Name: Obrazowanie konfokalne bariery krew-mózg w wysokiej rozdzielczości: obrazowanie, rekonstrukcja 3D i kwantyfikacja transcytozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Poznaj protokół obrazowania konfokalnego bariery krew-mózg myszy w wysokiej rozdzielczości z rekonstrukcją 3D. Metoda umożliwia kwantyfikację organelli subkomórkowych w komórkach śródbłonka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R.V. praca była wspierana przez Roche Postdoctoral Fellowship (2014-2017).

<ol><li>Blanchette, M., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+maintenance+of+the+BBB%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation and maintenance of the BBB.</a> Mech Dev. 138, Pt 1 8-16 (2015).</li>
<li>Chow, B. W., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+Constituents+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Molecular Constituents of the Blood-Brain Barrier.</a> Trends Neurosci. 38 (10), 598-608 (2015).</li>
<li>Niewoehner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Brain+Penetration+and+Potency+of+a+Therapeutic+Antibody+Using+a+Monovalent+Molecular+Shuttle%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Increased Brain Penetration and Potency of a Therapeutic Antibody Using a Monovalent Molecular Shuttle.</a> Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).</li>
<li>Yu, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+bispecific+antibodies+cross+the+blood-brain+barrier+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic bispecific antibodies cross the blood-brain barrier in nonhuman primates.</a> Sci Transl Med. 6 (261), 154(2014).</li>
<li>Preston, J. E., Joan Abbott, N., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcytosis+of+macromolecules+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Transcytosis of macromolecules at the blood-brain barrier.</a> Adv Pharmacol. 71, 147-163 (2014).</li>
<li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Into+rather+unexplored+terrain-transcellular+transport+across+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier.</a> Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).</li>
<li>Bien-Ly, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+receptor+%28TfR%29+trafficking+determines+brain+uptake+of+TfR+antibody+affinity+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Transferrin receptor (TfR) trafficking determines brain uptake of TfR antibody affinity variants.</a> J Exp Med. 211 (2), 233-244 (2014).</li>
<li>Sade, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+blood-brain+barrier+transcytosis+assay+reveals+antibody+transcytosis+influenced+by+pH-dependent+receptor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding.</a> PLoS One. 9 (4), 96340(2014).</li>
<li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRP-1-mediated+intracellular+antibody+delivery+to+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">LRP-1-mediated intracellular antibody delivery to the Central Nervous System.</a> Sci Rep. 5, 11990(2015).</li>
<li>Hsu, J., Rappaport, J., Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+binding%2C+uptake%2C+and+transport+of+ICAM-1-targeted+nanocarriers+across+endothelial+and+subendothelial+cell+components+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Specific binding, uptake, and transport of ICAM-1-targeted nanocarriers across endothelial and subendothelial cell components of the blood-brain barrier.</a> Pharm Res. 31 (7), 1855-1866 (2014).</li>
<li>Siupka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+apical-basal+traffic+of+the+cation-independent+mannose-6-phosphate+receptor+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).</li>
<li>Zlokovic, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+saturable+mechanism+for+transport+of+immunoglobulin+G+across+the+blood-brain+barrier+of+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A saturable mechanism for transport of immunoglobulin G across the blood-brain barrier of the guinea pig.</a> Exp Neurol. 107 (3), 263-270 (1990).</li>
<li>Deane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG-assisted+age-dependent+clearance+of+Alzheimer%27s+amyloid+beta+peptide+by+the+blood-brain+barrier+neonatal+Fc+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer's amyloid beta peptide by the blood-brain barrier neonatal Fc receptor.</a> J Neurosci. 25 (50), 11495-11503 (2005).</li>
<li>Cabezon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+applied+to+study+the+trafficking+of+8D3-coated+gold+nanoparticles+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy applied to study the trafficking of 8D3-coated gold nanoparticles at the blood-brain barrier.</a> Histochem Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Collin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+uptake+of+tau%2FpS422+antibody+and+reduced+progression+of+tau+pathology+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Neuronal uptake of tau/pS422 antibody and reduced progression of tau pathology in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain. 137 (10), 2834-2846 (2014).</li>
<li>Villasenor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+Endogenous+Immunoglobulins+by+Endothelial+Cells+at+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Trafficking of Endogenous Immunoglobulins by Endothelial Cells at the Blood-Brain Barrier.</a> Sci Rep. 6, 25658(2016).</li>
<li>Villasenor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+permeability+of+the+blood-brain+barrier+upon+pericyte+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Region-specific permeability of the blood-brain barrier upon pericyte loss.</a> J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).</li>
<li>Armulik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4537058/">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Sibarita, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSibarita%2C+JB+%22Deconvolution+Microscopy%22">Deconvolution Microscopy</a>. 95, 201-243 (2005).</li>
<li>Shaw, P. J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-0-387-45524-2_23">Comparison of Widefield/Deconvolution and Confocal Microscopy for Three-Dimensional Imaging</a>. , 453-467 (2006).</li>
<li>Chenouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+comparison+of+particle+tracking+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat Methods. 11 (3), 281-289 (2014).</li>
<li>Foret, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+theoretical+framework+to+infer+endosomal+network+dynamics+from+quantitative+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A general theoretical framework to infer endosomal network dynamics from quantitative image analysis.</a> Curr Biol. 22 (15), 1381-1390 (2012).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).</li>
<li>Bell, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+control+key+neurovascular+functions+and+neuronal+phenotype+in+the+adult+brain+and+during+brain+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging.</a> Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).</li>
<li>Ben-Zvi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mfsd2a+is+critical+for+the+formation+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.</a> Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).</li>
<li>Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+vesicles+in+the+blood-brain+barrier%3A+are+they+related+to+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial vesicles in the blood-brain barrier: are they related to permeability.</a> Cell Mol Neurobiol. 20 (2), 149-163 (2000).</li>
<li>Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing+-+multi-scale+spatio-temporal+imaging+towards+in+vivo+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing - multi-scale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology.</a> J Cell Sci. 130 (1), 23-38 (2017).</li>
</ol>

