Name: Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu w celu dalszej charakterystyki pojedynczej komórki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj metodę izolacji pojedynczych komórek z zawiesiny komórkowej przy użyciu przeciwciałowego wzbogacania na druciku. Technika umożliwia analizę genetyczną rzadkich populacji, w tym komórek nowotworowych krążących.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Austriacki Fundusz Naukowy (FWF), nr projektu. I 1220-B19 (do P.S.) w ramach projektu ERANET w ramach Translational Cancer Research (TRANSCAN) "Krążące komórki nowotworowe jako biomarker minimalnej choroby resztkowej w raku prostaty (CTC-SCAN)". Doktorant S.C. szkolił się w ramach Programu Doktoranckiego Medycyna Molekularna Uniwersytetu Medycznego w Grazu. Autorzy dziękują Ninie Schlögl, Danielowi Kummerowi, Gabi Wendt, Claudii Chudak, Julii Schulz i Johannie Schiller za fachową pomoc techniczną. Autorzy dziękują Georgowi Peinhauptowi za wsparcie w zakresie projektowania graficznego.

<ol><li>Saucedo-Zeni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+in+vivo+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+of+cancer+patients+using+a+functionalized+and+structured+medical+wire%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire.</a> Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).</li>
<li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+Molecular+Characterization+of+Tumor+Cells+in+Lung+Cancer+Patients+Using+a+Novel+In+Vivo+Device+for+Capturing+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells.</a> Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).</li>
<li>Kuske, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+circulating+tumor+cells+in+non-metastatic+high-risk+prostate+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients.</a> Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).</li>
<li>van Beers, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+PCR+predictor+for+aCGH+success+of+FFPE+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples.</a> Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).</li>
<li>El-Heliebi, A., Chen, S., Kroneis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Multiplex+PCR+for+Assessing+the+Quality+of+Whole+Genome+Amplified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using Multiplex PCR for Assessing the Quality of Whole Genome Amplified DNA.</a> Methods Mol Biol. 1347, 119-128 (2015).</li>
<li>Möhlendick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Robust+Method+to+Analyze+Copy+Number+Alterations+of+Less+than+100+kb+in+Single+Cells+Using+Oligonucleotide+Array+CGH%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67031(2013).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+and+Release%3A+rare+cell+analysis+from+a+functionalised+medical+wire%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire.</a> Sci Rep-UK. 7, 43424(2017).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+molecular+characterization+of+circulating+tumor+cell+using+an+in+vivo+capture+system+in+squamous+cell+carcinoma+of+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enumeration and molecular characterization of circulating tumor cell using an in vivo capture system in squamous cell carcinoma of head and neck.</a> Chin J Cancer Res. 29 (3), 196-203 (2017).</li>
<li>Carter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+circulating+tumor+cells+identifies+distinct+copy-number+profiles+in+patients+with+chemosensitive+and+chemorefractory+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer.</a> Nat Med. 23 (1), 114-119 (2017).</li>
<li>Luca, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+single+circulating+tumor+cells+by+next+generation+sequencing+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer.</a> Oncotarget. , (2016).</li>
<li>Aravanis, A. M., Lee, M., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-Generation+Sequencing+of+Circulating+Tumor+DNA+for+Early+Cancer+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection.</a> Cell. 168 (4), 571-574 (2017).</li>
<li>Page, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+Generation+Sequencing+of+Circulating+Cell-Free+DNA+for+Evaluating+Mutations+and+Gene+Amplification+in+Metastatic+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Next Generation Sequencing of Circulating Cell-Free DNA for Evaluating Mutations and Gene Amplification in Metastatic Breast Cancer.</a> Clin Chem. 63 (2), 532-541 (2017).</li>
<li>Kalinich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-based+signature+enables+high+specificity+detection+of+circulating+tumor+cells+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (5), 1123-1128 (2017).</li>
<li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accession+of+Tumor+Heterogeneity+by+Multiplex+Transcriptome+Profiling+of+Single+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells.</a> Clin Chem. 62 (11), 1504-1515 (2016).</li>
<li>Sinkala, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+protein+expression+in+circulating+tumour+cells+using+microfluidic+western+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting.</a> Nat Commun. 8, 14622(2017).</li>
<li>Morrow, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumourigenic+non-small-cell+lung+cancer+mesenchymal+circulating+tumour+cells%3A+a+clinical+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumourigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumour cells: a clinical case study.</a> Ann Oncol. 27 (6), 1155-1160 (2016).</li>
<li>Williamson, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenic+mimicry+in+small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Vasculogenic mimicry in small cell lung cancer.</a> Nat Commun. 7, 13322(2016).</li>
<li>Czyż, Z. T., Stoecklein, N. H., Polzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Microdissection+of+FFPE+Tissue+Areas+and+Subsequent+Whole+Genome+Amplification+by+Ampli1TM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser Microdissection of FFPE Tissue Areas and Subsequent Whole Genome Amplification by Ampli1TM.</a> Methods Mol Biol. 1347, 141-162 (2015).</li>
<li>Czyż, Z. T., Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+Whole-Genome+Amplification+of+Single+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deterministic Whole-Genome Amplification of Single Cells.</a> Methods Mol Biol. 1347, 69-86 (2015).</li>
<li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+retrieval+of+single+microchimeric+cells+and+verification+of+identity+by+on-chip+multiplex+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Automatic retrieval of single microchimeric cells and verification of identity by on-chip multiplex PCR.</a> J Cell Mol Med. 14 (4), 954-969 (2010).</li>
<li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Molecular+Genetic+and+Cytogenetic+Analysis+from+Single+Cells+after+Isothermal+Whole-Genome+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification.</a> Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).</li>
<li>Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., Ståhlberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+preamplification+simplifies+targeted+mRNA+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification.</a> Sci Rep-UK. 7, 45219(2017).</li>
<li>Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-319-53661-3_12">Potential and Challenges of Liquid Biopsies.</a> Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).</li>
