Name: Przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Poznaj metodę izotopowych znaczników do badania metabolizmu mikroorganizmów z wielu źródeł składników odżywczych. Technika ta pozwala ilościowo określić los pobranych substancji i pochodzenie metaboliczne syntetyzowanych związków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jean-Roch Mouret, Sylvie Dequin i Jean-Marie Sabalyrolles za przyczynienie się do stworzenia zrobotyzowanego systemu fermentacji oraz Martine Pradal, Nicolasowi Bouvierowi i Pascale Brial za ich wsparcie techniczne. Finansowanie tego projektu zostało zapewnione przez Ministère de l'Education Nationale, de la Recherche et de la Technologie.

<ol><li>Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fifteen+years+of+large+scale+metabolic+modeling+of+yeast%3A+developments+and+impacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts.</a> Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).</li>
<li>Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+identification+and+flux+quantification+in+the+central+metabolism+of+Saccharomyces+cerevisiae+under+different+conditions+of+glucose+repression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression.</a> J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).</li>
<li>Wiechert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">13C metabolic flux analysis.</a> Metab Eng. 3, 195-206 (2001).</li>
<li>Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+metabolic+flux+analysis+based+on+gas+chromatography-mass+spectrometry+derived+13C+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints.</a> Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).</li>
<li>Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analytic+and+systematic+framework+for+estimating+metabolic+flux+ratios+from+13C+tracer+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments.</a> BMC Bioinformatics. 9, 266(2008).</li>
<li>Zamboni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C+metabolic+flux+analysis+in+complex+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">13C metabolic flux analysis in complex systems.</a> Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).</li>
<li>Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+plant+metabolic+networks+from+steady-state+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis.</a> Biochimie. 91, 697-702 (2009).</li>
<li>Quek, L. -E., Dietmair, S., Krömer, J. O., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+flux+analysis+in+mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">Metabolic flux analysis in mammalian cell culture.</a> Metab Eng. 12, 161-171 (2010).</li>
<li>Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/279893606_Uptake_of_amino_acids_during_beer_production_The_concept_of_a_critical_time_value">Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value.</a> J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).</li>
<li>Magasanik, B., Kaiser, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+regulation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene. 290, 1-18 (2002).</li>
<li>Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+amino+acid%2C+nucleotide%2C+and+phosphate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190, 885-929 (2012).</li>
<li>Cooper, T. G. Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCooper%2C+TG+%22The+molecular+biology+of+the+yeast+Saccharomyces%3A+Metabolism+and+gene+expression%22">The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression</a>. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 39-99 (1982).</li>
<li>Jones, E. W., Fink, G. R. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJones%2C+EW+%22The+molecular+biology+of+the+yeast+Saccharomyces%3A+Metabolism+and+gene+expression%22">The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression</a>. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 182-299 (1982).</li>
<li>Hazelwood, L. A., Daran, J. -M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ehrlich+pathway+for+fusel+alcohol+production%3A+a+century+of+research+on+Saccharomyces+cerevisiae+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism.</a> Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).</li>
<li>Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0922338X90900574">Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions.</a> J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).</li>
<li>Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+reconstruction+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+metabolic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network.</a> Genome Res. 13, 244-253 (2003).</li>
<li>Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IsoCor%3A+correcting+MS+data+in+isotope+labeling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments.</a> Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ilościowe określenie podziału związków w sieciach metabolicznych przy użyciu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi jest obiecującym podejściem do zrozumienia działania metabolizmu drobnoustrojów. Metodologia ta, choć z powodzeniem stosowana z jednym lub dwoma znakowanymi substratami, nie może być obecnie wdrożona do badania metabolizmu różnych źródeł przy użyciu wielu znakowanych izotopów pierwiastkowych (tj. więcej niż dwóch substratów). Rzeczywiście, dostępne techniki analityczne umożliwiają dokładne określ...

