Name: Zbiorcze badanie przesiewowe shRNA w celu reaktywacji MeCP2 na nieaktywnym chromosomie X (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Poznaj metodę shRNA do identyfikacji regulatorów inaktywacji chromosomu X w mysich fibroblastach ścięgien. Protokół wykorzystuje sekwencjonowanie nowej generacji i gen MeCP2 do badania mechanizmów epigenetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Rossowi Dickinsowi z Uniwersytetu w Melbourne za łaskawe udostępnienie biblioteki shRNA używanej na ekranie. Praca ta została sfinansowana przez Rett Syndrome Research Trust (A.B.).

Wszystkie kroki z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone przy użyciu protokołów zatwierdzonych przez Fred Hutchinson Cancer Research Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Nie wiadomo, czy stosowane tutaj odczynniki stanowią znaczące zagrożenie dla zdrowia ludzkiego, z wyjątkiem 5-azacytydyny (5-AZA).
1. Generowanie reporterowej linii komórkowej z transgenem MeCP2-LUC-HR na Xi
<ol>
	<li>Przygotowanie fibroblastów ścięgien myszy od samicy myszy XMeCP2-LUC-HR /XMeCP2
	<ol>
		<li>Poddaj eutanazji 10-12-dniową samicę myszy XMeCP2-LUC-HR/XMeCP2.</li>
		<li>Za pomocą prostych nożyczek preparacyjnych wykonaj nacięcie obwodowe przez skórę bliższej części ogona.</li>
		<li>Trzymając tuszę w pobliżu podstawy ogona, odciągnij skórę od myszy, aby odsłonić włóknisto-chrzęstną część ogona. Usuń i przetnij końcówkę 10 mm odsłoniętej tkanki na fragmenty o długości 1 mm za pomocą skalpela chirurgicznego.</li>
		<li>Przenieś rozdrobnioną tkankę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego o 1 U/ml penicyliny, 1 μg/ml streptomycyny i 1,5 mg/ml kolagenazy, wstępnie przefiltrowane przez filtry siatkowe 0,45 μm, a następnie 0,2 μm. Inkubować przez 3-4 godziny w temperaturze 37 °C z ciągłym obracaniem.</li>
		<li>Odwirować próbkę w temperaturze pokojowej przy 500 x g przez 10 minut. Zawiesić osad w 10 ml DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą, 1 U/ml penicyliny i 1 μg/ml streptomycyny (DMEM-10) i umieścić na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Przejdź komórki raz i rozwiń do 10 cm płytki przed przejściem do następnego kroku.</li>
		<li>Unieśmiertelnić komórki, wykonując transdukcję z wektorem ekspresyjnym przenoszącym onkogeny wirusa HPV-16 (E6/E7), jak opisano wcześniej7.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Selekcja klonów pojedynczych komórek i charakterystyka ekspresji reporterowej MeCP2
	<ol>
		<li>Zbierz komórki z talerza o średnicy 10 cm. Najpierw odessać pożywkę, dodać 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA i inkubować przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C. Ugasić 9 ml DMEM-10 i zebrać zawieszone komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Rozcieńczyć komórki DMEM-10 do końcowego stężenia 1 komórka/100 μl. Przenieść na płytki 96-dołkowe, pipetując 100 μl zawiesiny do każdej studzienki.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C, aż studzienki zlecą się, co może potrwać do 2-3 tygodni. Wymieniaj pożywkę na nowy DMEM-10 co 3-5 dni. W przypadku zlewania zmobilizuj komórki za pomocą 20 μl 0,05% trypsyny-EDTA na dołek i podziel je na dwa zduplikowane zestawy 96-dołkowych płytek.</li>
		<li>Użyj jednego zestawu płytek do oznaczenia aktywności lucyferazy. Użyj jednorodnego zestawu do oznaczania lucyferazy świetlika, który nie wymaga usuwania pożywki. Postępuj zgodnie z protokołem dołączonym do zestawu.</li>
		<li>Użyj wyników z kroku 1.2.4, aby wybrać klony bez wykrywalnej aktywności lucyferazy z pozostałego zestawu płytek. Rozwiń te klony do płytek 24-dołkowych, a następnie 6-dołkowych.</li>
		<li>Wykonaj to samo dla klonu o najwyższej aktywności lucyferazy; zostanie to wykorzystane jako kontrola pozytywna do celów walidacji.</li>
		<li>Zbierz porcję każdej studzienki na płytce 6-dołkowej, aby uzyskać Western blot. Zmobilizuj komórki za pomocą 200 μl 0,05% trypsyny-EDTA. Inkubować przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C. Ugasić 2 ml DMEM-10 i przenieść połowę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Umyj komórki raz PBS przed lizą w celu uzyskania Western blot. Alternatywnie przenieś połowę komórek na inną 6-dołkową płytkę. Gdy komórki przyczepią się do dna płytki, spłucz PBS i lizą w celu uzyskania Western blot. </li>
		<li>Wykonaj Western blot z przeciwciałem anty-MeCP2, aby potwierdzić, że komórki lucyferazy ujemne wykazują ekspresję, podczas gdy komórki lucyferazy-dodatnie nie wykazują ekspresji MeCP2 typu dzikiego z aktywnego chromosomu X; postępuj zgodnie z wcześniej opisanym protokołem8. Użyj lizatu tkanki mózgowej od dowolnej myszy typu dzikiego jako kontroli pozytywnej.</li>
		<li>Płytka z kilkoma ujemnymi klonami w 2 x 105 komórek/dołku na płytce 6-dołkowej. Potraktować raz 10 μM 5-AZA, inkubować przez 72 godziny bez zmiany pożywki i oznaczyć aktywność lucyferazy zgodnie z opisem w kroku 1.2.3.</li>
		<li>Wybierz jeden negatywny klon (klon Xi), który uzyskał aktywność lucyferazy z 5-AZA i zacznij rozszerzać go na wiele 10-centymetrowych płytek. Zamroź pozostałe ujemne klony w ciekłym azocie jako kopię zapasową. Dodatni klon (klon Xa) może być utrzymywany w kulturze tkankowej lub zamrażany do czasu dalszego wykorzystania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Sprawdzanie biblioteki pod kątem reaktywacji za pomocą wyboru higromycyny B
<ol>
	<li>Zakażenie klonu testowego, zastosowanie selekcji i pobranie DNA do sekwencjonowania
	<ol>
		<li>Uzyskaj koncentraty wirusowe konstruktów retrowirusowych eksprymujących spinki do włosów z biblioteki shRNA lub wyprodukuj skoncentrowany supernatant wirusowy przy użyciu protokołu dołączonego do żądanej biblioteki.</li>
		<li>Przed przystąpieniem do badania przesiewowego należy miareczkować bibliotekę (za pomocą znacznika GFP, jeśli jest dostępny). Dąż do wielokrotności infekcji od 0,3 do 0,5,5, 
		UWAGA: Wykonaj co najmniej cztery niezależne badania, aby zminimalizować odsetek wyników fałszywie dodatnich. Użyj 20 płyt na ekran, aby uzyskać 100-krotne pokrycie biblioteki, aby zachować odpowiednią reprezentację spinów do włosów i uniknąć losowych przerw9. Jednak biorąc pod uwagę ekran pozytywnego wyboru i duży rozmiar biblioteki, prawdopodobnie wystarczyłby mniejszy zasięg.</li>
