Badanie sygnału insuliny podwzgórzowej do obwodowej nietolerancji glukozy za pomocą systemu ciągłego wlewu leków do mózgu myszy

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zbadanie roli sygnalizacji C-C-L-5 w działaniu insuliny w układzie obwodowym i metabolizmie glukozy poprzez manipulowanie sygnalizacją C-C-L-5 poprzez podawanie antagonisty Met-C-C-L-5 przez międzymózgowy system dostarczania komorowego, pompę mikroosmotyczną. Lek ten może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie fizjologii biochemicznej, takie jak chemokina C-C-L-5 w kontrolowaniu metabolizmu glukozy w organizmie i reakcji na insulinę w mózgu. Główną zaletą tego środka jest to, że eksperymentator może łatwo manipulować pewnymi sygnałami w mózgu przez pewien okres czasu, takimi jak C-C-L-5 tutaj, bez efektu kompensacyjnego lub rozwoju zaburzenia, co zwykle ma miejsce, gdy dokonujemy manipulacji genetycznej u gryzoni.

Wizualna demonstracja tej procedury jest ważna, ponieważ wprowadzenie pompy mikroosmotycznej i dokładny pomiar poziomu insuliny i glukozy we krwi wymaga umiejętności i precyzji. Na dzień przed zabiegiem należy przygotować mikro-osmotyczne pompy mózgowe za pomocą jednomililitrowej strzykawki i igły z główką, aby napełnić pompy sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym lub A-C-S-F. Następnie zanurz pompę w A-C-S-F i umieść ją na wytrząsarce, aby delikatnie wstrząsnąć przez noc.

Następnego dnia wyjąć A-C-S-F z pompy i napełnić ją całkowicie wcześniej przygotowanym roztworem leku rozcieńczonym w A-C-S-F, aż do wycieku nadmiaru. Następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych przyciąć rurki cewnika do pożądanej długości. Za pomocą igły do infuzji mózgu przymocuj rurki do zestawu do infuzji mózgu.

Następnie napełnić probówki w zestawie infuzyjnym roztworem leku. Po zmontowaniu zestawu należy przymocować go do pompy mikroosmotycznej. Na koniec, aby zapobiec wysychaniu pompy, zanurz ustawienie infuzji mózgu pompy osmotycznej w A-C-S-F w wysterylizowanej probówce o pojemności 50 mililitrów.

Aby rozpocząć operację, zamontuj i przymocuj głowę znieczulonej myszy do aparatu stereotaktycznego. Za pomocą nożyczek chirurgicznych i szczypiec rozetnij zewnętrzną skórę pokrywającą czaszkę. Następnie użyj jodu do oczyszczenia obwodowej czaszki.

Następnie użyj nożyczek z główką w pobliżu okolicy szyi, aby oddzielić najbardziej zewnętrzną warstwę skóry od skóry podskórnej w celu implantacji zestawu do fuzji mózgu z pompą osmotyczną. Za pomocą aparatu stereotaktycznego oznaczyć punkt infuzji w odniesieniu do mapy mózgu. Użyj wiertła do paznokci, aby wywiercić otwór wokół obszaru zaznaczonego na czaszce, uważając, aby nie złamać opon mózgowych i naczyń krwionośnych myszy.

Następnie umieść zestaw do fuzji mózgu z pompą mikroosmotyczną zawierający interesujący lek lub A-C-S-F jako kontrolę, pod skórą za obszarem szyi. Aby wstrzyknąć lek do mózgu, należy włożyć igłę do infuzji mózgu do wywierconego otworu. Użyj żelu odczulającego powierzchnię, aby przymocować igłę do czaszki i poczekaj, aż klej wyschnie.

Odetnij wystającą część na górze igły. Przed rozpoczęciem testu tolerancji glukozy przygotuj roztwór glukozy, rozpuszczając 3,75 grama glukozy i 15 mililitrów wody destylowanej. Ustal harmonogram z odpowiednimi odstępami czasu między każdym badaniem krwi, aby rejestrować odczyty podczas eksperymentu.

Następnie zważ każdą mysz po poszczeniu, aby obliczyć odpowiednią ilość glukozy do wstrzyknięcia. Następnie na stole warsztatowym przygotuj minutnik, chip glukozowy, glukometr, strzykawkę insulinową i żyletki. Aby zmierzyć poziom glukozy we krwi, najpierw włóż nowy chip glukozowy do glukometru i naciśnij przycisk start, aby ustawić zero.

Następnie podnieś mysz z tyłu szyi i pogłaszcz jej ogon, aby zapewnić wystarczający przepływ krwi. Użyj nowej żyletki, aby odciąć mały kawałek ogona, a następnie wyciśnij kroplę krwi do chipa glukozowego. Korzystając z techniki płukania żołądka, nakarm mysz glukozą i natychmiast uruchom stoper.

Zmierz poziom glukozy w różnych punktach czasowych. Aby rozpocząć test tolerancji insuliny, należy przygotować 0,25 jednostki roztworu insuliny ludzkiej. Następnie zważ każdą mysz po poszczeniu, aby obliczyć odpowiednią ilość insuliny do wstrzyknięcia.

Następnie ustal harmonogram, aby rejestrować odczyty podczas eksperymentu. Na koniec, po wstrzyknięciu insuliny, zmierz poziom glukozy we krwi, tak jak poprzednio. Metabolizm glukozy mierzono za pomocą doustnego testu tolerancji glukozy po operacji, po doustnym podaniu glukozy myszom.

Zmiany poziomu glukozy we krwi u myszy, którym podawano A-C-S-F lub podawano antagonistę C-C-L-5, są rejestrowane i pokazywane tutaj. Przeprowadzono również test wrażliwości na insulinę, a poziom glukozy we krwi u myszy, którym podawano antagonistę C-C-L-5, był tylko nieznacznie zmniejszony w porównaniu z myszami kontrolnymi, co sugeruje upośledzenie funkcji insuliny w obwodowym metabolizmie glukozy u myszy leczonych C-C-L-5. Aby przeanalizować aktywację sygnału insuliny, w podwzgórzu oceniono białko substratu receptora insuliny lub fosforylację I-R-S-1.

U myszy leczonych antagonistą C-C-L-5, gdy były karmione normalnie, fosforylacja I-R-S-1 była regulowana w górę w porównaniu z grupą kontrolną. W celu dalszej analizy aktywacji sygnału insuliny oceniono również poziomy fosforylowanej seryny 4-7-3 Akt, cząsteczki sygnałowej insuliny. Następnie sygnał prowokacji insuliną AKT był zwiększony u myszy z grupy kontrolnej leczonych A-C-S-F, ale nie u myszy leczonych antagonistą C-C-L-5.

Po opanowaniu wprowadzania pompy mikroosmotycznej zajmie to tylko pół godziny, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że głowa myszy jest lekko uniesiona, a kręgosłup znajduje się prosto na aparacie stereotaktycznym. Technika ta zapewnia badaczowi sposób w endokrynologii na zbadanie wpływu leku, chemokiny lub funkcji białka w mózgu gryzonia.

Po tej procedurze można wykonać dodatkowe środki, takie jak manipulowanie ekspresją genów za pomocą domózgowego dostarczania wirusa lub crisper 9, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób C-C-L-5 i receptor C-C-L-5 uczestniczą w trawieniu i metabolizmie pokarmu?