w 200 mikrolitrach kwasu wodnego. Po inkubacji przez cztery godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza zatrzymaj reakcję, dodając 33,6 miligrama siarczanu sodu.

Dodać 800 mikrolitrów sześciu normalnych kwasów solnych do utlenionego ekstraktu i inkubować próbkę w hermatycznie zamkniętej szklanej probówce przez 16 godzin w temperaturze 110 stopni Celsjusza w piecu grzewczym. Po pozostawieniu próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej dodać 200 mikrolitrów 2,5 milimolowej neuroleucyny i usunąć gazowy chlorowodór strumieniem azotu. Wysuszony ekstrakt przemyć dwukrotnie 800 mikrolitrami wody destylowanej, a następnie 800 mikrolitrami etanolu.

Następnie do ekstraktu dodaj 800 mikrolitrów 200-milimolowego buforu octanu litu. Oznaczyć względne stężenia aminokwasów w białkach w próbce za pomocą opisanej wcześniej metody chromatograficznej. Hydrolizuj oznakowany osad komórkowy, dodając 1,2 mililitra sześciomolowego kwasu solnego i inkubując próbkę przez 16 godzin w temperaturze 105 stopni Celsjusza w szczelnie zamkniętej szklanej probówce w piecu grzewczym.

Po pozostawieniu próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej dodaj 1,2 mililitra wody destylowanej. Po odwirowaniu w celu usunięcia resztek komórkowych rozprowadzić supernatant na sześć frakcji o pojemności 400 mikrolitrów w otwartych szklanych probówkach. Suszyć frakcje w piekarniku na sucho w temperaturze 105 stopni Celsjusza przez cztery do pięciu godzin, aż osiągną konsystencję syropu.

Podczas hydrolizy biomasy wysusz frakcję do uzyskania konsystencji syropu, często kontrolując kwas działania. W przypadku derywatyzacji ECF rozpuścić schłodzony wysuszony hydrolizat w 200 mikrolitrach 20-milimolowego kwasu solnego i 133 mikrolitrach mieszaniny pirydyny i etanolu w proporcji jeden do czterech. Dodaj 50 mikrolitrów chloromrówczanu etylu, aby uzyskać aminokwasy.

Po uwolnieniu dwutlenku węgla przenieść mieszaninę do probówek wirówkowych zawierających 500 mikrolitrów dichlorometanu w celu ekstrakcji derywatyzowanych związków. Wirować próbki przez 10 sekund. Po odwirowaniu przez cztery minuty w temperaturze 10 000 razy G, zebrać dolną fazę organiczną każdej próbki za pomocą pipety Pasteura i przenieść do fiolki do automatycznego pobierania próbek GC, która zawiera stożkową szklaną wkładkę, tak aby każda próbka mogła być bezpośrednio wstrzyknięta do przyrządu GCMS.

Do procedury ECF stosuje się odczynniki do derywatyzacji HPLC. Często zmieniaj odczynniki ECF. W przypadku derywatyzacji DMF-DMA wysuszony hydrolizat rozpuścić w 50 mikrolitrach metanolu i 200 mikrolitrach acetonitrylu.

Dodać 300 mikrolitrów DMF-DMA i przemieszać próbkę. Następnie przenieść próbkę do fiolki z automatycznym podajnikiem próbek do chromatografii statycznej, która zawiera stożkową szklaną wkładkę. W przypadku derywatyzacji BSTFA zawiesić hydrolizat w 200 mikrolitrach acetonitrylu.

Dodaj 200 mikrolitrów BSTFA do próbki i hermatycznie zamknij szklaną rurkę. Po inkubacji przez cztery godziny w temperaturze 135 stopni Celsjusza przenieść schłodzony ekstrakt bezpośrednio do fiolki z automatycznym podajnikiem próbek GC, która zawiera stożkową szklaną wkładkę. Teraz przeanalizuj próbki za pomocą chromatografu gazowego wyposażonego w wtryskiwacz autosamplera i sprzężonego ze spektrometrem masowym.

