Name: Ocena odpowiedzi Dictyostelium discoideum na ostrą stymulację mechaniczną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Poznaj metodę oceny odpowiedzi komórkowych na ostrą stymulację mechaniczną w Dictyostelium discoideum. Technika mikroskopowa pozwala badać lokalizację biosensorów i aktywację białek w odpowiedzi na przepływ ścinający.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant National Institutes of Health R35 GM118177 dla PND.

<ol><li>Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+chemotaxis%3A+a+network+of+signaling+pathways+controls+motility%2C+directional+sensing%2C+and+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity.</a> Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).</li>
<li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K%2C+cell+polarity%2C+and+directional+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).</li>
<li>Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).</li>
<li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+Protein+Signaling+Events+Are+Activated+at+the+Leading+Edge+of+Chemotactic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells.</a> Cell. 95 (1), 81-91 (1998).</li>
<li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Regulation+of+3-Phosphoinositides+by+PI+3-Kinase+and+PTEN+Mediates+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis.</a> Cell. 109 (5), 611-623 (2002).</li>
<li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Suppressor+PTEN+Mediates+Sensing+of+Chemoattractant+Gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients.</a> Cell. 109 (5), 599-610 (2002).</li>
<li>Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RasC+is+required+for+optimal+activation+of+adenylyl+cyclase+and+Akt%2FPKB+during+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation.</a> EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).</li>
<li>Kamimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP3-Independent+Activation+of+TorC2+and+PKB+at+the+Cell%27s+Leading+Edge+Mediates+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis.</a> Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).</li>
<li>Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C+Regulation+of+Phosphatidylinositol+3%2C4%2C5-trisphosphate-mediated+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).</li>
<li>Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+excitable+signal+integrator+couples+to+an+idling+cytoskeletal+oscillator+to+drive+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration.</a> Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).</li>
<li>Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitable+Signal+Transduction+Induces+Both+Spontaneous+and+Directional+Cell+Asymmetries+in+the+Phosphatidylinositol+Lipid+Signaling+System+for+Eukaryotic+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis.</a> Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).</li>
<li>Gerisch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobile+Actin+Clusters+and+Traveling+Waves+in+Cells+Recovering+from+Actin+Depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization.</a> Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).</li>
<li>Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+state+transitions+determine+pattern+in+the+Phosphatidylinositide-Actin+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system.</a> BMC Cell Biol. 12 (1), 42(2011).</li>
<li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Three-Dimensional+Dynamics+of+Actin+Waves%2C+a+Model+of+Cytoskeletal+Self-Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization.</a> Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).</li>
<li>Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Actin-Based+Wave+Generator+Organizes+Cell+Motility%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility.</a> PLOS Biol. 5 (9), e221(2007).</li>
<li>Devreotes, P., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+Networks+that+Regulate+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling Networks that Regulate Cell Migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).</li>
<li>Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+towards+a+paradigm%3A+common+mechanisms+of+chemotactic+signaling+in+Dictyostelium+and+mammalian+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).</li>
<li>Dalous, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+cell+polarity+and+actin-myosin+cytoskeleton+reorganization+under+mechanical+and+chemical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation.</a> Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).</li>
<li>Sato, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+direction+in+electric-signal-induced+cell+migration+by+cyclic+guanosine+monophosphate+and+phosphatidylinositol+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).</li>
<li>Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipids%2C+EGF+receptors%2C+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+j%22%5BJournal%5D)">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).</li>
<li>Decave, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+flow-induced+motility+of+Dictyostelium+discoideum+cells+on+solid+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate.</a> J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).</li>
<li>Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+mechanical+stimuli+act+on+common+signal+transduction+and+cytoskeletal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).</li>
<li>Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+development+and+chemotaxis+in+Dictyostelium+discoideum+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants.</a> Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).</li>
<li>Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Dictyostelium+discoideum+with+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).</li>
<li>Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24535823">PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis.</a> J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).</li>
<li>Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3381519/">Analysis of chemotaxis in Dictyostelium.</a> Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Brenner, M., Thoms, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+blocks+activation+of+cyclic+AMP+synthesis+in+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum.</a> Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).</li>
<li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Actin+Patterns+and+Arp2%2F3+Assembly+at+the+Substrate-Attached+Surface+of+Motile+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells.</a> Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).</li>
<li>Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+protein+Callipygian+defines+the+back+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).</li>
<li>Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Akt%2FPKB-related+kinase+is+essential+for+morphogenesis+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium.</a> Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).</li>
<li>Westendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+of+chemotactic+amoebae+operates+close+to+the+onset+of+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisane tutaj metody oferują wygodny sposób oceny zarówno zachowania populacji, jak i poszczególnych komórek w odpowiedzi na przepływ ścinający. Co ważne, podczas gdy poprzednie badania analizowały lokalizację znaczników krawędzi natarcia i opóźnień podczas migracji, obecne podejście pozwala na badanie natychmiastowych efektów poprzez ostre zastosowanie przepływu ścinającego. Korzystając z tej metody, wykazaliśmy, że w rzeczywistości początkowa reakcja komórek na przepływ ścinający nie wymaga migracji komórek. Zamiast te...

