Obrazy na żywo transportu białka GLUT4 w pierwotnych neuronach podwzgórza myszy przy użyciu mikroskopii dekonwolucyjnej
7 grudnia 2017
Ten protokół opisuje technikę obserwacji w czasie rzeczywistym transportu białka GLUT4 (Glucose Transporter 4) w czasie rzeczywistym po stymulacji insuliną oraz charakterystykę biologicznej roli CCR5 w szlaku sygnałowym insuliny-GLUT4 za pomocą mikroskopii dekonwolucyjnej.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest obserwacja transportu białek w czasie rzeczywistym w pierwotnych komórkach neuronalnych, takich jak GLUT4, w neuronach podwzgórza przy minimalnym uszkodzeniu. Metoda ta może wyjaśnić kluczowe pytania związane z neuronalną regulacją sygnalizacji insuliny i metabolizmu, tak jak w przypadku cukrzycy typu 2. Główną zaletą tej techniki jest to, że naukowcy mogą izolować pierwotne hodowle komórkowe i obserwować efekt wywołany lekiem w czasie rzeczywistym.
Implikacją tej techniki jest wybór terapii cukrzycy typu 2 lub insulinooporności związanej z mózgiem, ponieważ teraz wiemy, jak ten sygnał insuliny jest zmieniany przez chemokinę CCL5 w neuronach podwzgórza. Aby rozpocząć tę procedurę, pokryj szalki hodowlane lizyną poli-D na dzień przed posiewem. W przypadku naczynia z sześcioma dołkami dodaj 1,5 ml lizyny poli-D w stężeniu 0,05 mg/ml do każdej studzienki.
Następnego dnia usuń lizynę poli-D i umyj naczynia dwukrotnie 2 ml ddH2O. Następnie napełnij 10-centymetrowe szalki Petriego 20 ml roztworu myjącego i trzymaj je na lodzie. Napełnij probówki o pojemności 15 ml środkiem myjącym i trzymaj je na lodzie.
W celu izolacji tkanki mózgowej wysterylizuj platformę, mikroskop preparacyjny i narzędzia chirurgiczne 75% etanolem, aby uniknąć zanieczyszczenia. Następnie przetnij obszar pępowiny, aby odizolować szczenięta bez ich uszkadzania. Następnie zdejmij głowę każdego szczeniaka i zabezpiecz ją na miejscu za pomocą prostych kleszczy z cienką końcówką.
Użyj innych zakrzywionych kleszczy z cienką końcówką, aby usunąć zewnętrzną skórę i czaszkę z obu stron i oderwij je od przodu do kierunku grzbietowego. Następnie trzymaj izolowane mózgi na czystej szalce Petriego z lodowatym roztworem do mycia. Odwróć mózg i trzymaj brzuszną stronę do góry.
Następnie wyizoluj tkankę podwzgórza za pomocą zakrzywionych kleszczy z cienką końcówką. Przytrzymaj płat węchowy ostrymi kleszczami i oderwij cienkie opony mózgowe otaczające cały mózg zakrzywionymi kleszczami. Odwróć się do spodu kory i oddziel hipokamp od kory, ciągnąc go na bok.
Kiedy wszystkie obszary mózgu zostaną wyizolowane, posiekaj te tkanki w 15-mililitrowych probówkach zawierających lodowaty środek do mycia. W tej procedurze należy przepłukać tkanki, odwracając rurkę zawierającą tkankę dwa do trzech razy. Następnie trzymaj rurkę prosto, aby tkanki mogły się uspokoić.
Usuń górną pożywkę za pomocą szklanej pipety Pasteura podłączonej do systemu próżniowego. Aby umyć chusteczkę, dodaj 15 ml lodowatego podłoża do mycia i odwróć probówkę dwa do trzech razy. Po ostatnim umyciu usuń medium myjące za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
Inkubuj tkanki z buforem do trawienia papainy-trypsyny w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez siedem do 14 minut. Następnie zneutralizuj aktywność enzymów, dodając jedną objętość płodowej surowicy bydlęcej. Trzymaj probówkę na stojaku i odczekaj od jednej do dwóch minut, aby chusteczki się uspokoiły.