<li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24556840">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).</li>
<li>Ferreira, M. M., Ramani, V. C., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S157478911600017X">Circulating tumor cell technologies.</a> Mol Oncol. 10 (3), 374-394 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany protokół ma na celu pobranie komórek z funkcjonalizowanego przewodu (określanego jako urządzenie) w celu analizy genomowej ex vivo pojedynczej komórki. Przetestowaliśmy trzy linie komórkowe EpCAM-dodatnie (HT-29, LNCaP i VCaP), ale w zasadzie metodę tę można zastosować do dowolnej linii komórkowej wykazującej ekspresję EpCAM. Komórki docelowe EpCAM-dodatnie mogą być prezentowane Urządzeniu jako czysta zawiesina komórkowa (patrz 2.1.) lub zmieszane z nadwyżką komórek tła (np. krew obwodowa, patrz 2.2.). Podczas gdy szczególnie te ostatnie mogą być używane do testowania zdolności izolacyjnych w rzadkich warunkach ogniw, precyzyjne dostrojenie liczby ogniw podłączonych do drutu można przeprowadzić przy użyciu opisanego podejścia o małej objętości (patrz 2.3.). Ponieważ należy spodziewać się różnic między liniami komórkowymi, odpowiednie gęstości komórek do ładowania drutu, prędkość obrotowa, a także czas inkubacji muszą być testowane empirycznie, oceniając liczbę przyłączonych komórek za pomocą mikroskopu immunofluorescencyjnego.
W przypadku dalszych zastosowań genomicznych na poziomie pojedynczej komórki wymagane jest WGA. Wybrana metoda WGA może się różnić w zależności od laboratorium i w zasadzie nasza metoda jest otwarta na wszystkie metody, które mogą poradzić sobie z próbkami uzyskanymi z mikromanipulacji lub mikrodysekcji laserowej. W tym protokole stosujemy metodę opartą na enzymatycznie rozdrobnionym DNA ze względu na lepszą wydajność w porównaniu z metodą WGA7 opartą na fragmentacji cieplnej. Opcjonalnie, pojedyncze komórki mogą być przekazywane do izotermicznego WGA w celu późniejszego profilowania DNA20,21.
Opisany protokół ma na celu odzyskanie nienaruszonych komórek po podłączeniu do nowej generacji funkcjonalizowanych przewodów do analizy genomowej pojedynczej komórki. Pierwsza generacja funkcjonalizowanych drutów, które są również jedynymi dostępnymi do tej pory na rynku urządzeniami do wzbogacania in vivo z certyfikatem CE, została wykorzystana do zliczania CTC u pacjentów z przerzutami do raka. Wcześniejsze publikacje i nasze własne dane sugerują, że technika izolacji in vivo jest bardziej czuła w porównaniu z obecną technologią złotego standardu2. W związku z tym, wyposażenie tej techniki izolacji in vivo w funkcję odzyskiwania, jak zrealizowano w urządzeniu, pozwala na połączenie wysokiego odzysku CTC z charakteryzacją na poziomie pojedynczej komórki.
Urządzenie nie jest jednak dopuszczone do stosowania u pacjentów, dlatego dane kliniczne nie są dostępne. Stosowanie ex vivo (tj. izolowanie CTC z krwi obwodowej po pobraniu próbki) nie jest zalecane, ponieważ technologia jest dostosowana do ustawień występujących w błonie łokciowej, np. małej średnicy żyły (zwiększającej prawdopodobieństwo bezpośredniego kontaktu między CTC i wychwycenia przeciwciał) i długiego czasu retencji (30 minut, pozwalający na przejście 2-3 l krwi przez drut). Jednak, jak opisano w sekcji 2.2. Komórki docelowe można również izolować z próbek mieszanych7.
Obecnym ograniczeniem metody jest nieefektywne odzyskiwanie nieutrwalonych ogniw po odłączeniu od przewodów. To jednak może ulec poprawie poprzez etap utrwalenia komórek przed leczeniem odwarstwienia.
Podsumowując, protokół ten jest pierwszym krokiem w kierunku łącznego zastosowania techniki izolacji in vivo z odzyskiwaniem komórek do genetycznej charakterystyki pojedynczych komórek. Konieczne są dalsze wysiłki w celu optymalizacji regeneracji komórek i klirensu do ich zastosowania u pacjentów 1,2. Jednak medycyna spersonalizowana w zakresie monitorowania leczenia i podejmowania decyzji terapeutycznych wykracza poza wyliczenie CTC. Metoda ta jest zatem pierwszym krokiem w kierunku genomowej charakterystyki CTC na poziomie pojedynczej komórki.
Zastosowania w analizie transkryptomu pojedynczych komórek wydają się wykonalne, ponieważ nienaruszone komórki są zbierane. Pozostaje jednak do oceny, czy procedura odzyskiwania ma wpływ na integralność RNA (np. przekazywanie odzyskanych pojedynczych komórek do bezpośredniej lizy, a następnie RT-qPCR22). Jeśli się powiedzie, charakterystyka pojedynczych komórek (np. CTC) może zostać przeniesiona na poziom transkryptomu, co pozwoli na bardziej szczegółowe analizy. W związku z tym sekwencjonowanie RNA przy użyciu Smart-seq2 stanowi cenne narzędzie do dalszej analizy RNA pojedynczych komórek, ponieważ wstępnie amplifikowane cDNA (uzyskane podczas przygotowywania biblioteki sekwencjonowania RNA) można poddać ilościowemu PCR. Pozwoli to na połączoną analizę docelową i przesiewową pojedynczych odzyskanych komórek 22,23.
Obecnie funkcjonalizowane przewody oparte są na przeciwciałach anty-EpCAM, które są szeroko stosowanym markerem nabłonkowym do pozytywnej selekcjiCTCs 24. Ponieważ kilka CTC może obniżać poziom markerów nabłonkowych, takich jak cytokeratyny lub EpCAM25, dodanie przeciwciał, takich jak HER2/new, zwiększyłoby szansę na izolację CTC. Ferreira i wsp. opracowali i dokonali przeglądu kilku strategii wzbogacania opartych na przeciwciałach. w 2016 r.26. Mieszanina przeciwciał unieruchomionych na przewodzie może być w przyszłości ulepszeniem technologii prowadzącym do izolacji większej liczby i dodatkowych podtypów CTC.
Na wszystkich etapach związanych z obsługą drutu obowiązkowe jest utrzymywanie funkcjonalnej części drutu zanurzonej w roztworze w celu zachowania jego funkcjonalności. Zalecamy umieszczenie drutu w 1x PBS podczas oceny (mikroskop; np. kroki 3.1. - 3.3.) i magazynowania. Aby uniknąć niewłaściwego zabarwienia, zalecamy użycie świeżo przygotowanego roztworu barwiącego w krokach 1.2.1. oraz 1.2.2. Słabo wybarwione komórki utrudniają liczenie komórek na przewodzie i mogą prowadzić do niedoszacowania przyłączonych komórek.
Należy unikać zatykania pipety Pasteura gumową nasadką podczas wkładania drutu do pipety Pasteura w celu późniejszego załadowania zawiesiny ogniwa (krok 2.3.4.). Gumowa nasadka służy do przytrzymywania drutu na miejscu, tak aby część funkcjonalna znajdowała się wewnątrz końcówki pipety Pasteura. Jeśli nasadka jest zbyt mocno przymocowana do tylnej części pipety Pasteura, nałożenie zawiesiny kuwety nie jest możliwe. W takim przypadku należy poluzować nakrętkę w taki sposób, aby powietrze wypierane przez zawiesinę obciążonej komórki mogło opuścić pipetę.
Gięcie drutu ma kluczowe znaczenie dla jego orientacji podczas liczenia ogniw w krokach 3.2. oraz 3.3. Zamontuj przewody za pomocą taśmy samoprzylepnej w taki sposób, aby niedziałający koniec drutu opadł na bok. Po zeskanowaniu całej długości części funkcjonalnej, drut jest zwijany pod kątem 180°, dzięki czemu można zeskanować drugą połowę przewodu funkcjonalnego. Ten krok jest ważny dla początkowych eksperymentów mających na celu ocenę liczby ogniw na przewodzie. Po ocenie liczby komórek dla określonej linii komórkowej i procedury, procedurę można powtórzyć bez zliczania komórek (np. tylko sprawdzając obecność komórek lub pomijając ten krok). Staranne pipetowanie ma zasadnicze znaczenie dla uniknięcia utraty komórek podczas zmniejszania objętości supernatantu w kroku 4.8. Upewnij się, że pipetowanie odbywa się płynnie, nie powodując turbulencji w granulce.