Kliknij Instrument w menu oprogramowania komputerowego. Na karcie Sekwencja kliknij pozycję Edytuj przykładową tabelę dziennika, aby utworzyć przykładową listę, a następnie kliknij pozycję Uruchom i uruchom sekwencję, aby rozpocząć wstrzykiwania. Po zakończeniu analiz należy zapisać klaster intensywności dla każdego aminokwasu, który odpowiada jego różnym izotopomerom masowym.

Dodaj 10 mikrolitrów odpowiednich deuterowanych wzorców wewnętrznych do pięciu mililitrów supernatantu w 15-mililitrowej szklanej probówce. Dodać jeden mililitr dichlorometanu, szczelnie zamknąć probówkę i wstrząsać próbką na platformie bujającej przez 20 minut. Po odwirowaniu zbierz dolną fazę organiczną do 15-mililitrowej szklanej probówki.

Po powtórzeniu ekstrakcji dichlorometanem, wysuszyć ekstrakt organiczny na ponad 500 miligramów bezwodnego siarczanu sodu i zebrać fazę ciekłą za pomocą pipety Pasteura. Zagęścić ekstrakt czterokrotnie pod wpływem strumienia azotu. Następnie przenieść zagęszczoną próbkę do fiolki z automatycznym podajnikiem próbek do chromatografii chromatycznej.

W celu ilościowego oznaczania GCMS wstrzyknąć dwa mikrolitry próbki w stosunku 10 do jednego i oddzielić wyekstrahowane lotne cząsteczki przy użyciu odpowiedniego profilu temperatury pieca. Korzystając z arkuszy kalkulacyjnych w protokole tekstowym, wprowadź wartości danych surowych, które odpowiadają stężeniu aminokwasów zewnątrzkomórkowych, suchej masie komórek, zawartości białka w komórkach, stężeniu cząsteczek lotnych oraz wzbogaceniu izotopowemu aminokwasów proteinogennych i cząsteczek lotnych. Schemat ideowy przepływu pracy w celu zbadania zarządzania przez drożdże wieloma źródłami azotu, które znajdują się podczas fermentacji wina, jest pokazany tutaj.

Dla różnych punktów pobierania próbek parametry biologiczne wykazują wysoką odtwarzalność między fermenacjami. Przegląd redystrybucji azotu ze źródeł w soku winogronowym do wszystkich aminokwasów proteinogennych przedstawiono tutaj. W połączeniu z określeniem bilansów masy, pomiar wzbogacenia izotopowego aminokwasów proteinogennych dostarczył pierwszego ilościowego określenia udziału argininy, glutaminy, amonu i innych źródeł pochodzenia azotowego w grupach aminowych każdego z tych związków.

Przedstawiono tutaj porównanie ilości zużytych aminokwasów, które są bezpośrednio odzyskiwane do biomasy. Pokazano podział spożywanych aminokwasów alifatycznych, leucyny i waliny w sieci metabolicznej drożdży. Ponad 96% spożywanej waliny i leucyny jest odzyskiwane w produktach konwersji.

Co zaskakujące, znaczna część waliny i leucyny ulega katabolizacji pomimo znacznej nierównowagi między dostępnością tych związków w pożywce a ich zawartością w biomasie. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu dni. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o starannym doborze części podłoża do etykietowania zgodnie z kwestiami naukowymi.

Aby zapewnić dobrą odtwarzalność biologiczną, należy przeprowadzić fermentację i analizę chromatograficzną w dwóch egzemplarzach. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się mikrobiologią do zbadania, w jaki sposób metabolizm i fizjologia mikroorganizmów zmieniają się w zależności od warunków środowiskowych. Nie zapominaj, że praca z odczynnikami do derywatyzacji i rozpuszczalnikiem argininy może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i praca pod wyciągiem.