Name: Badanie sygnału insuliny podwzgórzowej do obwodowej nietolerancji glukozy za pomocą systemu ciągłego wlewu leków do mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj metodę ciągłego wlewu do mózgu myszy w celu badania roli CCL5 w sygnalizacji insuliny i metabolizmie glukozy. Technika ta pozwala precyzyjnie manipulować szlakami sygnałowymi w podwzgórzu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie ze strony Ministerstwa Nauki i Technologii Tajwanu - MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) oraz dopłatę zdrowotną i socjalną do wyrobów tytoniowych - MOHW106-TDU-B-212-144001 dla S-Y C.

UWAGA: Wszystkie protokoły i metody stosowane u zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Medycznego w Tajpej (numery protokołów: LAC-2014-0387)
1. Przygotowanie systemów infuzyjnych z mikropompą osmotyczną
UWAGA: Przygotuj pompę, bufor sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) i lek (roztwór białka Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL w aCSF)) w sterylnych warunkach, używając przefiltrowanych filtrami 0,2 μm i przeprowadź wszystkie procedury pod kapturem hodowlanym w rękawiczkach. Zabiegi chirurgiczne przeprowadza się w następujący sposób:
<ol>
	<li>Przygotuj pompy mikroosmotyczne na dzień przed zabiegiem: Napełnij pompę mikroosmotyczną mózgu sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF) za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły z główką dostarczonych wraz z zestawem. Zanurz pompę mikroosmotyczną w płynie CSF, umieść ją na shakerze i delikatnie wstrząśnij przez noc. 
	UWAGA: Pompę należy napełnić płynem CSF i unikać pęcherzyków powietrza wewnątrz pompy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Przed rozpoczęciem operacji należy przygotować rekombinowany roztwór białka Met-CCL5/RANTES (10 ng/ml, rozcieńczony w aCSF) do wykorzystania w eksperymencie. Usunąć płyn CSF z pompy i powoli napełniać pompę roztworem leku, aż nadmiar wycieknie. 
	UWAGA: 15 ml roztworu aCSF lub Met-CCL5/RANTES wystarcza na 5-8 pomp. 
	UWAGA: Powtórz procedurę, aby upewnić się, że pompa jest całkowicie wypełniona lekiem bez pęcherzyków w środku.</li>
	<li>Przyciąć rurki cewnika na żądaną długość i przymocować je igłą do infuzji mózgu w zestawie do infuzji mózgu. Napełnij zestaw infuzyjny i probówki lekiem.</li>
	<li>Na koniec zmontuj i podłącz zestaw do infuzji mózgu do pompy mikroosmotycznej. 
	UWAGA: W rurze ani pompie nie powinny tworzyć się pęcherzyki powietrza (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Zanurz cały zestaw do fuzji pompy osmotycznej i mózgu w CSF w wysterylizowanej probówce o pojemności 50 ml, aby zapobiec wysychaniu pompy. Zestaw do fuzji pompy osmotycznej z mózgiem jest teraz gotowy do użycia podczas operacji. 
	UWAGA: Systemy pomp mikroosmotycznych mogą być używane do długotrwałego wlewu leków. Zapewnia to bezpieczny i wygodny sposób dostarczania leku do mózgu myszy.</li>
</ol>
2. Chirurgia komorowa śródmózgowa – wszczepienie mikropompy osmotycznej
UWAGA: Wysterylizuj środowisko chirurgiczne 75% etanolem i upewnij się, że osoby biorące udział w badaniu noszą sterylne rękawiczki i czysty fartuch laboratoryjny. Narzędzia/instrumenty chirurgiczne muszą być autoklawowane i suszone przed użyciem, a następnie sterylizowane 75% etanolem pomiędzy operacjami na myszach.
<ol>
	<li>Zważ mysz i znieczul ją za pomocą wstrzyknięcia dootrzewnowego (IP) z ketaminą/ksylazyną (ketamina 50 mg/kg, ksylazyna 10 mg/kg). 
	UWAGA: Masy ciała myszy o masie ciała mniejszej niż 24 g nie są zalecane do operacji implantacji pompy osmotycznej.</li>
	<li>Zamontuj i zamocuj głowicę myszy na aparacie stereotaktycznym (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Użyj nożyczek chirurgicznych i szczypiec, aby rozciąć zewnętrzną skórę pokrywającą czaszkę. Użyj jodu do oczyszczenia czaszki obwodowej.</li>
	<li>Oddziel najbardziej zewnętrzną warstwę skóry od skóry podskórnej za pomocą pary szczypiec z głową w pobliżu okolicy szyi w celu implantacji zestawu do fuzji pompy osmotycznej i mózgu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Oznacz punkt infuzji w odniesieniu do mapy mózgu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D) za pomocą aparatu stereotaktycznego. W tym eksperymencie igła musi zostać wszczepiona w obszar 3. komory (Bregma: 0,0 mm boczny, 1,3 mm tylny, 5,7 mm brzuszny).</li>
	<li>Wywierć otwór za pomocą wiertła do gwoździ wokół obszaru zaznaczonego na czaszce (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). 
	UWAGA: Uważaj, aby nie połamać opon mózgowych i naczyń krwionośnych myszy, unikając w ten sposób przerwania mikronaczyń krwionośnych w mózgu.</li>
	<li>Umieść zestaw do fuzji pompy mikroosmotycznej z mózgiem zawierający CSF (jako kontrolę) lub lek (roztwór białka Met-CCL5 / RANTES) pod skórą za obszarem szyi i włóż igłę do infuzji mózgu do wywierconego otworu, aby wstrzyknąć lek do mózgu myszy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E). Igła przebije opony mózgowe i dostanie się do komory. Przymocuj igłę do czaszki za pomocą żelu odczulającego powierzchnię (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1F) i odczekaj 1-2 minuty, aż klej wyschnie. Następnie odetnij wystającą część na górze igły (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G-H).</li>
	<li>Użyj kleju do tkanek, aby zagoić ranę pooperacyjną na głowie. Nałóż 50 μl kleju na wierzch rany, przyciągnij obie strony skóry do siebie i przytrzymaj przez 30 sekund, aby skóra się uszczelniła (<silna klasa="xfig">Rysunek 1I). 
	UWAGA: Użyj 100% wacika nasączonego alkoholem do oczyszczenia rany po operacji i 100% ul penicyliny ze streptomycyną, aby zapobiec infekcji. UWAGA: Skóra myszy utworzy tkankę bliznowatą i zagoi się w ciągu kilku dni po podaniu kleju chirurgicznego. Główną zaletą kleju jest uniknięcie stosowania szwów chirurgicznych, które mogą powodować podrażnienia lub stany zapalne skóry.</li>
	<li>Umieść mysz w czystej klatce umieszczonej na ciepłym talerzu (podgrzanym do 37 °C) i poczekaj, aż mysz wyzdrowieje po działaniu znieczulającym. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest utrzymanie temperatury ciała myszy, aby zwiększyć szansę na przeżycie po operacji.</li>
	<li>Po tygodniowym okresie rekonwalescencji myszy będą gotowe do dalszych eksperymentów, takich jak doustny test tolerancji glukozy (OGTT) i test tolerancji insuliny (ITT).</li>
</ol>
3. Doustny test tolerancji glukozy (OGTT)
UWAGA: Wykonaj doustny test tolerancji glukozy 7 dni po infuzji aCSF i MetCCL5/RANTES (10 ng/mL, 100 μL). Utrzymuj 6-godzinny post dla myszy przed OGTT z wystarczającym dopływem wody. Trzymaj zwierzęta na tym samym stole roboczym, na którym będą wykonywane eksperymenty, aby mogły zaaklimatyzować się do środowiska i zmniejszyć stres podczas zabiegu.
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu glukozy: Przed przeprowadzeniem eksperymentu należy przygotować roztwór glukozy, rozpuszczając 3,75 g glukozy w 15 ml destylowanegoH2O.</li>
	<li>Ustal harmonogram rejestrowania odczytów podczas procedury doświadczalnej (Tabela 1). 
	UWAGA: Ważne jest, aby ustalić harmonogram z odpowiednimi odstępami czasu między każdym badaniem krwi, aby umożliwić dokładne rejestrowanie podczas eksperymentu.</li>
	<li>Zważ każdą mysz po poście i oblicz odpowiednią ilość glukozy do wstrzyknięcia. Na przykład, jeśli mysz waży 30 g, ilość podawanego roztworu glukozy powinna wynosić 300 μl.</li>
	<li>Na stole warsztatowym przygotuj następujące instrumenty:
	<ol>
		<li>Glukometr (naciśnij przycisk start, aby sprawdzić stan baterii, upewnij się, że działa przed testem.)</li>
		<li>Chip glukozowy</li>
		<li>Strzykawka insulinowa (0,3 ml strzykawki insulinowej)</li>
		<li>Żyletki</li>
		<li>minutnik</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po ustawieniu ławki zmierz i zapisz poziom glukozy we krwi w następujący sposób: Włóż czysty i nowy chip glukozowy do glukometru i naciśnij przycisk start, aby go wyzerować.</li>
	<li>Podnieś mysz za kark i pogłaszcz ogon kilka razy, aby zapewnić wystarczający przepływ krwi do okolicy ogona.</li>
	<li>Za pomocą nowej żyletki odetnij mały kawałek ogona i wyciśnij jedną małą kroplę krwi (około 10-20 μl) do chipa glukozowego. Krew powinna wypełnić chip, aby umożliwić dokładny pomiar. Glukometr natychmiast wyświetli poziom glukozy. Jeśli urządzenie pokazuje "błąd", powtórz procedurę z nowym chipem glukozowym. 
	UWAGA: Chip glukozowy wymaga tylko jednej kropli krwi. Gdy próbka krwi musi zostać pobrana więcej niż raz, po prostu należy wycisnąć, kilkakrotnie przesuwając palcami wzdłuż ogona myszy, trzymając koniec ogona bezpośrednio na chipie, aby pobrać krew. Nie jest konieczne obcinanie końca ogona za każdym razem podczas pobierania próbek krwi.</li>
	<li>Następnie nakarm myszy glukozą (0,25 g / ml) doustnie, stosując technikę gajnika żołądkowego. Ilość glukozy, która ma być podawana, powinna być obliczana za pomocą wzoru: 10X masa ciała (m.c.) μl roztworu glukozy (na przykład, jeśli mysz waży 30 g, ilość roztworu glukozy do podania wyniesie 300 μL). Uruchom minutnik natychmiast po podaniu doustnie glukozy.</li>
	<li>Powtórz procedurę pomiaru glukozy po 15, 30, 60, 90 i 120 minutach.</li>
	<li>Po zarejestrowaniu wszystkich odczytów poziomu glukozy wyrzuć żyletki i wiórki glukozy do pojemnika na zagrożenie biologiczne. Włóż jedzenie z powrotem do klatek dla myszy i załóż je z powrotem do pokoju dla zwierząt.</li>
</ol>
4. Test tolerancji insuliny (ITT)
UWAGA: Test tolerancji insuliny i doustny test tolerancji glukozy powinny być zaplanowane w odstępie co najmniej 7 dni, aby zmniejszyć efekt postu u zwierząt. W teście tolerancji insuliny (ITT) insulina ludzka (0,75 j./kg) będzie podawana we wstrzyknięciu IP.
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu insuliny 0,25 j.: Rozcieńczyć insulinę ludzką 100 j. w stosunku 1:400 w roztworze soli fizjologicznej.</li>
	<li>Zważ każdą mysz po poście i odpowiednio oblicz wstrzykniętą ilość insuliny: objętość (μL) 0,25 U insuliny do wstrzyknięcia IP = 3 X BW (0,75 U insuliny/kg masy ciała). Na przykład: dla myszy o masie ciała 28,8 g wstrzyknąć: 28,8 X 3 = 86,4 μl (0,25 j. rozcieńczonej insuliny) (Tabela 2). 
	UWAGA: Te same zwierzęta mogą mieć różną masę ciała po 6 godzinach postu w różne dni. W związku z tym konieczne jest zmierzenie masy ciała tuż przed i po poście oraz przeprowadzenie testu OGTT i ITT. Masa ciała myszy może spaść w zależności od gatunku, płci i czasu trwania postu. Wyższe dawki insuliny mogą spowodować wstrząs insulinowy i doprowadzić do śmierci zwierzęcia.</li>
	<li>Ustawić tabelę (Tabela 2) do zapisywania odczytów podczas procedury doświadczalnej. Powtórz kroki 3.4. zgodnie z pkt 3.8. do pomiaru poziomu glukozy we krwi.</li>
</ol>