		<li>Rano umieść 1 x 106 komórek Xi na 10 cm płytkach do hodowli tkankowych.</li>
		<li>Po południu należy zainfekować płytki, zastępując pożywkę świeżym DMEM-10 zawierającym supernatant wirusowy i 5-10 μg/ml polibrenu. Należy użyć ilości supernatantu wirusa określonej w kroku 2.1.2.</li>
		<li>Po 18-24 godzinach odessać pożywkę i dodać 10 ml świeżego DMEM-10 do każdej płytki. Kultura przez kolejne 48 godzin.</li>
		<li>Rano zmobilizuj komórki, używając 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA na płytkę i zatruj 9 ml DMEM-10 na płytkę. Przepuść zawiesinę przez filtr siatkowy 100 μm. Zebrać przefiltrowane zawiesiny razem i wysiać dwa zestawy 10 cm płytek w formacie 1 x 106 komórek/płytkę.</li>
		<li>Po południu zastąpić pożywkę w jednym zestawie płytek DMEM-10 zawierającym 15 μg/ml higromycyny B (dzień 0). W drugim zestawie wymień nośnik tylko na nowy DMEM-10.</li>
		<li>Po 48 godzinach zmobilizuj komórki z nieleczonego zestawu płytek za pomocą 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA. Inkubować przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C. Ugasić 9 ml DMEM-10. Przenieść komórki do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatanty i natychmiast przystąpić do ekstrakcji DNA z osadów. Alternatywnie, połącz komórki w większe probówki przed etapem wirowania.</li>
		<li>Ekstrahuj DNA za pomocą mieszaniny fenolu i chroformu i wytnij DNA octanem sodu i zimnym etanolem, jak opisano wcześniej10. Zebrać poszczególne próbki DNA poddane selekcji wstępnej selekcji i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.</li>
		<li>Kontynuuj hodowlę zestawu selekcyjnego higromycyny B przez kolejne 4 dni. Po 2 dniach uzupełnić pożywkę selekcyjną świeżym DMEM-10 zawierającym higromycynę B.</li>
		<li>W dniu 7 należy wymienić pożywkę selekcyjną tylko na nową DMEM-10. Odczekaj 2 do 4 dni na regenerację, a następnie zbierz komórki zgodnie z opisem w kroku 2.1.8. Kontynuuj ekstrakcję DNA zgodnie z opisem w kroku 2.1.9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identyfikacja zakrętów wzbogaconych w próbkach poselskich
	<ol>
		<li>Użyj kontekstu 5' (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') i 3' starterów z odwróconą pętlą (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3') do amplifikacji półspinek do włosów z próbek DNA przed i po selekcji. Użyj całego wyekstrahowanego DNA w oddzielnych reakcjach PCR z 100-200 ng DNA na reakcję. 
		UWAGA: Te startery kontekstowe 5' i startery pętli odwróconej 3' odpowiadają odpowiednio sekwencji kontekstowej miR-30 przed wstawką shRNA i sekwencji w pętli shRNA. Różne biblioteki będą wymagały różnych oligonukleotydów. W razie potrzeby dostosuj etapy oczyszczania, aby wyizolować różne rozmiary produktów.</li>
		<li>Użyj kulek do wyboru rozmiaru, aby usunąć startery i genomowe DNA oraz odzyskać produkty PCR o stężeniu od 100 do 200 pz. Postępuj zgodnie z protokołem dołączonym do koralików.</li>
		<li>Przygotuj bibliotekę sekwencjonowania, aby uporządkować półspinki do włosów. Wygeneruj co najmniej 50 milionów odczytów na ekran. Postępuj zgodnie z protokołem odpowiednim dla zestawu i sprzętu do sekwencjonowania. 
		UWAGA: 50 milionów odczytów na ekran zapewnia 1000-krotną reprezentację każdego shRNA w bibliotece i około 10-krotne pokrycie każdej niezależnej infekcji (przeprowadzane przy 100-krotnej reprezentacji każdego shRNA), co zapewnia odpowiednią reprezentację każdego zdarzenia infekcji.</li>
		<li>Wylicz każde shRNA za pomocą skryptu Perla, który zlicza sekwencje z idealnymi dopasowaniami. Wybrano shRNA, które miały co najmniej 10 odczytów w puli preselekcji do dalszej analizy. Oblicz wzbogacenia jako stosunek liczby po do preselekcji i określ współczynnik fałszywych odkryć (FDR) na podstawie 1000 permutacji. Wybrano geny, na które celowane są shRNA z <5% FDR, jako "trafienia" do dalszych testów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Walidacja zidentyfikowanych spinek ("trafień")
<ol>
	<li>Pakowanie lentiwirusów zawierających shRNA zidentyfikowane na ekranie przesiewowym
	<ol>
		<li>Wysiewaj 8 x 106 komórek 293FT na płytkę na płytkach 10 cm.</li>
		<li>Następnego dnia zastąp pożywkę 9 ml wolnego od antybiotyków DMEM-10 na płytkę; zrób to 30 minut przed transfekcją.</li>
		<li>W ciągu 30-minutowego odstępu przygotuj dwie mieszanki do transfekcji:
		<ol>
			<li>Przygotuj Mix 1 (na płytkę/shRNA; skaluj w górę zgodnie z całkowitą liczbą shRNA): 10 μl 2 mg/ml polietyleneniminy (PEI) w 0,5 ml optymalnej minimalnej niezbędnej pożywki. Wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
			<li>Przygotuj Mix 2 (na shRNA): 4 μg wektora shRNA do zapakowania, 1,5 μg wektora otoczki VSV-G (pMD2.G) i 2,5 μg wektora opakowania (psPAX2), zmieszane w 0,5 ml optymalnej minimalnej niezbędnej pożywki. 
			UWAGA: Do opakowania należy dołączyć pusty wektor lentiwirusowy do wykorzystania w późniejszych infekcjach jako kontrola negatywna.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodać 0,5 ml mieszaniny 1 do każdej porcji mieszaniny 2 i delikatnie wymieszać pipetując. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
		<li>Nakładać mieszaninę na każdą płytkę z kroku 3.1.2 kroplami; delikatnie obracać płytkę, aby wymieszać.</li>
		<li>Następnego dnia zastąp pożywkę 5 ml świeżego DMEM-10.</li>
		<li>Po 48 godzinach od początkowej transfekcji zebrać supernatant i przepuścić go przez filtr 0,22 μm. Wstępnie zwilż filtr DMEM-10, aby zmaksymalizować odzysk.</li>
		<li>Przefiltrowany supernatant należy podzielić na ilości idealne do zakażenia 6-dołkowej płytki.</li>
		<li>Zamrozić podwielokrotności w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia lub natychmiast przystąpić do transdukcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transdukcja i testowanie poszczególnych spinek do włosów pod kątem reaktywacji reportera lucyferazy i reaktywacji genu MeCP2 typu dzikiego na Xi.
	<ol>
		<li>Rano płytka 1 x 105 komórek Xi/studzienka na płytki 6-dołkowe.</li>
