Name: Przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Poznaj metodę izotopowych znaczników do badania metabolizmu mikroorganizmów z wielu źródeł składników odżywczych. Technika ta pozwala ilościowo określić los pobranych substancji i pochodzenie metaboliczne syntetyzowanych związków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jean-Roch Mouret, Sylvie Dequin i Jean-Marie Sabalyrolles za przyczynienie się do stworzenia zrobotyzowanego systemu fermentacji oraz Martine Pradal, Nicolasowi Bouvierowi i Pascale Brial za ich wsparcie techniczne. Finansowanie tego projektu zostało zapewnione przez Ministère de l'Education Nationale, de la Recherche et de la Technologie.

<ol><li>Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fifteen+years+of+large+scale+metabolic+modeling+of+yeast%3A+developments+and+impacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts.</a> Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).</li>
<li>Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+identification+and+flux+quantification+in+the+central+metabolism+of+Saccharomyces+cerevisiae+under+different+conditions+of+glucose+repression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression.</a> J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).</li>
<li>Wiechert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">13C metabolic flux analysis.</a> Metab Eng. 3, 195-206 (2001).</li>
<li>Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+metabolic+flux+analysis+based+on+gas+chromatography-mass+spectrometry+derived+13C+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints.</a> Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).</li>
<li>Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analytic+and+systematic+framework+for+estimating+metabolic+flux+ratios+from+13C+tracer+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments.</a> BMC Bioinformatics. 9, 266(2008).</li>
<li>Zamboni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C+metabolic+flux+analysis+in+complex+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">13C metabolic flux analysis in complex systems.</a> Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).</li>
<li>Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+plant+metabolic+networks+from+steady-state+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis.</a> Biochimie. 91, 697-702 (2009).</li>
<li>Quek, L. -E., Dietmair, S., Krömer, J. O., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+flux+analysis+in+mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">Metabolic flux analysis in mammalian cell culture.</a> Metab Eng. 12, 161-171 (2010).</li>
<li>Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/279893606_Uptake_of_amino_acids_during_beer_production_The_concept_of_a_critical_time_value">Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value.</a> J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).</li>
<li>Magasanik, B., Kaiser, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+regulation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene. 290, 1-18 (2002).</li>
<li>Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+amino+acid%2C+nucleotide%2C+and+phosphate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190, 885-929 (2012).</li>
<li>Cooper, T. G. Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCooper%2C+TG+%22The+molecular+biology+of+the+yeast+Saccharomyces%3A+Metabolism+and+gene+expression%22">The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression</a>. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 39-99 (1982).</li>
<li>Jones, E. W., Fink, G. R. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJones%2C+EW+%22The+molecular+biology+of+the+yeast+Saccharomyces%3A+Metabolism+and+gene+expression%22">The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression</a>. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 182-299 (1982).</li>
<li>Hazelwood, L. A., Daran, J. -M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ehrlich+pathway+for+fusel+alcohol+production%3A+a+century+of+research+on+Saccharomyces+cerevisiae+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism.</a> Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).</li>
<li>Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0922338X90900574">Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions.</a> J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).</li>
<li>Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+reconstruction+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+metabolic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network.</a> Genome Res. 13, 244-253 (2003).</li>
<li>Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IsoCor%3A+correcting+MS+data+in+isotope+labeling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments.</a> Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ilościowe określenie podziału związków w sieciach metabolicznych przy użyciu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi jest obiecującym podejściem do zrozumienia działania metabolizmu drobnoustrojów. Metodologia ta, choć z powodzeniem stosowana z jednym lub dwoma znakowanymi substratami, nie może być obecnie wdrożona do badania metabolizmu różnych źródeł przy użyciu wielu znakowanych izotopów pierwiastkowych (tj. więcej niż dwóch substratów). Rzeczywiście, dostępne techniki analityczne umożliwiają dokładne określ...