Migracja komórek eukariotycznych jest sterowana przez różne chemiczne i fizyczne sygnały w środowisku, w tym gradienty rozpuszczalnych lub związanych z substratem chemoatraktantów, zmienną sztywność substratów, pola elektryczne lub przepływ ścinający. Chociaż poczyniono wiele postępów w naszym zrozumieniu mechanizmów molekularnych napędzających chemotaksję, mniej wiadomo o innych typach ukierunkowanej migracji i o tym, jak te różnorodne sygnały są integrowane na poziomie komórkowym w celu wytworzenia jednolitej odpowiedzi migracyjnej.
Ukierunkowana migracja w kierunku rosnącego stężenia chemoatraktantu obejmuje trzy komponenty behawioralne: ruchliwość, kierunkowe wykrywanie i polaryzację1. Ruchliwość odnosi się do losowego ruchu komórek osiągniętego przez wysunięcie pseudopodów. Wykrywanie kierunkowe to zdolność komórki do wykrywania źródła chemoatraktantu, który może wystąpić nawet w unieruchomionych komórkach. Polaryzacja odnosi się do bardziej stabilnego asymetrycznego rozkładu składników wewnątrzkomórkowych między krawędzią natarcia i opóźnienia komórki, co prowadzi do zwiększonej trwałości w ruchu.
Odpowiedź komórkowa na chemoatraktant zależy od aktywności czterech koncepcyjnie zdefiniowanych sieci regulacyjnych: receptora/białka G, transdukcji sygnału, cytoszkieletu aktynowego i polarności1. Wiązanie chemoatraktantu z receptorem sprzężonym z białkiem G przekazuje sygnał za pośrednictwem heterotrimerycznych białek G α i βγ do dalszej sieci transdukcji sygnału, która wzmacnia sygnał kierunkowy. Wiele szlaków w sieci transdukcji sygnału działa równolegle i zasila sieć cytoszkieletu aktynowego w celu odchylenia polimeryzacji aktyny, a w konsekwencji wypukłości pseudopodów w kierunku gradientu. Do ważnych regulatorów chemotaksji należą GTPaza Ras, TorC2, kinaza 3-fosfoinozytolu (PI3K), homolog fosfatazy i tensyny (PTEN) oraz cyklaza guanylowa. Mechanizmy sprzężenia zwrotnego w sieci transdukcji sygnału oraz między transdukcją sygnału a sieciami cytoszkieletu aktynowego dodatkowo wzmacniają odpowiedź. Wreszcie, słabo zdefiniowana sieć polaryzacji otrzymuje dane wejściowe z cytoszkieletu aktynowego i dalej odchyla sieć transdukcji sygnału, aby promować trwałą migrację w kierunku gradientu.
Wiele z naszego mechanistycznego zrozumienia chemotaksji stało się możliwe dzięki rozwojowi fluorescencyjnie znakowanych biosensorów dla różnych komponentów sieci regulacyjnych. Wiele regulatorów chemotaksji ma asymetryczny rozkład albo samej cząsteczki regulatorowej, albo jej aktywności. Na przykład bioczujniki, które rozpoznają aktywowane wersje małych GTPaz Ras i Rap1 – domen wiążących Ras odpowiednio Raf1 (określanych tutaj jako RBD) i RalGDS – lokalizują się do krawędzi natarcia komórki chemotaksyjnej2,3. Podobnie, PI3K i jego produkt fosfatydyloinozytol (3,4,5)-trifosforan (PIP3), rozpoznawane przez domenę homologii pleckstrin (PH), również wykazują lokalizację z przodu komórki4,5. W przeciwieństwie do tego, 3-fosfataza PTEN, która przekształca PIP3 z powrotem w fosfatydyloinozytol (4,5)-bisfosforan, lokalizuje się na opóźnionej krawędzi komórki6. Co ważne, te biosensory zmieniają swoją lokalizację w odpowiedzi na globalną stymulację chemoatraktantem. Markery krawędzi natarcia, które są cytozolowe lub znajdują się na końcach wypukłości w komórce spoczynkowej, przemieszczają się do kory, podczas gdy markery krawędzi opóźnionej, które mają lokalizację korową i są nieobecne na końcach wypukłości w komórce spoczynkowej, stają się cytozolowe po stymulacji. Analiza rozkładu biosensorów w odpowiedzi na globalną stymulację chemoatraktantem minimalizuje wpływ ruchliwości i polaryzacji, które często zakłócają obserwacje. Globalna lub jednolita stymulacja zawiesiny komórkowej za pomocą chemoatraktantu jest również wykorzystywana jako narzędzie do oceny zmian w aktywacji białek w całej populacji, często wykrywanych przez fosforylację białek7,8,9. Ten test biochemiczny służy przede wszystkim do uzyskiwania informacji czasowych, podczas gdy mikroskopia służy do zbierania zarówno czasowych, jak i przestrzennych informacji o zachowaniu różnych składników sieci regulacyjnych.
Sieć transdukcji sygnału posiada cechy systemu o wysokiej pobudliwości10,11. Reakcje na ponadprogowe bodźce chemotaktyczne są "wszystko albo nic" i wykazują okresy refrakcji. Odpowiedzi są również wyzwalane stochastycznie i mogą wykazywać zachowanie oscylacyjne. Zdarzenia transdukcji sygnału są zlokalizowane w regionach kory mózgowej, które rozchodzą się jako fale12,13,14,15. Przednie lub tylne markery są rekrutowane do stref aktywnych rozchodzących się fal lub od nich dysocjują. Ze względu na obszar ogniotrwały ciągnący się za strefą aktywną, fale skierowane w przeciwnym kierunku anihilują, gdy się spotykają. Rozchodzące się fale transdukcji sygnału leżą u podstaw wypukłości komórkowych, które pośredniczą w migracji komórek10.
Wiele z wyżej wymienionych informacji na temat chemotaksji pochodzi z badań nad amebą społeczną Dictyostelium discoideum, chociaż podobne mechanizmy regulacyjne mają również zastosowanie do neutrofili i innych typów komórek ssaków16. Dictyostelium jest dobrze ugruntowanym organizmem modelowym, który ma silną odpowiedź chemotaktyczną podczas głodu, kiedy tysiące pojedynczych komórek migrują w kierunku centrum agregacji, ostatecznie tworząc wielokomórkowy owocnik zawierający zarodniki. Chemotaksja jest również niezbędna na etapie wzrostu pojedynczej komórki tego organizmu do lokalizowania bakteryjnych źródeł pożywienia. Co ważne, migracja pojedynczych komórek Dictyostelium jest niezwykle podobna do migracji neutrofili ssaków lub przerzutowych komórek nowotworowych, z których wszystkie przechodzą bardzo szybką migrację typu ameboidalnego. W rzeczywistości zarówno ogólna topologia sieci regulacyjnych, jak i wiele indywidualnych szlaków transdukcji sygnału zaangażowanych w chemotaksję są zachowane między Dictyostelium a leukocytami ssaków17. Ponadto inne komórki, takie jak fibroblasty, wykorzystują receptorowe kinazy tyrozynowe (RTK) zamiast GPCR; jednak RTK mogą zasilać podobne sieci.
W przeciwieństwie do chemotaksji, brakuje dokładnego zrozumienia mechanizmów sygnalizacyjnych, które napędzają różne inne tryby ukierunkowanej migracji. Podobnie jak w przypadku komórek migrujących w gradiencie chemoatraktantu, kilka badań wykazało aktywację i/lub lokalizację typowych markerów krawędzi natarcia, w tym polimeryzacji aktyny, PIP3 i/lub kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) 1/2, na czele komórek poddawanych ukierunkowanej migracji w odpowiedzi na przepływ ścinający lub zmiany pól elektrycznych18,19,20,21. Jednak w tych badaniach ciągła ekspozycja na bodziec powodowała również migrację komórek, pozostawiając otwarte pytanie, czy na przykład markery krawędzi natarcia lokalizują się specyficznie w odpowiedzi na bodziec, czy też po prostu lokalizują się na krawędzi natarcia z powodu zwiększonej liczby pseudopodów z przodu migrującej komórki.
Opracowaliśmy testy, które pozwalają nam obserwować reakcję komórek na ostre zakłócenia mechaniczne dostarczane jako przepływ ścinający, zarówno na poziomie populacji, jak i jako pojedyncze komórki22. Podobnie jak w przypadku globalnej stymulacji chemoatraktantem, ostra stymulacja przepływem ścinającym umożliwia badanie odpowiedzi komórkowej na bodziec mechaniczny bez zakłócającego wpływu ruchliwości lub polaryzacji. Połączenie tych testów biochemicznych i mikroskopowych z perturbacjami genetycznymi lub farmakologicznymi pozwala nam dowiedzieć się, w jaki sposób bodźce mechaniczne są odbierane i przekazywane. Co więcej, podejście to zapewnia również nowatorską metodę łączenia się z systemem za receptorem chemoatraktantu w przypadku braku chemoatraktantu, izolując w ten sposób transdukcję sygnału i sieci cytoszkieletu aktynowego od sieci receptor/białko G.
Korzystając z technik opisanych poniżej, wykazaliśmy niedawno, że ostre naprężenie ścinające prowadzi do aktywacji wielu składników chemotaktycznej transdukcji sygnału i sieci cytoszkieletu aktynowego22. Stosując ostry bodziec mechaniczny w różnych odstępach czasu, wykazaliśmy, że podobnie jak w przypadku chemoatraktantów, odpowiedź na bodźce mechaniczne również wykazuje cechy układu pobudliwego, w tym zachowanie odpowiedzi w warunkach nasycenia typu "wszystko albo nic" w warunkach nasycenia i obecność okresu refrakcji. Wreszcie, łącząc stymulację mechaniczną i chemiczną, wykazaliśmy, że te dwa bodźce mają wspólną transdukcję sygnału i sieci cytoszkieletów aktynowych, co prawdopodobnie pozwala na integrację wielu bodźców w celu odchylenia migracji komórek.