		<li>Po południu należy zainfekować płytki, zastępując pożywkę 2 ml świeżego DMEM-10 zawierającego supernatant lentiwirusowy i 5-10 μg/ml polibrenu. Zainfekować studzienkę kontrolną supernatantem wirusowym wytwarzanym z pustego wektora lentiwirusowego.</li>
		<li>Następnego dnia zastąp pożywkę 2 ml DMEM-10 zawierającego 1 mg/ml puromycyny. Kultura przez cztery dni.</li>
		<li>Zastąp pożywkę 2 ml świeżego DMEM-10 i odczekaj 48-72 godziny na odzyskanie.</li>
		<li>Zmobilizuj komórki za pomocą 150 μl 0,05% trypsyny-EDTA. Inkubować przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C. Ugasić 1,5 ml DMEM-10. Przenieść komórki do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i odwirować przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforze do lizy dostarczonym w zestawie do oznaczania lucyferazy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Przenieś lizaty na białą 96-dołkową płytkę i oznacz aktywność lucyferazy przy użyciu protokołu dołączonego do zestawu. Użyj komórek Xa jako kontroli pozytywnej, a komórek Xi zakażonych pustym wektorem lentiwirusowym jako kontroli negatywnej. 
		UWAGA: Unikaj wystawiania białych płytek na działanie światła fluorescencyjnego przed testem; Zmniejszy to tło i zwiększy czułość testu. Stwierdzono, że protokół dostarczony w zestawie testowym jest najskuteczniejszy, jeśli jest wykonywany w ciemności, gdy tylko jest to możliwe.</li>
		<li>Aby ustalić, czy spinka do włosów miała wpływ na poziom ekspresji MeCP2 na aktywnym chromosomie X, wyizoluj RNA z transdukowanych komórek Xi i zmierz poziom mRNA MeCP2 za pomocą ilościowego PCR ze starterami zaprojektowanymi do amplifikacji tylko MeCP2 typu dzikiego (F: 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGAACAGC-3').</li>
		<li>Opcjonalnie: Zwiększ czułość testu, dodając 5-AZA do końcowego stężenia 0,2 μM po odzyskaniu komórek po selekcji puromycyny. Hoduj komórki przez 72 godziny bez wymiany pożywki, a następnie oznacz aktywność lucyferazy przy użyciu komercyjnego zestawu do oznaczania lucyferazy.</li>
		<li>Zmierz reaktywację wyciszonego MeCP2 typu dzikiego. Zainfekuj komórki Xa, które są siedliskiem dzikiego typu MeCP2 na Xi, wektorem zawierającym pojedyncze spinki do włosów, postępując zgodnie z krokami protokołu 3.2.1. - 3.2.4. Wyizoluj RNA z komórek i zmierz poziom mRNA MeCP2 za pomocą ilościowej PCR ze starterami przeznaczonymi do amplifikacji tylko MeCP2 typu dzikiego (F: 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3').</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Amir, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rett+syndrome+is+caused+by+mutations+in+X-linked+MECP2%2C+encoding+methyl-CpG-binding+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2.</a> Nat Genet. 23, 185-188 (1999).</li>
<li>Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+neurological+defects+in+a+mouse+model+of+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome.</a> Science. 315, 1143-1147 (2007).</li>
<li>Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitting+the+Puzzle+Pieces%3A+the+Bigger+Picture+of+XCI%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI.</a> Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).</li>
<li>Disteche, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosage+compensation+of+the+sex+chromosomes+and+autosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes.</a> Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+microglia+do+not+reverse+pathology+in+mouse+models+of+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome.</a> Nature. 521, E1-E4 (2015).</li>
<li>Sripathy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screen+for+reactivation+of+MeCP2+on+the+inactive+X+chromosome+identifies+the+BMP%2FTGF-beta+superfamily+as+a+regulator+of+XIST+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).</li>
<li>Foster, S. A., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+papillomavirus+type+16+E7+alleviates+a+proliferation+block+in+early+passage+human+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells.</a> Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).</li>
<li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26160567">The Western Blot.</a> Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).</li>
<li>Strezoska, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+PCR+conditions+and+increased+shRNA+fold+representation+improve+reproducibility+of+pooled+shRNA+screens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens.</a> PLoS One. 7, e42341(2012).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+High-Molecular-Weight+DNA+from+Mammalian+Tissues+Using+Proteinase+K+and+Phenol%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).</li>
<li>Goto, Y., Takagi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraploid+embryos+rescue+embryonic+lethality+caused+by+an+additional+maternally+inherited+X+chromosome+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse.</a> Development. 125, 3353-3363 (1998).</li>
<li>Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+of+Xist+RNA%2C+DNA+methylation%2C+and+histone+hypoacetylation+in+maintaining+X+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation.</a> J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).</li>
<li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349, (2015).</li>
<li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521, 232-236 (2015).</li>
<li>Bhatnagar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+pharmacological+reactivation+of+the+mammalian+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).</li>
<li>Minkovsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mbd1-Atf7ip-Setdb1+pathway+contributes+to+the+maintenance+of+X+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation.</a> Epigenetics Chromatin. 7, 12(2014).</li>
<li>Minkovsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screen+of+inactive+X+chromosome+reactivation+identifies+the+enhancement+of+DNA+demethylation+by+5-aza-2%27-dC+upon+inhibition+of+ribonucleotide+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2'-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 42(2015).</li>
</ol>