Zrozumienie, jak działa metabolizm mikroorganizmów, jest kluczowym zagadnieniem dla projektowania skutecznych strategii usprawniających procesy fermentacji i modulujących produkcję związków fermentacyjnych. Postępy w genomice i genomice funkcjonalnej w ciągu ostatnich dwóch dekad w znacznym stopniu przyczyniły się do poszerzenia wiedzy na temat topologii sieci metabolicznych w wielu mikroorganizmach. Dostęp do tych informacji doprowadził do opracowania podejść, które mają na celu kompleksowe spojrzenie na funkcje komórkowe1. Metodologie te często opierają się na modelowej interpretacji mierzalnych parametrów. Te dane doświadczalne obejmują, z jednej strony, tempo wychwytu i produkcji metabolitów, a z drugiej strony, ilościowe informacje wewnątrzkomórkowe, które uzyskuje się z doświadczeń ze znacznikami izotopowymi. Dane te dostarczają informacji niezbędnych do wnioskowania o aktywności in vivo różnych szlaków w zdefiniowanej sieci metabolicznej2,3,4. Obecnie dostępne techniki analityczne umożliwiają dokładne wykrywanie wzorców znakowania cząsteczek tylko w przypadku stosowania izotopu pojedynczego pierwiastka i ewentualnie w przypadku jednoczesnego znakowania z dwoma pierwiastkami izotopowymi. Co więcej, w większości warunków wzrostu źródło węgla składa się tylko z jednego lub dwóch związków. W związku z tym podejścia oparte na 13znacznikach izotopowych C z substratów węglowych zostały szeroko i skutecznie zastosowane w celu opracowania pełnego zrozumienia operacji sieci metabolicznej węgla5,6,7,8.
Dla porównania, w wielu środowiskach naturalnych i przemysłowych, dostępne zasoby azotu, które wspierają rozwój mikroorganizmów, często składają się z szerokiej gamy molekuł. Na przykład podczas fermentacji wina lub piwa azot jest dostarczany w postaci mieszaniny 18 aminokwasów i amonu w różnych stężeniach9. Ten szereg związków N, które są dostępne dla anabolizmu, sprawia, że te złożone warunki podłoża znacznie różnią się od tych powszechnie stosowanych w badaniach fizjologicznych, ponieważ te ostatnie są osiągane przy użyciu unikalnego źródła azotu, zwykle amonu.
Ogólnie rzecz biorąc, zinternalizowane związki azotu mogą być bezpośrednio włączane do białek lub katabolizowane. Struktura sieciowa metabolizmu azotu w wielu mikroorganizmach, w tym w drożdżach Saccharomyces cerevisiae, jest bardzo złożona w zależności od różnorodności substratów. Schematycznie, system ten opiera się na połączeniu centralnego rdzenia metabolizmu azotu, który katalizuje wzajemną konwersję glutaminy, glutaminianu i α-ketoglutaranu10,11, z transaminazami i deaminazami. Poprzez tę sieć gromadzone są grupy aminowe z amonu lub innych aminokwasów i uwalniane są α-ketokwasy. Te produkty pośrednie są również syntetyzowane przez centralny metabolizm węgla (CCM)12,13. Ta duża liczba reakcji rozgałęzionych i pośrednich, biorących udział zarówno w katabolizmie egzogennych źródeł azotu, jak i w anabolizmie aminokwasów proteinogennych, spełnia wymagania anaboliczne komórek. Aktywność poprzez te różne połączone ze sobą szlaki powoduje również wydalanie metabolitów. W szczególności α-ketokwasy mogą być przekierowywane przez szlak Ehrlicha w celu wytworzenia wyższych alkoholi i ich pochodnych estrów octanowych 14, które są niezbędnymi składnikami profili sensorycznych produktów. Następnie, sposób metabolizmu azotu odgrywa kluczową rolę w produkcji biomasy i tworzeniu lotnych cząsteczek (aromatu).