Niedawno, CellCollector DC01, przewód medyczny wyposażony w przeciwciała anty-EpCAM do izolowania CTC z krwi obwodowej pacjentów z rakiem, został dodany do metodycznego spektrum enumeracji CTC1,2,3. W trwającym obecnie badaniu nad rakiem gruczołu krokowego bez przerzutów, ten funkcjonalizowany drut zgłasza prawie dwa razy więcej pacjentów z dodatnim CTC i wyższą liczbę CTC u pacjentów z dodatnim CTC w porównaniu z CellSearch, złotym standardem w liczeniu CTC3. Ze względu na tę zachęcającą wydajność, pożądana byłaby izolacja komórek z funkcjonalizowanego przewodu medycznego do analizy pojedynczej komórki, ale ani leczenie enzymatyczne roztworami odłączającymi komórki (np. trypsyną), ani mikrodysekcja laserowa nie pozwalają na odzyskanie nienaruszonych komórek (dane nie pokazane).
Aby umożliwić odłączenie przechwyconych komórek, nowa generacja funkcjonalizowanych przewodów została wyposażona w specyficzny polimer. Ten polimer, który łączy przeciwciała wychwytujące z drutem, jest podatny na leczenie buforem uwalniającym, co pozwala na oderwanie nienaruszonych komórek (CellCollector DC03 określany jako urządzenie). Nowe funkcjonalizowane urządzenie umożliwia izolację komórek docelowych z różnych stężeń komórek linii komórek nowotworowych wzbogaconych odpowiednio do albuminy surowicy bydlęcej (BSA) / soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i krwi obwodowej.
Aby ułatwić wizualne wykrywanie komórek na urządzeniu i po odzyskaniu, docelowe komórki rakowe są znakowane estrem sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE) i barwnikiem DNA przed leczeniem (tj. ładowaniem i odłączaniem). Wpływ leczenia na jakość DNA pojedynczych komórek został wcześniej oceniony po WGA za pomocą kontroli jakości PCR4,5, array-CGH6,7 i sekwencjonowaniu celowanym7 nie wykazując różnicy w porównaniu z komórkami niepoddanymi działaniu substancji mikromanipulowanych z zawiesin komórkowych7. Zaletą tej metody jest połączenie rzadkiego wstępnego wzbogacania komórek docelowych i odzyskiwania komórek do dalszej analizy pojedynczej komórki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Obecne urządzenie do pobierania próbek in vivo z oznakowaniem CE jest zwykle używane do liczenia CTC, a nie do charakterystyki molekularnej pojedynczej komórki2,8. Jednak bardziej kompleksowa analiza mająca na celu zbadanie heterogeniczności wśród CTC wymaga analizy na poziomie pojedynczej komórki (tj. ukierunkowanego sekwencjonowania na poziomie pojedynczej komórki). Inne metody oparte na komórkach opierają się na immunomagnetycznej izolacji EpCAM-dodatnich CTC i obsłudze pojedynczych komórek w oparciu o dielektroforezę w celu późniejszej molekularnej analizy genetycznej9,10. Charakterystyka molekularna CTC jest ważnym wymogiem dla ich użytecznego wdrożenia w warunkach klinicznych i jest równie ważna w podstawowych badaniach kaskady przerzutowej. Równolegle do CTC, krążące DNA guza (ctDNA) stało się bardzo ważne, ponieważ umożliwia analizę DNA obciążenia guza przy minimalnych procedurach technicznej izolacji11,12. Podejścia oparte na komórkach mogą służyć jako wkład uzupełniający, ponieważ pozwalają na analizę ekspresji RNA13,14 i protein15, a także dla hodowli komórkowych pochodzących z CTC lub ksenoprzeszczepów16,17. Chociaż nadal trzeba pokonać przeszkody, takie jak niska regeneracja komórek i zezwolenie na stosowanie u pacjentów, metoda "złów i wypuść" stanowi ważny kolejny krok w kierunku scharakteryzowania rzadkich komórek docelowych.

