Zbiorcze badanie przesiewowe shRNA w celu reaktywacji MeCP2 na nieaktywnym chromosomie X

Procedurę tę należy rozpocząć od przygotowania fibroblastów ścięgien myszy, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zbierz komórki z 10-centymetrowej płytki, najpierw zasysając pożywkę. Następnie dodaj jeden mililitr 0,05% trypsyny EDTA i inkubuj przez dwie do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po inkubacji wygasić trypsynę dziewięcioma mililitrami DMEM-10 i zebrać zawieszone komórki w 15-mililitrowej stożkowej probówce. Rozcieńczyć komórki DMEM-10 do końcowego stężenia jednej komórki na 100 mikrolitrów. Następnie przenieś komórki do 96-dołkowych płytek, pipetując 100 mikrolitrów zawiesiny do każdej studzienki.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż studzienki zaczną się zlewać, co może potrwać do dwóch do trzech tygodni. Wymieniaj pożywkę na nowy DMEM-10 co trzy do pięciu dni. Po zlaniu się zmobilizuj komórki za pomocą 20 mikrolitrów 0,05% trypsyny EDTA na dołek i podziel je na dwa zduplikowane zestawy 96-dołkowych płytek.

Test aktywności lucyferazy w jednym zestawie płytek. Użyj jednorodnego testu lucyferazy świetlika, który nie wymaga usuwania pożywki, zgodnie z protokołem dołączonym do zestawu do testów lucyferazy. Użyj wyników testu, aby wybrać klony bez wykrywalnej aktywności lucyferazy z pozostałego zestawu płytek.

Rozwiń te klony najpierw do płytki 24-dołkowej, a następnie do płytki sześciodołkowej. Wykonaj to samo dla klonu o najwyższej aktywności lucyferazy. Zostanie to wykorzystane jako kontrola pozytywna do celów walidacji.

Po ekspansji w płytce z sześcioma dołkami zbierz porcję każdej studzienki na Western blot. Zmobilizuj komórki za pomocą 200 mikrolitrów 0,05% trypsyny EDTA. Inkubuj komórki przez dwie do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Ugasić komórki dwoma mililitrami DMEM-10 i przenieść połowę komórek na inną płytkę sześciodołkową. Poczekaj, aż komórki przyczepią się do dolnej części płytki. Następnie przemyj komórki raz PBS przed lizą w kierunku Western blot.

Płytka kilku ujemnych klonów po 0,2 miliona komórek na studzienkę w płytce sześciodołkowej. Potraktuj komórki raz 10 mikromolową 5-azacytydyną. Następnie inkubować przez 72 godziny bez zmiany pożywki przed oznaczeniem aktywności lucyferazy, jak poprzednio.

Następnie wybierz jeden ujemny klon, który uzyskał aktywność lucyferazy z 5-azacytydyną do badania przesiewowego i zacznij rozszerzać go na wiele 10-centymetrowych płytek. Zamroź pozostałe ujemne klony w ciekłym azocie jako kopię zapasową. Dodatni klon może być utrzymywany w kulturze tkankowej lub zamrażany do czasu dalszego wykorzystania.

Rano umieść milion nieaktywnych komórek X na 10-centymetrowych płytkach do hodowli tkankowych. Po południu należy zainfekować płytki, zastępując pożywkę świeżym DMEM-10 zawierającym z góry określoną ilość supernatantu wirusa i od pięciu do 10 mikrogramów na mililitr polibrenu. Po 18 do 24 godzinach odessać pożywkę i dodać 10 mililitrów świeżego DMEM-10 do każdej płytki.

Płytki hodowlane przez kolejne 48 godzin. Rano zmobilizuj komórki za pomocą jednego mililitra 0,05% trypsyny EDTA na płytkę i wygasz komórki 9 mililitrami DMEM-10 na płytkę. Przepuść zawiesinę przez filtr siatkowy o średnicy 100 mikronów.

Zbierz przefiltrowane zawiesiny razem i wysiewaj dwa zestawy 10-centymetrowych płytek po milion komórek na płytkę. Po południu zastąpić pożywkę w jednym zestawie płytek DMEM-10 zawierającym 15 mikrogramów na mililitr higromycyny, B.In drugim zestawie zastąpić pożywkę tylko świeżym DMEM-10. Po 48 godzinach zmobilizuj komórki z nietraktowanych płytek Hygromycyny B za pomocą jednego mililitra 0,05% trypsyny EDTA.

Inkubować przez dwie do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie wygasz komórki 9 mililitrami DMEM-10. Pobrać poszczególne próbki i natychmiast przystąpić do ekstrakcji DNA.

