Przetwarzanie ludzkiej tkanki serca w kierunku samoorganizującego się hydrożelu macierzy zewnątrzkomórkowej do zastosowań in vitro i in vivo

Ogólnym celem tej procedury jest przetworzenie macierzy zewnątrzkomórkowej serca do hydrożelu, co umożliwia badanie wpływu macierzy w różnych testach komórkowych. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie serca, takie jak to, jak macierz zewnątrzkomórkowa wpływa na zachowanie komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia ona wykorzystanie macierzy zewnątrzkomórkowej do przeprowadzania eksperymentów na dużą skalę in vitro lub in vivo.

Zastosowania tej techniki można rozszerzyć w kierunku terapii zawału mięśnia sercowego, ponieważ matryca może dostarczyć niezbędnych wskazówek dotyczących przeżycia. Aby rozpocząć eksperyment, za pomocą sterylnego skalpela z ostrzem numer dziesięć, należy usunąć tkankę tłuszczową z uzyskanego wcześniej mięśnia sercowego lewej komory. Pokrój mięsień sercowy w kostkę około 1 na 1 na 1 cm za pomocą skalpela.

Następnie umieść kostki w sterylnej probówce o pojemności 50 ml. Probówki zawierające kostki przechowuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Wyjmij probówkę z przygotowanymi kostkami z zamrażarki i przetransportuj ją na lodzie do kriostatu.

Ustaw temperaturę obiektu i komory kriostatu na 15 stopni Celsjusza. Schłodzić puste probówki i stemple o pojemności 50 ml w komorze. Dodaj warstwę pożywki do kriosekcji na zimny stempel i pozwól mu zamarznąć, aż stanie się biały i stały.

Dodaj drugą warstwę pożywki do kriosekcji i umieść rurkę mięśnia sercowego w drugiej warstwie. Upewnij się, że podłoże do kriosekcji i mięsień sercowy są całkowicie zamrożone. Następnie włóż stempel z zamrożonym mięśniem sercowym do uchwytu i dokręć wszystkie.

Przyciąć powierzchnię tkanki, aż do uzyskania równej powierzchni do cięcia. Podziel zamrożony mięsień sercowy na sekcje z automatycznym cięciem, aby zagwarantować jednolite cięte sekcje. Z jednej kostki można wyciąć około 30 do 40 sekcji.

Umieść każdą plasterkę, po pokrojeniu, luźno w wstępnie schłodzonej probówce o pojemności 50 ml. Zamknij napełnione probówki i umieść je na lodzie. Przenieść zamrożone fragmenty wszystkich probówek o pojemności 50 ml do jednej sterylnej zlewki.

Dodać 50 ml roztworu do lizy na 50 ml probówki zawierającej plastry mięśnia sercowego. Następnie wstrząśnij plasterkami mięśnia sercowego w sterylnej zlewce. Przecedź płyn z plastrami chusteczki przez grube sitko.

Następnie przenieś plastry tkanki pęsetą do nowej sterylnej zlewki. Dodaj 50 ml 0,5% SDS w PBS na początkową 50 ml probówkę plastrów mięśnia sercowego. Potrząsać zlewką w sposób ciągły przez sześć godzin z prędkością 100–150 obr./min w temperaturze pokojowej.

Po wstrząśnięciu przecedź płyn z chusteczkami przez grube sitko. Za pomocą pęsety przenieś plastry tkanek do nowej sterylnej zlewki i umyj je trzykrotnie 50 ml PBS. Następnie umyj plastry przez noc w PBS, z 1% penicyliną streptomycyną i 1% nystatyną.

Następnego dnia usuń roztwór myjący i dodaj 25 ml FBS podgrzanego do 37 stopni Celsjusza z 1% streptomycyną penicyliny i 1% nystatyną do pozbawionych komórek plasterków na początkową probówkę 50 ml plastrów mięśnia sercowego. Inkubuj plastry przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby usunąć resztki DNA z matrycy. Następnie przenieś plastry do nowej sterylnej zlewki i umyj trzykrotnie 50 ml PBS.