Zrozumienie, jak działa metabolizm mikroorganizmów, jest kluczowym zagadnieniem dla projektowania skutecznych strategii usprawniających procesy fermentacji i modulujących produkcję związków fermentacyjnych. Postępy w genomice i genomice funkcjonalnej w ciągu ostatnich dwóch dekad w znacznym stopniu przyczyniły się do poszerzenia wiedzy na temat topologii sieci metabolicznych w wielu mikroorganizmach. Dostęp do tych informacji doprowadził do opracowania podejść, które mają na celu kompleksowe spojrzenie na funkcje komórkowe1. Metodologie te często opierają się na modelowej interpretacji mierzalnych parametrów. Te dane doświadczalne obejmują, z jednej strony, tempo wychwytu i produkcji metabolitów, a z drugiej strony, ilościowe informacje wewnątrzkomórkowe, które uzyskuje się z doświadczeń ze znacznikami izotopowymi. Dane te dostarczają informacji niezbędnych do wnioskowania o aktywności in vivo różnych szlaków w zdefiniowanej sieci metabolicznej2,3,4. Obecnie dostępne techniki analityczne umożliwiają dokładne wykrywanie wzorców znakowania cząsteczek tylko w przypadku stosowania izotopu pojedynczego pierwiastka i ewentualnie w przypadku jednoczesnego znakowania z dwoma pierwiastkami izotopowymi. Co więcej, w większości warunków wzrostu źródło węgla składa się tylko z jednego lub dwóch związków. W związku z tym podejścia oparte na 13znacznikach izotopowych C z substratów węglowych zostały szeroko i skutecznie zastosowane w celu opracowania pełnego zrozumienia operacji sieci metabolicznej węgla5,6,7,8.
Dla porównania, w wielu środowiskach naturalnych i przemysłowych, dostępne zasoby azotu, które wspierają rozwój mikroorganizmów, często składają się z szerokiej gamy molekuł. Na przykład podczas fermentacji wina lub piwa azot jest dostarczany w postaci mieszaniny 18 aminokwasów i amonu w różnych stężeniach9. Ten szereg związków N, które są dostępne dla anabolizmu, sprawia, że te złożone warunki podłoża znacznie różnią się od tych powszechnie stosowanych w badaniach fizjologicznych, ponieważ te ostatnie są osiągane przy użyciu unikalnego źródła azotu, zwykle amonu.
Ogólnie rzecz biorąc, zinternalizowane związki azotu mogą być bezpośrednio włączane do białek lub katabolizowane. Struktura sieciowa metabolizmu azotu w wielu mikroorganizmach, w tym w drożdżach Saccharomyces cerevisiae, jest bardzo złożona w zależności od różnorodności substratów. Schematycznie, system ten opiera się na połączeniu centralnego rdzenia metabolizmu azotu, który katalizuje wzajemną konwersję glutaminy, glutaminianu i α-ketoglutaranu10,11, z transaminazami i deaminazami. Poprzez tę sieć gromadzone są grupy aminowe z amonu lub innych aminokwasów i uwalniane są α-ketokwasy. Te produkty pośrednie są również syntetyzowane przez centralny metabolizm węgla (CCM)12,13. Ta duża liczba reakcji rozgałęzionych i pośrednich, biorących udział zarówno w katabolizmie egzogennych źródeł azotu, jak i w anabolizmie aminokwasów proteinogennych, spełnia wymagania anaboliczne komórek. Aktywność poprzez te różne połączone ze sobą szlaki powoduje również wydalanie metabolitów. W szczególności α-ketokwasy mogą być przekierowywane przez szlak Ehrlicha w celu wytworzenia wyższych alkoholi i ich pochodnych estrów octanowych 14, które są niezbędnymi składnikami profili sensorycznych produktów. Następnie, sposób metabolizmu azotu odgrywa kluczową rolę w produkcji biomasy i tworzeniu lotnych cząsteczek (aromatu).
Reakcje, enzymy i geny biorące udział w metabolizmie azotu są obszernie opisane w literaturze. Jednak kwestia rozmieszczenia wielu źródeł azotu w całej sieci metabolicznej nie została jeszcze rozwiązana. Istnieją dwa główne powody, które wyjaśniają ten brak informacji. Po pierwsze, ze względu na dużą złożoność sieci metabolizmu azotu, do pełnego zrozumienia jej działania potrzebna jest duża ilość danych ilościowych, które do tej pory były niedostępne. Po drugie, wiele ograniczeń eksperymentalnych i ograniczeń metod analitycznych uniemożliwiało wdrożenie podejść, które wcześniej były stosowane do wyjaśnienia funkcji CCM.
Aby przezwyciężyć te problemy, zdecydowaliśmy się opracować podejście na poziomie systemu, które opiera się na uzgadnianiu danych z serii eksperymentów z izotopowymi znacznikami. Przepływ pracy obejmuje: 
- Zestaw fermentacji przeprowadzanych w tych samych warunkach środowiskowych, przy czym za każdym razem oznaczane jest inne wybrane źródło składników odżywczych (substrat). 
- Kombinacja procedur analitycznych (HPLC, GC-MS) w celu dokładnego określenia, na różnych etapach fermentacji, stężenia resztkowego znakowanego substratu oraz stężenia i wzbogacenia izotopowego związków, które pochodzą z katabolizmu znakowanej cząsteczki, w tym pochodzącej biomasy. 
- Obliczenie masy i równowagi izotopowej dla każdej zużytej znakowanej cząsteczki oraz dalsza zintegrowana analiza zestawu danych w celu uzyskania globalnego przeglądu zarządzania wieloma źródłami składników odżywczych przez mikroorganizmy poprzez określenie proporcji strumienia.
Aby zastosować tę metodologię, należy zwrócić uwagę na powtarzalne zachowanie szczepu/mikroorganizmu między kulturami. Ponadto próbki z różnych kultur muszą być pobierane podczas tego samego, dobrze określonego postępu fermentacji. W pracach eksperymentalnych opisanych w tym manuskrypcie system wspomagany przez robota jest używany do monitorowania fermentacji online w celu uwzględnienia tych ograniczeń.
Ponadto, ważne jest, aby wybrać zestaw oznaczonych substratów (związek, rodzaj i położenie etykiety), który jest odpowiedni do rozwiązania naukowego problemu badania. Tutaj wybrano 15znakowanych N amonu, glutaminy i argininy jako trzy główne źródła azotu znajdujące się w soku winogronowym. Pozwoliło to na ocenę wzorca redystrybucji azotu od spożywanych związków do aminokwasów proteinogennych. Naszym celem było również zbadanie losów szkieletu węglowego spożywanych aminokwasów i ich udziału w produkcji cząsteczek lotnych. Aby osiągnąć ten cel, do badania włączono jednolicie 13znakowanych C leucyny, izoleucyny, treoniny i waliny jako aminokwasów pochodzących z głównych produktów pośrednich szlaku Ehrlicha.
Ogólnie rzecz biorąc, zbadaliśmy ilościowo, jak drożdże zarządzają złożonymi zasobami azotu, redystrybuując egzogenne źródła azotu, aby spełnić swoje wymagania anaboliczne podczas fermentacji, jednocześnie usuwając nadmiar prekursorów węgla w postaci lotnych cząsteczek. Procedura eksperymentalna opisana w tym artykule może być zastosowana do zbadania innych wielorakich źródeł składników odżywczych wykorzystywanych przez dowolny inny mikroorganizm. Wydaje się, że jest to odpowiednie podejście do analizy wpływu tła genetycznego lub warunków środowiskowych na zachowanie metaboliczne mikroorganizmów.