Dr Leko przyczynił się do powstania tego artykułu jako pracownik Fred Hutchinson Cancer Research Center. Wyrażone poglądy są jego własnymi poglądami i niekoniecznie reprezentują poglądy National Institutes of Health lub rządu Stanów Zjednoczonych

W naszym niedawnym badaniu6 wygenerowaliśmy mysią linię komórkową z genami oporności na lucyferazy i higromycynę połączonymi z MeCP2 na Xi i transdukowaliśmy ją za pomocą biblioteki >60 000 shRNA ukierunkowanych na > 25 000 genów. Znaleźliśmy 30 genów, których knock-down dawał przewagę w przeżywalności przy selekcji higromycyny B, co sugeruje ich rolę w kontroli MeCP2 i wyciszaniu chromosomu X. Wyniki te zostały potwierdzone poprzez transdukcję zgłoszonej linii komórkowej za pomo...

Jedna z najczęstszych form dziedzicznego upośledzenia umysłowego u kobiet, zespół Retta, jest spowodowany heterozygoycznymi mutacjami w MeCP2, genie chromosomu X, który koduje białko niezbędne do prawidłowego funkcjonowania neuronów1. Potencjalnym podejściem do leczenia tego zaburzenia byłaby reaktywacja allelu MeCP2 typu dzikiego na Xi, ponieważ wykazano, że przywrócenie ekspresji MeCP2 odwraca deficyty neurologiczne w mysim modelu tej choroby1,2,4. Jednak epigenetyczne wyciszenie jednego z dwóch chromosomów X w komórkach żeńskich jest ściśle utrzymywane przez cały okres życia organizmu3,4, a silna reaktywacja genu Xi prawdopodobnie wymagałaby poważnego zakłócenia w wielu epigenetycznych szlakach regulacyjnych.
Aby zidentyfikować czynniki niezbędne do utrzymania wyciszenia MeCP2, najpierw opracowaliśmy transgeniczny model myszy przenoszący fuzję genu oporności na MeCP2-lucyferazy-higromycynę (MeCP2-LUC-HR) na jednym z dwóch chromosomów X (XMeCP2-LUC-HR/XMeCP2)5. Chociaż MeCP2 wyrażany z konstruktu fuzyjnego okazał się niestabilny i spowodował utratę funkcji, fenotypowo naśladując delecję MeCP2 u hemizygotycznych samców (XMeCP2-LUC-HR/Y), ekspresja genów reporterowych była łatwo wykrywalna we wzorze zgodnym z ekspresją endogennego MeCP25. Następnie wygenerowaliśmy unieśmiertelnione klony fibroblastów z konstruktem na nieaktywnym lub aktywnym chromosomie X i potwierdziliśmy, że ten pierwszy wyrażał MeCP2 typu dzikiego, a nie konstrukt reporterowy; W przypadku tych drugich było odwrotnie. Po wystawieniu na działanie środka demetylującego DNA, o którym wiadomo, że znosi wyciszanie genów, 5-azacytydyny (5-AZA), komórki z reporterem na Xi ("komórki reporterowe") uzyskały aktywność w teście bioluminescencji, co wskazuje, że nasz konstrukt może zostać reaktywowany, a zatem wykorzystany do genetycznych badań przesiewowych.
Następnie opracowaliśmy wysokoprzepustowe genetyczne badanie przesiewowe dla regulatorów wyciszania MeCP2. Linia komórkowa reporterowa została najpierw zainfekowana biblioteką retrowirusową zawierającą >60 000 różnych shRNA ukierunkowanych na > 25 000 genów w całym genomie myszy 5,6, a następnie poddana selekcji higromycyny B. Częstość występowania spinki do włosów porównano w próbkach pre- i poselskich przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji, ponieważ reaktywacja reporterowa dawała przewagę wzrostu w ramach selekcji higromycyny B i skutkowała wzbogaceniem odpowiedzialnych spinek do włosów. Korzystając z tego podejścia, zidentyfikowaliśmy 30 genów zaangażowanych w wyciszanie MeCP2, a następnie potwierdziliśmy wyniki poprzez transdukcję komórek reporterowych za pomocą indywidualnych spinek do włosów i pomiar ich aktywności lucyferazy.

<table><tbody><tr><td>293FT Linia komórkowa</td><td>Invitrogen</td><td>R700-07</td><td></td></tr><tr><td>5-azacytydyna</td><td>Sigma</td><td>A2385-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-MECP2</td><td>Millipore</td><td>07-013</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Sigma</td><td>C2674-1G</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-dołkowe stałe białe mikropłytki polistyrenowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-336</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Zatrzymanie ekspresji Wektor retrowirusowy przystosowany do mikroRNA (pMSCV)</td><td>Otwarte biosystemy</td><td>EAV4679</td><td></td></tr><tr><td>Zatrzymanie ekspresji pSM2 Retrowirusowa biblioteka shRNAmir</td><td>Open Biosystems</td><td>RMM3796</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Fisherbrand</td><td>03-600-511</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td>SY&ndash; 401&ndash; 2501</td><td>Lub równoważny</td></tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>Calbiochem</td><td>400051-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>System oznaczania lucyferazy Bright-Glo</td><td>Promega</td><td>E2610</td><td>Jednorodny test do badań przesiewowych kolonii</td></tr><tr><td>System oznaczania lucyferazy</td><td>Promega</td><td>E4530</td><td>Niejednorodny test do testowania indywidualnych spinek</td></tr> <tr><td>do włosówLuminometr TopCount NXT</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td>Lub podobny luminometr</td></tr><tr><td>MiSeq Reagent Kit v2</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2001</td><td>Użyj zestawu kompatybilnego z Twoim sprzętem</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td>Wektor</td></tr> <tr><td>obwiedni VSV-GPolybrene</td><td>Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenomenina</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>#12260</td><td>Wektor opakowania</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A11138-02</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr></tbody></table>

zbiorcze badanie przesiewowe shrna w celu reaktywacji mecp2 na nieaktywnym chromosomie x