<ol><li>Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines%2Fintercrines+and+central+regulation+of+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chemokines/intercrines and central regulation of feeding.</a> Am J Physiol. 266, R1711-R1715 (1994).</li>
<li>Milanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+hypothalamic+inflammation+reverses+diet-induced+insulin+resistance+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver.</a> Diabetes. 61, 1455-1462 (2012).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+hypothalamic+inflammation+associated+with+the+susceptibility+to+obesity+in+rats+exposed+to+high-fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+diabetes+research%22%5BJournal%5D)">Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet.</a> Experimental diabetes research. 2012, 847246(2012).</li>
<li>Benomar, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+and+leptin+induce+Glut4+plasma+membrane+translocation+and+glucose+uptake+in+a+human+neuronal+cell+line+by+a+phosphatidylinositol+3-kinase-+dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Insulin and leptin induce Glut4 plasma membrane translocation and glucose uptake in a human neuronal cell line by a phosphatidylinositol 3-kinase- dependent mechanism.</a> Endocrinology. 147, 2550-2556 (2006).</li>
<li>Gual, P., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulation+of+insulin+signaling+through+IRS-1+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulation of insulin signaling through IRS-1 phosphorylation.</a> Biochimie. 87, 99-109 (2005).</li>
<li>Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+due+to+phosphorylation+of+insulin+receptor+substrate-1+at+serine+302%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302.</a> The Journal of biological chemistry. 279, 35298-35305 (2004).</li>
<li>Boura-Halfon, S., Zick, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+IRS+proteins%2C+insulin+action%2C+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Endocrinology+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of IRS proteins, insulin action, and insulin resistance.</a> American journal of physiology. Endocrinology and metabolism. 296, E581-E591 (2009).</li>
<li>Chou, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL5%2FRANTES+contributes+to+hypothalamic+insulin+signaling+for+systemic+insulin+responsiveness+through+CCR5%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5.</a> Sci Rep. 6, 37659(2016).</li>
<li>Calegari, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+of+the+hypothalamus+leads+to+defective+pancreatic+islet+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inflammation of the hypothalamus leads to defective pancreatic islet function.</a> J Biol Chem. 286, 12870-12880 (2011).</li>
<li>Mighiu, P. I., Filippi, B. M., Lam, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+inflammation+to+the+brain-liver+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Linking inflammation to the brain-liver axis.</a> Diabetes. 61, 1350-1352 (2012).</li>
<li>Tavares, E., Minano, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANTES%3A+a+new+prostaglandin+dependent+endogenous+pyrogen+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">RANTES: a new prostaglandin dependent endogenous pyrogen in the rat.</a> Neuropharmacology. 39, 2505-2513 (2000).</li>
<li>Appay, V., Rowland-Jones, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANTES%3A+a+versatile+and+controversial+chemokine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">RANTES: a versatile and controversial chemokine.</a> Trends in immunology. 22, 83-87 (2001).</li>
<li>DeVos, S. L., Miller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+intraventricular+delivery+of+drugs+to+the+rodent+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system.</a> J Vis Exp. , e50326(2013).</li>
<li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Admission+blood+glucose+and+in-hospital+clinical+outcome+among+patients+with+acute+stroke+in+Inner+Mongolia%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Invest+Med%22%5BJournal%5D)">Admission blood glucose and in-hospital clinical outcome among patients with acute stroke in Inner Mongolia, China.</a> Clin Invest Med. 32, E151-E157 (2009).</li>
<li>Olsen, T. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19271949">Blood glucose in acute stroke.</a> Expert Rev Neurother. 9, 409-419 (2009).</li>
<li>De Jong, W. H., Borm, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+and+nanoparticles%3Aapplications+and+hazards%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Drug delivery and nanoparticles:applications and hazards.</a> Int J Nanomedicine. 3, 133-149 (2008).</li>
<li>Kitade, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR5+plays+a+critical+role+in+obesity-induced+adipose+tissue+inflammation+and+insulin+resistance+by+regulating+both+macrophage+recruitment+and+M1%2FM2+status%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status.</a> Diabetes. 61, 1680-1690 (2012).</li>
<li>Kennedy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CCR5+results+in+glucose+intolerance+in+diet-induced+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 305, E897-E906 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mechanizm przewlekłego stanu zapalnego i związanych z nim chemokin, takich jak CCL5 i jego receptor – CCR5, w rozwoju cukrzycy typu 2 pozostaje niejasny. Przewlekły stan zapalny powoduje infiltrację makrofagów do tkanki tłuszczowej i wpływa na regulację adipokin; w międzyczasie przyciąga również komórki β i upośledza wydzielanie insuliny z wysp Langerhansa w odpowiedzi na poziom glukozy we krwi. Podwzgórze w mózgu odgrywa ważną rolę jako centrum kontroli w koordynowaniu sygnałów insuliny i adipokiny z ogólnoustrojowych tkanek obwodowych w regulacji apetytu, metabolizmu glukozy we krwi obwodowej i odpowiedzi insulinowej. Wiele badań wskazuje również, że zapalenie podwzgórza prowadzi do wadliwej regulacji homeostazy energetycznej, a także wadliwej funkcji wysp trzustkowych i wątroby 2,3,9,10. CCL5 w mózgu przyczynia się do przyjmowania pokarmu i regulacji temperatury ciała w podwzgórzu11,12; jednak korelacja CCL5 z podwzgórzową i ogólnoustrojową sygnalizacją insuliny jest niejasna. Aby odpowiedzieć na to pytanie, wygenerowano mysz z nokautem całego ciała CCL5 (CCL5-/-), która pokazuje fenotyp insulinooporności z wyższym poziomem insuliny i wysokim poziomem glukozy we krwi8. Jednak rozwój fenotypu T2DM wymaga dużo czasu i trudno jest zbadać rolę i mechanizm CCL5 w podwzgórzu sygnał insuliny ze względu na możliwe długoterminowe efekty kompensacyjne. Dlatego najlepszym podejściem jest bezpośrednia manipulacja sygnalizacją CCL5 w neuronach podwzgórza. Istnieje jednak wiele typów neuronów w regionie podwzgórza, a generowanie myszy z nokautem specyficznych dla komórek jest dość kosztowne i czasochłonne. Wykorzystanie systemu infuzyjnego ICV może zatem zaoszczędzić czas i zapewnić bardziej szczegółowe podejście do manipulowania funkcją CCL5 bezpośrednio w mózgu, omijając możliwe obwodowe reakcje zapalne.
Badania z wykorzystaniem pomp osmotycznych zostały już wcześniej opublikowane, dostarczając doskonałych przykładów i demonstracji technik związanych z implantacją pomp osmotycznych u gryzoni13. Jednak podczas stosowania tych protokołów w naszym badaniu stanęliśmy przed kilkoma wyzwaniami. Po pierwsze, niektóre ze sprzętów użytych w protokole są dość drogie, w tym 1) system elektryczny do dotarcia na miejsce, wyciągnięcia i wszczepienia igły do mózgu myszy, 2) system termiczny do utrzymywania temperatury ciała myszy i 3) system dostarczania tlenu i izofluranu do podawania znieczulenia myszom. Po drugie, techniki opisane w innych artykułach były trudne do powtórzenia, ponieważ byliśmy w stanie wykorzystać do naszych badań tylko zwierzęta w niewielkim zakresie masy ciała i w określonym wieku. Zdajemy sobie sprawę, że większe myszy bardziej nadają się do zabiegu chirurgicznego i implantacji. Jednak w naszym badaniu musieliśmy użyć mniejszych i młodszych myszy, aby uniknąć wpływu nadwagi i starzenia się na insulinę i regulację poziomu glukozy we krwi: w badaniu wybrano tylko samce myszy o masie ciała 25 ± 2 g i wieku około 2 miesięcy. W związku z tym trudno jest wykonać operację i zszyć ranę na głowie myszy. Po trzecie, reakcja zapalna musi zostać zminimalizowana po operacji, ponieważ celem tego badania jest cytokina zapalna. Myszy i szczury mogą łatwo usuwać szwy i otwarte rany po operacji, co spowoduje stan zapalny i nasilenie reakcji chemokin. Dlatego konieczna jest strategia dotarcia do miejsca oraz narysowania i wszczepienia igły do mózgu myszy, która pozwoli uniknąć wtórnej infekcji. Dlatego zmodyfikowaliśmy wcześniej opisane protokoły, aby ta technika była opłacalna, łatwiejsza i mniej szkodliwa dla zwierząt, jak opisano w następnym akapicie.
Po pierwsze, użyliśmy wiertła do gwoździ, aby ręcznie wywiercić otwór wokół obszaru docelowego zaznaczonego na czaszce, jak opisano w kroku 2.6. Ta metoda jest opłacalna i pozwala nam monitorować całą procedurę, aby uniknąć uszkodzenia opon mózgowych i naczyń krwionośnych myszy. Regulacja poziomu glukozy we krwi jest upośledzona po ostrym udarze, takim jak krwotok do mózgu. Ostrą hiperglikemię i zespoły cukrzycopodobne obserwowano również po udarze mózgu w warunkach klinicznych14,15. Podobnie, stwierdziliśmy również upośledzony poziom glukozy i odpowiedź insulinową u myszy z krwotokiem i ropą w mózgu. Zdajemy sobie sprawę, że lepsza kontrola chirurgii manualnej jest niezbędna do zapewnienia spójności wyników. Po drugie, wykorzystaliśmy nowo opracowany biomateriał medyczny powszechnie stosowany w klinikach, klej tkankowy (Krok 2.8), do uszczelnienia skóry na głowie myszy po operacji, unikając w ten sposób szwów i przyspieszając tempo gojenia. Ułatwia to wykonywanie zabiegów chirurgicznych i zmniejsza ryzyko wtórnego stanu zapalnego. Po trzecie, czas potrzebny na wykonanie całego zabiegu chirurgicznego jest stosunkowo krótszy, co zwiększa szansę na przeżycie myszy i obniża dawkę leku znieczulającego wstrzykiwanego dootrzewnowo. Zaobserwowaliśmy wysoki wskaźnik przeżycia (95%) i uzyskaliśmy stosunkowo dokładne wyniki, postępując zgodnie z tym zmodyfikowanym protokołem.
Ograniczeniem tej techniki jest stosunkowo krótki czas dostarczania leku. Chociaż pompa osmotyczna może być umieszczona w ciele myszy alternatywnie bez ponownego otwierania mózgu, nasze badanie koncentruje się tylko na zapalnym wpływie chemokiny na mózg w celu regulacji obwodowej ogólnoustrojowej sygnalizacji insuliny. Dodatkowa operacja w tkankach obwodowych mogłaby wywołać reakcję zapalną w tkankach obwodowych, co z kolei zwiększyłoby ekspresję chemokiny zapalnej i wpłynęłoby na wyniki. Po drugie, okres półtrwania leku ogranicza również czas trwania badania. Rekombinowane białka, takie jak chemokina, mają zwykle krótszy okres półtrwania, który z czasem traci swoją aktywność, choć pozwala nam to również badać efekt blokowania sygnalizacji CCL5 w mózgu w krótkim okresie. Nasze wcześniejsze badania opisywały również podejście do modyfikacji genetycznej w celu wygenerowania myszy z nokautem CCL5, które zapewnia model o długoterminowych skutkach8.
Istnieje kilka nowych technik i alternatywnych metod dostarczania leków do mózgu. Nanotechnologia to potężna technika, która może być wykorzystywana do dostarczania leków do ośrodkowego układu nerwowego. Jednak wiele leków jest termoczułych i może zostać zniszczonych podczas próby pakowania ich w nanocząstki16. Ponadto nanocząstki mogą przechodzić przez barierę krew-mózg i być wychwytywane przez komórki, które są odpowiednie dla siRNA lub większości popularnych leków, ale nie jest to idealna metoda wiązania liganda z receptorem. CCL5 wymaga wiązania się ze swoim receptorem, CCR5, w neuronach ARC podwzgórza, aby zadziałało8, a dostarczenie antagonisty CCL5 MetCCL5 do neuronów przez nanocząstki może spowodować utratę zdolności do wiązania i blokowania CCR5 na powierzchni komórki.
Poziom glukozy we krwi był znacznie wyższy u myszy, którym podawano antagonistę CCL5 MetCCL5 w porównaniu z grupą kontrolną (myszy, którym podawano aCSF) w doustnym teście tolerancji glukozy. Dodatkowe podawanie insuliny (test tolerancji insuliny) również nie było w stanie obniżyć poziomu glukozy we krwi u myszy otrzymujących MetCCL5 (Figura 4B), co sugeruje, że zarówno endogenna, jak i zewnętrzna insulina nie mogą obniżyć poziomu glukozy we krwi podczas blokowania sygnalizacji CCL5 w podwzgórzu. Myszy stały się oporne na insulinę bez aktywności CCL5 w podwzgórzu. Zwiększoną fosforylację seryny302 IRS-1 stwierdzono u myszy otrzymujących Met-CCL5 w porównaniu z myszami kontrolnymi otrzymującymi aCSF (Figura 5A-B). Wykazano, że fosforylacja IRS-1 seryny 302 indukuje fizyczną dysocjację IRS-1 od receptora insuliny, co jest główną przyczyną insulinooporności6; insulina nie jest w stanie aktywować dalszych sygnałów, takich jak szlak PI3K-Akt. Badanie ex vivo stymulacji insuliną potwierdziło, że cząsteczka sygnałowa insuliny Akt (p-AktS473) nie była aktywowana przez insulinę w tkance podwzgórza myszy z podsłuchem Met-CCL5, a zamiast tego fosforylacja seryny 302 wzrosła. Podsumowując, zarówno dane fizjologiczne (OGTT i ITT), jak i badania molekularne pokazują, że sygnalizacja CCL5 w podwzgórzu pośredniczy w regulacji sygnału insuliny w podwzgórzu, co przyczynia się do systematycznej insulinooporności i metabolizmu glukozy.
Rola i mechanizm CCL5 i CCR5 w cukrzycy związanej z otyłością pozostaje niejasny. Kitade i in. stwierdzili, że niedobór CCR5 chronił myszy przed stanem zapalnym wywołanym otyłością, rekrutacją makrofagów i insulinoopornością17. Jednak inne badania przeprowadzone przez Kennedy'ego i wsp. wykazały przeciwne wyniki wskazujące, że niedobór CCR5 upośledza ogólnoustrojową tolerancję glukozy, a także sygnalizację insuliny adipocytów i mięśni18. W obu badaniach zastosowano dietę wysokotłuszczową w celu wywołania otyłości, która prowadzi do przewlekłego stanu zapalnego całego organizmu i odpowiedzi kompensacyjnej. Badania te nie dostarczyły jasnych i jasnych mechanizmów CCL5 i CCR5 w regulacji sygnalizacji insuliny. Z drugiej strony, technika pompy osmotycznej pozwala na infuzję specyficzną dla mózgu i pozwala uniknąć reakcji kompensacyjnej przy ograniczonym w czasie dostarczaniu.
Podsumowując, chociaż pompa osmotyczna z systemem infuzyjnym mózgu wydaje się być "staromodną" techniką, zapewnia tańszą, łatwiejszą i mniej szkodliwą metodę dostarczania leków i pomaga badać funkcję sygnalizacji receptora ligandowego w mózgu.