Autorzy są zatrudnieni przez firmę Roche za wynagrodzeniem.

Opisany powyżej protokół opisuje przygotowanie swobodnie pływających skrawków mózgu, barwienie immunofluorescencyjne, akwizycję obrazu i parametry analizy do mikroskopii BBB o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta została niedawno wykorzystana do zbadania lokalizacji platform dostarczania przeciwciał3, transportu endogennej IgG przez barierę krew-mózg17 oraz niejednorodności bariery krew-mózg po utracie perycytów18. Różne kroki w protokole mogą być modyfikowane, aby dostosować się do konkretnego celu eksperymentu. Po pierwsze, zastosowanie grubych (100 μm) skrawków ułatwia ich obsługę podczas procedur barwienia immunologicznego i montażu. Pozwala również na odbudowę 3D sieci naczyń włosowatych, jednostki nerwowo-naczyniowej oraz na generowanie przekrojów kapilarnych i NVU. Jednak przenikanie przeciwciał do skrawków tkanek może się różnić, a niektóre barwienie przeciwciał może być ograniczone do powierzchownej warstwy tkanki w pobliżu szkiełka nakrywkowego. Protokół można zmodyfikować poprzez zwiększenie stężenia detergentu na etapie permeabilizacji i/lub długości etapu przepuszczalności, aby poprawić penetrację przeciwciał do tkanki. Po drugie, jakość obrazu może być pogorszona podczas próby uzyskania obrazów głębiej w tkance (zwykle od 20 do 30 μm pod powierzchnią) z powodu rozpraszania światła, a także aberracji optycznych spowodowanych niedopasowaniem współczynnika załamania światła. Aby przezwyciężyć ten problem, nowe metody oczyszczania tkanek i aktywnej penetracji przeciwciał20 można połączyć z tym protokołem w celu obrazowania większych objętości tkanki. Po trzecie, dekonwolucja jest wykonywana po akwizycji obrazu w celu poprawy rozdzielczości osiowej obrazu. Wybór algorytmu ślepej dekonwolucji zastosowanego w tym protokole opierał się na (i) jego łatwości użycia, ponieważ nie jest wymagane wstępne obliczanie funkcji rozproszenia punktów, (ii) jego odporności na poprawę jakości obrazu21 oraz (iii) braku artefaktów na wewnątrzkomórkowych strukturach mIgG po wdrożeniu. W zależności od struktur wewnątrzkomórkowych wizualizowanych w próbce, inne algorytmy dekonwolucji mogą skutkować wyższą jakością obrazu. Poniższe piśmiennictwo21,22 zawiera obszerną dyskusję na temat zalet i ograniczeń dodatkowych algorytmów dekonwolucji obrazu. Wreszcie, zastosowanie pakietu oprogramowania do analizy obrazu pozwoliło na segmentację naczyń włosowatych i struktur wewnątrzkomórkowych w trzech wymiarach. Oczywiście analiza obrazu nie jest ograniczona do oprogramowania opisanego w protokole, a alternatywne pakiety, na przykład te omówione w odnośniku23, mogą być używane do segmentacji obrazów. Przydatność różnych programów do analizy struktur wewnątrzkomórkowych w poprzek bariery krew-mózg powinna być weryfikowana empirycznie poprzez ocenę dokładności segmentacji obrazu.
Ponieważ metoda ta opiera się na utrwalonych próbkach, nie dostarcza bezpośrednich informacji na temat dynamiki transcytozy w całej barierze krew-mózg. Można go jednak połączyć z eksperymentami w czasie24, na przykład poprzez dożylne wstrzyknięcie cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania i zmierzenie jej akumulacji w BEC w różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu, w celu zrekonstruowania kinetyki transportu wewnątrzkomórkowego. Zaletą tego podejścia jest to, że pozwala ono na analizę głębokich obszarów mózgu, jak pokazano narysunku 18, które są obecnie niedostępne dla metod obrazowania na żywo w trybie przyżyciowym. Krytycznym krokiem podczas protokołu jest dokładne monitorowanie utrwalenia tkanki. Wiązanie z 4% PFA radykalnie zmniejsza immunogenność organelli wewnątrzkomórkowych oraz endogennych lub obwodowo podawanych immunoglobulin17 (Figura 1B). Ograniczeniem tego protokołu jest wymóg wysokiej jakości przeciwciał (tj. niskie barwienie nieswoiste, niska reaktywność krzyżowa) odpowiednich do immunofluorescencji. Pod warunkiem, że takie odczynniki są dostępne, metoda może być zastosowana do zbadania wewnątrzkomórkowej lokalizacji dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Na przykład protokół został wykorzystany do identyfikacji lizosomów w komórkach śródbłonka mózgu17. Należy również zauważyć, że ponieważ protokół ten opiera się na mikroskopii konfokalnej, rozdzielczość boczna jest ograniczona dyfrakcją i nie może rozdzielić struktur mniejszych niż około 175 do 250 nm (ryc. 2).
W poprzednich badaniach przeprowadzono szczegółową analizę składu komórkowego jednostki nerwowo-naczyniowej przy użyciu mikroskopii konfokalnej25,26. Jednak badanie transportu wewnątrzkomórkowego w BBB opiera się głównie na wykorzystaniu transmisyjnej mikroskopii elektronowej 19,27,28. Chociaż metoda ta zapewnia najwyższą rozdzielczość boczną struktur wewnątrzkomórkowych, mikroskopia elektronowa pozostaje trudną techniką o niskiej przepustowości. Co więcej, liczba różnych celów molekularnych, które można uwidocznić za pomocą EM, jest bardzo ograniczona. Protokół ten stanowi dostępną alternatywę dla badania transportu wewnątrzkomórkowego w BBB. Cała procedura, od pobrania mózgu po analizę obrazu, można przeprowadzić w ciągu 5 do 6 dni. Jeśli dostępne są odpowiednie przeciwciała, immunofluorescencja umożliwia jednoczesne wykrywanie wielu typów/cząsteczek komórek w tej samej próbce. Co więcej, protokół ten można połączyć z technikami mikroskopii superrozdzielczej w celu przezwyciężenia ograniczeń rozdzielczości przestrzennej29. Ogólnie rzecz biorąc, opisany powyżej protokół umożliwia ilościowe określenie zmian w wewnątrzkomórkowej lokalizacji białek będących przedmiotem zainteresowania w jednostce nerwowo-naczyniowej. Jego zastosowanie w przypadku różnych zaburzeń genetycznych lub farmakologicznych pozwoli na zbadanie wewnątrzkomórkowej struktury i funkcji transportowych BBB in vivo.