<table><tbody><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td></td><td>Fisher D16-1</td><td>Służy do przygotowania pożywek HL-5 i płytek SM (kroki 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Pepton proteozy</td><td>Fisher</td><td>DF0120-17-6</td><td>Służy do przygotowania pożywki HL-5 (krok 1.1)</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Fisher</td><td>50-550-445</td><td>Służy do przygotowania pożywek HL-5 i płytek SM (kroki 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 7H2O</td><td>Fisher</td><td>S373-500</td><td>Służy do przygotowania pożywki HL-5 i 10X buforu fosforanowego (kroki 1.1, 1.3)</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P386-500</td><td>Służy do przygotowania pożywki HL-5, płytek SM i buforu fosforanowego 10X (kroki 1.1-1.3)</td></tr><tr><td>Streptomycyna (siarczan dihydrostreptomycyny)</td><td>Fisher</td><td>ICN10040525</td><td>Użyj do przygotowania pożywki HL-5 (krok 1.1)</td></tr><tr><td>Pepton (Bacto)</td><td>Fisher</td><td>DF0118-17-0</td><td>Służy do przygotowania płytek SM (krok 1.2)</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>P288-100</td><td>Służy do przygotowania płytek SM (krok 1.2)</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td>Służy do przygotowania płytek SM (krok 1.2)</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td>Służy do przygotowania buforu DB (krok 1.4)</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Użyj do przygotowania buforu DB (krok 1.4)</td></tr><tr><td></td><td>Kofeina Fisher</td><td>O1728-500</td><td>Użyj do przygotowania kofeiny (krok 1.5)</td></tr><tr><td>cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenozyna 3 stopy, 5 stóp-cykliczny monofosforan, sól sodowa)</td><td>Fisher</td><td>11-680-1100MG</td><td>Użyj do przygotowania cAMP (krok 1.6)</td></tr><tr><td>Kwas foliowy</td><td>Sigma</td><td>F7876</td><td>Użyj do przygotowania folic kwas (krok 1.7)</td></tr><tr><td>Baza tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td>Służy do przygotowania 3X buforu próbki (krok 1.8)</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166-500</td><td>Służy do przygotowania 3X buforu próbki (krok 1.8)</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td>Służy do przygotowania 3X buforu próbki (krok 1.8)</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610610</td><td>Służy do przygotowania 3X buforu próbki (krok 1.8)</td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Bio-Rad</td><td>1610404</td><td>Służy do przygotowania 3X buforu próbki (krok 1.8)</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher</td><td>S299-100</td><td>Służy do przygotowania buforu próbki z inhibitorami proteazy i fosfatazy (etap 1.8)</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Fisher</td><td>50-994-911</td><td>Służy do przygotowania buforu próbki z inhibitorami proteazy i fosfatazy (krok 1.8)</td></tr><tr><td>Dekahydrat pirofosforanu sodu</td><td>Fisher</td><td>S390-500</td><td>Służy do przygotowania buforu próbki z inhibitorami proteazy i fosfatazy (krok 1.8)</td></tr><tr><td>Kompletny koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA (Roche)</td><td>Sigma</td><td>11873580001</td><td>Służy do przygotowania buforu próbki z inhibitorami proteazy i fosfatazy (krok 1.8)</td></tr><tr><td>Latrunkulina A</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T119-0100</td><td>Służy do przygotowania latrunkuliny A (krok 1.9)</td></tr><tr><td>4-15% Tris-HCl żel poliakrylamidowy</td><td>Bio-Rad</td><td>3450029</td><td>Zastosowanie do immunoblottingu (krok 3.3)</td></tr><tr><td>Membrana z polifluorku winylidenu</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td>Zastosowanie do immunoblottingu (krok 3.3)</td></tr><tr><td>Fosfo-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Przeciwciało królicze</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>2060</td><td>Przeciwciało pierwotne do stosowania w immunoblottingu (krok 3.3)</td></tr><tr><td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) ( D13.14.4E) Przeciwciało XP</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>4370</td><td>Przeciwciało pierwotne do stosowania w immunoblottingu (krok 3.3)</td></tr><tr><td>Królicze IgG HRP połączone z całym Ab (od osła)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>Przeciwciało drugorzędowe do stosowania w immunoblottingu (krok 3.3)</td></tr><tr><td>Ulepszony substrat chemiluminescencyjny (substrat Clarity Western ECL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td>Zastosowanie do immunoblottingu (krok 3.3)</td></tr><tr><td>Bufor do usuwania pasów (Restore Plus Western blot striping buffer)</td><td>Pierce</td><td>PI46430</td><td>Użyj do immunoblottingu (krok 3.3)</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue</td><td>Fisher</td><td>PI20278</td><td>Użyj do immunoblottingu (krok 3.3)</td></tr><tr><td>Szczep K. aerogenes (niepatogenny)</td><td>Dicty Stock Center (dictybase.