Insulina wpływa na wiele różnych tkanek, w tym na mózg. Insulina przechodzi przez barierę krew-mózg, dostaje się do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i wiąże się z receptorem insuliny (IR) w podwzgórzu, aby regulować przyjmowanie pokarmu, aktywność współczulną i obwodową odpowiedź na insulinę. Zaproponowano, że przewlekły stan zapalny w obwodowych tkankach tłuszczowych przyczynia się do cukrzycy typu 2 (T2DM), ale sposób, w jaki te reakcje zapalne wpływają na sygnały insuliny w podwzgórzu, pośrednicząc w ogólnoustrojowej odpowiedzi na insulinę i nietolerancji glukozy, pozostaje niejasny. Niektóre chemokiny uczestniczą w regulacji apetytu i regulacji temperatury ciała w podwzgórzu1, takie jak czynnik martwicy nowotworu alfa (TNFα), interleukina (IL)-6, IL-1β, białko chemoatraktantu monocytów-1 (MCP-1) i CCL5 (ligand motywu C-C 5). Ponadto stan zapalny w podwzgórzu prowadzi do insulinooporności w T2DM2,3.
Wśród tych chemokin, zmiana poziomów ekspresji chemokiny CCL5 i jej receptora, CCR5, w tkance tłuszczowej była związana z miażdżycą i nietolerancją glukozy w cukrzycy typu 2 zarówno u ludzi, jak i u zwierząt. CCL5 pełni również funkcje neuroendokrynne, w tym regulację spożycia pokarmu i temperatury ciała w podwzgórzu. Dlatego ważne jest zbadanie, czy CCL5 uczestniczy w aktywacji sygnału insuliny w podwzgórzu lub tkankach obwodowych.
Sygnalizacja insuliny jest ściśle regulowana w komórkach. Wiązanie insuliny z receptorami insuliny (IR) aktywuje białka substratu receptora insuliny (IRS), a następnie kinazę 3-fosfatydyloinozytolu (PI3K) i aktywację kinazy białkowej B (PKB/AKT) oraz translokację błonową transportera glukozy-4 (GLUT4)4. Białka IRS są kluczowymi regulatorami w tym szlaku sygnałowym: mają wiele reszt tyrozyny i seryny, które mogą być fosforylowane w odpowiedzi na pozytywne lub negatywne sygnały insuliny5. Na przykład fosforylacja seryny 302 na IRS-1 może prowadzić do fizycznej dysocjacji IRS-1 od IR i blokować transdukcję sygnału insuliny, prowadząc do insulinooporności6. Wykazano, że upośledzenie aktywności białek IRS w podwzgórzu indukuje insulinooporność i nietolerancję glukozy u myszy7.
Jednym z powszechnych sposobów badania funkcji określonego genu jest manipulowanie ekspresją docelowych genów rozmieszczonych w całym ciele organizmu. Może to jednak mieć kilka wad: 1) może generować różne efekty regulacyjne lub kompensacyjne sprzężenia zwrotnego w czasie oraz 2) ta metoda nie pomaga nam zilustrować roli białka docelowego w określonych regionach mózgu. Ponadto zwierzęta z nokautem genów specyficznych dla tkanek i komórek potrzebują dużo czasu na rozmnażanie i są kosztowne. W związku z tym stosujemy system krótkotrwałej pompy osmotycznej do infuzji mózgu - stosunkowo szybki i wygodny sposób na zakłócenie sygnalizacji białka docelowego w mózgu za pomocą leku antagonistycznego w celu przezwyciężenia wyżej wymienionych problemów. Zastrzyki stereotaktyczne wymagały skomplikowanych umiejętności chirurgicznych i rozległych inwestycji w oprzyrządowanie i czas. W tym protokole zapewniamy prosty i bezpieczny sposób wykonania wstrzyknięcia stereotaktycznego oraz szybką, mniej szkodliwą i natychmiastową metodę wykrywania stężenia glukozy we krwi i badania roli CCL5 w regulacji sygnalizacji insuliny w podwzgórzu.