<table><tbody><tr><td>Gilupi Release Buffer</td><td>Gilupi</td><td>GIL083</td><td>Służy do odłączania komórek od przewodu</td></tr><tr><td>McCoy's 5A Medium (1x) suppl. z L-Glutaminą</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16600-082</td><td>Pożywka hodowlana używana do komórek HT-29, dostosuj pożywkę hodowlaną do linii komórkowej używanej do eksperymentów</td></tr><tr><td>Roztwór buforowy HEPES (1 M)</td><td>PAA</td><td>S11-001</td><td>Suplement do pożywki</td></tr> <tr><td>McCoy's 5APłodowa surowica bydlęca Gold</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td>Suplement do McCoy's 5a Zmodyfikowana pożywka</td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna (100x)</td><td>Biowest</td><td>L0018-100</td><td>Suplement do McCoy's 5a Zmodyfikowana pożywka</td></tr><tr><td>z soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Biowest</td><td>L0950-100</td><td>Roztwór do odrywania komórek (hodowla komórkowa)</td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>GFL</td><td>Typ 1003</td><td>Stosowana do roztworów do podgrzewania</td></tr> wstępnego <tr><td>Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Służy do inkubacji komórek (hodowli komórkowych)</td></tr><tr><td>50 ml probówki reakcyjne</td><td>VWR</td><td>525-0403</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik rolkowy</td><td>Stuart Scientific</td><td>SRT6D</td><td>Służy do mocowania komórek do drutu, jednocześnie zapobiegając osadzaniu się komórek</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Proliferacja komórek Zestaw</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34554</td><td>Służy do znakowania żywych komórek (etykieta cytoplazmatyczna)</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>H3570</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Służy do barwienia DNA (przeciwbarwienie nukleinowe)</td></tr><tr><td>Wirówka (wyposażona w 15 ml i 50 ml probówek reakcyjnych)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td>Służy do granulowania komórek</td></tr><tr><td>Observer Z1 (mikroskop fluorescencyjny/mikrodyparacyjny)</td><td>Carl Zeiss Microimaging</td><td></td><td>Odwrócony (immunofluorescencyjny) mikroskop zdolny do mikrodysekcji laserowej; Mikroskopy fluorescencyjne muszą być w stanie wykryć Hoechst 33342 (filtr DAPI) i CFSE (filtr FITC)</td></tr> <tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td>Służy do powlekania powierzchni szklanych/plastikowych</td></tr><tr><td>MS1 Minishaker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z404039</td><td>Używany do wirowania</td></tr><tr><td>Probówki Vacutainer EDTA (lub Na-heparyna)</td><td>BD</td><td>366450 (lub 366480)</td><td>Używany jako probówka reakcyjna do wychwytywania komórek docelowych ex vivo</td></tr><tr><td>Detektor CANCER03 DC03</td><td>Gilupi</td><td>GIL003</td><td>Funkcjonalizowany przewód zdolny do izolowania i odłączania komórek EpCAM-dodatnich (określanych również jako catch& wydanie, C& R)</td></tr> <tr><td>Igły strzykawkowe (G20)</td><td>VWR</td><td>613-0554</td><td>Służy do nakłuwania gumowych nasadek w celu umożliwienia niefunkcjonalnej części C& R, aby przez nią przeprowadzić Komora</td></tr><tr><td>Neubauera</td><td>Roth</td><td>T729.1</td><td>Służy do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Pipety Pasteura 150 mm</td><td>Volac</td><td>D810</td><td>Służy do aplikacji komórek o małej objętości do C& R</td></tr><tr><td>Smarownica</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td>Używana na szkiełkach do utrzymywania zawiesiny komórek na miejscu</td></tr><tr><td>Sterylny filtr strzykawkowy (0,2 i mikro; m)</td> <td>Corning</td><td>431219</td><td>Do filtrowania świeżo przygotowanego Gilupi Release Buffer</td></tr><tr><td>Delfia PlateShaker</td><td>Perkin Elmer</td><td>1296-003</td><td>Służy do mieszania podczas odrywania komórek</td></tr><tr><td>Probówki 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30,125,150</td><td></td></tr><tr><td>Ampli1 WGA Zestaw</td><td>Silicon Biosystems</td><td></td><td>Zamawiane za pośrednictwem Silicon Biosystems</td></tr><tr><td>Axiovert M200 wyposażony w Mikromanipulator MMJ i CellTram vario</td><td>Zeiss/Eppendorf</td><td></td><td>Zastosowanie mikromanipulacji pod ręką</td></tr><tr><td>Mikrokapilary (25 &mikro; m średnicy), CustomTip Typ I</td><td>Eppendorf</td><td>930001201</td><td>Służy do mikromanipulacji komórkami</td></tr><tr><td>0,2 ml probówki PCR</td><td>Biozym</td><td>710920</td><td></td></tr><tr><td>Cytowirówka i sprzęt</td><td>Hettich</td><td>Universal 32</td><td>Używaj cytowirówki pod ręką</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Bio-Rad</td><td>DNA Engine Dyad</td><td>Każdy termocykler z podgrzewaną pokrywą może być używany</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Roth</td><td>CX73.1</td><td>Używaj wirówki biurkowej pod ręką</td></tr><tr><td>MembraneSlide 1.0 PET</td><td>Zeiss</td><td>415101-4401-050</td><td>Szkiełka szklane powlekane membraną do mikrodysekcji laserowej</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>Użyj sieciowania DNA pod ręką</td></tr><tr><td>Standardowe odczynniki</td><td></td><td></td><td></td>PCR</tr><tr><td>6x Ładowanie DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td>Użyj żelu Ładowanie barwnika pod ręką</td></tr><tr><td>Drabinka DNA</td><td>BioLabs</td><td>N0551G</td><td>Użyj drabiny 100 pz</td></tr><tr><td>pod ręką Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Stacja elektroforezy żelowej</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Użyj systemu elektroforezy pod ręką</td></tr><tr><td>Żel Czerwony kwas nukleinowy Barwnik</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Barwnik interkalacyjny do wizualizacji DNA W żelach agarozowych</td></tr></tbody></table>

wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu w celu dalszej charakterystyki pojedynczej komórki