Reakcje, enzymy i geny biorące udział w metabolizmie azotu są obszernie opisane w literaturze. Jednak kwestia rozmieszczenia wielu źródeł azotu w całej sieci metabolicznej nie została jeszcze rozwiązana. Istnieją dwa główne powody, które wyjaśniają ten brak informacji. Po pierwsze, ze względu na dużą złożoność sieci metabolizmu azotu, do pełnego zrozumienia jej działania potrzebna jest duża ilość danych ilościowych, które do tej pory były niedostępne. Po drugie, wiele ograniczeń eksperymentalnych i ograniczeń metod analitycznych uniemożliwiało wdrożenie podejść, które wcześniej były stosowane do wyjaśnienia funkcji CCM.
Aby przezwyciężyć te problemy, zdecydowaliśmy się opracować podejście na poziomie systemu, które opiera się na uzgadnianiu danych z serii eksperymentów z izotopowymi znacznikami. Przepływ pracy obejmuje: 
- Zestaw fermentacji przeprowadzanych w tych samych warunkach środowiskowych, przy czym za każdym razem oznaczane jest inne wybrane źródło składników odżywczych (substrat). 
- Kombinacja procedur analitycznych (HPLC, GC-MS) w celu dokładnego określenia, na różnych etapach fermentacji, stężenia resztkowego znakowanego substratu oraz stężenia i wzbogacenia izotopowego związków, które pochodzą z katabolizmu znakowanej cząsteczki, w tym pochodzącej biomasy. 
- Obliczenie masy i równowagi izotopowej dla każdej zużytej znakowanej cząsteczki oraz dalsza zintegrowana analiza zestawu danych w celu uzyskania globalnego przeglądu zarządzania wieloma źródłami składników odżywczych przez mikroorganizmy poprzez określenie proporcji strumienia.
Aby zastosować tę metodologię, należy zwrócić uwagę na powtarzalne zachowanie szczepu/mikroorganizmu między kulturami. Ponadto próbki z różnych kultur muszą być pobierane podczas tego samego, dobrze określonego postępu fermentacji. W pracach eksperymentalnych opisanych w tym manuskrypcie system wspomagany przez robota jest używany do monitorowania fermentacji online w celu uwzględnienia tych ograniczeń.
Ponadto, ważne jest, aby wybrać zestaw oznaczonych substratów (związek, rodzaj i położenie etykiety), który jest odpowiedni do rozwiązania naukowego problemu badania. Tutaj wybrano 15znakowanych N amonu, glutaminy i argininy jako trzy główne źródła azotu znajdujące się w soku winogronowym. Pozwoliło to na ocenę wzorca redystrybucji azotu od spożywanych związków do aminokwasów proteinogennych. Naszym celem było również zbadanie losów szkieletu węglowego spożywanych aminokwasów i ich udziału w produkcji cząsteczek lotnych. Aby osiągnąć ten cel, do badania włączono jednolicie 13znakowanych C leucyny, izoleucyny, treoniny i waliny jako aminokwasów pochodzących z głównych produktów pośrednich szlaku Ehrlicha.
Ogólnie rzecz biorąc, zbadaliśmy ilościowo, jak drożdże zarządzają złożonymi zasobami azotu, redystrybuując egzogenne źródła azotu, aby spełnić swoje wymagania anaboliczne podczas fermentacji, jednocześnie usuwając nadmiar prekursorów węgla w postaci lotnych cząsteczek. Procedura eksperymentalna opisana w tym artykule może być zastosowana do zbadania innych wielorakich źródeł składników odżywczych wykorzystywanych przez dowolny inny mikroorganizm. Wydaje się, że jest to odpowiednie podejście do analizy wpływu tła genetycznego lub warunków środowiskowych na zachowanie metaboliczne mikroorganizmów.