<table><tbody><tr><td>Klej tkankowy Vetbond</td><td>3M</td><td>#1049SB</td><td>Klej używany do uszczelniania miejsca zmiany chorobowej na głowie myszy</td></tr><tr><td>Klej błyskawiczny LOCTITE 454</td><td>Durect Corporation</td><td>#8670</td><td>Klej używany do mocowania igły na czaszce myszy</td></tr><tr><td>Alzet Micro-Osmotic</td><td>Pump Durect Corporation</td><td>#9922</td><td>0.11 &mu; l na godzinę, 28 dni</td></tr><tr><td>System infuzyjny mózgu</td><td>Durect Corporation</td><td>#8851</td><td>1-3 mm, używany do perfuzji leku do mózgu myszy</td></tr><tr><td>Glukometr</td><td>Roche</td><td>#06870244001</td><td>Służy do pomiaru poziomu glukozy we krwi</td></tr><tr><td>Chip glukozy</td><td>Roche</td> <td># 06454011020</td><td>Służy do ładowania próbki krwi</td></tr><tr><td>Niebieska</td><td>Sigma</td> Evana<td>#MKBK0523V</td><td>Aby zademonstrować wlew leku obszar</td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>#3232145 C</td><td>Służy do dootrzewnowego</td></tr><tr><td>podawania insuliny MIO NE116 JEDNOSTKA KONTROLNA (wiertło do paznokci)</td><td>Mio System</td><td>#E235-015</td><td>Do wiercenia otworu w czaszce myszy</td></tr><tr><td>CCL5/Met-RANTES Białko</td><td>R& D</td><td>#ADB0111081</td><td>Rekombinowany ludzki CCL5, E-coli pochodzący</td></tr><tr><td>z wzoru aCSF</td><td>119 mM NaCl 26,2 mM NaHCO3 2,5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1,3 mM MgCl2 10 mM glukozy</td><td></td><td>Filtr sterylizować za pomocą 0,22 &m; m aparat filtrujący i przechowywać w temperaturze 4& stopni C. aCSF jest stabilny przez 3-4 tygodnie</td></tr><tr><td>Phospho-IRS-1 Przeciwciało Serine302</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td> <td># 12879</td><td>1:1000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>IRS-1 (D23G12)</td><td>przeciwciało Sygnalizacja komórkowa</td> <td># 12879</td><td>1:1000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Phospho-Akt Serine 473</td><td>przeciwciało Sygnalizacja komórkowa</td> <td># 9916</td><td>1:2000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Akt (pan) (C67E7) przeciwciało</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>#9916</td><td>1:1000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Zwierzęta: C57BL/6</td><td>NAR Labs</td><td></td><td>Szczep myszy typu dzikiego użyty w badaniu</td></tr></tbody></table>