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Genetyczne badania przesiewowe z wykorzystaniem genów reporterowych wstawionych do heterochromatyny były szeroko stosowane do badania mechanizmów kontroli epigenetycznej w organizmach modelowych. Technologie, w tym krótkie RNA spinki do włosów (shRNA) i zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR), umożliwiły takie badania przesiewowe w diploidalnych komórkach ssaków. Tutaj opisujemy zakrojone na szeroką skalę badanie przesiewowe shRNA pod kątem regulatorów inaktywacji chromosomu X (XCI), przy użyciu mysiej linii komórkowej z genami oporności na lucyferazy świetlika i higromycyny wbitymi na C-końcu genu metylowego białka wiążącego CpG 2 (MeCP2) na nieaktywnym chromosomie X (Xi). Reaktywacja konstruktu w linii komórek reporterowych dała przewagę w zakresie przeżycia przy selekcji higromycyny B, umożliwiając nam przebadanie przesiewowe dużej biblioteki shRNA i zidentyfikowanie spinek do włosów, które reaktywowały reporter, mierząc ich wzbogacenie po selekcji za pomocą sekwencjonowania nowej generacji. Wzbogacone spinki do włosów zostały następnie indywidualnie zweryfikowane, testując ich zdolność do aktywacji reportera lucyferazy na Xi.

Fibroblasty ścięgna myszy pobrano od wcześniej opisanej samicy myszy XMeCP2-LUC-HR/XMeCP2, unieśmiertelniono poprzez transdukcję retrowirusową onkogenów E6 i E7 wirusa HPV-167, sklonowano metodą rozcieńczeń ograniczających oraz przetestowano pod kątem aktywności lucyferazy i ekspresji białka MeCP2 typu dzikiego (Rycina 1A oraz 1B). Aktywność lucyferazy była wysoka, jeśli reporter znajdował się na Xa, i niewykrywalna, jeśli na Xi; natywna ekspresja MeCP2...

Informujemy o małym RNA spinki do włosów (shRNA) i protokole sekwencjonowania nowej generacji do identyfikacji regulatorów inaktywacji chromosomu X w linii komórkowej myszy z genami oporności na lucyferazy świetlika i higromycynę połączonymi z genem białka wiążącego metylo CpG 2 (MeCP2) na nieaktywnym chromosomie X.

Zbiorcze badanie przesiewowe shRNA w celu reaktywacji MeCP2 na nieaktywnym chromosomie X