Bariera krew-mózg (BBB) to ciągła bariera komórkowa utworzona przez astrocyty, perycyty, neurony i komórki śródbłonka, która oddziela ośrodkowy układ nerwowy (OUN) od krążenia krwi1. Regulacja transportu przez barierę krew-mózg odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy mózgu i jest pośredniczona przez wyspecjalizowane właściwości komórek śródbłonka mózgu (BEC). Obecność ścisłych połączeń międzykomórkowych między BEC i niska podstawowa szybkość transcytozy ograniczają odpowiednio parakomórkowy i transkomórkowy transport cząsteczek krwiopochodnych2. Ostatnio szlak transcytozy w BEC został wykorzystany do usprawnienia dostarczania terapeutycznych dużych cząsteczek do mózgu3,4. Jednak mechanizmy transcytozy w BBB nie zostały jeszcze w pełni scharakteryzowane5,6.
Przeprowadzono szeroko zakrojone prace in vitro, aby rozszyfrować komórkowe i molekularne mechanizmy regulujące transport wewnątrzkomórkowy między BECs7,8,9,10,11, ale takie systemy nie są w stanie podsumować złożonej architektury i fizjologii jednostki nerwowo-naczyniowej (NVU). Z drugiej strony, badania in vivo12,13 dostarczają szczegółowych informacji ilościowych na temat szybkości transportu przez barierę krew-mózg, ale nie dostarczają wglądu w wewnątrzkomórkowe mechanizmy transportu. Dlatego badanie komórkowych i wewnątrzkomórkowych składników NVU in vivo i ex vivo pozostaje bardzo trudne14. Tylko ograniczona liczba technik jest możliwa do analizy struktur subkomórkowych w komórkach NVU. W większości badań wykorzystuje się mikroskopię elektronową, ale technika ta jest ograniczona przez złożone protokoły wymagane do prawidłowego przygotowania tkanek i obchodzenia się z próbką. Dlatego opracowaliśmy metodologię opartą na mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości, która ułatwiłaby przetwarzanie próbek mózgu, analizę i kwantyfikację przedziałów subkomórkowych w komórkach NVU.
Tutaj opisujemy protokół, który wykorzystuje swobodnie pływające sekcje mózgu myszy do wykonywania ilościowego obrazowania BBB i NVU na poziomie komórkowym i subkomórkowym. Przetestowaliśmy i zwalidowaliśmy szereg przeciwciał w celu zobrazowania i zrekonstruowania NVU w trzech wymiarach. Co więcej, protokół ten umożliwia obrazowanie z maksymalną rozdzielczością ograniczoną dyfrakcją optyczną organelli w naczyniach włosowatych mózgu. Wraz z analizą obrazu, protokół ten może być wykorzystany do zbadania wewnątrzkomórkowego transportu makrocząsteczek przez barierę krew-mózg w różnych warunkach eksperymentalnych, na przykład w mysich modelach choroby neurodegeneracji.

<table><tbody><tr><td>Klon przeciwciała monoklonalnego szczura ER-MP12 przeciwko CD31 / PECAM</td><td>Novus Biologicals</td><td>MCA2388</td><td>Etykiety Komórki śródbłonka mózgu Stosować w rozcieńczeniu 1:100 wykryć za pomocą poliklonalnej antyszczurzej IgG (H+L) osła w połączeniu z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowanym w rozcieńczeniu 1:400</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne szczura przeciwko Podocalyxin</td><td>R& Systemy MAB1556</td><td></td><td>Etykiety Światło naczyń włosowatych Stosować w rozcieńczeniu 1:100 wykryć za pomocą poliklonalnej przeciw szczurom IgG (H+L) osła sprzężonej z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowanym w rozcieńczeniu 1:400</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko CollagenIV</td><td>Biotrend</td><td>BT21-5014-70</td><td>Etykiety Błona podstawna naczyń włosowatych Stosować w rozcieńczeniu 1:100 wykryć za pomocą poliklonalnej anty-króliczej IgG (H+L) osła w połączeniu z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowany w rozcieńczeniu 1:400</td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne kozy przeciwko CD13</td><td>R& D Systems</td><td>AF2335</td><td>Etykiety perycyty Stosować w rozcieńczeniu 1:100 wykryć za pomocą poliklonalnej antykozyj IgG (H+L) osła sprzężonej z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowanej w rozcieńczeniu 1:400</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne klon G-A-5 przeciwko GFAP sprzężony z Cy3</td><td>Abcam</td><td>ab49874</td><td>Etykiety Astrocyty Stosować w rozcieńczeniu 1:100</td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne królika przeciwko Iba-1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>Etykiety Microglej Stosować w rozcieńczeniu 1:100 wykryć za pomocą poliklonalnego antyszczurzego przeciwciała IgG (H+L) osła sprzężonego z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowanym w rozcieńczeniu 1:400</td></tr><tr><td>Szczurze przeciwciało monoklonalne ABL93 gainst LAMP2</td><td>Fitzgerald</td><td>10R-CD107BBMSP</td><td>Etykiety Lizosomy Stosować w rozcieńczeniu 1:100 wykryć za pomocą poliklonalnej anty-szczurzej IgG (H+L) osła w połączeniu z odpowiednim barwnikiem AlexaFluor, stosowany w rozcieńczeniu 1:400</td></tr><tr><td>przeciwciało poliklonalne osła przeciwko mysim IgG (H+L) AlexaFluor594</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21203</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:400</td></tr><tr><td>przeciwciało poliklonalne osła przeciwko mysiej IgG (H+L) AlexaFluor488</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21202</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:400</td></tr><tr><td>kozie przeciwciało poliklonalne przeciwko mysim IgG (H+L) AlexaFluor555</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21422</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:400</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10334347</td><td>Plisowana jakościowa bibuła filtracyjna Whatman Grade 0858 1/2, ziarnisty</td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td>Roth Carl</td><td>258.1</td><td>Roti Coll 1</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny Medium montażowe</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>Dako Medium do montażu fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Dorosłe myszy</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>000664</td><td>C57BL/6J samiec lub samica myszy w wieku od 9 do 19 miesięcy</td></tr><tr><td>Wibratom</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047235612</td><td>Leica VT100S z wibracyjnym ostrzem</td></tr><tr><td>Mikrotom konfokalny ze skaningiem laserowym</td><td>Leica Microsystems</td><td>PL</td><td>Leica TCS SP8 X z detektorami HyD i laserem światła białego</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazów</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Leica Application Suite AF w wersji 3.1.0 build 8587</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Oprogramowanie naukowe Bitplane</td><td>NA</td>: <td>Imaris wersja 7.6.5 kompilacja 31770 dla x64</td></tr><tr><td>Fluorescence SpectraViewer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NA</td><td>https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td></tr></tbody></table>