badanie sygnału insuliny podwzgórzowej do obwodowej nietolerancji glukozy za pomocą systemu ciągłego wlewu leków do mózgu myszy

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Insulina reguluje systematyczny metabolizm w podwzgórzu i obwodową odpowiedź na insulinę. Reakcja zapalna w obwodowych tkankach tłuszczowych przyczynia się do rozwoju cukrzycy typu 2 (T2DM) i regulacji apetytu w podwzgórzu. Sugeruje się, że poziomy chemokiny CCL5 i receptora chemokiny C-C typu 5 (CCR5) pośredniczą w miażdżycy i nietolerancji glukozy w cukrzycy typu 2 (T2DM). Ponadto CCL5 odgrywa rolę neuroendokrynną w podwzgórzu, regulując przyjmowanie pokarmu i temperaturę ciała, co skłania nas do zbadania jego funkcji w sygnalizacji insuliny podwzgórzowej i regulacji obwodowego metabolizmu glukozy.
System infuzji mózgu z mikropompą osmotyczną to szybki i precyzyjny sposób na manipulowanie funkcją CCL5 i badanie jej wpływu na mózg. Zapewnia również wygodne alternatywne podejście do generowania transgenicznego zwierzęcia nokautującego. W tym systemie sygnalizacja CCL5 została zablokowana przez infuzję śródmózgowo-komorową (ICV) jego antagonisty, MetCCL5, za pomocą pompy mikroosmotycznej. Obwodowy metabolizm glukozy i odpowiedź na insulinę wykryto za pomocą doustnego testu tolerancji glukozy (OGTT) i testu tolerancji insuliny (ITT). Aktywność sygnalizacyjną insuliny analizowano następnie za pomocą blot białkowego z próbek tkanek pochodzących od zwierząt.
Po 7-14 dniach infuzji MetCCL5, metabolizm glukozy i reakcja na insulinę były upośledzone u myszy, co widać w wynikach OGTT i ITT. Fosforylacja seryny302 IRS-1 była zwiększona, a aktywność Akt została zmniejszona w neuronach podwzgórza myszy po zahamowaniu CCL5. Podsumowując, nasze dane sugerują, że blokowanie CCL5 w mózgu myszy zwiększa fosforylację IRS-1 S302 i przerywa sygnalizację insuliny w podwzgórzu, prowadząc do zmniejszenia funkcji insuliny w tkankach obwodowych, a także upośledzenia metabolizmu glukozy.