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Materiały i wyposażenie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna (model G-33 lub porównywalna alternatywa)</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Służy do hodowli komórek K. aerogenes (krok 2.1.1) oraz do bazalacji i stymulacji komórek D. discoideum (krok 3). Promień bezwładności tej wytrząsarki wynosi 9,5 mm.</td></tr><tr><td>10 cm szalka Petriego</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>Użyj do przygotowania płytek SM (krok 1.2)</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Fisher</td><td>02-671-51B</td><td>Służy do liczenia komórek D. discoideum (krok 2.1.2)</td></tr><tr><td>Szalka 35 mm (naczynie do hodowli tkankowych Corning Falcon Easy-Grip)</td><td>Fisher</td><td>08-772A</td><td>Służy do płytki D. discoideumkomórki do stymulacji mechanicznej, a następnie lizy komórek (krok 3.1.1)</td></tr><tr><td>Kubek polistyrenowy (5 ml)</td><td>VWR</td><td>13915-985</td><td>Służy do stymulacji zawiesiny komórek D. discoideum za pomocą chemoatraktantu (krok 3.2.2)</td></tr><tr><td>Jednostka fluidyczna z pompą (ibidi Pump System)</td><td>Ibidi</td><td>10902</td><td>Służy do dostarczania mechanicznej stymulacji do komórek D. discoideum w kanale (kroki 4.1, 4.2 i 5)</td></tr><tr><td>Szkiełko z kanałem (&mu;-Slide III 3w1 ibiTreat: #1.5 polimerowe szkiełko nakrywkowe, poddane działaniu kultur tkankowych, sterylizowane)</td><td>Ibidi</td><td>80316</td><td>Służy do płytki D. discoideum komórek do stymulacji mechanicznej dostarczanej przez urządzenie fluidyczne (kroki 4.1, 4.2 i 5)</td></tr><tr><td>Zbiorniki 50 ml (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit)</td><td>Ibidi</td><td>10978</td><td>Służy do ustawiania urządzenia fluidycznego do dostarczania stymulacji mechanicznej do komórek D. discoideum w kanale (kroki 4.1, 4.2 i 5)</td></tr><tr><td>Linie dla jednostki płynowej (zestaw perfuzyjny ŻÓŁTY i ZIELONY)</td><td>Ibidi</td><td>10964</td><td>Służy do ustawiania urządzenia fluidycznego do dostarczania stymulacji mechanicznej do komórek D. discoideum w kanale (kroki 4.1, 4.2 i 5). Uwaga: obie żyłki można również wyciąć z rurki 1,6 mm (numer katalogowy 10842).</td></tr><tr><td>Przewód do odpływu (rurka o średnicy wewnętrznej 1,6 mm)</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td>Służy do ustawiania urządzenia fluidycznego do dostarczania stymulacji mechanicznej do komórek D. discoideum w kanale (kroki 4.1, 4.2 i 5).</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Zeiss Observer.Z1 wyposażony w obiektyw olejowy 40X/1,3 i obiektyw powietrzny 20X/0,3 (lub porównywalną alternatywę)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Służy do obrazowania komórek D. discoideum z kontrastem fazowym lub oświetleniem fluorescencyjnym (kroki 4 i 5)</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem UltraView wyposażony w 40&times;/1.25&ndash; Obiektyw olejowy 0,75 (lub porównywalna alternatywa)</td><td>Perkin-Elmer</td><td>DM 16000</td><td>Alternatywa stosowana do obrazowania komórek D. discoideum (krok 4.1.4)</td></tr><tr><td>Mikroiniektor FemtoJet (Eppendorf; model 5247 lub porównywalna alternatywa) z Eppendorf InjectMan</td><td>Eppendorf</td><td>5252000021D i 5192000027</td><td>Służy do mechanicznej stymulacji komórek D. discoideum za pomocą mikropipety (krok 4.3). Uwaga: numery katalogowe dotyczą najnowszej wersji urządzenia (4i).</td></tr><tr><td>Mikropipeta (Femtotip; 1 &mu; m średnica zewnętrzna, 0,5 &mu; m średnica wewnętrzna )</td><td>Eppendorf</td><td>930000035</td><td>Służy do dostarczania mechanicznej stymulacji do komórek D. discoideum za pomocą mikropipety (krok 4.3)</td></tr><tr><td>Końcówki do mikroładowarek (Eppendorf Femtotips Końcówki do mikrowstrzykiwaczy Femtojet)</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>Służy do napełniania mikropipety (femtotip) buforem (krok 4.3.1)</td></tr><tr><td>Komora 1-dołkowa (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)</td><td>Fisher</td><td>12-565-472</td><td>Służy do powlekania ogniwami D. discoideum do stymulacji mechanicznej dostarczanej za pomocą mikropipety (krok 4.3.2)</td></tr><tr><td>Komora 8-dołkowa (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Komorowa szklana osłona)</td><td>Fisher</td><td>12-565-338</td><td>Służy do powlekania ogniw D. discoideum do stymulacji mechanicznej dostarczanej przez masowe dodawanie buforu (krok 4.4.1)</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</strong</td><td>>Komentarze</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Analysis Software (Fidżi)</td><td>NIH</td><td>https://fiji.sc/</td> <td>Użyj do ilościowego określenia odpowiedzi na stymulację mechaniczną (krok 4.5)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy migracji (Tracking Tool PRO)</td><td>Gradientech</td><td>http://gradientech.se/tracking-tool-pro/</td> <td>Służy do ilościowego określania szybkości i trwałości komórek (krok 5.4)</td></tr></tbody></table>