obrazowanie konfokalne bariery krew-mózg w wysokiej rozdzielczości: obrazowanie, rekonstrukcja 3d i kwantyfikacja transcytozy

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Bariera krew-mózg (BBB) to dynamiczny interfejs wielokomórkowy, który reguluje transport cząsteczek między krążeniem a mózgiem. Transcytoza w barierze krew-mózg reguluje dostarczanie hormonów, metabolitów i przeciwciał terapeutycznych do miąższu mózgu. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który łączy immunofluorescencję swobodnie pływających odcinków z laserową skaningową mikroskopią konfokalną i analizą obrazu w celu wizualizacji organelli subkomórkowych w komórkach śródbłonka na granicy krwi. Połączenie tego zestawu danych z oprogramowaniem do analizy obrazu 3D pozwala na półautomatyczną segmentację i kwantyfikację objętości i powierzchni naczyń włosowatych, a także liczby i intensywności organelli wewnątrzkomórkowych w BBB. Do zilustrowania metody wykorzystano wykrywanie endogennej immunoglobuliny myszy (IgG) w pęcherzykach wewnątrzkomórkowych i ich ilościowe oznaczanie w BBB. Protokół ten może być potencjalnie zastosowany do badania mechanizmów kontrolujących transcytozę BBB różnych cząsteczek in vivo.

