Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu w celu dalszej charakterystyki pojedynczej komórki

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie komórek z zawiesiny komórkowej w celu udostępnienia ich do dalszej analizy pojedynczych komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w kontekście płynnych biopsji i heterogeniczności komórkowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia izolację pojedynczych komórek w oparciu o przeciwciała i ich odzyskanie w celu późniejszej molekularnej analizy genetycznej na poziomie pojedynczej komórki.

Po dopuszczeniu do stosowania u pacjentów, technika ta umożliwi scharakteryzowanie krążących komórek nowotworowych od pacjentów z rakiem. Ponieważ metoda ta może zapewnić wgląd w niejednorodność pojedynczych komórek, można ją zastosować do wszystkich rodzajów zawiesin komórkowych zawierających subpopulacje, takie jak próbki krwi, próbki z kultur komórkowych lub odłączone tkanki i narządy. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy użyliśmy urządzenia do wzbogacania in vivo, które nie jest w stanie uwolnić komórek w celu dalszej analizy.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy pobierania pojedynczych komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej lub mikromanipulacji są trudne do pomyślnego wykonania, ponieważ proces pozyskiwania pojedynczych komórek jest podatny na utratę komórek i wymaga wysokiego poziomu wiedzy specjalistycznej. W jednym mililitrze wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych ponownie zawieś komórki znakowane HT-29 CFSE i pozwól im zregenerować się w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Aby zebrać komórki, odwiruj przy 300 g przez trzy minuty.

Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w jednym mililitrze gotowego do użycia roztworu do barwienia DNA Hoechst 33342 w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut. Następnie odwirować zawiesinę komórkową o masie 300 g przez trzy minuty. Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w czterech mililitrach soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1X.

Następnie policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru i sprawdź znakowanie fluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Następnie odwirować komórki o masie 300 g przez trzy minuty, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w ilości około 500 000 komórek na mililitr i umieścić komórki na lodzie. W pięciu mililitrach krwi obwodowej dodaj około 500 do 500 000 komórek, a następnie wymieszaj, odwracając probówkę.

Po wyjęciu drutu ze schowka zdejmij gumową nasadkę, która przytrzymuje drut i umyj drut w 1X buforowanym fosforanem soli fizjologicznej i zamontuj go w nasadce rurki. Następnie inkubuj probówkę na przechylonym mieszadle rolkowym z prędkością pięciu obrotów na minutę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji trzykrotnie przepłukać drut w 1X buforowanym fosforanem soli fizjologicznej.

Następnie przechowuj drut w 15-mililitrowej probówce zawierającej 1X sól fizjologiczną buforowaną fosforanem w ciemności. Narysuj prostokątny obszar na szkiełku za pomocą pisaka do smaru, a następnie dodaj do niego 500 mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1X. Aby zanurzyć funkcjonalną część drutu w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1X, zegnij niedziałającą część drutu i umieść ją na szkiełku podstawowym.

Aby policzyć liczbę przechwyconych komórek, sprawdź wzrokowo obie strony drutu. Po sprawdzeniu przenieś drut z powrotem do 15-mililitrowej probówki z solą fizjologiczną buforowaną 1X fosforanem i trzymaj w ciemności. W jednym mililitrze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1X rozpuść cztery miligramy składnika buforowego uwalniającego, a następnie przefiltruj roztwór przez sterylny filtr o średnicy 0,2 mikrometra, aby uzyskać gotowy do użycia bufor.

Następnie podgrzej bufor uwalniający w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po podgrzaniu przenieś 1,6 mililitra buforu uwalniającego, aby całkowicie napełnić 1,5-mililitrową probówkę reakcyjną. Następnie inkubuj funkcjonalną część drutu w buforze uwalniającym w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez 20 minut.

Po inkubacji umieść drut na wytrząsarce z prędkością 500 obrotów na minutę przez 15 minut. Następnie odwiruj drut o masie 300 g przez 10 minut. Po zakończeniu wirowania należy wysunąć drut z probówki, zamknąć nakrętkę i ponownie odwirować probówkę o masie 300 g przez 10 minut.

Aby zmniejszyć objętość zawiesiny komórkowej, należy wyrzucić wszystkie oprócz 100 mikrolitrów supernatantu do mikromanipulacji lub 300 mikrolitrów do późniejszego cytowirowania i mikrodysekcji laserowej. Następnie szybko przejdź do pobierania próbek z pojedynczych komórek. W celu mikromanipulacji przenieś całe 100 mikrolitrów zawiesiny komórek na szklane szkiełko.