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Rzadkie komórki docelowe mogą być izolowane z wysokiego tła komórek niedocelowych za pomocą przeciwciał specyficznych dla białek powierzchniowych komórek docelowych. Niedawno opracowana metoda wykorzystuje drut medyczny funkcjonalizowany przeciwciałami przeciwko cząsteczkom adhezji komórek przeciwnabłonkowych (EpCAM) do izolacji in vivo krążących komórek nowotworowych (CTC)1. Kohorta dopasowana do pacjentów w raku gruczołu krokowego bez przerzutów wykazała, że technika izolacji in vivo skutkowała wyższym odsetkiem pacjentów z dodatnim wynikiem CTC, a także wyższą liczbą CTC w porównaniu z obecnym złotym standardem w liczeniu CTC. Ponieważ komórek nie można odzyskać z obecnych urządzeń medycznych, wyprodukowano nowy funkcjonalizowany drut (określany jako urządzenie) umożliwiający wychwytywanie, a następnie odłączanie komórek za pomocą obróbki enzymatycznej. Komórki mogą przyczepiać się do urządzenia, wizualizować je pod mikroskopem i odłączać za pomocą obróbki enzymatycznej. Odzyskane komórki są cytowirowane na szkiełkach pokrytych membraną i pobierane pojedynczo za pomocą mikrodysekcji laserowej lub mikromanipulacji. Próbki z pojedynczych komórek są następnie poddawane amplifikacji całego genomu pojedynczej komórki, co pozwala na wielokrotną analizę, w tym badania przesiewowe i podejścia specyficzne dla celu. Procedura izolacji i odzyskiwania pozwala uzyskać wysokiej jakości DNA z pojedynczych komórek i nie upośledza późniejszej amplifikacji całego genomu (WGA). Amplifikowane DNA pojedynczej komórki może zostać przekazane do badań przesiewowych i/lub analizy ukierunkowanej, takiej jak porównawcza hybrydyzacja genomu (array-CGH) lub sekwencjonowanie. Urządzenie umożliwia izolację ex vivo ze sztucznych próbek rzadkich komórek (tj. 500 komórek docelowych wzbogaconych o 5 ml krwi obwodowej). Podczas gdy tempo odklejania komórek jest dopuszczalne (50 - 90%), wskaźnik odzyskiwania komórek oderwanych od szkiełek obejmuje szeroki zakres w zależności od użytej linii komórkowej (<10 - >50%) i wymaga dalszej uwagi. To urządzenie nie jest dopuszczone do stosowania u pacjentów.