Jako reprezentatywne przykłady obrazów uzyskanych zgodnie z opisanym tutaj protokołem, przekroje mózgu myszy barwiono przeciwciałami rozpoznającymi różne komponenty NVU, w tym błonę podstawną, astrocyty, perycyty i komórki śródbłonka (szczegółowe informacje o użytych przeciwciałach znajdują się w Tabeli materiałów) (Rycina 1A, D, oraz E). Przy tej rozdzielczości możliwe jest rozróżnienie poszczególnych wypustek astrocytarnych i stópek końcowych, które pozostają w bezpośrednim kontakcie z kapilarami.
Aby podkreślić przydatność niniejszego protokołu do wykrywania struktur wewnątrzkomórkowych, przekroje mózgu zwierząt, którym obwodowo wstrzyknięto ludzkie przeciwciało mAb86 przeciwko Tau16, zabarwiono przeciwciałem przeciwko ludzkim przeciwciałom znakowanym fluorescencyjnie (Rysunek 1B). Wiadomo, że mAb86 specyficznie celuje w neurony wykazujące patologiczną formę białka Tau16. Stosując opisany tutaj protokół, mAb86 wykryto z rozdzielczością ograniczoną dyfrakcyjnie w pojedynczych strukturach pęcherzykowych wewnątrz neuronów (Rysunek 1B-C). Dodatkowo, endogenne IgG mysie wykryto w strukturach wewnątrzkomórkowych w komórkach śródbłonka, ale nie w perycytach (Rysunek 1D-E oraz Rysunek 2).
Pozyskanie wysokorozdzielczych stosów z-stack confocal naczyń krwionośnych mózgu umożliwia trójwymiarową segmentację naczyń włosowatych oraz pęcherzyków wewnątrzkomórkowych w obrębie BBB. Rycina 2 przedstawia przykład procesu renderowania i segmentacji naczynia włosowatego znakowanego CollagenIV oraz pęcherzyków wewnątrzkomórkowych wykazujących obecność mysiego IgG (mIgG). Poprzez kwantyfikację pełnego zbioru danych z obrazów poddanych segmentacji, na przykład poprzez pomiar liczby pęcherzyków w przeliczeniu na objętość naczynia włosowatego, możliwe jest badanie zmian w procesach transportu wewnątrzkomórkowego w różnych warunkach. Rycina 3B-C pokazuje różnice w liczbie pęcherzyków mIgG oraz intensywności fluorescencji odpowiadającej mIgG w parenchymie mózgu, odpowiednio, po usunięciu perycytów w modelu mysim pdgf-bret/ret  , zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami17. To samo podejście zostało niedawno wykorzystane do analizy zmian w transporcie wewnątrzkomórkowym w obrębie BBB między różnymi regionami mózgu18.
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej i wykres analizujący rozkład białek; rozmiar pęcherzyka=175 nm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Etykietowanie wielu typów komórek i struktur subkomórkowych jednostki naczyniowo-nerwowej. Reprezentatywne obrazy jednostki naczyniowo-nerwowej (A i D) oraz pęcherzyków wewnątrzkomórkowych w neuronach (B) lub komórkach śródbłonka (E) uzyskane zgodnie z niniejszym protokołem. Obraz maksymalnej projekcji intensywności w A (góra) pokazuje rozkład astrocytów GFAP-dodatnich (czerwony) otaczających naczynia włosowate oznakowane CollagenIV (zielony). Strzałki wskazują poszczególne wypustki astrocytarne. Pasek skali = 20 µm. Przy tej rozdzielczości poszczególne wypustki astrocytarne i stopki końcowe są wyraźnie widoczne, co pokazano na powiększonym obrazie zaznaczonego obszaru (dół). Groty strzałek wskazują stopki końcowe astrocytów. Pasek skali = 10 µm. Obraz w B pokazuje akumulację przeciwciała wstrzykniętego obwodowo, mAb86 (zielony), w neuronie hipokampa. Groty strzałek wskazują poszczególne pęcherzyki mAb86-dodatnie. Pasek skali = 10 µm. Wykres w C przedstawia profil intensywności linii pojedynczego pęcherzyka. Rozmiar pęcherzyka oszacowano na podstawie pełnej szerokości w połowie maksimum dopasowania Gaussa (czarna