ocena odpowiedzi dictyostelium discoideum na ostrą stymulację mechaniczną

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaksja, czyli migracja w górę chemoatraktantu, jest najlepiej rozumianym sposobem migracji kierowanej. Badania z wykorzystaniem ameby społecznej Dictyostelium discoideum wykazały, że złożona sieć transdukcji sygnału równoległych szlaków wzmacnia odpowiedź na chemoatraktanty i prowadzi do tendencyjnej polimeryzacji aktyny i wysunięcia się pseudopoda w kierunku gradientu. Natomiast mechanizmy molekularne napędzające inne rodzaje migracji ukierunkowanej, na przykład spowodowane narażeniem na przepływ ścinający lub pola elektryczne, nie są znane. Wiele regulatorów chemotaksji wykazuje lokalizację na krawędzi natarcia lub opóźnienia migrującej komórki, a także wykazuje przejściowe zmiany w lokalizacji lub aktywacji po globalnej stymulacji chemoatraktantem. Aby zrozumieć mechanizmy molekularne innych typów migracji kierowanej, opracowaliśmy metodę, która pozwala na badanie odpowiedzi komórkowej na ostrą stymulację mechaniczną w oparciu o krótką (2 - 5 s) ekspozycję na przepływ ścinający. Stymulacja ta może być dostarczana w kanale podczas obrazowania komórek wyrażających fluorescencyjnie znakowane biosensory w celu zbadania zachowania poszczególnych komórek. Dodatkowo populacja komórek może być stymulowana na płytce, poddawana lizie i immunoblottowana za pomocą przeciwciał, które rozpoznają aktywne wersje interesujących ich białek. Łącząc oba testy, można zbadać szeroki wachlarz cząsteczek aktywowanych przez zmiany w lokalizacji subkomórkowej i/lub fosforylacji. Za pomocą tej metody ustaliliśmy, że ostra stymulacja mechaniczna wyzwala aktywację chemotaktycznej transdukcji sygnału i sieci cytoszkieletu aktynowego. Zdolność do badania reakcji komórkowych na ostrą stymulację mechaniczną jest ważna dla zrozumienia zdarzeń inicjujących niezbędnych do motoryki wywołanej przepływem ścinającym. Podejście to dostarcza również narzędzia do badania chemotaktycznej sieci transdukcji sygnału bez zakłócającego wpływu receptora chemoatraktantu.