<table><tbody><tr><td>D-Glukoza</td><td>PanReac</td><td>141341.0416</td><td></td></tr><tr><td>D-Fruktoza</td><td>PanReac</td><td>142728.0416</td><td></td></tr><tr><td>Kwas DL-jabłkowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0875</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy jednowodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7129</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0772</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4514</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan manganu jednowodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan siedmiowodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan miedzi (II) pięciowodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7631</td><td></td></tr><tr><td>Jod potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4286</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek kobaltu (II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3169</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>Heptamolibdenian amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7302</td><td></td></tr><tr><td>Myo-inozytol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>Kwas D-pantotenowy sól hemiwapniowa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>21210</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina, chlorowodorek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4625</td><td></td></tr><tr><td>Kwas nikotynowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4126</td><td></td></tr><tr><td>Pirydoksyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5669</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Ergost&eacute; rol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6510</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>101074F</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek żelaza (III)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-asparaginowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-glutaminowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>L-Histydyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-Izoleucyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-Lizyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-Fenyloalanina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>L-Prolina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-treonina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-Tryptofan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrozyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>L-Walina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>13C5-L-Walina</td><td>Eurisotop</td><td>CLM-2249-H-0.25</td><td></td></tr><tr><td>13C6-L-Leucyna</td><td>Eurisotop</td><td>CLM-2262-H-0,25</td><td></td></tr><tr><td>15Chlorek N-amonu</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-467-1</td><td></td></tr><tr><td>ALPHA-15N-L-Glutamina</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-1016-1</td><td></td></tr><tr><td>U-15N4-L-arginina</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-396-PK</td><td></td></tr><tr><td>Octan etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>270989</tr><tr><td>Propanian etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>112305</td><td></td></tr><tr><td>2-metylopropanian etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>246085</td><td></td></tr><tr><td>Butanian etylu</td><td>Sigma</td><td>Aldrich E15701</td><td></td></tr><tr><td>2-metylobutanian etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>306886</td><td></td></tr><tr><td>3-metylobutanian etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8.08541.0250</td><td></td></tr><tr><td>Heksanian etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>148962</td><td></td></tr><tr><td>Oktanian etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244910</td><td></td></tr><tr><td>Dekanian etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W243205</td><td></td></tr><tr><td>Dodekanian etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244112</td><td></td></tr><tr><td>Mleczan etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244015</td><td></td></tr><tr><td>Bursztynian dietylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>W237701</tr><tr><td>octan 2-metylopropylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W217514</td><td></td></tr><tr><td>octan 2-metylobutylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W364401</td><td></td></tr><tr><td>octan 3-metylobutylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>287725</td><td></td></tr><tr><td>octan 2-fenyloetylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>290580</td><td></td></tr><tr><td>2-metylopropanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>294829</td><td></td></tr><tr><td>2- metylobutanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>133051</td><td></td></tr><tr><td>3-metylobutanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>309435</td><td></td></tr><tr><td>Hexanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>128570</td><td></td></tr><tr><td>2-fenyloetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77861</td><td></td></tr><tr><td>Kwas propanowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94425</td><td></td></tr><tr><td>Kwas butanowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>19215</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 2-metylopropanowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>58360</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 2-metylobutanowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>193070</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 3-metylobutanowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W310212</td><td></td></tr><tr><td>Kwas heksanowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>153745</td><td></td></tr><tr><td>Kwas oktanowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W279900</td><td></td></tr><tr><td>Kwas dekanowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W236403</td><td></td></tr><tr><td>Kwas dodekanowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L556</td><td></td></tr><tr><td>Fermentor 