<table><tbody><tr><td>D-Glukoza</td><td>PanReac</td><td>141341.0416</td><td></td></tr><tr><td>D-Fruktoza</td><td>PanReac</td><td>142728.0416</td><td></td></tr><tr><td>Kwas DL-jabłkowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0875</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy jednowodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7129</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0772</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4514</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan manganu jednowodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan siedmiowodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan miedzi (II) pięciowodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7631</td><td></td></tr><tr><td>Jod potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4286</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek kobaltu (II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3169</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>Heptamolibdenian amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7302</td><td></td></tr><tr><td>Myo-inozytol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>Kwas D-pantotenowy sól hemiwapniowa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>21210</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina, chlorowodorek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4625</td><td></td></tr><tr><td>Kwas nikotynowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4126</td><td></td></tr><tr><td>Pirydoksyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5669</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Ergost&eacute; rol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6510</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>101074F</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek żelaza (III)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-asparaginowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-glutaminowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>L-Histydyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-Izoleucyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-Lizyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-Fenyloalanina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>L-Prolina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-treonina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-Tryptofan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrozyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>L-Walina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>13C5-L-Walina</td><td>Eurisotop</td><td>CLM-2249-H-0.25</td><td></td></tr><tr><td>13C6-L-Leucyna</td><td>Eurisotop</td><td>CLM-2262-H-0,25</td><td></td></tr><tr><td>15Chlorek N-amonu</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-467-1</td><td></td></tr><tr><td>ALPHA-15N-L-Glutamina</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-1016-1</td><td></td></tr><tr><td>U-15N4-L-arginina</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-396-PK</td><td></td></tr><tr><td>Octan etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>270989</tr><tr><td>Propanian etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>112305</td><td></td></tr><tr><td>2-metylopropanian etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>246085</td><td></td></tr><tr><td>Butanian etylu</td><td>Sigma</td><td>Aldrich E15701</td><td></td></tr><tr><td>2-metylobutanian etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>306886</td><td></td></tr><tr><td>3-metylobutanian etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8.08541.0250</td><td></td></tr><tr><td>Heksanian etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>148962</td><td></td></tr><tr><td>Oktanian etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244910</td><td></td></tr><tr><td>Dekanian etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W243205</td><td></td></tr><tr><td>Dodekanian etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244112</td><td></td></tr><tr><td>Mleczan etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244015</td><td></td></tr><tr><td>Bursztynian dietylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>W237701</tr><tr><td>octan 2-metylopropylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W217514</td><td></td></tr><tr><td>octan 2-metylobutylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W364401</td><td></td></tr><tr><td>octan 3-metylobutylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>287725</td><td></td></tr><tr><td>octan 2-fenyloetylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>290580</td><td></td></tr><tr><td>2-metylopropanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>294829</td><td></td></tr><tr><td>2- metylobutanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>133051</td><td></td></tr><tr><td>3-metylobutanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>309435</td><td></td></tr><tr><td>Hexanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>128570</td><td></td></tr><tr><td>2-fenyloetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77861</td><td></td></tr><tr><td>Kwas propanowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94425</td><td></td></tr><tr><td>Kwas butanowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>19215</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 2-metylopropanowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>58360</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 2-metylobutanowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>193070</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 3-metylobutanowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W310212</td><td></td></tr><tr><td>Kwas heksanowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>153745</td><td></td></tr><tr><td>Kwas oktanowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W279900</td><td></td></tr><tr><td>Kwas dekanowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W236403</td><td></td></tr><tr><td>Kwas dodekanowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L556</td><td></td></tr><tr><td>Fermentor 