Odpowiedź czasowa regulatorów chemotaksji na ostrą stymulację mechaniczną
Aby ocenić odpowiedź komórek D. discoideum na stymulację mechaniczną, przyległe komórki zdolne do agregacji poddano krótkiemu impulsowi przepływu ścinającego. Komórki D. discoideum zdolne do agregacji wydzielają cAMP, który może być wykrywany przez sąsiednie komórki. Aby wyeliminować wpływ sygnalizacji międzykomórkowej, komórki potraktowano ...

Tutaj opisujemy metody oceny odpowiedzi komórkowej na ostrą stymulację mechaniczną. W teście opartym na mikroskopii badamy lokalizację biosensorów znakowanych fluorescencyjnie po krótkiej stymulacji przepływem ścinającym. Badamy również biochemicznie aktywację różnych interesujących nas białek w odpowiedzi na ostrą stymulację mechaniczną.

Ocena odpowiedzi Dictyostelium discoideum na ostrą stymulację mechaniczną

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie aktywności różnych składników wewnątrzkomórkowej sieci transdukcji sygnału po krótkich zaburzeniach mechanicznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie migracji komórek, takie jak to, w jaki sposób komórki wyczuwają i kierunkowo migrują w kierunku różnych sygnałów środowiskowych, w tym bodźców mechanicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na zbadanie początkowej reakcji na bodziec mechaniczny bez mylącego wpływu ruchliwości lub polaryzacji na odpowiedź.Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy przetestowaliśmy odpowiedź komórek adherentnych na chemoatraktant, który był dostarczany z lekkim pobudzeniem i zauważyliśmy silną odpowiedź komórek stymulowanych kontrolą nośnika. Na początek przygotuj Klebsiella aerogenes, zaszczepiając niewielką liczbę komórek z zamrożonego bulionu do pożywki HL5 bez antybiotyków i inkubuj kulturę przez noc. Wzrost Dictyostelium w obecności bakterii Klebsiella aerogenes zmniejszy liczbę makropinosomów, co poprawi reakcję komórek na bodźce zewnętrzne.Zaplanuj eksperyment tak, aby gdy bakterie są gotowe, Dictyostelium rosło wykładniczo. Zbierz te komórki Dictyostelium i policz je za pomocą hemocytometru. Następnie rozprowadź 260 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej zawierającej 100 000 komórek Dictyostelium na płytce SM.Również do ubezpieczenia przygotuj płytki z dwukrotnie większą liczbą i o połowę mniejszą liczbą komórek Dictyostelium. Po jednym dniu wzrostu w temperaturze pokojowej odwróć płytkę i kontynuuj hodowlę płytki, aż komórki Dictyostelium zaczną oczyszczać trawnik bakteryjny, ale jeszcze nie zaczęły się agregować. Następnie dodaj pięć mililitrów buforu DB na płytkę i zeskrob Dictyostelium za pomocą szklanego rozsiewacza.Przenieś komórki i roztwór do 50-mililitrowej probówki polipropylenowej, a następnie przepłucz płytkę pięcioma dodatkowymi mililitrami DB i dodaj je do 50-mililitrowej probówki. W razie potrzeby czynność powtórzyć. Aby umyć Dictyostelium, napełnij probówkę do 50 mililitrów DB, osadź komórki, a następnie odessaj i wyrzuć supernatant.Kilkakrotnie przemywać komórki, aż supernatant będzie klarowny. Na koniec ponownie zawieś Dictyostelium w buforze DB do około pięciu milionów komórek na mililitr. Na początek ułóż dwa miliony kompetentnych w agregacji Dictyostelium na 35-milimetrowych szalkach z dwoma mililitrami DB. Przygotuj jedną płytkę na każdy punkt czasowy i niestymulowaną kontrolę.W temperaturze pokojowej pozwól komórkom przymocować się do płytki na 10 minut. Następnie zmyj nieprzyłączone komórki z płytki, używając dwóch płukań jednym mililitrem DB. Po oczyszczeniu płytek z nieprzyłączonego Dictyostelium, inkubować przyłączone komórki w buforze basolacyjnym przez 30 minut, nie naruszając płytek. Bardzo ważne jest, aby unikać jakiegokolwiek ruchu płytek podczas półgodzinnej inkubacji, aby zapobiec przedwczesnej stymulacji komórek.Teraz, aby zastosować kontrolowaną ilość stymulacji mechanicznej, indywidualnie przenieś płytkę do wytrząsarki orbitalnej i uruchom wytrząsarkę z prędkością 150 obr./min przez pięć sekund. Następnie, po upływie pożądanego czasu, odessać bufor i niezwłocznie umieścić płytkę na lodzie. Natychmiast dodaj 100 mikrolitrów buforu próbki z inhibitorami proteazy i fosfatazy i zeskrob komórki.Zbierz lizat do 1,5 mililitrowych probówek i natychmiast podgrzej je w 95 stopniach Celsjusza przez 10 minut. Kontynuuj analizę lizatu lub przenieś je do minus 20 stopni Celsjusza w celu przechowywania. Po wykonaniu zawiesin komórek kompetentnych wegetatywnie lub agregacyjnie załadować około 600 mikrolitrów do szkiełka komory mikroprzepływowej.Wloty muszą być całkowicie wypełnione, więc w razie potrzeby uzupełnij je buforem. Pozwól komórkom przyczepić się przez 10 minut. Podłącz linię wejściową urządzenia do pompy elektronicznej ze zbiornikiem o pojemności 15 mililitrów.Za pomocą oprogramowania sterującego pompą zamknij zawór, a następnie napełnij zbiornik DB. Teraz ustaw ciśnienie na 50 milibarów i włącz pompę. Napełnij i przepłucz linię