Następnie ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Dodaj 6 ml podłoża galwanicznego do probówki i delikatnie odpipetuj tkankę w górę i w dół 50 razy za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Trzymaj probówkę na stojaku i odczekaj od jednej do dwóch minut, aby grube, niezdysocjowane tkanki mogły się uspokoić.
Następnie przenieś górną fazę zawierającą zdysocjowane komórki do nowej probówki i rozcieńcz ją pożywką galwaniczną. Następnie dodaj 2 ml kompletnej pożywki hodowlanej do każdego dołka sześciodołkowego naczynia. Aby przygotować komórki do obrazowania na żywo, ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe z neuronami za pomocą kleszczy i ostrożnie umieść je na szklanym szkiełku.
Następnie usuń nadmiar podłoża za pomocą delikatnych chusteczek zadaniowych, składając je dwukrotnie i ostrożnie umieszczając na szkiełku nakrywkowym, nie przesuwając go. Konieczne jest usunięcie nadmiaru podłoża, aby zapobiec niepotrzebnemu przesuwaniu się szkiełka nakrywkowego. Następnie potraktuj wybrane próbki komórek CCL5 w stężeniu 10 ng/ml lub insuliną w dawce 10 jednostek/ml przez jedną minutę.
Następnie dodać 1,5 ml rozcieńczonej insuliny na krawędzi szkiełek nakrywkowych. Następnie dodaj olejek immersyjny na soczewkę obiektywu 1,52 NA o powiększeniu 60 razy. Następnie umieść szkiełka nakrywkowe na stoliku mikroskopu dekonwolucyjnego tak, aby szkiełka nakrywkowe były skierowane w dół i odpowiednio zabezpieczone.
Użyj jasnego pola lub oświetlenia fluorescencyjnego, aby zidentyfikować komórki docelowe. Następnie dostosuj ostrość, aż komórki docelowe będą wyraźnie widoczne. Nie przesuwaj soczewki obiektywu poza obszar szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć niepotrzebnych zadrapań.
Następnie zidentyfikuj GFP-GLUT4 na podstawie sygnału GFP. Następnie zidentyfikuj żądane komórki docelowe do akwizycji obrazu. Następnie ustaw odpowiednie parametry eksperymentalne dla każdej komórki docelowej, w tym liczbę pikseli, długość fali wzbudzenia, procent transmisji, czas ekspozycji, grubość stosu, przedział czasu i całkowity czas obrazowania.
Dostosuj parametr ekspozycji do około 2000 do 3000 zliczeń, aby uzyskać maksymalną intensywność pikseli. Aby zminimalizować fluorescencyjne wybielanie zdjęć, zmniejsz procent przepuszczalności światła wzbudzającego tak bardzo, jak to możliwe, utrzymując czas naświetlania krótszy niż jedna sekunda. Ustaw górną i dolną granicę stosu Z na każdej komórce docelowej, przesuwając stolik mikroskopu, aż górna i dolna część komórki docelowej będą nieco nieostre.
Bardzo ważne jest, aby zminimalizować fluorescencyjne wybielanie zdjęć w przypadku śmierci neuronów po obrazie świetlnym. Rysunek ten pokazuje, że pierwotne hodowane neurony podwzgórza były znakowane markerem neuronalnym MAP2. Marker neuronalny podwzgórza POMC i ich koekspresja CCR5.
Współzlokalizowany obraz pokazuje, że CCL5 ulega ekspresji w neuronach podwzgórza POMC-dodatnich. Obrazy te pokazują ekspresję białka GFP-GLUT4 w neuronach podwzgórza typu dzikiego i podwójnie ujemnych neuronach podwzgórza CCR5. Neurony stymulowano insuliną lub CCL5.