1L</td><td>Legallais</td><td>AT1357</td><td>Fermentor ręcznie robiony do fermentacji</td></tr><tr><td>Jednorazowy system filtracji próżniowej</td><td>Dominique Deutscher</td><td>029311</td><td></td></tr><tr><td>Fermentory (250 ml)</td><td>Legallais</td><td>AT1352</td><td>Fermentor ręcznie robiony do fermentacji</td></tr><tr><td>Sterylne rurki</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Zamki fermentacyjne</td><td>Legallais</td><td>AT1356</td><td>Zamki fermetacyjne ręcznie robione do fermentacji</td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży baktonowych</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptone</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka do inkubatora</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Licznik cząstek</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605697</td><td>Multisizer 3 Coulter</td></tr><tr><td>Counter Wirówka</td><td>Jouan</td><td></td><td>GR412</td></tr><tr><td>Plate Butler System robotyczny</td><td>Lab Services BV</td><td>PF0X-MA</td><td>Automatic Instrument</td></tr><tr><td>Plate Butler Software</td><td>Lab Services BV</td><td></td><td>Oprogramowanie do monitorowania robotów</td></tr><tr><td>RobView</td><td></td><td></td><td>Opracowane przez nas oprogramowanie obliczeniowe</td></tr><tr><td>My SQL</td><td></td><td></td><td>Międzynarodowa baza źródeł</td></tr><tr><td>Mieszadła wielopunktowe Cimarec i Telesystem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50088009</td><td>String Drive 60</td></tr><tr><td>Platforma BenchBlotter rocker</td><td>Dutscher</td><td>60903</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw enzymatyczny amoniaku</td><td>R-Biopharm AG</td><td>5390</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety spektrofotometru</td><td>VWR</td><td>634-0678</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UviLine 9400</td><td>Secomam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standardy aminokwasów fizjologiczne - kwasowe i neutralne</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6407</td><td></td></tr><tr><td>Wzorce aminokwasów fizjologiczne - podstawy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6282</td><td></td></tr><tr><td>litowe cytrynianu - Odczynnik Ultra ninhydryny</td><td>Biochrom</td><td>BC80-6000-06</td><td></td></tr><tr><td>Kwas sulfosalycylowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2130</td><td></td></tr><tr><td>Norleucine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N1398</td><td></td></tr><tr><td>Biochrom 30 AAA</td><td>Biochrom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZChrom Elite</td><td>Biochrom</td><td></td><td>Oprogramowanie do sterowania instrumentami i analizy danych</td></tr><tr><td>Żywica Ultropac 8 Lithium</td><td>Biochrom</td><td>BC80-6002-47</td> Litowy fizjologiczny filtr <td>kolumnowy o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Millex GV</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGVX13NL</td><td>Millex GV 13mm (wielkość porów 0,22 i mikro; m)</td></tr> <tr><td>Filtr membranowy PALL</td><td>VWR</td><td>514-4157</td><td>Supor-450 47mm 0,45&micro; </td></tr><tr><td>m Pompa próżniowa Millivac Mini</td><td>Millipore</td><td>XF5423050</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowa gładka półmisek wagowa 70mm</td><td>VWR</td><td>611-1380</td><td></td></tr><tr><td>Waga precyzyjna</td><td>Mettler</td><td></td><td>Dane techniczne AE163</td></tr><tr><td>Suszony dimetylosulfoksydek</td><td>Merck</td><td>1029310161</td><td>(maks. 0,025% H2O) Piec</td></tr><tr><td>do spalania</td><td>SeccoSolv Legallais</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td><td>Interchim</td><td>UP40840A</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Fluka</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny dymiący 37% Emsure</td><td>Merck</td><td>1003171000</td><td>Grade ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Bufor octanu litu</td><td>Biochrom</td><td>80-2038-10</td><td></td></tr><tr><td>Komercyjny roztwór hydrolizowanych aminokwasów</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AAS18</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina sulfon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0876</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteinowy monohydrat Sigma</td><td>Aldrich</td><td>30170</td><td></td></tr><tr><td>Probówki hodowlane ze szkła pyrexowego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z653586</td><td></td></tr><tr><td>Pirydyna</td><td>Acros Organics</td><td>131780500</td><td>99% ekstraczysty</td></tr><tr><td>chloromrówczan etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23131</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Fiolki Sigma Aldrich</td><td>32222</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>854165</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowkładki do fiolek 1,5 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SU860066</td><td></td></tr><tr><td>GC/MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>5890 GC/5973 MS</td><td></td></tr><tr><td>Chemstation</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Oprogramowanie do kontroli i analizy danych</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td>Chromasolv, do HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td>ChromasolvPlus, do HPLC</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide dimetyloacetal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>394963</td><td></td></tr><tr><td>BSTFA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>33024</td><td></td></tr><tr><td>DB-17MS kolumna</td><td>Agilent Technologies</td><td>122-4731</td><td>30 m * 0,25 mm * 0,15 i mikro; m</td></tr><tr><td>Siarczan sodu, bezwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238597</td><td></td></tr><tr><td>Azot techniczny</td><td>Produkty powietrzne</td><td>14629</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna Zebron ZB-WAX</td><td>Phenomenex</td><td>7HG-G007-11</td><td>30 m * 0,25 mm * 0,25 i mikro; m</td></tr><tr><td>Helium BIP</td><td>Air products</td><td>26699</td><td></td></tr><tr><td>Szklane pipety Pasteura</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td></td></tr></tbody></table>

przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

Badania w dziedzinie mikrobiologii opierają się na zastosowaniu szerokiego zakresu metodologii. W szczególności opracowanie odpowiednich metod w istotny sposób przyczynia się do dostarczenia szerokiej wiedzy na temat metabolizmu mikroorganizmów rosnących w chemicznie zdefiniowanych podłożach zawierających unikalne źródła azotu i węgla. W przeciwieństwie do tego, zarządzanie poprzez metabolizm wielu źródeł składników odżywczych, pomimo ich szerokiej obecności w środowisku naturalnym lub przemysłowym, pozostaje praktycznie niezbadane. Sytuacja ta wynika głównie z braku odpowiednich metodologii, co utrudnia prowadzenie dochodzeń.
Przedstawiamy eksperymentalną strategię, aby ilościowo i kompleksowo zbadać, jak działa metabolizm, gdy składnik odżywczy jest dostarczany jako mieszanina różnych cząsteczek, tj. złożony zasób. W tym miejscu opisujemy jego zastosowanie do oceny podziału wielu źródeł azotu przez sieć metaboliczną drożdży. Przepływ pracy łączy informacje uzyskane podczas eksperymentów ze znacznikiem stabilnych izotopów przy użyciu wybranych 13substratów znakowanych C lub 15N. Najpierw składa się z równoległych i powtarzalnych fermentacji w tym samym środowisku, które obejmuje mieszaninę cząsteczek zawierających N; Jednak za każdym razem oznaczane jest wybrane źródło azotu. Zastosowano kombinację procedur analitycznych (HPLC, GC-MS) w celu oceny wzorców znakowania docelowych związków oraz ilościowego określenia zużycia i odzysku substratów w innych metabolitach. Zintegrowana analiza całego zestawu danych zapewnia przegląd losów zużytych substratów w komórkach. Takie podejście wymaga dokładnego protokołu pobierania próbek – ułatwionego przez zrobotyzowany system monitorowania fermentacji online – oraz przeprowadzenia wielu czasochłonnych analiz. Pomimo tych ograniczeń pozwoliło to po raz pierwszy zrozumieć podział wielu źródeł azotu w całej sieci metabolicznej drożdży. Wyjaśniliśmy redystrybucję azotu z bardziej obfitych źródeł w kierunku innych N-związków i określiliśmy metaboliczne pochodzenie lotnych cząsteczek i aminokwasów proteinogennych.

Rysunek 3 przedstawia schematyczny diagram przebiegu eksperymentu, który został zastosowany w celu zbadania sposobu zarządzania przez drożdże wieloma źródłami azotu występującymi podczas fermentacji wina. 
Dla różnych punktów pobierania próbek parametry biologiczne – cechy wzrostu, wzorce zużycia azotu oraz profil aminokwasów białkowych – wykazują wysoką powtarzalność między fermentacjami (Rysunek 4). Ta spójność potwierdza is...

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę ilościowego i kompleksowego badania metabolizmu wielu źródeł składników odżywczych. Ten przepływ pracy, oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi i procedury analitycznej, pozwala na określenie losu spożywanych składników odżywczych i pochodzenia metabolicznego cząsteczek syntetyzowanych przez mikroorganizmy.

Przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe zbadanie metabolizmu wielu źródeł składników odżywczych przy użyciu znakowanych substratów. Taki przebieg pracy pozwala na określenie losów spożywanych składników odżywczych oraz pochodzenia metabolicznego związków syntetyzowanych przez drożdże. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie metabolizmu drobnoustrojów, takie jak to, jak działa cały metabolizm w zależności od warunków środowiskowych.Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wyjaśnienie i ilościowe określenie białka dystrybucji składników odżywczych z wielu źródeł. Metoda ta została wykorzystana do zbadania metabolizmu azotu w drożdżach, ale może być również stosowana do innych metabolizmów i mikroorganizmów. Kluczem do sukcesu w tym eksperymencie jest powtarzalność fermentacji.Użytkownicy muszą zwrócić szczególną uwagę na pobranie komórek w tym samym określonym stadium fizjologicznym. Procedurę zademonstrują Christian Picou z naszego personelu technicznego, Pauline Seguinot, doktorantka z laboratorium oraz Stephanie Rollero, doktorantka z laboratorium i Stephanie Rollero, doktorantka z naszego zespołu. W autoklawie pasteryzować każde podłoże syntetyczne przygotowane dla każdego źródła azotu w jednolitrowej kolbie zawierającej mieszadło magnetyczne.Rozpuść odpowiednią ilość znakowanej cząsteczki, aby osiągnąć pożądane stężenie końcowe w pożywce. Wysterylizuj pożywkę za pomocą jednorazowego systemu filtracji próżniowej. Za pomocą sterylnego cylindra miarowego podziel pożywkę między dwa wstępnie wysterylizowane fermentory, które zawierają magnetyczny pręt mieszający i są wyposażone w blokady fermentacyjne, aby uniknąć przedostawania się tlenu, ale umożliwić uwolnienie dwutlenku węgla.Po wyhodowaniu szczepu cerevisiae w pożywce YPD, należy zebrać podwielokrotność hodowli wstępnej pod przepływem laminarnym i określić ilościowo populację komórek za pomocą elektronicznego licznika cząstek, który jest wyposażony w aperturę o średnicy 100 mikrometrów. Po odwirowaniu kultury wstępnej zawiesić osad w odpowiedniej objętości sterylnej wody, aby uzyskać końcowe stężenie 2,5 razy 10 do 9 komórek na mililitr. Następnie zaszczepić każdy fermentor jednym mililitrem zawiesiny komórkowej.Następnie przygotuj platformę fermentacyjną, instalując fermentory w prowadnicach wsporczych, które są odpowiednio umieszczone na 21-pozycyjnych płytach mieszających i ustaw szybkość mieszania na 270 obr./min. Aby rozpocząć monitorowanie online każdej fermentacji, uruchom aplikację sterującą robotem, kliknij przycisk Rozpocznij test i wybierz objętość fermentacji, którą chcesz przeprowadzić. Aby upewnić się, że wyświetlany interfejs pozwala na wskazanie liczby i położenia fermentorów na platformie, kliknij prawym przyciskiem myszy lokalizację slotu i wybierz opcję Wyłącz, aby dezaktywować monitorowanie pustych pozycji.Aby zainicjować oprogramowanie obliczeniowe, kliknij przycisk Inicjator i zatwierdź za pomocą OK. Następnie kliknij przycisk Start w aplikacji do sterowania robotem, aby rozpocząć akwizycję masy. Następnie odwirować dwie sześciomililitrowe próbki pobrane z fermentorów w temperaturze 2000 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zakończeniu przenieś każdy zamrożony supernatant do dwóch probówek i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Umyj każdą osadkę dwukrotnie pięcioma mililitrami wody destylowanej i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu pomiaru wzbogacenia izotopowego. Dodaj 200 mikrolitrów 25% roztworu kwasu sulfosalicylowego, który zawiera 2,5 milimolową norleucynę jako wzorzec wewnętrzny, do 800 mikrolitrów próbki w celu usunięcia cząsteczek o dużej masie cząsteczkowej. Po inkubacji i odwirowaniu przefiltrować mieszaninę przez membranę nitrocelulozową o wielkości porów 0,22 mikrometra i umieścić próbkę w systemie analizy aminokwasów.W programie lub oprogramowaniu systemu analitycznego należy kliknąć przycisk Uruchom, aby rozpocząć analizy chromatografii cieczowej z analizatorem wyposażonym w kolumnę kationowymienną. Następnie przygotuj utleniony ekstrakt, zawieszając wcześniej przygotowany oznakowany osad komórkowy w 200 mikrolitrach kwasu wodnego. Po inkubacji przez cztery godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza zatrzymaj reakcję, dodając 33,6 miligrama siarczanu sodu.Dodać 800 mikrolitrów sześciu normalnych kwasów solnych do utlenionego ekstraktu i inkubować próbkę w hermatycznie zamkniętej szklanej probówce przez 16 godzin w temperaturze 110 stopni Celsjusza w piecu grzewczym. Po pozostawieniu próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej dodać 200 mikrolitrów 2,5 milimolowej neuroleucyny i usunąć gazowy chlorowodór strumieniem azotu. Wysuszony ekstrakt przemyć dwukrotnie 800 mikrolitrami wody destylowanej, a następnie 800 mikrolitrami etanolu.Następnie do ekstraktu dodaj 800 mikrolitrów 200-milimolowego buforu octanu litu. Oznaczyć względne stężenia aminokwasów w białkach w próbce za pomocą opisanej wcześniej metody chromatograficznej. Hydrolizuj oznakowany osad komórkowy, dodając 1,2 mililitra sześciomolowego kwasu solnego i inkubując próbkę przez 16 godzin w temperaturze 105 stopni Celsjusza w szczelnie zamkniętej szklanej probówce w piecu grzewczym.Po pozostawieniu próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej dodaj 1,2 mililitra wody destylowanej. Po odwirowaniu w celu usunięcia resztek komórkowych