za pomocą DB, klikając zawór, aby go otworzyć. Po płukaniu przez około 30 sekund należy przekręcić ciśnienie z powrotem do zera, a następnie zamknąć zawór.Następnie podłącz linię do jednego z trzech wlotów po jednej stronie zjeżdżalni. Nie zatrzymuj żadnych pęcherzyków powietrza, a po wykonaniu połączenia zakryj pozostałe dwa wloty po tej stronie zjeżdżalni. Teraz zakończ konfigurację, podłączając przewód od odpływu do pojedynczego wylotu po przeciwnej stronie zjeżdżalni.Następnie, pod jasnym polem lub oświetleniem fazowym pod mikroskopem fluorescencyjnym, view kanał za pomocą obiektywu pneumatycznego 20X i przepłucz kanał. Następnie ustaw ciśnienie na około 50 milibarów i otwórz zawór. Gdy ciecz wypłynie z odpływu, zmniejsz ciśnienie zewnętrzne do zera, odczekaj około 30 sekund i zamknij zawór.Następnie przełącz się na obiektyw olejowy 40X, skup się na najszerszej części kanału i przygotuj oprogramowanie do zbierania obrazów co trzy sekundy z oświetleniem RFP lub GFP. Przy zamkniętym zaworze ustaw ciśnienie na żądaną wartość. Następnie uzyskaj pięć obrazów przed stymulacją w trzysekundowych odstępach czasu.Następnie na krótko otwórz zawór, aby dostarczyć bodziec. Teraz zbierz co najmniej 15 dodatkowych klatek danych w ciągu 45 sekund. Określ ilościowo odpowiedź zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Najpierw załaduj szkiełko mikroprzepływowe za pomocą Dictyostelium, jak opisano w poprzednim rozdziale. Na potrzeby tego eksperymentu przygotuj dwie linie wejściowe. Aby zamknąć linie, należy użyć fizycznego zacisku na linii przenoszącej roztwór do uzdatniania i sterowanego programowo zaworu, aby zamknąć linię przenoszącą roztwór DB z pojazdem.Teraz napełnij dwie linie odpowiednim roztworem, samym buforem plus nośnikiem lub buforem z leczeniem, takim jak inhibitor. Po przepłukaniu przewodów należy podłączyć je do dwóch wlotów z boku zjeżdżalni z kanałem i zakryć niewykorzystany wlot. Następnie podłącz przewód odpływowy do wylotu po przeciwnej stronie.Teraz umyj zjeżdżalnię za pomocą bufora plus pojazdu, jak opisano wcześniej. Następnie wypełnij kanał zabiegiem. Najpierw zmniejsz przepływ do zera milibarów.Następnie przełącz zawory, przepływaj przez około 15 sekund i rozpocznij odmierzanie czasu inkubacji. Co około 10 minut przelej świeży roztwór uzdatniający przez komórki przez około 15 sekund, aby uzupełnić poziom tlenu w komorze. Komórki kompetentne do adherentnej agregacji poddano pięciosekundowemu przepływowi ścinającemu za pomocą wytrząsarki orbitalnej.Dictyostelium zostały wstępnie potraktowane kofeiną w celu zmniejszenia ich podstawowej aktywności. W rezultacie stwierdzono bardzo niską aktywność podstawową PKBR1 i ERK2 oraz silny wzrost fosforylacji kluczowych reszt tych kinaz wraz ze stymulacją. W komórkach kompetentnych do agregacji, wyrażających różne biosensory znakowane fluorescencyjnie, dwa wiodące markery, PHcrac i LimE, które są rekrutowane przez PIP3 lub nowo spolimeryzowaną aktynę, wykazały głównie cytozolową lokalizację w komórkach spoczynku.Po pięciu sekundach przepływu ścinającego te biosensory szybko przemieściły się do kory mózgowej i powróciły do cytozolu. Działanie leku depolimeryzującego aktynę Latrunkuliny A przetestowano przy użyciu podobnego eksperymentu z siłą ścinającą. W tym przypadku komórki wegetatywne najpierw poddano działaniu warunków kontrolnych, a następnie przełączono do buforu zawierającego pożądany czynnik testowy.Leczenie latrunkuliną A blokowało relokalizację markerów krawędzi natarcia do kory mózgowej. Co ciekawe, jeśli przepływ nie został odcięty po dwóch sekundach, ale pozostał włączony przez cały czas trwania eksperymentu, nadal obserwowano przejściową globalną odpowiedź. W wyniku globalnej odpowiedzi komórki wegetatywne migrowały pod prąd.Właściwe przygotowanie komórek jest niezwykle ważne dla powodzenia tych testów. Komórki wegetatywne muszą być hodowane w połączeniu z bakteriami, aby zapewnić ich reakcję na stymulację mechaniczną. W przypadku komórek kompetentnych do agregacji, komórki, które są słabo lub nadmiernie rozwinięte, mają tendencję do słabej reakcji.Podejścia biochemiczne i mikroskopowe wzajemnie się uzupełniają, co pozwoliło nam ocenić dużą liczbę produktów pośrednich transdukcji sygnału pod kątem ich reakcji na stymulację mechaniczną. Dodając do tego perturbacje farmakologiczne, a także genetyczne, możemy dowiedzieć się, w jaki sposób bodźce mechaniczne są odbierane i przekazywane. Jest to ważne dla zrozumienia ukierunkowanej migracji komórek, która jest kierowana przez bodźce fizyczne, takie jak przepływ ścinający.Ponieważ stymulacja mechaniczna wyzwala aktywację tej samej sieci transdukcji sygnału, co chemoatraktanty, możemy teraz badać integrację różnych bodźców w komórkach. Ostatecznie badania te pomogą nam zrozumieć, w jaki sposób migrujące komórki, takie jak nasze własne komórki odpornościowe i przerzutowe komórki rakowe, poruszają się po organizmie.