Kontynuuj hodowlę zestawu selekcyjnego higromycyny B przez kolejne sześć dni, uzupełniając pożywkę selekcyjną świeżym DMEM-10 zawierającym higromycynę B co drugi dzień. Szóstego dnia wymień pożywkę selekcyjną tylko na nową DMEM-10. Odczekaj cztery dni na regenerację, a następnie zbierz próbkę DNA po selekcji, tak jak poprzednio.

Należy przystąpić do identyfikacji spinek do włosów wzbogaconych w próbkach poselekcyjnych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby zweryfikować trafienia, najpierw umieść osiem milionów komórek o długości 293 stóp na płytce na 10-centymetrowych płytkach. Następnego dnia zastąp pożywkę dziewięcioma mililitrami wolnego od antybiotyków DMEM-10 na płytkę 30 minut przed przecięciem.

Następnie dodać 0,5 mililitra mieszanki do transfekcji po jednym do każdej porcji mieszanki transfekcyjnej dwóch i delikatnie wymieszać pipetując. Następnie inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Nałóż mieszaninę na każdą płytkę kroplami i delikatnie zakręć płytką, aby wymieszać.

Następnego dnia zastąp pożywkę pięcioma mililitrami świeżego DMEM-10,48 godziny po początkowej transfekcji, zbierz supernatant lentiwirusowy i przepuść go przez filtr 0,22 mikrona, który został wstępnie zmoczony DMEM-10, aby zmaksymalizować odzysk. Następnego ranka umieść 0,1 miliona nieaktywnych komórek X na studzienku na sześciu płytkach dołkowych. Po południu należy zainfekować płytki, zastępując pożywkę dwoma mililitrami świeżego DMEM-10 zawierającego supernatant lentiwirusowy i pięcioma do 10 mikrogramami na mililitr polibrenu.

Zainfekować studzienkę kontrolną supernatantem wirusowym wytwarzanym z pustego wektora lentiwirusowego. Następnego dnia zastąp pożywkę dwoma mililitrami DMEM-10 zawierającymi jeden miligram na mililitr puromycyny. Korzystaj z wyboru przez cztery dni.

Po czterech dniach zastąp pożywkę dwoma mililitrami świeżego DMEM-10 i odczekaj od 48 do 72 godzin na regenerację. Po zmobilizowaniu komórek ze 150 mikrolitrami 0,05% trypsyny EDTA, inkubuj je przez dwie do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ugasić komórki 1,5 mililitra DMEM-10 przed przeniesieniem do stożkowych probówek i odwirowaniem komórek w temperaturze pokojowej 500 razy G przez 10 minut.

Usuń pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach buforu do lizy dostarczonego w zestawie do oznaczania lucyferazy. Inkubować zawiesinę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po pięciu minutach przenieść zawiesinę na białą płytkę 96-dołkową.

Test należy wykonać w ciemni, postępując zgodnie z protokołem dołączonym do zestawu. Użyj aktywnych komórek X jako kontroli pozytywnej i ujemnych komórek X zakażonych pustym wektorem lentiwirusowym jako kontroli negatywnej. Unieśmiertelnione klony fibroblastów ścięgien myszy wykazują dodatnią lub ujemną aktywność lucyferazy świetlika, zgodnie z umiejscowieniem reportera odpowiednio na aktywnym lub nieaktywnym chromosomie X.

Ekspresja MeCP2, określona przez Western blot, wykazuje odwrotny wzorzec. Należy zauważyć, że aktywność lucyferazy świetlików może być indukowana w ujemnych klonach po podaniu 5-azacytydyny. Jeśli gen oporności na higromycynę jest obecny na aktywnym chromosomie X, daje przewagę w przeżywalności przy selekcji higromycyny w porównaniu z komórkami z genem na nieaktywnym chromosomie X.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zaprojektować i wykonać badanie przesiewowe regulatorów inaktywacji chromosomu X za pomocą reporterów selektywnie wstawionych na nieaktywnym chromosomie X. Moje laboratorium przeprowadziło wcześniej zgłoszone badania przesiewowe zasad pod kątem regulatorów chromatyny u drożdży, a nasz sukces w tym podejściu zainspirował mnie do zaprojektowania tego badania przesiewowego dla regulatorów inaktywacji chromosomu X w komórkach ssaków. Zgodnie z tą procedurą, można zastosować inne metody, takie jak użycie małych, interferujących RNA, CRISPR, małych cząsteczek, aby pomóc odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące inaktywacji chromosomu X w komórkach ssaków.