rozprowadzić supernatant na sześć frakcji o pojemności 400 mikrolitrów w otwartych szklanych probówkach. Suszyć frakcje w piekarniku na sucho w temperaturze 105 stopni Celsjusza przez cztery do pięciu godzin, aż osiągną konsystencję syropu.Podczas hydrolizy biomasy wysusz frakcję do uzyskania konsystencji syropu, często kontrolując kwas działania. W przypadku derywatyzacji ECF rozpuścić schłodzony wysuszony hydrolizat w 200 mikrolitrach 20-milimolowego kwasu solnego i 133 mikrolitrach mieszaniny pirydyny i etanolu w proporcji jeden do czterech. Dodaj 50 mikrolitrów chloromrówczanu etylu, aby uzyskać aminokwasy.Po uwolnieniu dwutlenku węgla przenieść mieszaninę do probówek wirówkowych zawierających 500 mikrolitrów dichlorometanu w celu ekstrakcji derywatyzowanych związków. Wirować próbki przez 10 sekund. Po odwirowaniu przez cztery minuty w temperaturze 10 000 razy G, zebrać dolną fazę organiczną każdej próbki za pomocą pipety Pasteura i przenieść do fiolki do automatycznego pobierania próbek GC, która zawiera stożkową szklaną wkładkę, tak aby każda próbka mogła być bezpośrednio wstrzyknięta do przyrządu GCMS.Do procedury ECF stosuje się odczynniki do derywatyzacji HPLC. Często zmieniaj odczynniki ECF. W przypadku derywatyzacji DMF-DMA wysuszony hydrolizat rozpuścić w 50 mikrolitrach metanolu i 200 mikrolitrach acetonitrylu.Dodać 300 mikrolitrów DMF-DMA i przemieszać próbkę. Następnie przenieść próbkę do fiolki z automatycznym podajnikiem próbek do chromatografii statycznej, która zawiera stożkową szklaną wkładkę. W przypadku derywatyzacji BSTFA zawiesić hydrolizat w 200 mikrolitrach acetonitrylu.Dodaj 200 mikrolitrów BSTFA do próbki i hermatycznie zamknij szklaną rurkę. Po inkubacji przez cztery godziny w temperaturze 135 stopni Celsjusza przenieść schłodzony ekstrakt bezpośrednio do fiolki z automatycznym podajnikiem próbek GC, która zawiera stożkową szklaną wkładkę. Teraz przeanalizuj próbki za pomocą chromatografu gazowego wyposażonego w wtryskiwacz autosamplera i sprzężonego ze spektrometrem masowym.Kliknij Instrument w menu oprogramowania komputerowego. Na karcie Sekwencja kliknij pozycję Edytuj przykładową tabelę dziennika, aby utworzyć przykładową listę, a następnie kliknij pozycję Uruchom i uruchom sekwencję, aby rozpocząć wstrzykiwania. Po zakończeniu analiz należy zapisać klaster intensywności dla każdego aminokwasu, który odpowiada jego różnym izotopomerom masowym.Dodaj 10 mikrolitrów odpowiednich deuterowanych wzorców wewnętrznych do pięciu mililitrów supernatantu w 15-mililitrowej szklanej probówce. Dodać jeden mililitr dichlorometanu, szczelnie zamknąć probówkę i wstrząsać próbką na platformie bujającej przez 20 minut. Po odwirowaniu zbierz dolną fazę organiczną do 15-mililitrowej szklanej probówki.Po powtórzeniu ekstrakcji dichlorometanem, wysuszyć ekstrakt organiczny na ponad 500 miligramów bezwodnego siarczanu sodu i zebrać fazę ciekłą za pomocą pipety Pasteura. Zagęścić ekstrakt czterokrotnie pod wpływem strumienia azotu. Następnie przenieść zagęszczoną próbkę do fiolki z automatycznym podajnikiem próbek do chromatografii chromatycznej.W celu ilościowego oznaczania GCMS wstrzyknąć dwa mikrolitry próbki w stosunku 10 do jednego i oddzielić wyekstrahowane lotne cząsteczki przy użyciu odpowiedniego profilu temperatury pieca. Korzystając z arkuszy kalkulacyjnych w protokole tekstowym, wprowadź wartości danych surowych, które odpowiadają stężeniu aminokwasów zewnątrzkomórkowych, suchej masie komórek, zawartości białka w komórkach, stężeniu cząsteczek lotnych oraz wzbogaceniu izotopowemu aminokwasów proteinogennych i cząsteczek lotnych. Schemat ideowy przepływu pracy w celu zbadania zarządzania przez drożdże wieloma źródłami azotu, które znajdują się podczas fermentacji wina, jest pokazany tutaj.Dla różnych punktów pobierania próbek parametry biologiczne wykazują wysoką odtwarzalność między fermenacjami. Przegląd redystrybucji azotu ze źródeł w soku winogronowym do wszystkich aminokwasów proteinogennych przedstawiono tutaj. W połączeniu z określeniem bilansów masy, pomiar wzbogacenia izotopowego aminokwasów proteinogennych dostarczył pierwszego ilościowego określenia udziału argininy, glutaminy, amonu i innych źródeł pochodzenia azotowego w grupach aminowych każdego z tych związków.Przedstawiono tutaj porównanie ilości zużytych aminokwasów, które są bezpośrednio odzyskiwane do biomasy. Pokazano podział spożywanych aminokwasów alifatycznych, leucyny i waliny w sieci metabolicznej drożdży. Ponad 96% spożywanej waliny i leucyny jest odzyskiwane w produktach konwersji.Co zaskakujące, znaczna część waliny i leucyny ulega katabolizacji pomimo znacznej nierównowagi między dostępnością tych związków w pożywce a ich zawartością w biomasie. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu dni. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o starannym doborze części podłoża do etykietowania zgodnie z kwestiami naukowymi.Aby zapewnić dobrą odtwarzalność biologiczną, należy przeprowadzić fermentację i analizę chromatograficzną w dwóch egzemplarzach. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się mikrobiologią do zbadania, w jaki sposób metabolizm i fizjologia mikroorganizmów zmieniają się w zależności od warunków środowiskowych. Nie zapominaj, że praca z odczynnikami do derywatyzacji i rozpuszczalnikiem argininy może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i praca pod wyciągiem.