Umieść plastry ECM luźno na nowej sterylnej płytce sześciodołkowej. Zamroź ECM w temperaturze 80 stopni Celsjusza i liofilizuj go przez dwa dni w liofilizacji. Do sproszkowania warstwy ECM należy użyć rurek frezujących zawierających kulki ceramiczne o średnicy 1,4 mm.

Napełnij probówki luźno liofilizowanym ECM, używając sterylnej, pęsety. Zatrzaskowo zamroź probówki w ciekłym azocie. Włóż zamrożone rurki do frezarki i sproszkowaj ECM.

Ustaw czas trwania na 30 sekund, dostosuj maksymalną prędkość i uruchom urządzenie. Po sproszkowaniu wyjmij probówki i ponownie zamroź je w ciekłym azocie. Umyj mikrocząsteczki z probówek, dodając 1 ml ddH20 na probówkę i wstrząśnij do całkowitego rozpuszczenia.

Następnie przefiltruj niejednorodny roztwór przez siatkę o długości 200 mikrometrów do probówki o pojemności 50 ml. Zamrozić probówkę w ciekłym azocie. Zastąp standardową pokrywkę probówki filtrem 0,22 mikrometra, aby zapobiec wypływaniu proszku z probówki.

Włóż rurkę do liofilizatora i ponownie liofilizuj, aby usunąć wodę z etapu mycia. Przygotowany wcześniej liofilizowany ludzki proszek ECM rozpuścić w roztworze pepsyny, do końcowego stężenia 10 mg na ml. Przenieść roztwór do probówek o pojemności 2 ml o objętości 1 ml na probówkę.

Odpipetować roztwór, aby dokładnie wymieszać. Następnie umieść probówki w wytrząsarce i potrząsaj z prędkością 1200 obr./min przez 48 godzin w temperaturze 27 stopni Celsjusza. Wyjmij probówki z wytrząsarki i umieść je na lodzie lub wstępnie schłodzonym uchwycie na probówki.

Zmieszać 1/9 objętości roztworu ECM zimnego 10X PBS z 1/10 objętości roztworu ECM zimnego 0,1-molowego wodorotlenku sodu we wstępnie schłodzonej probówce i umieścić na lodzie w celu zneutralizowania strawionego roztworu ECM i dezaktywacji pepsyny. Na koniec dodać roztwór ECM do mieszaniny neutralizującej i dokładnie wymieszać przez pipetowanie lub wirowanie. Testy ilościowe dla poszczególnych składników ECM wykazały pełniejsze usuwanie DNA i lepsze zachowanie całkowitego kolagenu, elastyny i glikozominoglikanów w porównaniu z decelularyzacją przez samą SDS.

RT-PCR wykorzystano do ilościowego określenia ekspresji strukturalnych białek kardiomiocytowych, wczesnych i późnych kardiomiogennych czynników transkrypcyjnych oraz genów markerów powierzchniowych komórek śródbłonka w mysim ESC, ulegających spontanicznemu różnicowaniu. Kontakt z cECM napędza pluripotencjalne komórki macierzyste, najlepiej w kierunku fenotypu podobnego do kardiomiozytu. Mikroskopia światła z kontrastem fazowym pokazuje, że trawienie enzymatyczne cECM przez 48 godzin daje bardziej zhomogenizowany roztwór ECM.

Żywe/martwe barwienie ludzkich fibroblastów serca na hydrożelu cECM wykazuje zwiększoną żywotność. Zarówno mikrocząstki cECM, jak i hydrożel cECM zwiększają aktywność metaboliczną kurczliwych komórek HL-1 w warunkach niedokrwiennych w porównaniu z komórkami w standardowej hodowli. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu tygodnia od tkanki do hydrożelu, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się regeneracją serca do zbadania wpływu macierzy zewnątrzkomórkowej serca, systemów modelowych in vitro i in vivo.