Synteza nanokryształów konwersji w górę domieszkowanych lantanowców w otoczce do zastosowań komórkowych

Ogólnym celem tej procedury jest synteza nanokryształów konwersji w górę domieszkowanych lantanowców w oparciu o podejście do współstrącania w wysokiej temperaturze oraz przeprowadzenie biokompatybilnych modyfikacji powierzchni, które umożliwią dalsze zastosowania komórkowe. W ciągu ostatnich kilku lat nasze laboratorium opracowało bardzo unikalną konwersję nanokryształów domieszkowaną lantanowców, która wykazała bardzo unikalne właściwości optyczne, dzięki czemu mogą absorbować światło podczerwone o dużej długości fali i zasadniczo przekształcać to światło w wielobarwne emisje w krótkim zakresie długości fal, w tym promieniowanie UV widzialne nawet w oknach światła podczerwonego. Tak unikalne struktury nanokrystaliczne wykazały bardzo obiecujące właściwości do zastosowań biomedycznych.

Metoda ta zapewnia wykonalne podejście do syntezy nanostruktur konwersji w górę rdzenia-powłoki i ich biokompatybilnej techniki modyfikacji powierzchni do regulacji białek kanału błonowego bramki świetlnej po oświetleniu światłem w bliskiej podczerwieni. Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować roztwory podstawowe kompleksów octanu pierwiastków ziem rzadkich w metanolu. Przygotuj 20 miligramów na mililitr roztworów wodorotlenku sodu i fluorku amonu w metanolu.

Roztwory podstawowe należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odpipetować trzy mililitry kwasu oleinowego i siedem mililitrów 1-oktadecenu do 50-mililitrowej kolby okrągłodennej z trzema szyjkami. Dodaj do tego 1,089 mililitra roztworu octanu itru, 0,608 mililitra roztworu octanu iterbu, 83,6 mikrolitra roztworu octanu tulu i 128,5 mikrolitra roztworu octanu neodymu.

Wyposaż kolbę w mieszadło i termometr. Podgrzać kolbę do 100 stopni Celsjusza w łaźni olejowej, mieszając, aż metanol odparuje. Następnie podłączyć kolbę do przewodu Schlenka i pompować kolbę przez dwie do trzech minut, aby usunąć resztki metanolu.

Następnie umieścić kolbę w atmosferze azotu. Podgrzej mieszaninę reakcyjną w temperaturze 150 stopni Celsjusza przez godzinę, mieszając z prędkością 700 obr./min. Następnie pozwól mieszaninie ostygnąć do temperatury pokojowej.

Następnie umieść w 15-mililitrowej probówce wirówkowej dwa mililitry roztworu podstawowego wodorotlenku sodu i 2,965 mililitra roztworu podstawowego fluorku amonu. Szczelnie zamknij probówkę i mieszaj mieszaninę wodorotlenku sodu i fluorku amonu przez pięć sekund. W ciągu pięciu minut za pomocą szklanej pipety powoli dodawać mieszaninę wodorotlenku sodu i fluorku amonu do kolby reakcyjnej, mieszając.

Następnie podgrzej mieszaninę reakcyjną do nie więcej niż 50 stopni Celsjusza. Trzymaj mieszaninę w tej temperaturze przez 30 minut. Następnie podgrzej mieszaninę do 100 stopni Celsjusza, aby odparować metanol.

Podłączyć kolbę do przewodu Schlenka i usuwać resztki metanolu w próżni przez dwie do trzech minut. Napełnić kolbę azotem gazowym i podgrzać mieszaninę reakcyjną do 290 stopni Celsjusza w temperaturze pięciu stopni Celsjusza na minutę. Trzymaj mieszaninę w temperaturze lub nieco powyżej 290 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny.

Następnie pozwól mieszaninie ostygnąć do temperatury pokojowej, mieszając. Przenieś mieszaninę produktu do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Wypłucz pozostałość do probówki z 30 mililitrami etanolu.

Odwirować mieszaninę 4 000 razy g przez osiem minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i rozproszyć ciała stałe w 10 mililitrach heksanów przez sonikację przez dwie minuty. Dodać 30 mililitrów etanolu do dyspersji, ponownie odwirować mieszaninę w tych samych warunkach i wyrzucić supernatant.

Rozproszyć ciała stałe w pięciu mililitrach heksanów i przechowywać dyspersję w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Sprawdź przekonwertowaną w górę emisję roztworu UCNs typu core-shell po napromieniowaniu laserem 808 nm w ciemności. Aby rozpocząć przygotowywanie UCN modyfikowanych DBCO, umyj przygotowane nanokryształy rdzenia-powłoki w 30 mililitrach etanolu przez odwirowanie.

Odrzucić supernatant i dodać 10 mililitrów wodnego roztworu kwasu solnego o pH cztery. Sonikować mieszaninę przez 30 minut, aby rozpuścić ciała stałe. Przenieść mieszaninę do szklanej fiolki i energicznie mieszać przez dwie godziny.

Następnie umyj mieszaninę czterema 30-mililitrowymi porcjami eteru dietylowego. Połącz frakcje eterowe i odłóż na bok umytą warstwę wodną. Odzyskaj śladowe UCN wolne od ligandów z warstw eteru za pomocą 10 mililitrów wody dejonizowanej i połącz warstwy wodne.

Dodaj 20 mililitrów acetonu do połączonych warstw wodnych i mieszaj mieszaninę przez pięć sekund. Odwirować mieszaninę 35 000 razy g przez 10 minut. Odrzucić supernatant i rozpuścić osad w dwóch mililitrach wody dejonizowanej, aby otrzymać roztwór UCN wolnych od ligandów.