Strzałki wskazują punkt GFP-GLUT4 w zapaleniu nerwu przed lub po stymulacji insuliną lub CCL5, a gwiazdki wskazują powierzchnię GLUT4-GFP przed lub po stymulacji CCL5. Po opanowaniu, to laboratoryjne nagranie techniki komórek pierwotnych można wykonać od jednej do czterech godzin, w zależności od wymagań eksperymentu i tego, czy jest to wykonane prawidłowo. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się neurobiologią do zbadania możliwości scharakteryzowania natychmiastowego efektu wywołanego lekiem w pierwotnej hodowli komórkowej.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować pierwotny neuron podwzgórza, neuron hipokampa i neuron korowy. Oprócz laboratorium możesz również wiedzieć, jak wykonać nagranie na żywo cząsteczki szeregowej po różnych stymulacjach. Nie zapomnij założyć fartucha laboratoryjnego i rękawiczek oraz często używać etanolu, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteriami i grzybami od zwierząt.
Zachowaj również ostrożność podczas obchodzenia się z szkiełkami nakrywkowymi i neuronami podczas tej procedury.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół obserwacji w czasie rzeczywistym transportu transportera glukozy 4 (GLUT4) znakowanego GFP w pierwotnych komórkach neuronalnych podwzgórza po stymulacji insuliną. Analizie poddano również rolę CCR5 w szlaku sygnałowym insulina–GLUT4, co dostarcza informacji na temat neuronalnej regulacji sygnalizacji insulinowej i metabolizmu w kontekście cukrzycy typu 2.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- biologia komórki
- endokrynologia
Wstęp
- Badanie koncentruje się na mechanizmach transportu GLUT4 w odpowiedzi na insulinę.
- Adresuje ono pytania behawioralne i metaboliczne związane z cukrzycą typu 2.
- Udział CCR5 w sygnalizacji insulinowej otwiera nowe możliwości terapeutyczne.
- Pierwotne hodowle komórek neuronalnych pozwalają na zminimalizowanie uszkodzeń podczas przeprowadzania eksperymentów.
Cel badania
- Zbadanie dynamiki transportu GLUT4 w odpowiedzi na insulinę.
- Ocena roli CCR5 w szlaku sygnalizacji insulinowej.
- Pogłębienie zrozumienia neuronalnego wpływu na regulację insuliny.
Zastosowane metody
- Do obrazowania na żywo wykorzystano pierwotne hodowle komórek neuronów podwzgórza.
- Izolację tkanek mózgowych od szczeniąt przeprowadzono w warunkach sterylnych.
- Obrazowanie na żywo wykonano przy użyciu mikroskopii dekonwolucyjnej w celu śledzenia transportu GLUT4.
- Podczas obrazowania komórki traktowano insuliną oraz CCL5, aby zaobserwować ich działanie.
- Dokonano korekt kluczowych parametrów eksperymentalnych, aby zminimalizować fotowyblakanie.
Główne wyniki
- Wizualizowano transport GFP-GLUT4 w odpowiedzi na stymulację insuliną oraz CCL5.
- Obserwacje wykazały ko-lokalizację CCR5 z markerami neuronalnymi, co wpływa na transport GLUT4.
- Badanie to ujawnia potencjalną dysregulację mechanizmów sygnalizacji insulinowej spowodowaną przez CCR5.
- Wyniki podkreślają kluczowe interakcje między sygnalizacją neuronalną a metabolizmem.
Wnioski
- Badanie umożliwia obserwację w czasie rzeczywistym transportu GLUT4 indukowanego przez insulinę w neuronach.
- Wyniki podkreślają rolę CCR5, sugerując kierunki terapeutyczne w leczeniu cukrzycy typu 2.