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Procedurę tę należy rozpocząć od przygotowania fibroblastów ścięgien myszy, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zbierz komórki z 10-centymetrowej płytki, najpierw zasysając pożywkę. Następnie dodaj jeden mililitr 0,05% trypsyny EDTA i inkubuj przez dwie do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po inkubacji wygasić trypsynę dziewięcioma mililitrami DMEM-10 i zebrać zawieszone komórki w 15-mililitrowej stożkowej probówce. Rozcieńczyć komórki DMEM-10 do końcowego stężenia jednej komórki na 100 mikrolitrów. Następnie przenieś komórki do 96-dołkowych płytek, pipetując 100 mikrolitrów zawiesiny do każdej studzienki.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż studzienki zaczną się zlewać, co może potrwać do dwóch do trzech tygodni. Wymieniaj pożywkę na nowy DMEM-10 co trzy do pięciu dni. Po zlaniu się zmobilizuj komórki za pomocą 20 mikrolitrów 0,05% trypsyny EDTA na dołek i podziel je na dwa zduplikowane zestawy 96-dołkowych płytek.Test aktywności lucyferazy w jednym zestawie płytek. Użyj jednorodnego testu lucyferazy świetlika, który nie wymaga usuwania pożywki, zgodnie z protokołem dołączonym do zestawu do testów lucyferazy. Użyj wyników testu, aby wybrać klony bez wykrywalnej aktywności lucyferazy z pozostałego zestawu płytek.Rozwiń te klony najpierw do płytki 24-dołkowej, a następnie do płytki sześciodołkowej. Wykonaj to samo dla klonu o najwyższej aktywności lucyferazy. Zostanie to wykorzystane jako kontrola pozytywna do celów walidacji.Po ekspansji w płytce z sześcioma dołkami zbierz porcję każdej studzienki na Western blot. Zmobilizuj komórki za pomocą 200 mikrolitrów 0,05% trypsyny EDTA. Inkubuj komórki przez dwie do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Ugasić komórki dwoma mililitrami DMEM-10 i przenieść połowę komórek na inną płytkę sześciodołkową. Poczekaj, aż komórki przyczepią się do dolnej części płytki. Następnie przemyj komórki raz PBS przed lizą w kierunku Western blot.Płytka kilku ujemnych klonów po 0,2 miliona komórek na studzienkę w płytce sześciodołkowej. Potraktuj komórki raz 10 mikromolową 5-azacytydyną. Następnie inkubować przez 72 godziny bez zmiany pożywki przed oznaczeniem aktywności lucyferazy, jak poprzednio.Następnie wybierz jeden ujemny klon, który uzyskał aktywność lucyferazy z 5-azacytydyną do badania przesiewowego i zacznij rozszerzać go na wiele 10-centymetrowych płytek. Zamroź pozostałe ujemne klony w ciekłym azocie jako kopię zapasową. Dodatni klon może być utrzymywany w kulturze tkankowej lub zamrażany do czasu dalszego wykorzystania.Rano umieść milion nieaktywnych komórek X na 10-centymetrowych płytkach do hodowli tkankowych. Po południu należy zainfekować płytki, zastępując pożywkę świeżym DMEM-10 zawierającym z góry określoną ilość supernatantu wirusa i od pięciu do 10 mikrogramów na mililitr polibrenu. Po 18 do 24 godzinach odessać pożywkę i dodać 10 mililitrów świeżego DMEM-10 do każdej płytki.Płytki hodowlane przez kolejne 48 godzin. Rano zmobilizuj komórki za pomocą jednego mililitra 0,05% trypsyny EDTA na płytkę i wygasz komórki 9 mililitrami DMEM-10 na płytkę. Przepuść zawiesinę przez filtr siatkowy o średnicy 100 mikronów.Zbierz przefiltrowane zawiesiny razem i wysiewaj dwa zestawy 10-centymetrowych płytek po milion komórek na płytkę. Po południu zastąpić pożywkę w jednym zestawie płytek DMEM-10 zawierającym 15 mikrogramów na mililitr higromycyny, B.In drugim zestawie zastąpić pożywkę tylko świeżym DMEM-10. Po 48 godzinach zmobilizuj komórki z nietraktowanych płytek Hygromycyny B za pomocą jednego mililitra 0,05% trypsyny EDTA.Inkubować przez dwie do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie wygasz komórki 9 mililitrami DMEM-10. Pobrać poszczególne próbki i natychmiast przystąpić do ekstrakcji DNA.Kontynuuj hodowlę zestawu selekcyjnego higromycyny B przez kolejne sześć dni, uzupełniając pożywkę selekcyjną świeżym DMEM-10 zawierającym higromycynę B co drugi dzień. Szóstego dnia wymień pożywkę selekcyjną tylko na nową DMEM-10. Odczekaj cztery dni na regenerację, a następnie zbierz próbkę DNA