Następnie rozpuść 200 miligramów kwasu poliakrylowego w 20 mililitrach wody dejonizowanej za pomocą sonikacji przez 20 minut. Dodaj do tego roztwór UCN wolnych od ligandów, energicznie mieszając. Doprowadzić pH mieszaniny do 7,4 za pomocą jednomolowego roztworu wodorotlenku sodu.

Sonikuj mieszaninę przez 30 minut i mieszaj mieszaninę przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie odwirować mieszaninę 35 000 razy g przez 10 minut. Umyj ciała stałe przez odwirowanie w 10 mililitrach dejonizowanej wody cztery razy.

Rozproszyć umyte ciała stałe w ośmiu mililitrach wody dejonizowanej, aby uzyskać 10 miligramów na mililitr roztworu UCN modyfikowanych polimerami. Odwirować jeden miligram modyfikowanych polimerami UCN w ilości 35 000 razy g przez 10 minut. Pozostały roztwór przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Umyj ciała stałe przez trzykrotne odwirowanie w jednomililitrowych porcjach suchego DMF. Następnie rozpuść osad w 200 mikrolitrach suchego DMF. Dodaj do tego roztworu 12,2 miligrama HOBT, 14 miligramów EDC, pięć miligramów DBCO-aminy i 16 mikrolitrów DIPEA.

Mieszaj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie odwiruj mieszaninę przez 10 minut w temperaturze 35 000 razy g. Umyj ciała stałe cztery razy przez odwirowanie w jednomililitrowych porcjach DMSO.

Rozproszyć UCN zmodyfikowane DBCO w 0,2 mililitra DMSO i przechowywać dyspersję w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Najpierw wysiewaj raz po 10 piąte komórki HEK293 na 12-dołkowej płytce i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnie w probówce do mikrowirówek połącz jeden mikrogram wybranego plazmidu z dwoma mikrolitrami środka do transfekcji P3000 w 100 mikrolitrach MEM.

W innej probówce do mikrowirówek połącz 1,5 mikrolitra odczynnika do transfekcji ze 100 mikrolitrami MEM. Inkubować obie mieszaniny w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie połącz mieszaniny i dodaj 400 mikrolitrów MEM o niskiej surowicy.

Następnie dwukrotnie przemyj inkubowane komórki jednomililitrowymi porcjami DMEM bez surowicy. Rozprowadzić 600-mikrolitrową mieszaninę transfekcji do dołków 12-dołkowej płytki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny.

Następnie usuń pożywkę i umyj komórki dwukrotnie jednomililitrowymi porcjami DMEM. Rozprowadzić między studzienkami jeden mililitr tetra-acetylowanego roztworu N-azydoacetylo-mannozaminy w DMEM. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa dni.

Następnie umyj, trypsynizuj i ponownie zakulturuj komórki w naczyniu konfokalnym przez noc. Następnie zastąp pożywkę jednym mililitrem świeżego DMEM zawierającego dwa mikrolitry 50-miligramowego na mililitr roztworu DBCO-UCN. Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny i dwukrotnie umyć komórki DMEM.

Wyłącz światło dygestorium i dodaj odpowiednie roztwory buforowe dienu do komórek w celu obrazowania wapnia i inkubuj komórki przez 30 minut w ciemności. Umyj komórki DMEM bez surowicy. Naświetl ogniwa światłem bliskiej podczerwieni o długości 808 nanometrów o mocy 0,8 wata na centymetr kwadratowy.

Naprzemiennie naświetlać przez pięć minut z pięciominutowymi przerwami, aż komórki będą napromieniane przez 20 minut. Zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego. Transmisyjna mikroskopia elektronowa UCN rdzenia i rdzenia-powłoki wykazała kuliste struktury o grubości powłoki około pięciu nanometrów.

TEM o wysokiej rozdzielczości wykazał odstępy d zgodne z wysoce skrystalizowanymi nanostrukturami. Po modyfikacji powierzchni UCN łatwo zdyspergowały się w roztworze buforowym. Dynamiczne rozpraszanie światła wykazało, że średnica hydrodynamiczna DBCO-UCN w roztworze wodnym wynosi około 96 nanometrów.

Potencjały zeta UCN modyfikowanych PAA i DBCO wskazują na ujemnie naładowane powierzchnie, co jest zgodne z rozpuszczalnością i stabilnością w wodnych roztworach buforowych. Testy emisji w górę wykazały, że UCN modyfikowane przez PAA i DBCO miały takie same wzorce emisji jak UCN z rdzeniem podstawowym, gdy były napromieniowane światłem o długości fali 808 nanometrów. Znakowane azydem komórki HEK293 z ekspresją białek kanałowych bramkowanych światłem wykorzystano do przetestowania biozastosowań DBCO-UCN.

Lokalizacja UCN na znacznikach azydku została przypisana grupom DBCO zabarwionym barwnikiem zawierającym azydek. Kiedy komórki te były wystawione na działanie światła bliskiej podczerwieni, DBCO-UCN ułatwiały przepływ jonów wapnia przez błonę komórkową, jak wykazano za pomocą obrazowania konfokalnego i cytometrii przepływowej z fluorescencyjnym wskaźnikiem wapnia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować nanokryształy konwersji rdzenia-powłoki z biokompatybilną modyfikacją powierzchni i ich dalszymi zastosowaniami biologicznymi w celu aktywacji kanału jonowego bramkowanego światłem w żywych komórkach, postępując zgodnie z tą procedurą.