- Wnioski rozciągają się na zrozumienie mechanizmów neuronalnych wpływających na zaburzenia metaboliczne.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym transportu GLUT4 w pierwotnych neuronach podwzgórza, dostarczając wglądu w mechanizmy rozregulowania sygnalizacji insulinowej istotne dla cukrzycy typu 2. Poprzez powiązanie sygnalizacji chemokin (CCL5) z dynamiką neuronalnych transporterów glukozy, metoda ta wspiera walidację celów w szlakach metabolicznych chorób OUN. Podejście to ogranicza ryzyko związane z hipotezami we wczesnej fazie badań, dostarczając ilościowych danych z żywych komórek na temat translokacji białek w warunkach kontrolowanej stymulacji.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Analizuje funkcjonalną zależność pomiędzy białkiem CCR5 a stymulowaną insuliną translokacją GLUT4 w neuronach podwzgórza.
- Wartość operacyjna: Umożliwia bezpośrednią obserwację dynamiki białek w komórkach pierwotnych, ograniczając zależność od systemów zastępczych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera mechanistyczną ocenę ryzyka w odniesieniu do celów w OUN zaangażowanych w regulację metaboliczną.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych odczytów wydajności translokacji GLUT4 do błony komórkowej po stymulacji insuliną lub chemokiną.
- Wartość operacyjna: Ustanawia powtarzalny test obrazowania na żywo do śledzenia dynamiki transporterów w modelach neuronalnych.
- Gotowość testu: Dostarcza rozdzielcze przestrzennie dane z odstępami czasowymi, odpowiednie do profilowania efektów związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy zaburzenia równowagi chemokin obwodowych z defektami centralnego sygnalizowania insulinowego w neuronalnym modelu istotnym dla przebiegu choroby.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje pierwotne neurony podwzgórza z modeli typu dzikiego oraz modeli z deficytem CCR5 w celu oceny odpowiedzi zależnych od genotypu.
- Ciągłość translacyjna: Przenosi ustalenia in vitro na patofizjologię otyłości i cukrzycy typu 2 in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Technika ta wpisuje się w wczesne etapy procesów badawczych, wspierając walidację hipotez przed identyfikacją związków wiodących i badaniami przedklinicznymi nad skutecznością w programach dotyczących chorób metabolicznych.
- Biologia odkrywcza: Badanie powiązań mechanistycznych między receptorami chemokin a regulowanym przez insulinę transportem glukozy w neuronach.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowe punkty końcowe oparte na obrazowaniu do oceny wpływu związków na transport GLUT4.
- Analityka: Zapewnia pomiary intensywności punktów GFP-GLUT4 i lokalizacji błonowej do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Jest zgodne z modelami przedklinicznymi dzięki wykorzystaniu pierwotnych neuronów, które odzwierciedlają wzorce koekspresji CCR5 i POMC w neuronach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia skalowalną platformę obrazowania na żywo, którą można zastosować do innych transporterów lub receptorów znakowanych fluorescencyjnie w kulturach neuronalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do hipotez dotyczących celów poprzez wizualizację dynamiki białek w czasie rzeczywistym w komórkach istotnych fizjologicznie.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły obrazowania żywych komórek z określonymi parametrami wzbudzenia, ekspozycji i tworzenia stosów z (z-stacking), aby zminimalizować fotowyblakanie.
- Wartość strategiczna: Dostarcza podstaw do decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), wykazując, czy dany cel moduluje sygnalizację insulinową w kluczowych populacjach neuronalnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację terapii metabolicznych ukierunkowanych na ośrodkowy układ nerwowy z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o dowody mechanistyczne z modeli neuronalnych istotnych dla ludzi.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w izolacji pierwotnych neuronów, sterylnej obróbce tkanek oraz fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek.
- Zależne od dostępu do systemów mikroskopii dekonwolucyjnej z obiektywami imersyjnymi 60x i kontrolą parametrów środowiskowych.
- Konieczna jest standaryzacja przygotowania komórek, czasu stymulacji oraz parametrów akwizycji obrazu pomiędzy zespołami.
- Należy uwzględnić zmienność wydajności transfekcji pierwotnych komórek oraz bazową ekspresję GLUT4 podczas porównywania warunków.
- Ograniczone ryzykiem fototoksyczności podczas przedłużonego obrazowania, co niweluje się poprzez optymalizację intensywności wzbudzenia i czasu ekspozycji zgodnie z opisem w protokole.