U myszy przeprowadzono chirurgiczne implantacje pomp do infuzji osmotycznej zawierających albo aCSF jako kontrolę, albo antagonistę CCL5 MetCCL5 (w celu zablokowania efektów CCL5 w mózgu). W 7. i 14. dobie po operacji przeanalizowano obwodową tolerancję glukozy oraz odpowiedź na insulinę u myszy, stosując test OGTT (po 7 dniach) i ITT (po 14 dniach), zgodnie z opisanym protokołem. Doustny test tolerancji glukozy (OGTT) oraz test tolerancji insuliny (ITT) przeprowadzono u myszy po 6-godzinnym poście. Myszy podano doustnie glukozę w ilości dostosowanej do ich masy ciała. Zapisano zmiany poziomu glukozy we krwi, jak przedstawiono na Rysunku 3. Test wrażliwości na insulinę wykonano poprzez podanie myszom insuliny drogą dosytrynialną (IP), a następnie niezwłocznie zmierzono zmianę poziomu glukozy we krwi. Zapisano zmiany poziomu glukozy we krwi po stymulacji insuliną u myszy otrzymujących różne leki w infuzji, co przedstawiono na Rysunku 4. W grupie myszy z infuzją antagonisty CCL5 (MetCCL5) poziom glukozy we krwi obniżył się tylko nieznacznie po podaniu glukozy (Rysunek 3B) oraz po iniekcji insuliny (Rysunek 4B>) w porównaniu z myszami z infuzją aCSF. Wyniki te sugerują upośledzenie funkcji insuliny w obwodowym metabolizmie glukozy u myszy, którym podano MetCCL5 do mózgu.
Następnie przeanalizowano aktywację sygnału insulinowego poprzez ocenę poziomów fosforylacji IRS-1 oraz aktywacji Akt w tkankach podwzgórza. Fosforylacja seryny 302 w białku IRS-1 była zwiększona u myszy traktowanych antagonistą (MetCCL5) (Rysunek 5B-C) przy normalnym żywieniu myszy. W grupie kontrolnej do podwzgórza myszy podano aCSF, a próba insulinowa aktywowała Akt (fosforylowana seryna 473 Akt), będącą cząsteczką sygnałową w dalszej części szlaku (Rysunek 5D, F), bez zwiększania aktywacji seryny 302 w IRS-1 (Rysunek 5D-E) oraz fosforylacji seryny 473 w Akt. W przeciwieństwie do tego, sygnał Akt nie wzrósł u myszy, którym podano MetCCL5>, natomiast odnotowano wzrost fosforylacji seryny 302 białka IRS-1. Jednocześnie zablokowanie sygnału CCL5 w mózgu myszy przerwało aktywność insuliny w podwzgórzu i upośledziło obwodową funkcję insuliny. Na podstawie ogólnych wyników, takich jak rezultaty ITT, OGTT oraz próby insulinowej ex vivo, wyciągnięto wniosek, że CCL5 w podwzgórzu przyczynia się do aktywacji sygnału insulinowego i obwodowego metabolizmu glukozy po stymulacji insuliną.
<img alt="Procedura eksperymentu na zwierzętach z konfiguracją chirurgiczną, obserwacją stanu zapalnego oraz rekonwalescencją pooperacyjną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przygotowanie pompy osmotycznej i procedura chirurgiczna implantacji u myszy. (AZestaw do infuzji do mózgu i pompa przygotowana poprzez przepłukanie roztworem leku. Czerwone strzałki wskazują rurki cewników wypełnione cieczą.B) Unieruchom i zamocuj głowę myszy w aparacie stereotaktycznym. (C) Oddzielić zewnętrzną warstwę skóry od tkanki podskórnej w celu implantacji zestawu do infuzji do mózgu z mikropompą osmotyczną; linie przerywane wskazują miejsce implantacji pompy osmotycznej. (DStrzałka wskazuje stronę infuzji.E) Wywierć otwór wokół zaznaczonego obszaru na czaszce. (F) Umieść zestaw do infuzji do mózgu z pompą osmotyczną w tylnej części ciała myszy, a następnie wprowadź igłę do infuzji do mózgu w wywiercony otwór (zakreślona kreska). (G) Przymocuj igłę do czaszki za pomocą kleju tkankowego i odetnij górną część igły (nożyczki wskazane w G), jak pokazano w (H). (I) Zamknij ranę, używając kleju tkankowego. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Disekcja mózgu; uwidocznienie komór za pomocą barwnika, analiza porównawcza, wynik eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2. Reprezentatywne obrazy obszaru dyfuzji leku podczas podawania leku do obszaru komór za pomocą pompy osmotycznej. Błękit Evansa jest reprezentatywnym lekiem wykorzystanym w ilustracji infuzji leku do obszaru komór za pomocą pompy osmotycznej (A) oraz dyfuzji do komór bocznych i trzeciej komory mózgu (B). Pasek skali = 0,5 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Poziomy glukozy w czasie; Wykres liniowy; aCSF vs. McCL5; Wyniki eksperymentalne; n=8 próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Metabolizm glukozy u myszy po operacji, zmierzony za pomocą doustnego testu tolerancji glukozy (OGTT). Rozkład poziomów glukozy we krwi uległ zmianie po doustnym podaniu glukozy myszom WT, którym podano aCSF (A) oraz antagonista, MCCL5 (B). Dane przedstawiono jako średnia ± SE. (Rysunek zmodyfikowany z8). *p&lt;0,05, przy użyciu dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig3large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykresy poziomu glukozy; aCSF vs. MCCL5; przebieg czasowy w ciągu 120 min; analiza odpowiedzi cukrzycowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Funkcja insuliny w glikemii u myszy – test tolerancji insuliny (ITT). Rozkład poziomów glukozy we krwi uległ zmianie po wstrzyknięciu insuliny u myszy WT, którym podano aCSF (A), a następnie podano w infuzji antagonistę, MCCL5 (B). Dane przedstawiono jako średnia ± SE (rys. zmodyfikowano z8). ***p&lt;0,01, przy użyciu dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza Western blot oraz wykresy słupkowe przedstawiające fosforylację IRS-1 i Akt w badaniu nad CCL5 w warunkach braku postu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Aktywność sygnałowa insuliny u myszy po operacji. (A) Western blotting hamującej formy fosforylacji seryny 302 białka IRS-1 (podłoże odpowiedzi insulinowej-1, pIRS1)S302) w tkankach podwzgórza myszy traktowanych aCSF lub antagonistą CCL5, MetCCL5 (Mpompa infuzyjna CCL5).B) Powiązane poziomy fosforylowanego IRS-1S302 po infuzji do podwzgórza myszy z normalnym żywieniem. (C) Western blotting fosforylacji IRS-1 w pozycji S302 oraz aktywacji Akt (fosfo-Akt S473, pAktS473) z lub bez stymulacji insuliną w tkance podwzgórza po podaniu aCSF lub METInfuzja CCL5.D-E) Poziomy względne pIRS-1S302, pS6KT421, oraz pAktS473(Liczba „2” na każdym wykresie słupkowym oznacza: n=2 dla wszystkich pomiarów ilościowych). (Puste słupki w 5D-E, po lewej: bez insuliny; słupki prążkowane w 5D-E, po prawej: z insuliną). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#</td>
			<td>Identyfikator myszy</td>
			<td>Kluczowe zagadnienia</td>
			<td>Glukoza</td>
			<td>Start</td>
			<td>0</td>
			<td>15</td>
			<td>30</td>
			<td>60</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>masa</td>
			<td>μL =10xBW</td>
			<td>czas</td>
			<td>min</td>
			<td>min</td>
			<td>min</td>
			<td>min</td>
			<td>min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>501</td>
			<td>25,8 g</td>
			<td>258</td>
			<td>9:00</td>
			<td>9:00</td>
			<td>9:00</td>
			<td>9:15</td>
			<td>9:30</td>
			<td>10:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>502</td>
			<td>25,3 g</td>
			<td>253</td>
			<td>9:07</td>
			<td>9:07</td>
			<td>9:07</td>
			<td>9:22</td>
			<td>9:37</td>
			<td>10:07</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Harmonogram pomiarów podczas doustnego testu tolerancji glukozy (OGTT)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#</td>
			<td>Identyfikator myszy</td>
			<td>Ciało</td>
			<td>Insulina 0,25 IU</td>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.</td>
			<td>0</td>
			<td>15</td>
			<td>30</td>
			<td>60</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>masa</td>
			<td>μL =3xBW</td>
			<td>czas</td>
			<td>min</td>
			<td>min</td>
			<td>min</td>
			<td>min</td>
			<td>min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>501</td>
			<td>28,8 g</td>
			<td>86.4</td>
			<td>9:00</td>
			<td>9:00</td>
			<td>9:15</td>
			<td>9:30</td>
			<td>10:00</td>
			<td>10:30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>502</td>
			<td>25,3 g</td>
			<td>75.9</td>
			<td>9:07</td>
			<td>9:07</td>
			<td>9:22</td>
			<td>9:37</td>
			<td>10:07</td>
			<td>10:37</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Harmonogram pomiarów podczas testu tolerancji insuliny (ITT)