linia ciągła) krzywej intensywności (zielona linia i kółka). Obrazy w D przedstawiają trójwymiarową rekonstrukcję komórki śródbłonka (zielony) otoczonej przez perycyyt (czerwony) w obrębie błony podstawnej (CollagenIV, szary). Dolne panele pokazują poszczególne kanały fluorescencji. Pasek skali = 10 µm. Obrazy w E pokazują lokalizację mIgG (czerwony) w pęcherzykach wewnątrzkomórkowych w komórkach śródbłonka (panel lewy, CD31 w kolorze zielonym), ale nie w perycytach (panel prawy, CD13 w kolorze zielonym). Na wszystkich obrazach jądra barwione DAPI są pokazane w kolorze niebieskim. Pasek skali = 5 µm. Panele D i E zostały zmodyfikowane z referencji17. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej, barwienie na kolagen IV, mIgG i DAPI; pojedynczy przekrój, stos z-stack 3D, segmentacja pęcherzyków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Trójwymiarowe odwzorowanie naczyń włosowatych i pęcherzyków wewnątrzkomórkowych w barierze krew-mózg. Zgodnie z opisanym protokołem uzyskano wysokorozdzielcze obrazy konfokalne naczyń włosowatych wykazujących obecność kolagenu IV (zielony) oraz wewnątrzkomórkowych pęcherzyków zawierających mysie IgG (czerwony) (A). Panel lewy przedstawia pojedynczy przekrój optyczny z przekrojami poprzecznymi. Strzałki wskazują poszczególne pęcherzyki mIgG-dodatnie wewnątrz komórek śródbłonka mózgu. Panel prawy przedstawia rekonstrukcję 3D pełnego stosu z-stack wykonaną za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów (patrz Tabela materiałów). Objętość naczyń włosowatych (B) oraz poszczególne pęcherzyki (C) zostały odwzorowane w trzech wymiarach i poddane kwantyfikacji przy użyciu oprogramowania do przetwarzania obrazów (patrz Tabela materiałów). Na wszystkich obrazach jądra barwione DAPI przedstawiono w kolorze niebieskim. Paski skali = 5 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, analiza mIgG, kolagen IV, schematy tkanki mózgowej, C57BL/6 vs pdgf-b&lt;sup&gt;ret/ret&lt;/sup&gt;." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3Ilościowe oznaczenie wewnątrzkomórkowej lokalizacji mIgG w barierze krew-mózg. Reprezentatywne obrazy przedstawiające (A) trójwymiarowe rekonstrukcje naczyń włosowatych (oznaczonych kolagenem IV, zielony) oraz rozkład mIgG (czerwony) u myszy C57BL/6 i w pdgf-bret/ret myszy z uszczupleniem perycytów opisanymi wcześniej w19Skale = 10 µmObrazy w B przedstawia segmentację pęcherzyków wewnątrzkomórkowych w obrębie maski CollagenIV. Wykres w B przedstawia ilościowe określenie i porównanie liczby pęcherzyków mIgG w jednostce objętości kapilary. Każdy punkt reprezentuje pomiary z poszczególnych segmentów kapilar. Linia ciągła oznacza średnią, a słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe danych. Obrazy w C pokaż sygnał fluorescencji mIgG poza maską CollagenIV. Podobnie wykres w C przedstawia kwantyfikację i porównanie intensywności fluorescencji mIgG w miąższu mózgu myszy C57BL/6 oraz pdgf-bret/ret myszy z wyczerpaną populacją perycytów. Jednostki intensywności fluorescencji znormalizowano względem średniej intensywności mIgG w miąższu, zmierzonej u wszystkich myszy C57BL/6. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie literatury17. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy protokół oparty na mikroskopii do obrazowania w wysokiej rozdzielczości oraz trójwymiarową rekonstrukcję mysiego układu nerwowo-naczyniowego i bariery krew-mózg za pomocą swobodnie pływających odcinków mózgu. Metoda ta pozwala na wizualizację, analizę i kwantyfikację organelli wewnątrzkomórkowych w BBB.