Komórki po barwieniu CFSE oraz barwieniu kwasów nukleinowych można ocenić za pomocą mikroskopu immunofluorescencyjnego wyposażonego w filtry dla DAPI i FITC. Jądra wykazują jasne przeciwbarwienie w kanale DAPI, podczas gdy cytoplazma komórek wykazuje jednorodne znakowanie CFSE o heterogenicznej intensywności międzykomórkowej (Ryc. 2A i 2E). Podobnego kształtu i intensywności barwienia należy oczekiwać od komórek przytwierdzonych do drutu (Ryc. 2B i 2F), jak również od komórek oddzielonych od drutu i naniesionych na szkiełko (Ryc. 2D i 2H).
Wysokie gęstości komórek (np. &gt;1 000 000 cells/mL) mogą prowadzić do całkowitego pokrycia drutu komórkami podczas ich obciążania. Jednak niższe gęstości komórek, zmiany prędkości obrotowej podczas inkubacji oraz stosowanie różnych linii komórkowych wpływają na wydajność izolacji i wymagają osobnego przetestowania. Gdy druty inkubowano z 5 mL komórek HT-29 przy gęstości 100 000 cells/mL, zgodnie z opisem w sekcji 2.1., na drutach uchwycono średnio 254 ± 103 komórki (n = 5). W analogicznym eksperymencie z użyciem komórek LNCaP uzyskano średnio 440 ± 319 komórek (n = 5) na drut.
Przedstawienie 500, 5 000 i 50 000 komórek HT-29 w 5 mL krwi obwodowej na drutach (zgodnie z sekcją 2.2. protokołu) doprowadziło odpowiednio do wychwycenia 75 ± 18 komórek, 25 ± 9 komórek i 47 ± 57 komórek (n = 3 dla każdej grupy). Jeśli drut zostanie naładowany 15 µL zawiesiny komórek (1 000 000 komórek/mL) zgodnie z protokołem w sekcji 2.3., do drutu może przyłączyć się do 1 000 komórek (HT-29).
Wydajność odrywania komórek wynosiła od 81% w komórkach HT-29 (zakres 54,9% - 93,2%, n = 5) do 81% (zakres 63,51% - 92,87%, n = 6) oraz 91% (zakres 84,7% - 95,3%, n = 6) w komórkach LNCaP i VCaP, odpowiednio. Podobnie, odzyskiwanie odseparowanych komórek różniło się w zależności od linii komórkowej: metodą cytocentryfugacji odzyskano średnio 28% odseparowanych komórek HT-29. Podczas gdy w przypadku LNCaP wskaźnik odzysku był niższy niż 10%, średni wskaźnik odzysku dla komórek VCaP wyniósł 55%.
Około 75% pojedynczych komórek poddanych WGA daje wysokiej jakości produkty WGA: są to 1) rozmycie produktów WGA w zakresie od 0,1 do &gt; 1 kb (Rysunek 4, górny panel) oraz 2) trzy lub cztery prążki w PCR kontroli jakości 4plex (Rysunek 4, dolny panel). Produkty WGA mogą być wykorzystane do 1) profilowania array-CGH spełniającego kryteria jakości dla profili array-CGH pojedynczych komórek 6,7 oraz 2) ukierunkowanego NGS po ponownej amplifikacji WGA 7.
<img alt="Schemat hodowli komórkowej; izolacja pojedynczych komórek za pomocą mikrofabrykacji; do dalszych analiz." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat izolacji i odzyskiwania komórek docelowych do analizy pojedynczych komórek. (A) Komórki są hodowane do 90% konfluencji i (B) zbierane w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Po barwieniu CFSE i barwnikiem kwasów nukleinowych, (C) funkcjonalizowany drut jest inkubowany w obecności komórek albo w objętości 5 mL przy użyciu probówek reakcyjnych, albo w małej objętości przy użyciu końcówki pipety Pasteura. Ta druga metoda pozwala na zastosowanie objętości zawiesiny komórkowej tak niskich jak 15 µL. (D) Komórki muszą zostać odspięte w ciągu 4 h po naładowaniu. W związku z tym drut umieszcza się w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 mL wypełnionej buforem uwalniającym. Po 15 min inkubacji na wytrząsarce i 10 min wirowania, drut jest usuwany, a zawiesina komórkowa jest wirowana w celu osadzenia komórek. (E) Odzyskane komórki są przenoszone albo na szkiełko przedmiotowe do mikromanipulacji pojedynczą komórką (góra), albo poddawane cytocentryfugacji na szkiełko powlekane membraną i przekazywane do mikrodysekcji laserowej (dół). (F) Na koniec zebrane pojedyncze komórki są amplifikowane za pomocą amplifikacji całego genomu (WGA). Produkty WGA są kompatybilne z analizami array-CGH oraz celowanym NGS. Epitop EpCAM: zielone koło na powierzchni komórki. Funkcjonalizowany drut: urządzenie, szare potrójne druty helikalne. Polimer: fioletowe linie. Przeciwciała anty-EpCAM: pomarańczowe. Aktywność buforu uwalniającego: czerwona strzałka. Marker z tłuszczu służący do utrzymania zawiesiny komórkowej na miejscu: ciemnoniebieska elipsa. Odzyskana zawiesina komórkowa: jasnoniebieska. Kapilara do mikromanipulacji: czarna linia. Powiększenie: komórka odzyskana za pomocą mikromanipulacji, cytospin na szkiełku pokrytym membraną zawierającym odzyskane komórki (szara wypełniona elipsa). Powiększenie: odzyskiwana komórka poddawana mikrodysekcji laserowej (szara okrągła linia: membrana z szkiełka membranowego służąca jako podłoże dla mikrodysekcji laserowej), obiektyw z wiązką lasera (niebieska linia zbliżająca się do szkiełka membranowego od dołu). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wychwytywanie i uwalnianie komórek, mikroskopia fluorescencyjna, HT-29 i LNCaP, analiza urządzenia mikrofluidycznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Wizualizacja znakowanych komórek. (A,E) Komórki przed załadunkiem: komórki są znakowane CFSE i barwione kontrastowo barwnikiem interkalującym DNA, co pokazuje zakres intensywności sygnału CFSE (zielony). (B,F) Znakowane komórki wychwycone na drucie. (C,G) Drut po procedurze odrywania komórek. (D,H) Komórki oddzielone od drutu i odzyskane poprzez cytocentryfugację na szkiełko. CFSE: kanał FITC (zielony). Barwienie DNA: kanał DAPI (niebieski). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat funkcjonalizowanej igły do mikroekstrakcji, zbliżenie na strukturę igły stosowaną w chemii analitycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Drut i komora magazynująca. (A) Przegrody drutu. (B) Detal części funkcjonalizowanej. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej PCR; prążki DNA, kontrola jakości 4plex, rozmaz amplifikacji genomu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Kontrola jakości produktów WGA otrzymanych z pojedynczych komórek poddanych micromanipulacji. Panel górny: produkty WGA otrzymane z pojedynczych komórek zazwyczaj dają rozmazy DNA w zakresie od 0,2 kb do &gt; 1,0 kb z maksymalną intensywnością około 0,5 kb. Próbki nr 1, 7 i 13 (oznaczone gwiazdkami) wykazują suboptimalne lub brak rozmazów DNA. Panel dolny: produkty WGA mają wystarczającą jakość, jeśli PCR 4plex daje trzy lub cztery z czterech produktów PCR (o wielkości 100, 200, 300 i 400 bp). Próbki 1, 7, 10 i 13 wykazują mniej niż trzy prążki i zostałyby wykluczone z dalszej analizy. Ścieżka M zawiera drabinę 100 bp, a gwiazdki wskazują próbki o niewystarczającej jakości produktu WGA. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sekwencja startera</td>
			<td>UWAGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5′-gtt cca ata tga ttc cac cc-3′</td>
			<td>starter forward 100 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5′-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3′</td>
			<td>odwrócony starter 100 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5′-agg tgg agc gag gct agc-3′</td>
			<td>starter forward 200 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5′-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3′</td>
			<td>rewersyjny primer 200 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5′-agg tga gac att ctt gct gg-3′</td>
			<td>starter prawy 300 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5′-tcc act aac cag tca gcg tc-3′</td>
			<td>odwrócony primer 300 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5′-aca gtc cat gcc atc act gc-3′</td>
			<td>starter forward 400 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5′-gct tga caa agt ggt cgt tg-3′</td>
			<td>odwrócony primer 400 bp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Sekwencje starterów dla 4plex PCR kontroli jakości

Ten protokół ma na celu odzyskanie i przygotowanie rzadkich komórek docelowych z mieszaniny z komórkami tła niebędącymi celem, do molekularnej charakterystyki genetycznej na poziomie pojedynczej komórki. Jakość DNA jest równa jakości pojedynczych komórek niepoddanych działaniu metody i pozwala na zastosowanie pojedynczych komórek (zarówno w oparciu o badania przesiewowe, jak i analizę celowaną).

Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu w celu dalszej charakterystyki pojedynczej komórki