Ten protokół bada rolę ligandu 5 (CCL5) chemokiny (motyw C-C) w podwzgórzu, dostarczając antagonistę, MetCCL5, do mózgu myszy za pomocą systemu infuzji mózgu za pomocą mikro-pompy osmotycznej. To przejściowe zahamowanie aktywności CCL5 przerwało sygnalizację insuliny w podwzgórzu, prowadząc do nietolerancji glukozy i obwodowej ogólnoustrojowej wrażliwości na insulinę.

Badanie sygnału insuliny podwzgórzowej do obwodowej nietolerancji glukozy za pomocą systemu ciągłego wlewu leków do mózgu myszy

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zbadanie roli sygnalizacji C-C-L-5 w działaniu insuliny w układzie obwodowym i metabolizmie glukozy poprzez manipulowanie sygnalizacją C-C-L-5 poprzez podawanie antagonisty Met-C-C-L-5 przez międzymózgowy system dostarczania komorowego, pompę mikroosmotyczną. Lek ten może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie fizjologii biochemicznej, takie jak chemokina C-C-L-5 w kontrolowaniu metabolizmu glukozy w organizmie i reakcji na insulinę w mózgu. Główną zaletą tego środka jest to, że eksperymentator może łatwo manipulować pewnymi sygnałami w mózgu przez pewien okres czasu, takimi jak C-C-L-5 tutaj, bez efektu kompensacyjnego lub rozwoju zaburzenia, co zwykle ma miejsce, gdy dokonujemy manipulacji genetycznej u gryzoni.Wizualna demonstracja tej procedury jest ważna, ponieważ wprowadzenie pompy mikroosmotycznej i dokładny pomiar poziomu insuliny i glukozy we krwi wymaga umiejętności i precyzji. Na dzień przed zabiegiem należy przygotować mikro-osmotyczne pompy mózgowe za pomocą jednomililitrowej strzykawki i igły z główką, aby napełnić pompy sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym lub A-C-S-F. Następnie zanurz pompę w A-C-S-F i umieść ją na wytrząsarce, aby delikatnie wstrząsnąć przez noc.Następnego dnia wyjąć A-C-S-F z pompy i napełnić ją całkowicie wcześniej przygotowanym roztworem leku rozcieńczonym w A-C-S-F, aż do wycieku nadmiaru. Następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych przyciąć rurki cewnika do pożądanej długości. Za pomocą igły do infuzji mózgu przymocuj rurki do zestawu do infuzji mózgu.Następnie napełnić probówki w zestawie infuzyjnym roztworem leku. Po zmontowaniu zestawu należy przymocować go do pompy mikroosmotycznej. Na koniec, aby zapobiec wysychaniu pompy, zanurz ustawienie infuzji mózgu pompy osmotycznej w A-C-S-F w wysterylizowanej probówce o pojemności 50 mililitrów.Aby rozpocząć operację, zamontuj i przymocuj głowę znieczulonej myszy do aparatu stereotaktycznego. Za pomocą nożyczek chirurgicznych i szczypiec rozetnij zewnętrzną skórę pokrywającą czaszkę. Następnie użyj jodu do oczyszczenia obwodowej czaszki.Następnie użyj nożyczek z główką w pobliżu okolicy szyi, aby oddzielić najbardziej zewnętrzną warstwę skóry od skóry podskórnej w celu implantacji zestawu do fuzji mózgu z pompą osmotyczną. Za pomocą aparatu stereotaktycznego oznaczyć punkt infuzji w odniesieniu do mapy mózgu. Użyj wiertła do paznokci, aby wywiercić otwór wokół obszaru zaznaczonego na czaszce, uważając, aby nie złamać opon mózgowych i naczyń krwionośnych myszy.Następnie umieść zestaw do fuzji mózgu z pompą mikroosmotyczną zawierający interesujący lek lub A-C-S-F jako kontrolę, pod skórą za obszarem szyi. Aby wstrzyknąć lek do mózgu, należy włożyć igłę do infuzji mózgu do wywierconego otworu. Użyj żelu odczulającego powierzchnię, aby przymocować igłę do czaszki i poczekaj, aż klej wyschnie.Odetnij wystającą część na górze igły. Przed rozpoczęciem testu tolerancji glukozy przygotuj roztwór glukozy, rozpuszczając 3,75 grama glukozy i 15 mililitrów wody destylowanej. Ustal harmonogram z odpowiednimi odstępami czasu między każdym badaniem krwi, aby rejestrować odczyty podczas eksperymentu.Następnie zważ każdą mysz po poszczeniu, aby obliczyć odpowiednią ilość glukozy do wstrzyknięcia. Następnie na stole warsztatowym przygotuj minutnik, chip glukozowy, glukometr, strzykawkę insulinową i żyletki. Aby zmierzyć poziom glukozy we krwi, najpierw włóż nowy chip glukozowy do glukometru i naciśnij przycisk start, aby ustawić zero.Następnie podnieś mysz z tyłu szyi i pogłaszcz jej ogon, aby zapewnić wystarczający przepływ krwi. Użyj nowej żyletki, aby odciąć mały kawałek ogona, a następnie wyciśnij kroplę krwi do chipa glukozowego. Korzystając z techniki płukania żołądka, nakarm mysz glukozą i natychmiast uruchom stoper.Zmierz poziom glukozy w różnych punktach czasowych. Aby rozpocząć test tolerancji insuliny, należy przygotować 0,25 jednostki roztworu insuliny ludzkiej. Następnie zważ każdą mysz po poszczeniu, aby obliczyć odpowiednią ilość insuliny do wstrzyknięcia.Następnie ustal harmonogram, aby rejestrować odczyty podczas eksperymentu. Na koniec, po wstrzyknięciu insuliny, zmierz poziom glukozy we krwi, tak jak poprzednio. Metabolizm glukozy mierzono za pomocą doustnego testu tolerancji glukozy po operacji, po doustnym podaniu glukozy myszom.Zmiany poziomu glukozy we krwi u myszy, którym podawano A-C-S-F lub podawano antagonistę C-C-L-5, są rejestrowane i pokazywane tutaj. Przeprowadzono również test wrażliwości na insulinę, a poziom glukozy we krwi u myszy, którym podawano antagonistę C-C-L-5, był tylko nieznacznie zmniejszony w porównaniu z myszami kontrolnymi, co sugeruje upośledzenie funkcji insuliny w obwodowym metabolizmie glukozy u myszy leczonych C-C-L-5. Aby przeanalizować aktywację sygnału insuliny, w podwzgórzu oceniono białko substratu receptora insuliny lub fosforylację I-R-S-1.U myszy leczonych antagonistą C-C-L-5, gdy były karmione normalnie, fosforylacja I-R-S-1 była regulowana w górę w porównaniu z grupą kontrolną. W celu dalszej analizy aktywacji sygnału insuliny oceniono również poziomy fosforylowanej seryny 4-7-3 Akt, cząsteczki sygnałowej insuliny. Następnie sygnał prowokacji insuliną AKT był zwiększony u myszy z grupy kontrolnej leczonych A-C-S-F, ale nie u myszy leczonych antagonistą C-C-L-5.Po opanowaniu wprowadzania pompy mikroosmotycznej zajmie to tylko pół godziny, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że głowa myszy jest lekko uniesiona, a kręgosłup znajduje się prosto na aparacie stereotaktycznym. Technika ta zapewnia badaczowi sposób w endokrynologii na zbadanie wpływu leku, chemokiny lub funkcji białka w mózgu gryzonia.Po tej procedurze można wykonać dodatkowe środki, takie jak manipulowanie ekspresją genów za pomocą domózgowego dostarczania wirusa lub crisper 9, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób C-C-L-5 i receptor C-C-L-5 uczestniczą w trawieniu i metabolizmie pokarmu?