Obrazowanie konfokalne bariery krew-mózg w wysokiej rozdzielczości: obrazowanie, rekonstrukcja 3D i kwantyfikacja transcytozy

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Ogólnym celem tej metody jest zapewnienie opartego na mikroskopii protokołu obrazowania w wysokiej rozdzielczości i trójwymiarowej rekonstrukcji mysiej bariery krew-mózg. Łączy immunofluorescencję swobodnie pływających odcinków z mikroskopią konfokalną w celu analizy organelli subkomórkowych w komórkach śródbłonka mózgu. Metoda ta uczy się przygotowania swobodnie pływających wycinków mózgu, barwienia immunofluorescencyjnego, akwizycji obrazu i analizy parametrów do mikroskopii wysokorozdzielczej bariery krew-mózg. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na ilościowe określenie organelli subkomórkowych w komórkach jednostki nerwowo-naczyniowej. Procedurę zademonstruje Roberto Villase

high-resolution-confocal-imaging-blood-brain-barrier-imaging-3d

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę obrazowania fluorescencyjnie znakowanych komórek w półgrubych skrawkach mózgu. Poprzez utrwalenie, pocięcie i optyczne klarowanie tkanki mózgowej opisujemy, w jaki sposób standardowe obrazowanie epifluorescencyjne lub konfokalne może być wykorzystane do wizualizacji poszczególnych komórek i sieci neuronalnych w obrębie nienaruszonej tkanki nerwowej.

Szybka metoda obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości w półgrubych przekrojach mózgu

Źródło: Villaseñor, R i Collin. L. Obrazowanie konfokalne bariery krew-mózg w wysokiej rozdzielczości: obrazowanie, rekonstrukcja 3D i kwantyfikacja transcytozy. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości bariery krew-mózg (BBB) przy użyciu mikroskopii konfokalnej, pokazując wycinki mózgu myszy barwione przeciwciałami w celu analizy składników BBB i struktur wewnątrzkomórkowych, mających zastosowanie do badania homeostazy mózgu, interakcji...

Trójwymiarowe obrazowanie konfokalne o wysokiej rozdzielczości bariery krew-mózg w wycinku mózgu myszy

Źródło: Bagheri, M., et al. Protokół trójwymiarowej konfokalnej analizy morfometrycznej astrocytów. J. Vis. Exp. (2015).Ten film pokazuje obrazowanie fluorescencyjnie znakowanych astrocytów w części mózgu myszy przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Wycinek mózgu umieszcza się pod odpowiednią soczewką obiektywu i dobiera odpowiednie fluorofory i filtry. Po automatycznej optymalizacji ekspozycji, parametry skanowania są definiowane w celu zapewnienia obrazów 2D o wysokiej rozdzielczości. Parametry...