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie komórek z zawiesiny komórkowej w celu udostępnienia ich do dalszej analizy pojedynczych komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w kontekście płynnych biopsji i heterogeniczności komórkowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia izolację pojedynczych komórek w oparciu o przeciwciała i ich odzyskanie w celu późniejszej molekularnej analizy genetycznej na poziomie pojedynczej komórki.Po dopuszczeniu do stosowania u pacjentów, technika ta umożliwi scharakteryzowanie krążących komórek nowotworowych od pacjentów z rakiem. Ponieważ metoda ta może zapewnić wgląd w niejednorodność pojedynczych komórek, można ją zastosować do wszystkich rodzajów zawiesin komórkowych zawierających subpopulacje, takie jak próbki krwi, próbki z kultur komórkowych lub odłączone tkanki i narządy. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy użyliśmy urządzenia do wzbogacania in vivo, które nie jest w stanie uwolnić komórek w celu dalszej analizy.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy pobierania pojedynczych komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej lub mikromanipulacji są trudne do pomyślnego wykonania, ponieważ proces pozyskiwania pojedynczych komórek jest podatny na utratę komórek i wymaga wysokiego poziomu wiedzy specjalistycznej. W jednym mililitrze wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych ponownie zawieś komórki znakowane HT-29 CFSE i pozwól im zregenerować się w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Aby zebrać komórki, odwiruj przy 300 g przez trzy minuty.Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w jednym mililitrze gotowego do użycia roztworu do barwienia DNA Hoechst 33342 w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut. Następnie odwirować zawiesinę komórkową o masie 300 g przez trzy minuty. Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w czterech mililitrach soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1X.Następnie policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru i sprawdź znakowanie fluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Następnie odwirować komórki o masie 300 g przez trzy minuty, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w ilości około 500 000 komórek na mililitr i umieścić komórki na lodzie. W pięciu mililitrach krwi obwodowej dodaj około 500 do 500 000 komórek, a następnie wymieszaj, odwracając probówkę.Po wyjęciu drutu ze schowka zdejmij gumową nasadkę, która przytrzymuje drut i umyj drut w 1X buforowanym fosforanem soli fizjologicznej i zamontuj go w nasadce rurki. Następnie inkubuj probówkę na przechylonym mieszadle rolkowym z prędkością pięciu obrotów na minutę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji trzykrotnie przepłukać drut w 1X buforowanym fosforanem soli fizjologicznej.Następnie przechowuj drut w 15-mililitrowej probówce zawierającej 1X sól fizjologiczną buforowaną fosforanem w ciemności. Narysuj prostokątny obszar na szkiełku za pomocą pisaka do smaru, a następnie dodaj do niego 500 mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1X. Aby zanurzyć funkcjonalną część drutu w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1X, zegnij niedziałającą część drutu i umieść ją na szkiełku podstawowym.Aby policzyć liczbę przechwyconych komórek, sprawdź wzrokowo obie strony drutu. Po sprawdzeniu przenieś drut z powrotem do 15-mililitrowej probówki z solą fizjologiczną buforowaną 1X fosforanem i trzymaj w ciemności. W jednym mililitrze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1X rozpuść cztery miligramy składnika buforowego uwalniającego, a następnie przefiltruj roztwór przez sterylny filtr o średnicy 0,2 mikrometra, aby uzyskać gotowy do użycia bufor.Następnie podgrzej bufor uwalniający w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po podgrzaniu przenieś 1,6 mililitra buforu uwalniającego, aby całkowicie napełnić 1,5-mililitrową probówkę reakcyjną. Następnie inkubuj funkcjonalną część drutu w buforze uwalniającym w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez 20 minut.Po inkubacji umieść drut na wytrząsarce z prędkością 500 obrotów na minutę przez 15 minut. Następnie odwiruj drut o masie 300 g przez 10 minut. Po zakończeniu wirowania należy wysunąć drut z probówki, zamknąć nakrętkę i ponownie odwirować probówkę o masie 300 g przez 10 minut.Aby zmniejszyć objętość zawiesiny komórkowej, należy wyrzucić wszystkie oprócz 100 mikrolitrów supernatantu do mikromanipulacji lub 300 mikrolitrów do późniejszego cytowirowania i mikrodysekcji laserowej. Następnie szybko przejdź do pobierania próbek z pojedynczych komórek. W celu mikromanipulacji przenieś całe 100 mikrolitrów zawiesiny komórek na szklane szkiełko.Następnie umieść szklane szkiełko na mikroskopie wyposażonym w mikromanipulator i pozwól komórkom osiąść przez pięć minut. Następnie w 0,2-mililitrowych probówkach do PCR odpipetować dwa mikrolitry głównej mieszanki do lizy komórek i przenieść na lód. Użyj mikromanipulatora, aby zebrać pojedynczą komórkę w jednym mikrolitrze soli fizjologicznej buforowanej 1X fosforanem.Następnie przenieś komórkę bezpośrednio do dwóch mikrolitrów głównej mieszanki lizy komórek. Użyj mikrofugi na biurku, aby szybko odwirować próbki o masie 2 000 g przez trzy sekundy, aby zebrać płyn na dnie probówki. Następnie przenieś próbkę na lód i przystąp do amplifikacji całego genomu opartej na adapterze i łączniku.Odessać tylko jedną komórkę za pomocą maksymalnie jednego mikrolitra buforu. Podczas przenoszenia komórki do roztworu do lizy upewnij się, że widzisz pęcherzyki wydobywające się z roztworu, wskazujące, że cała zasysana objętość została przeniesiona. W przypadku mikrodysekcji laserowej cytowirówkę należy umieścić całe 300 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na szkiełku pokrytym membraną o masie 300 g przez pięć minut.Następnie umieść szkiełko pokryte membraną na mikroskopie zdolnym do mikrodysekcji laserowej. Następnie odpipetuj 4,5 mikrolitra głównej mieszanki do lizy komórek do nasadki 0,2-mililitrowej probówki do PCR. Umieść nasadkę nad próbką i zbierz pojedynczą komórkę za pomocą mikrodysekcji laserowej.Bezpośrednio po tym należy sprawdzić, czy w nasadce PCR nie ma izolowanych komórek, wyjąć probówkę PCR z laserowego mikroskopu mikrodyparacyjnego i zamknąć probówkę. Zbierz cały płyn na dnie tubki za pomocą krótkiego wirowania. Przenieś próbkę na lód i przystąp do amplifikacji całego genomu opartej na adapterze i łączniku.Upewnij się, że odzyskałeś mikrowypreparowaną laserowo komórkę. Dlatego ważne jest, aby pokryć całą nakrętkę probówki roztworem do lizy. Po mikrodysekcji sprawdź nasadkę probówki pod kątem obecności komórki.Aby pokazać komórki, które są barwione CFSE i Hoechst 33342, obrazowanie immunofluorescencyjne wykonano przed ładowaniem drutu, podczas podłączania ogniw do drutu, następnie odłączania od drutu, a na końcu na szkiełku. Obrazy immunofluorescencyjne komórek przed naładowaniem pokazują jasne zabarwienie nukleinowe na niebiesko, podczas gdy cytoplazma komórek wykazuje zielone zabarwienie CFSE o niejednorodnej intensywności międzykomórkowej. Podobny wzór barwienia obserwuje się również w przypadku komórek, które są przyczepione, a następnie odłączone od drutu.Aby sprawdzić jakość produktów do amplifikacji całego genomu, uruchomiono 1% żel agarozowy. Żel agarozowy wykazuje rozmaz DNA w zakresie od 0,2 do ponad 1 kilozasady dla produktów PCR amplifikacji całego genomu. Produkty 4plex quality control PCR uzyskane z pojedynczej komórki dają produkty o długości 100, 200, 300 i 400 par zasad.Produkty, które mają mniej niż trzy pasma, są wyłączone z dalszej analizy. Po opanowaniu technika ta pozwala na izolację pojedynczych komórek z zawiesin komórkowych w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby komórki były zanurzone w buforze, szczególnie w czasie, gdy ogniwa są podłączone do drutu, aby uniknąć uszkodzenia komórek.Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić metody analizy, takie jak hybrydyzacja genomowa porównawcza obszarowo, sekwencjonowanie nowej generacji i PCR specyficzny dla celu, w celu scharakteryzowania pojedynczych komórek na podstawie zmienności liczby kopii i mutacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i odzyskiwać komórki z zawiesin komórkowych za pomocą funkcjonalizowanego przewodu oraz jak pobierać próbki pojedynczych komórek do wielu dalszych molekularnych analiz genetycznych. Nie zapominaj, że praca z ludzką krwią stwarza możliwość infekcji, dlatego podczas wykonywania tej procedury obowiązkowe jest noszenie rękawiczek i fartucha laboratoryjnego.