studying-hypothalamic-insulin-signal-to-peripheral-glucose

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Clamp hiperinsulinemiczno-euglikemiczny, lub clamp insulinowy, jest złotym standardem w ocenie działania insuliny in vivo. Opisano metodę przeprowadzania clampów insulinowych u myszy. Obejmuje ona metodę cewnikowania tętniczego, która pozwala na wykonywanie eksperymentów na świadomych, nieskrępowanych myszach przy minimalnym stresie.

Zaciski hiperinsulinemiczno-euglikemiczne u świadomych, nieunieruchomionych myszy

Modulacja zależnej od hipokampa przestrzennej pamięci roboczej poprzez bezpośrednią mikroiniekcję wewnątrzhipokampalną, połączoną z następującą po niej mikrodializą in vivo w celu oznaczania metabolitów u świadomych, aktywnych behawioralnie zwierząt.

Mikroiniekcja insuliny do hipokampa i mikrodializa in vivo podczas testów pamięci przestrzennej

Ten film pokazuje, jak przeprowadzić doustny test tolerancji glukozy na myszy laboratoryjnej.

Doustny test tolerancji glukozy (OGTT): pomiar metabolizmu glukozy u myszy

W tym filmie demonstrujemy montaż systemu infuzji mózgu za pomocą mikropompy osmotycznej, a następnie jego chirurgiczną implantację w czaszce myszy. System ten umożliwia ciągłe dostarczanie potencjalnych leków i ułatwia badanie ich wpływu na mózg i tkankę mózgową.

System ciągłego wlewu leków w modelu mysim: zabieg chirurgiczny polegający na wszczepieniu systemu infuzyjnego pompy mikroosmotycznej w mózg myszy w celu ciągłego dostarczania leków

Ten film pokazuje wpływ ciągłego wlewu leku do mózgu myszy na poziom glukozy we krwi. Metabolizm glukozy ocenia się poprzez pobranie krwi z ogona myszy na czczo i pomiar poziomu glukozy przed i po doustnym podaniu glukozy. Tolerancję insuliny ocenia się poprzez wstrzyknięcie insuliny myszy, przy czym poziom glukozy jest rejestrowany w określonych odstępach czasu.

Ocena wpływu ciągłego wlewu leku do mózgu myszy na obwodowy poziom glukozy

Ten protokół opisuje technikę obserwacji w czasie rzeczywistym transportu białka GLUT4 (Glucose Transporter 4) w czasie rzeczywistym po stymulacji insuliną oraz charakterystykę biologicznej roli CCR5 w szlaku sygnałowym insuliny-GLUT4 za pomocą mikroskopii dekonwolucyjnej.

Obrazy na żywo transportu białka GLUT4 w pierwotnych neuronach podwzgórza myszy przy użyciu mikroskopii dekonwolucyjnej

Obecny artykuł opisuje generację i charakterystykę metaboliczną myszy karmionych dietą wysokotłuszczową jako model insulinooporności i otyłości wywołanej dietą. Ponadto zawiera szczegółowe protokoły do wykonywania doustnego testu tolerancji glukozy i testu tolerancji insuliny, monitorując zmiany metabolizmu glukozy w całym organizmie in vivo.

Badanie metabolizmu glukozy in vivo u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową przy użyciu doustnego testu tolerancji glukozy (OGTT) i testu tolerancji insuliny (ITT)

Tutaj opisujemy prostą metodę wszczepienia myszom komercyjnego ciągłego monitora glikemii przeznaczonego dla pacjentów i dostarczamy skrypty do analizy wyników.

Proste, ciągłe monitorowanie glikemii u swobodnie poruszających się myszy

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół zwiększania stężenia glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) myszy. Takie podejście może być przydatne do badania wpływu wysokiego poziomu glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym na neurodegenerację, funkcje poznawcze i obwodowy metabolizm glukozy u myszy.

Implantacja minipompy osmotycznej w celu zwiększenia stężenia glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym myszy

Zacisk hiperglikemiczny służy do pomiaru uwalniania insuliny przy utrzymującym się wyższym stężeniu glukozy we krwi. Zacisk hipoglikemiczny służy do pomiaru produkcji glukozy indukowanej reakcjami przeciwregulacyjnymi. Obie metody wykorzystują tę samą procedurę chirurgiczną. W tym miejscu przedstawiamy technikę zaciskową do oceny ogólnoustrojowego metabolizmu glukozy.

Zacisk hiperglikemiczny i zacisk hipoglikemiczny u świadomych myszy

W tym miejscu podajemy szczegółowe informacje na temat stymulowanego glukozą wydzielania insuliny (GSIS) poprzez perfuzję przez naczynia krwionośne myszy z nienaruszoną trzustką jako dodatkową technikę oceny funkcji endokrynnej trzustki z redukcją możliwych czynników zakłócających.

Stymulowane glukozą wydzielanie insuliny poprzez perfuzję przez naczynia krwionośne myszy z nienaruszoną trzustką

Poznaj metodę ciągłego wlewu do mózgu myszy w celu badania roli CCL5 w sygnalizacji insuliny i metabolizmie glukozy. Technika ta pozwala precyzyjnie manipulować szlakami sygnałowymi w podwzgórzu.

Badanie sygnału insuliny podwzgórzowej do obwodowej nietolerancji glukozy za pomocą systemu ciągłego wlewu leków do mózgu myszy

Przeglądaj więcej filmów