assessment-dictyostelium-discoideum-response-to-acute-mechanical

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zastosowanie elektrofizjologii w badaniach dostępnych synaps umożliwia ilościowe pomiary aktywności synaptycznej, co jest przydatne w analizie mutantów synaptycznych. Niniejszy artykuł opisuje metodę dysekcji służącą do odsłonięcia złączy neuromięśniowych (NMJ) u Caenorhabditis elegans (C. elegans) i krótko omawia możliwe zastosowania tak przygotowanego preparatu.

Disekcja i rejestracja z połączenia nerwowo-mięśniowego C. elegans

Celem niniejszej pracy jest przeszkolenie czytelnika w obsłudze zintegrowanego mikroskopu sił atomowych i obrazowania optycznego do stymulacji mechanicznej żywych komórek w hodowli. Przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku. Zaprezentowano reprezentatywny zestaw danych obrazujący odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.

Badanie odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i sił atomowych

Infekcja prostaty może być czynnikiem przyczyniającym się do pośredniczenia w bólu miednicy w przewlekłym zapaleniu gruczołu krokowego. Opisujemy procedurę przygotowania standaryzowanego inokulum bakteryjnego, wkraplania bakterii do cewki moczowej samców myszy oraz metodologii pomiaru allodynii dotykowej u myszy w czasie.

Pomiar dotykowej allodynii w mysim modelu bakteryjnego zapalenia gruczołu krokowego

Opisano protokół, który wykorzystuje anoksję/głód u C. elegans do modelowania niedokrwienia/reperfuzji. Wyniki funkcjonalne obejmują zwiększoną śmiertelność, widoczne nieprawidłowości w procesach neuronalnych znakowanych GFP oraz upośledzone reakcje behawioralne, które wymagają funkcji neuronalnej.

Model niedokrwienia/reperfuzji beztlenowej u C. elegans

Ten film demonstruje protokół przeprowadzania jednowłóknistych zapisów elektrofizjologicznych na preparacie in vitro mysiego nerwu jelita grubego.

Metody in vitro Charakterystyka funkcjonalna zakończeń aferentnych jelita grubego myszy

Użycie dostosowanego "chipa węchowego" do efektywnego obrazowania wapnia u samców C. elegans jest opisane tutaj. Pokazano również badania dotyczące narażenia mężczyzn na glicerol i feromon.

Wykorzystanie dostosowanego mikroprzepływowego chipa węchowego do obrazowania aktywności neuronalnej w odpowiedzi na feromony w męskich neuronach głowy C. elegans

Nieprawidłowa funkcja czuciowa leży u podstaw bólu trzewnego i innych objawów funkcjonalnych i zapalnych chorób jelit. Przedstawiono protokół elektrofizjologicznego zapisu nerwów doprowadzających okrężnicy w preparacie ex vivo jelita grubego szczura.

In vitro Charakterystyka właściwości elektrofizjologicznych włókien doprowadzających okrężnicy u szczurów

Nowe narzędzia do badań mechanobiologii są potrzebne, aby zrozumieć, jak stres mechaniczny aktywuje szlaki biochemiczne i wywołuje reakcje biologiczne. W tym artykule prezentujemy nową metodę selektywnej stymulacji mechanicznej unieruchomionych zwierząt za pomocą pułapki mikroprzepływowej, umożliwiającej obrazowanie odpowiedzi komórkowych w wysokiej rozdzielczości.

Wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego do stymulacji mechanicznej i obrazowania C. elegans w wysokiej rozdzielczości

Opracowaliśmy wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek. Test ten jest kompatybilny z cytometrią przepływową, barwieniem immunologicznym i mikroskopią sił trakcyjnych, umożliwiając ilościowe pomiary interakcji biomechanicznych między komórkami, ich macierzą zewnątrzkomórkową i bakteriami chorobotwórczymi.

Wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek

Siły mechaniczne są ważne dla kontrolowania migracji komórek. Protokół ten demonstruje użycie elastycznych hydrożeli, które można odkształcić za pomocą szklanej mikropipety i mikromanipulatora w celu stymulacji komórek za pomocą lokalnego gradientu sztywności w celu wywołania zmian w strukturze komórki i migracji.

Test durotaksji pojedynczej komórki do oceny mechanicznej kontroli ruchu komórkowego i powiązanych zdarzeń sygnalizacyjnych

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak przeprowadzić ulepszony test mechanicznej nocycepcji u larw Drosophila. Używamy tutaj testu, aby wykazać, że nadwrażliwość mechaniczna (allodynia i hiperalgezja) występuje u larw Drosophila.

Ulepszony test i narzędzia do pomiaru mechanicznej nocycepcji u larw Drosophila

Poznaj metodę oceny odpowiedzi komórkowych na ostrą stymulację mechaniczną w Dictyostelium discoideum. Technika mikroskopowa pozwala badać lokalizację biosensorów i aktywację białek w odpowiedzi na przepływ ścinający.

Ocena odpowiedzi Dictyostelium discoideum na ostrą stymulację mechaniczną

Przeglądaj więcej filmów