target-cell-pre-enrichment-whole-genome-amplification-for-single-cell

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W niniejszym artykule opisujemy prostą metodę izolacji pojedynczych komórek z pierwotnych kultur neuronalnych szczura oraz późniejszą analizę transkryptomu z wykorzystaniem amplifikacji aRNA. Metoda ta może zostać zastosowana do każdego typu komórek.

Analiza transkryptomu pojedynczych komórek

Ten film opisuje technikę izolowania pojedynczych komórek z puli komórek docelowych w celu przeprowadzenia dalszej analizy. W tej metodzie mikromanipulator zamontowany w mikroskopie służy do bardzo precyzyjnej izolacji pojedynczej komórki docelowej.

Pobieranie próbek z pojedynczych komórek za pomocą mikromanipulacji: technika izolowania pojedynczych komórek z zawiesiny komórek rakowych

Ten film opisuje technikę uzyskiwania pojedynczej komórki z heterogenicznej populacji komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej. Pojedyncza wyizolowana komórka może być wykorzystana do dalszych badań genomicznych lub badań nad rakiem.

Pobieranie próbek pojedynczych komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej: technika zbierania komórek docelowych z heterogenicznej populacji komórek

Ten protokół opisuje, jak ocenić ekspresję dużej liczby genów na poziomie klonalnym. Jednokomórkowy RT-qPCR daje wysoce wiarygodne wyniki z dużą czułością dla setek próbek i genów.

Ekspresja genów w pojedynczej komórce za pomocą multipleksu RT-qPCR w celu scharakteryzowania heterogeniczności rzadkich populacji limfoidalnych

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek jest coraz bardziej popularnym i dostępnym narzędziem do rozwiązywania problemów związanych ze zmianami genomowymi w wysokiej rozdzielczości. Udostępniamy protokół, który wykorzystuje sekwencjonowanie pojedynczych komórek do identyfikacji zmian liczby kopii w pojedynczych komórkach.

Wykrywanie zmian numeru kopii za pomocą sekwencjonowania pojedynczych komórek

Opisana jest prosta, ale skuteczna metoda, która wykorzystuje magnetyczne nanocząstki do wykrywania i wzbogacania komórek B reagujących na antygen do analizy funkcjonalnej i fenotypowej.

Wykrywanie i wzbogacanie rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu w celu analizy fenotypu i funkcji

Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Tutaj prezentujemy protokół dysocjacji komórek do efektywnego izolowania komórek obecnych w niskiej obfitości w systemie wzrokowym Drosophila poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS).

Oczyszczanie komórek o niskiej liczebności w układzie wzrokowym Drosophila

Tutaj prezentujemy zintegrowany przepływ pracy w celu identyfikacji cech fenotypowych i molekularnych, które charakteryzują krążące komórki nowotworowe (CTC). Łączymy barwienie immunologiczne na żywo i mikromanipulację mikromanipulacją pojedynczych i grupowanych CTC z technikami opartymi na pojedynczych komórkach do dalszej analizy i oceny zdolności do wysiewu przerzutów.

Mikromanipulacja krążącymi komórkami nowotworowymi w celu dalszej analizy molekularnej i oceny potencjału przerzutowego

Obecny protokół opisuje metodę pojedynczej komórki do iteracyjnych analiz epigenomicznych przy użyciu pojedynczej komórki wielokrotnego użytku. Pojedyncza komórka wielokrotnego użytku umożliwia analizę wielu znaczników epigenetycznych w tej samej pojedynczej komórce i statystyczną walidację wyników.

Pojedyncza komórka wielokrotnego użytku do iteracyjnych analiz epigenomicznych

Komórki nowotworowe krążące (CTC) są kluczowe dla badania postępu nowotworów i przerzutów. Niniejszy artykuł przedstawia wysokoprzepustowy, zintegrowany protokół wzbogacania CTC oraz sekwencjonowania pojedynczego CTC, poprawiający efektywność przechwytywania i czystość CTC, jednocześnie zmniejszając koszty zanieczyszczenia i sekwencjonowania, co przyczynia się do rozwoju badań i zastosowań klinicznych w precyzyjnej onkologii.

Technologia sortowania komórek nowotworowych o wysokiej przepustowości i sekwencjonowania pojedynczych komórek oparta na mikrofluidice

Poznaj metodę izolacji pojedynczych komórek z zawiesiny komórkowej przy użyciu przeciwciałowego wzbogacania na druciku. Technika umożliwia analizę genetyczną rzadkich populacji, w tym komórek nowotworowych krążących.

Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu w celu dalszej charakterystyki pojedynczej komórki

Przeglądaj więcej filmów