1L</td><td>Legallais</td><td>AT1357</td><td>Fermentor ręcznie robiony do fermentacji</td></tr><tr><td>Jednorazowy system filtracji próżniowej</td><td>Dominique Deutscher</td><td>029311</td><td></td></tr><tr><td>Fermentory (250 ml)</td><td>Legallais</td><td>AT1352</td><td>Fermentor ręcznie robiony do fermentacji</td></tr><tr><td>Sterylne rurki</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Zamki fermentacyjne</td><td>Legallais</td><td>AT1356</td><td>Zamki fermetacyjne ręcznie robione do fermentacji</td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży baktonowych</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptone</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka do inkubatora</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Licznik cząstek</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605697</td><td>Multisizer 3 Coulter</td></tr><tr><td>Counter Wirówka</td><td>Jouan</td><td></td><td>GR412</td></tr><tr><td>Plate Butler System robotyczny</td><td>Lab Services BV</td><td>PF0X-MA</td><td>Automatic Instrument</td></tr><tr><td>Plate Butler Software</td><td>Lab Services BV</td><td></td><td>Oprogramowanie do monitorowania robotów</td></tr><tr><td>RobView</td><td></td><td></td><td>Opracowane przez nas oprogramowanie obliczeniowe</td></tr><tr><td>My SQL</td><td></td><td></td><td>Międzynarodowa baza źródeł</td></tr><tr><td>Mieszadła wielopunktowe Cimarec i Telesystem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50088009</td><td>String Drive 60</td></tr><tr><td>Platforma BenchBlotter rocker</td><td>Dutscher</td><td>60903</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw enzymatyczny amoniaku</td><td>R-Biopharm AG</td><td>5390</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety spektrofotometru</td><td>VWR</td><td>634-0678</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UviLine 9400</td><td>Secomam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standardy aminokwasów fizjologiczne - kwasowe i neutralne</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6407</td><td></td></tr><tr><td>Wzorce aminokwasów fizjologiczne - podstawy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6282</td><td></td></tr><tr><td>litowe cytrynianu - Odczynnik Ultra ninhydryny</td><td>Biochrom</td><td>BC80-6000-06</td><td></td></tr><tr><td>Kwas sulfosalycylowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2130</td><td></td></tr><tr><td>Norleucine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N1398</td><td></td></tr><tr><td>Biochrom 30 AAA</td><td>Biochrom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZChrom Elite</td><td>Biochrom</td><td></td><td>Oprogramowanie do sterowania instrumentami i analizy danych</td></tr><tr><td>Żywica Ultropac 8 Lithium</td><td>Biochrom</td><td>BC80-6002-47</td> Litowy fizjologiczny filtr <td>kolumnowy o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Millex GV</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGVX13NL</td><td>Millex GV 13mm (wielkość porów 0,22 i mikro; m)</td></tr> <tr><td>Filtr membranowy PALL</td><td>VWR</td><td>514-4157</td><td>Supor-450 47mm 0,45&micro; </td></tr><tr><td>m Pompa próżniowa Millivac Mini</td><td>Millipore</td><td>XF5423050</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowa gładka półmisek wagowa 70mm</td><td>VWR</td><td>611-1380</td><td></td></tr><tr><td>Waga precyzyjna</td><td>Mettler</td><td></td><td>Dane techniczne AE163</td></tr><tr><td>Suszony dimetylosulfoksydek</td><td>Merck</td><td>1029310161</td><td>(maks. 0,025% H2O) Piec</td></tr><tr><td>do spalania</td><td>SeccoSolv Legallais</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td><td>Interchim</td><td>UP40840A</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Fluka</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny dymiący 37% Emsure</td><td>Merck</td><td>1003171000</td><td>Grade ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Bufor octanu litu</td><td>Biochrom</td><td>80-2038-10</td><td></td></tr><tr><td>Komercyjny roztwór hydrolizowanych aminokwasów</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AAS18</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina sulfon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0876</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteinowy monohydrat Sigma</td><td>Aldrich</td><td>30170</td><td></td></tr><tr><td>Probówki hodowlane ze szkła pyrexowego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z653586</td><td></td></tr><tr><td>Pirydyna</td><td>Acros Organics</td><td>131780500</td><td>99% ekstraczysty</td></tr><tr><td>chloromrówczan etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23131</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Fiolki Sigma Aldrich</td><td>32222</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>854165</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowkładki do fiolek 1,5 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SU860066</td><td></td></tr><tr><td>GC/MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>5890 GC/5973 MS</td><td></td></tr><tr><td>Chemstation</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Oprogramowanie do kontroli i analizy danych</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td>Chromasolv, do HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td>ChromasolvPlus, do HPLC</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide dimetyloacetal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>394963</td><td></td></tr><tr><td>BSTFA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>33024</td><td></td></tr><tr><td>DB-17MS kolumna</td><td>Agilent Technologies</td><td>122-4731</td><td>30 m * 0,25 mm * 0,15 i mikro; m</td></tr><tr><td>Siarczan sodu, bezwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238597</td><td></td></tr><tr><td>Azot techniczny</td><td>Produkty powietrzne</td><td>14629</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna Zebron ZB-WAX</td><td>Phenomenex</td><td>7HG-G007-11</td><td>30 m * 0,25 mm * 0,25 i mikro; m</td></tr><tr><td>Helium BIP</td><td>Air products</td><td>26699</td><td></td></tr><tr><td>Szklane pipety Pasteura</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td></td></tr></tbody></table>

przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

Badania w dziedzinie mikrobiologii opierają się na zastosowaniu szerokiego zakresu metodologii. W szczególności opracowanie odpowiednich metod w istotny sposób przyczynia się do dostarczenia szerokiej wiedzy na temat metabolizmu mikroorganizmów rosnących w chemicznie zdefiniowanych podłożach zawierających unikalne źródła azotu i węgla. W przeciwieństwie do tego, zarządzanie poprzez metabolizm wielu źródeł składników odżywczych, pomimo ich szerokiej obecności w środowisku naturalnym lub przemysłowym, pozostaje praktycznie niezbadane. Sytuacja ta wynika głównie z braku odpowiednich metodologii, co utrudnia prowadzenie dochodzeń.
Przedstawiamy eksperymentalną strategię, aby ilościowo i kompleksowo zbadać, jak działa metabolizm, gdy składnik odżywczy jest dostarczany jako mieszanina różnych cząsteczek, tj. złożony zasób. W tym miejscu opisujemy jego zastosowanie do oceny podziału wielu źródeł azotu przez sieć metaboliczną drożdży. Przepływ pracy łączy informacje uzyskane podczas eksperymentów ze znacznikiem stabilnych izotopów przy użyciu wybranych 13substratów znakowanych C lub 15N. Najpierw składa się z równoległych i powtarzalnych fermentacji w tym samym środowisku, które obejmuje mieszaninę cząsteczek zawierających N; Jednak za każdym razem oznaczane jest wybrane źródło azotu. Zastosowano kombinację procedur analitycznych (HPLC, GC-MS) w celu oceny wzorców znakowania docelowych związków oraz ilościowego określenia zużycia i odzysku substratów w innych metabolitach. Zintegrowana analiza całego zestawu danych zapewnia przegląd losów zużytych substratów w komórkach. Takie podejście wymaga dokładnego protokołu pobierania próbek – ułatwionego przez zrobotyzowany system monitorowania fermentacji online – oraz przeprowadzenia wielu czasochłonnych analiz. Pomimo tych ograniczeń pozwoliło to po raz pierwszy zrozumieć podział wielu źródeł azotu w całej sieci metabolicznej drożdży. Wyjaśniliśmy redystrybucję azotu z bardziej obfitych źródeł w kierunku innych N-związków i określiliśmy metaboliczne pochodzenie lotnych cząsteczek i aminokwasów proteinogennych.

Rycina 3 przedstawia schematyczny diagram procesu wdrożonego w celu zbadania sposobu zarządzania wieloma źródłami azotu występującymi podczas fermentacji wina przez drożdże. 
W różnych punktach pobierania próbek parametry biologiczne – charakterystyka wzrostu, wzorce zużycia azotu oraz profil aminokwasów proteinogennych – wykazują wysoką powtarzalność pomiędzy fermentacjami (Rycina 4). Ta spójność potwierdza zasadność podejści...

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę ilościowego i kompleksowego badania metabolizmu wielu źródeł składników odżywczych. Ten przepływ pracy, oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi i procedury analitycznej, pozwala na określenie losu spożywanych składników odżywczych i pochodzenia metabolicznego cząsteczek syntetyzowanych przez mikroorganizmy.

Przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe zbadanie metabolizmu wielu źródeł składników odżywczych przy użyciu znakowanych substratów. Taki przebieg pracy pozwala na określenie losów spożywanych składników odżywczych oraz pochodzenia metabolicznego związków syntetyzowanych przez drożdże. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie metabolizmu drobnoustrojów, takie jak to, jak działa cały metabolizm w zależności od warunków środowiskowych.Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wyjaśnienie i ilościowe określenie białka dystrybucji składników odżywczych z wielu źródeł. Metoda ta została wykorzystana do zbadania metabolizmu azotu w drożdżach, ale może być również stosowana do innych metabolizmów i mikroorganizmów. Kluczem do sukcesu w tym eksperymencie jest powtarzalność fermentacji.Użytkownicy muszą zwrócić szczególną uwagę na pobranie komórek w tym samym określonym stadium fizjologicznym. Procedurę zademonstrują Christian Picou z naszego personelu technicznego, Pauline Seguinot, doktorantka z laboratorium oraz Stephanie Rollero, doktorantka z laboratorium i Stephanie Rollero, doktorantka z naszego zespołu. W autoklawie pasteryzować każde podłoże

workflow-based-on-combination-isotopic-tracer-experiments-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano profilowanie stabilnych izotopów za pomocą analizy chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas w celu badania przepływu metabolitów pośrednich u nicienia Caenorhabditis elegans. Szczegółowo przedstawiono metody oceny wzbogacenia izotopowego w dwutlenku węgla, kwasach organicznych i aminokwasach po ekspozycji na izotopy, zarówno podczas rozwoju na płytkach agarowych, jak i w okresie dorosłości w hodowli ciekłej.