po selekcji, tak jak poprzednio.Należy przystąpić do identyfikacji spinek do włosów wzbogaconych w próbkach poselekcyjnych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby zweryfikować trafienia, najpierw umieść osiem milionów komórek o długości 293 stóp na płytce na 10-centymetrowych płytkach. Następnego dnia zastąp pożywkę dziewięcioma mililitrami wolnego od antybiotyków DMEM-10 na płytkę 30 minut przed przecięciem.Następnie dodać 0,5 mililitra mieszanki do transfekcji po jednym do każdej porcji mieszanki transfekcyjnej dwóch i delikatnie wymieszać pipetując. Następnie inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Nałóż mieszaninę na każdą płytkę kroplami i delikatnie zakręć płytką, aby wymieszać.Następnego dnia zastąp pożywkę pięcioma mililitrami świeżego DMEM-10,48 godziny po początkowej transfekcji, zbierz supernatant lentiwirusowy i przepuść go przez filtr 0,22 mikrona, który został wstępnie zmoczony DMEM-10, aby zmaksymalizować odzysk. Następnego ranka umieść 0,1 miliona nieaktywnych komórek X na studzienku na sześciu płytkach dołkowych. Po południu należy zainfekować płytki, zastępując pożywkę dwoma mililitrami świeżego DMEM-10 zawierającego supernatant lentiwirusowy i pięcioma do 10 mikrogramami na mililitr polibrenu.Zainfekować studzienkę kontrolną supernatantem wirusowym wytwarzanym z pustego wektora lentiwirusowego. Następnego dnia zastąp pożywkę dwoma mililitrami DMEM-10 zawierającymi jeden miligram na mililitr puromycyny. Korzystaj z wyboru przez cztery dni.Po czterech dniach zastąp pożywkę dwoma mililitrami świeżego DMEM-10 i odczekaj od 48 do 72 godzin na regenerację. Po zmobilizowaniu komórek ze 150 mikrolitrami 0,05% trypsyny EDTA, inkubuj je przez dwie do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ugasić komórki 1,5 mililitra DMEM-10 przed przeniesieniem do stożkowych probówek i odwirowaniem komórek w temperaturze pokojowej 500 razy G przez 10 minut.Usuń pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach buforu do lizy dostarczonego w zestawie do oznaczania lucyferazy. Inkubować zawiesinę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po pięciu minutach przenieść zawiesinę na białą płytkę 96-dołkową.Test należy wykonać w ciemni, postępując zgodnie z protokołem dołączonym do zestawu. Użyj aktywnych komórek X jako kontroli pozytywnej i ujemnych komórek X zakażonych pustym wektorem lentiwirusowym jako kontroli negatywnej. Unieśmiertelnione klony fibroblastów ścięgien myszy wykazują dodatnią lub ujemną aktywność lucyferazy świetlika, zgodnie z umiejscowieniem reportera odpowiednio na aktywnym lub nieaktywnym chromosomie X.Ekspresja MeCP2, określona przez Western blot, wykazuje odwrotny wzorzec. Należy zauważyć, że aktywność lucyferazy świetlików może być indukowana w ujemnych klonach po podaniu 5-azacytydyny. Jeśli gen oporności na higromycynę jest obecny na aktywnym chromosomie X, daje przewagę w przeżywalności przy selekcji higromycyny w porównaniu z komórkami z genem na nieaktywnym chromosomie X.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zaprojektować i wykonać badanie przesiewowe regulatorów inaktywacji chromosomu X za pomocą reporterów selektywnie wstawionych na nieaktywnym chromosomie X. Moje laboratorium przeprowadziło wcześniej zgłoszone badania przesiewowe zasad pod kątem regulatorów chromatyny u drożdży, a nasz sukces w tym podejściu zainspirował mnie do zaprojektowania tego badania przesiewowego dla regulatorów inaktywacji chromosomu X w komórkach ssaków. Zgodnie z tą procedurą, można zastosować inne metody, takie jak użycie małych, interferujących RNA, CRISPR, małych cząsteczek, aby pomóc odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące inaktywacji chromosomu X w komórkach ssaków.

pooled-shrna-screen-for-reactivation-mecp2-on-inactive-x

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W niniejszej pracy wykorzystujemy ludzką bibliotekę pulową LentiPlex oraz tradycyjne metody sekwencjonowania w celu identyfikacji genów docelowych sprzyjających przeżyciu komórek. Przedstawiamy sposób przygotowania i dekonwolucji screeningu LentiPlex oraz walidacji uzyskanych wyników.