Trójwymiarowe obrazowanie astrocytów znakowanych immunologicznie za pomocą mikroskopii konfokalnej

Aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości fluorescencyjnie znakowanych komórek w dużych tkankach, najlepiej byłoby, gdyby próbki biologiczne były obrazowane bez dzielenia na sekcje. 3DISCO to prosta procedura oczyszczania tkanek oparta na sekwencyjnej inkubacji z rozpuszczalnikami organicznymi. Po oczyszczeniu narządy stają się przezroczyste, co pozwala na kompleksowe skanowanie laserowe próbki.

Obrazowanie oczyściło nienaruszone systemy biologiczne na poziomie komórkowym za pomocą 3DISCO

Ten artykuł opisuje metodę, za pomocą której architektura naczyniowa w mózgu może być określona ilościowo za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo i ex vivo.

Kwantyfikacja architektury naczyń mózgowych za pomocą mikroskopii dwufotonowej w mysim modelu zapalenia nerwów wywołanego przez HIV

Ukierunkowanie leków na nowotwory ośrodkowego układu nerwowego jest dużym wyzwaniem. W tym miejscu opisujemy protokół wytwarzania in vitro naśladującego barierę nowotworową krew-mózg przy użyciu komórek mysich i / lub ludzkich oraz omawiamy ich znaczenie dla przewidywalności celowania w nowotwór ośrodkowego układu nerwowego in vivo.

Przewidywanie dostarczania ładunków in vivo przy użyciu bariery krew-mózg w naczyniu

Przezczaszkowe obrazowanie optyczne umożliwia szerokie obrazowanie transportu płynu mózgowo-rdzeniowego w korze mózgowej żywych myszy przez nienaruszoną czaszkę.

Obrazowanie in vivo transportu płynu mózgowo-rdzeniowego przez nienaruszoną czaszkę myszy za pomocą makroskopii fluorescencyjnej

Bariera krew-mózg (BBB) może być tymczasowo przerwana za pomocą skoncentrowanych ultradźwięków za pośrednictwem mikropęcherzyków (FUS). W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół wysokoprzepustowego otwierania BBB in vivo przy użyciu modułowego systemu FUS dostępnego dla ekspertów niebędących ekspertami w dziedzinie ultrasonografii.

Wysokoprzepustowy, sterowany obrazem stereotaktyczny neuronawigacja i skoncentrowany system ultrasonograficzny do otwierania bariery krew-mózg u gryzoni

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i hodowli mikrośrodowiska przerzutowego guza bariery krew-mózg, a następnie ilościowego określenia jego stanu za pomocą obrazowania konfokalnego i sztucznej inteligencji (uczenia maszynowego).

Kwantyfikacja mikrośrodowiska guza z przerzutami do mózgu za pomocą modelu 3D Organ-On-A Chip, uczenia maszynowego i tomografii konfokalnej

Ten protokół opisuje procedury chirurgiczne i techniczne, które umożliwiają w czasie rzeczywistym wielofotonowe obrazowanie fluorescencyjne mózgu gryzonia podczas skoncentrowanych ultradźwięków i zabiegów mikropęcherzykowych w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg.

Mikroskopia wielofotonowa w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji skoncentrowanych ultradźwięków i zabiegów mikropęcherzyków w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg

Bariera krew-mózg (BBB) odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu stabilnego i zdrowego środowiska mózgu. Dysfunkcja bariery krew-mózg jest związana z wieloma chorobami neurologicznymi. Opracowaliśmy trójwymiarowy model bariery krew-mózg pochodzący z komórek macierzystych, aby zbadać patologię naczyń mózgowych, integralność bariery krew-mózg oraz sposób, w jaki bariera krew-mózg jest zmieniona przez genetykę i chorobę.

Rekonstrukcja bariery krew-mózg in vitro w celu modelowania i terapeutycznego ukierunkowania choroby neurologicznej

Poznaj protokół obrazowania konfokalnego bariery krew-mózg myszy w wysokiej rozdzielczości z rekonstrukcją 3D. Metoda umożliwia kwantyfikację organelli subkomórkowych w komórkach śródbłonka.

Obrazowanie konfokalne bariery krew-mózg w wysokiej rozdzielczości: obrazowanie, rekonstrukcja 3D i kwantyfikacja transcytozy

Przeglądaj więcej filmów