workflow-based-on-combination-isotopic-tracer-experiments-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano profilowanie stabilnych izotopów za pomocą analizy chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas w celu badania przepływu metabolitów pośrednich u nicienia Caenorhabditis elegans. Szczegółowo przedstawiono metody oceny wzbogacenia izotopowego w dwutlenku węgla, kwasach organicznych i aminokwasach po ekspozycji na izotopy, zarówno podczas rozwoju na płytkach agarowych, jak i w okresie dorosłości w hodowli ciekłej.

Stabilne profilowanie izotopowe strumieni metabolicznych produktów pośrednich u Caenorhabditis elegans w stadium rozwojowym i dorosłym

Znakowanie izotopem 13C jest użyteczną techniką określania centralnego metabolizmu komórkowego dla różnych typów mikroorganizmów. Po hodowli komórek ze specyficznym znakowanym substratem, pomiar GC-MS może ujawnić funkcjonalne szlaki metaboliczne na podstawie unikalnych wzorów znakowania w aminokwasach proteinogennych.

Potwierdzanie i odkrywanie szlaków metabolicznych poprzez znakowanie 13C aminokwasów proteinogennych

Aktywna społeczność bakteryjna związana z jelitami Spodoptera littoralis, została określona przez sondowanie stabilnymi izotopami (SIP) sprzężone z pirosekwencjonowaniem. Korzystając z tej metodologii, identyfikacja metabolicznie aktywnych gatunków bakterii w społeczności została przeprowadzona z wysoką rozdzielczością i precyzją.

Identyfikacja metabolicznie aktywnych bakterii w jelicie ogólnego Spodoptera littoralis za pomocą sondowania stabilnych izotopów DNA przy użyciu 13C-glukozy

In planta pomiar strumieni składników odżywczych i toksycznych jest niezbędny do badania odżywiania i toksyczności roślin. W tym miejscu omawiamy protokoły radioznacznikowe do oznaczania napływu i odpływu w nienaruszonych korzeniach roślin, używając jako przykładów strumieni potasu (K+) i amoniaku/amonu (NH3/NH4+). Omówiono zalety i ograniczenia takich technik.

Pomiar strumieni mineralnych składników odżywczych i substancji toksycznych w roślinach z radioaktywnymi znacznikami

Rozpuszczona materia organiczna stanowi ważne źródło energii i składników odżywczych dla ekosystemów. W tym miejscu demonstrujemy metodę opartą na terenie do manipulowania otaczającą pulą rozpuszczonej materii organicznej in situ za pomocą łatwych do odtworzenia impulsów składników odżywczych.

Zrozumienie biogeochemii rozpuszczonej materii organicznej poprzez manipulacje składnikami odżywczymi in situ w ekosystemach strumieni

Ten artykuł opisuje metodę badania metabolizmu komórkowego w złożonych społecznościach wielu typów komórek, wykorzystując kombinację śledzenia stabilnych izotopów, sortowania komórek w celu izolowania określonych typów komórek oraz spektrometrii mas.

Metoda pomiaru metabolizmu w posortowanych subpopulacjach złożonych zbiorowisk komórkowych za pomocą śledzenia stabilnych izotopów

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Prezentowany tutaj jest protokół dla techniki opartej na mikroskopii epifluorescencyjnej dla pojedynczej komórki, do ilościowego określania wskaźników wypasu u wodnych drapieżnych eukariontów z wysoką precyzją i rozdzielczością taksonomiczną.

Fluorescencyjnie znakowane bakterie jako znacznik w celu ujawnienia nowych szlaków przepływu węgla organicznego w ekosystemach wodnych

Nowatorska metoda przygotowania próbek została zademonstrowana do analizy makrokolonii bakteryjnych na bazie agaru za pomocą matrycowej desorpcji/jonizacji laserowej spektrometrii mas.

Badanie współpracy mikrobiologicznej poprzez obrazową analizę spektrometrii mas kolonii bakteryjnych hodowanych na agarze i w tkance podczas infekcji

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący optyczną fototermiczną hybrydyzację in situ z fluorescencją podczerwieni (OPTIR-FISH), znaną również jako fototermiczna RYBA w średniej podczerwieni (MIP-FISH), do identyfikacji pojedynczych komórek i zrozumienia ich metabolizmu. Metodologia ta może być szeroko stosowana do różnych zastosowań, w tym do mapowania metabolizmu komórkowego z rozdzielczością pojedynczej komórki.

Optyczna fototermiczna hybrydyzacja in situ z fluorescencją w podczerwieni (OPTIR-FISH)

Poznaj metodę izotopowych znaczników do badania metabolizmu mikroorganizmów z wielu źródeł składników odżywczych. Technika ta pozwala ilościowo określić los pobranych substancji i pochodzenie metaboliczne syntetyzowanych związków.

Przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych (Wideo) | JoVE Journal

Przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych

Przeglądaj więcej filmów