Przesiewanie biblioteki połączonej shRNA MISSION LentiPlex w komórkach ssaków

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół identyfikacji zdarzeń rekombinacji homologicznej, które wystąpiły w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą Southern blotting i/lub PCR. Przykładem tej metody jest generowanie modeli myszy zastępujących genetyczną miozynę II bez mięśni przy użyciu tradycyjnej technologii celowania opartej na embrionalnych komórkach macierzystych opartej na rekombinacji homologicznej.

Identyfikacja zdarzeń rekombinacji homologicznej w embrionalnych komórkach macierzystych myszy przy użyciu Southern blotting i reakcji łańcuchowej polimerazy

Biblioteka CRISPR/sgRNA została zastosowana do badania genów kodujących białka. Jednak wykonalność biblioteki sgRNA w celu odkrycia funkcji granicy CTCF w regulacji genów pozostaje niezbadana. W tym miejscu opisujemy bibliotekę sgRNA specyficzną dla loci HOX, aby wyjaśnić funkcję granic CTCF w loci HOX.

PRZEKĄTNA TERENU Badania przesiewowe biblioteki CRISPR/sgRNA skoncentrowane na loci identyfikujące krytyczne granice CTCF

Tutaj opisujemy protokół generowania realnego modelu samicy mysiej z nielosową inaktywacją chromosomu X, tzn. chromosom X odziedziczony po matce jest nieaktywny w 100% komórek. Opisujemy również protokół testowania wykonalności, tolerancji i bezpieczeństwa farmakologicznej reaktywacji nieaktywnego chromosomu X in vivo.

Nielosowy mysi model do farmakologicznej reaktywacji Mecp2 na nieaktywnym chromosomie X

Technologia CRISPR-Cas9 zapewnia efektywną metodę precyzyjnej edycji genomu ssaków w dowolnym typie komórki i stanowi nowatorski sposób przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych całego genomu. Szczegółowy protokół omawiający kroki wymagane do pomyślnego przeprowadzenia zbiorczych badań przesiewowych CRISPR-Cas9 dla całego genomu znajduje się tutaj.

Połączone genetyczne badania przesiewowe oparte na CRISPR w komórkach ssaków

Test immunologiczny elektrochemiluminescencji (ECLIA) to nowatorskie podejście do ilościowego wykrywania endogennych i egzogennie stosowanych wariantów białka MeCP2, które daje wysoce ilościowe, dokładne i powtarzalne pomiary z niskim błędem wewnątrz- i międzytestowym w szerokim zakresie roboczym. W tym miejscu opisano protokół dla MeCP2-ECLIA w formacie 96-dołkowym.

Test oparty na elektrochemiluminescencji dla wariantów białka MeCP2

Opisano techniki generowania biblioteki krótkich peptydów, które mogą aktywować komórki tuczne za pośrednictwem receptora MRGPRX2. Powiązane techniki są łatwe, niedrogie i można je rozszerzyć na inne receptory komórkowe.

Peptydy przesiewowe, które aktywują MRGPRX2 za pomocą zmodyfikowanych komórek HEK

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe RNA (RNAi) z wykorzystaniem puli lentiwirusowych shRNA mogą być narzędziem do wykrywania terapeutycznie istotnych syntetycznych celów śmiertelnych w nowotworach złośliwych. Zapewniamy zbiorcze podejście do badań przesiewowych shRNA w celu zbadania efektorów epigenetycznych w ostrej białaczce szpikowej (AML).

Zbiorcze badania przesiewowe biblioteki shRNA w celu identyfikacji czynników modulujących fenotyp oporności na leki

Opracowaliśmy międzygatunkowe porównawcze podejście onkogenomiczne, wykorzystując analizy genomiczne i funkcjonalne badania genomowe do identyfikacji i porównania celów terapeutycznych w nowotworach powstających w genetycznie modyfikowanych modelach mysich i odpowiadającym im typie nowotworu ludzkiego.

Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych

Rysunek 1: Ramy end-to-end. Rysunek ilustruje kompleksowe ramy wiedzy multimodalnej Graf VISHAM-KG. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji

Poznaj metodę shRNA do identyfikacji regulatorów inaktywacji chromosomu X w mysich fibroblastach ścięgien. Protokół wykorzystuje sekwencjonowanie nowej generacji i gen MeCP2 do badania mechanizmów epigenetycznych.

Zbiorcze badanie przesiewowe shRNA w celu reaktywacji MeCP2 na nieaktywnym chromosomie X

Przeglądaj więcej filmów