Stabilne profilowanie izotopowe strumieni metabolicznych produktów pośrednich u Caenorhabditis elegans w stadium rozwojowym i dorosłym

Znakowanie izotopem 13C jest użyteczną techniką określania centralnego metabolizmu komórkowego dla różnych typów mikroorganizmów. Po hodowli komórek ze specyficznym znakowanym substratem, pomiar GC-MS może ujawnić funkcjonalne szlaki metaboliczne na podstawie unikalnych wzorów znakowania w aminokwasach proteinogennych.

Potwierdzanie i odkrywanie szlaków metabolicznych poprzez znakowanie 13C aminokwasów proteinogennych

Aktywna społeczność bakteryjna związana z jelitami Spodoptera littoralis, została określona przez sondowanie stabilnymi izotopami (SIP) sprzężone z pirosekwencjonowaniem. Korzystając z tej metodologii, identyfikacja metabolicznie aktywnych gatunków bakterii w społeczności została przeprowadzona z wysoką rozdzielczością i precyzją.

Identyfikacja metabolicznie aktywnych bakterii w jelicie ogólnego Spodoptera littoralis za pomocą sondowania stabilnych izotopów DNA przy użyciu 13C-glukozy

Rozpuszczona materia organiczna stanowi ważne źródło energii i składników odżywczych dla ekosystemów. W tym miejscu demonstrujemy metodę opartą na terenie do manipulowania otaczającą pulą rozpuszczonej materii organicznej in situ za pomocą łatwych do odtworzenia impulsów składników odżywczych.

Zrozumienie biogeochemii rozpuszczonej materii organicznej poprzez manipulacje składnikami odżywczymi in situ w ekosystemach strumieni

Ten artykuł opisuje metodę badania metabolizmu komórkowego w złożonych społecznościach wielu typów komórek, wykorzystując kombinację śledzenia stabilnych izotopów, sortowania komórek w celu izolowania określonych typów komórek oraz spektrometrii mas.

Metoda pomiaru metabolizmu w posortowanych subpopulacjach złożonych zbiorowisk komórkowych za pomocą śledzenia stabilnych izotopów

Ten artykuł opisuje szczegółowe protokoły do produkcji urządzeń ekosystemowych (EcoFAB), które umożliwiają badania roślin i interakcji roślina-mikroorganizm w ściśle kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

Protokoły wytwarzania ekosystemów (EcoFAB) do budowy ekosystemów laboratoryjnych przeznaczonych do badania interakcji między roślinami a mikroorganizmami

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Prezentowany tutaj jest protokół dla techniki opartej na mikroskopii epifluorescencyjnej dla pojedynczej komórki, do ilościowego określania wskaźników wypasu u wodnych drapieżnych eukariontów z wysoką precyzją i rozdzielczością taksonomiczną.

Fluorescencyjnie znakowane bakterie jako znacznik w celu ujawnienia nowych szlaków przepływu węgla organicznego w ekosystemach wodnych

Nowatorska metoda przygotowania próbek została zademonstrowana do analizy makrokolonii bakteryjnych na bazie agaru za pomocą matrycowej desorpcji/jonizacji laserowej spektrometrii mas.

Badanie współpracy mikrobiologicznej poprzez obrazową analizę spektrometrii mas kolonii bakteryjnych hodowanych na agarze i w tkance podczas infekcji

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący optyczną fototermiczną hybrydyzację in situ z fluorescencją podczerwieni (OPTIR-FISH), znaną również jako fototermiczna RYBA w średniej podczerwieni (MIP-FISH), do identyfikacji pojedynczych komórek i zrozumienia ich metabolizmu. Metodologia ta może być szeroko stosowana do różnych zastosowań, w tym do mapowania metabolizmu komórkowego z rozdzielczością pojedynczej komórki.

Optyczna fototermiczna hybrydyzacja in situ z fluorescencją w podczerwieni (OPTIR-FISH)

Poznaj metodę izotopowych znaczników do badania metabolizmu mikroorganizmów z wielu źródeł składników odżywczych. Technika ta pozwala ilościowo określić los pobranych substancji i pochodzenie metaboliczne syntetyzowanych związków.

Przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych (Wideo) | JoVE Journal

Przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych

Przeglądaj więcej filmów