Następnie umieść szklane szkiełko na mikroskopie wyposażonym w mikromanipulator i pozwól komórkom osiąść przez pięć minut. Następnie w 0,2-mililitrowych probówkach do PCR odpipetować dwa mikrolitry głównej mieszanki do lizy komórek i przenieść na lód. Użyj mikromanipulatora, aby zebrać pojedynczą komórkę w jednym mikrolitrze soli fizjologicznej buforowanej 1X fosforanem.

Następnie przenieś komórkę bezpośrednio do dwóch mikrolitrów głównej mieszanki lizy komórek. Użyj mikrofugi na biurku, aby szybko odwirować próbki o masie 2 000 g przez trzy sekundy, aby zebrać płyn na dnie probówki. Następnie przenieś próbkę na lód i przystąp do amplifikacji całego genomu opartej na adapterze i łączniku.

Odessać tylko jedną komórkę za pomocą maksymalnie jednego mikrolitra buforu. Podczas przenoszenia komórki do roztworu do lizy upewnij się, że widzisz pęcherzyki wydobywające się z roztworu, wskazujące, że cała zasysana objętość została przeniesiona. W przypadku mikrodysekcji laserowej cytowirówkę należy umieścić całe 300 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na szkiełku pokrytym membraną o masie 300 g przez pięć minut.

Następnie umieść szkiełko pokryte membraną na mikroskopie zdolnym do mikrodysekcji laserowej. Następnie odpipetuj 4,5 mikrolitra głównej mieszanki do lizy komórek do nasadki 0,2-mililitrowej probówki do PCR. Umieść nasadkę nad próbką i zbierz pojedynczą komórkę za pomocą mikrodysekcji laserowej.

Bezpośrednio po tym należy sprawdzić, czy w nasadce PCR nie ma izolowanych komórek, wyjąć probówkę PCR z laserowego mikroskopu mikrodyparacyjnego i zamknąć probówkę. Zbierz cały płyn na dnie tubki za pomocą krótkiego wirowania. Przenieś próbkę na lód i przystąp do amplifikacji całego genomu opartej na adapterze i łączniku.

Upewnij się, że odzyskałeś mikrowypreparowaną laserowo komórkę. Dlatego ważne jest, aby pokryć całą nakrętkę probówki roztworem do lizy. Po mikrodysekcji sprawdź nasadkę probówki pod kątem obecności komórki.

Aby pokazać komórki, które są barwione CFSE i Hoechst 33342, obrazowanie immunofluorescencyjne wykonano przed ładowaniem drutu, podczas podłączania ogniw do drutu, następnie odłączania od drutu, a na końcu na szkiełku. Obrazy immunofluorescencyjne komórek przed naładowaniem pokazują jasne zabarwienie nukleinowe na niebiesko, podczas gdy cytoplazma komórek wykazuje zielone zabarwienie CFSE o niejednorodnej intensywności międzykomórkowej. Podobny wzór barwienia obserwuje się również w przypadku komórek, które są przyczepione, a następnie odłączone od drutu.

Aby sprawdzić jakość produktów do amplifikacji całego genomu, uruchomiono 1% żel agarozowy. Żel agarozowy wykazuje rozmaz DNA w zakresie od 0,2 do ponad 1 kilozasady dla produktów PCR amplifikacji całego genomu. Produkty 4plex quality control PCR uzyskane z pojedynczej komórki dają produkty o długości 100, 200, 300 i 400 par zasad.

Produkty, które mają mniej niż trzy pasma, są wyłączone z dalszej analizy. Po opanowaniu technika ta pozwala na izolację pojedynczych komórek z zawiesin komórkowych w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby komórki były zanurzone w buforze, szczególnie w czasie, gdy ogniwa są podłączone do drutu, aby uniknąć uszkodzenia komórek.

Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić metody analizy, takie jak hybrydyzacja genomowa porównawcza obszarowo, sekwencjonowanie nowej generacji i PCR specyficzny dla celu, w celu scharakteryzowania pojedynczych komórek na podstawie zmienności liczby kopii i mutacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i odzyskiwać komórki z zawiesin komórkowych za pomocą funkcjonalizowanego przewodu oraz jak pobierać próbki pojedynczych komórek do wielu dalszych molekularnych analiz genetycznych. Nie zapominaj, że praca z ludzką krwią stwarza możliwość infekcji, dlatego podczas wykonywania tej procedury obowiązkowe jest noszenie rękawiczek i fartucha laboratoryjnego.