Name: Przetwarzanie ludzkiej tkanki serca w kierunku samoorganizującego się hydrożelu macierzy zewnątrzkomórkowej do zastosowań in vitro i in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Poznaj metodę dekompozycji ludzkiego mięknięcia sercowego w samoorganizujący się hydrożel macierzy zewnątrzkomórkowej. Technika umożliwia badania in vitro i in vivo oraz ma zastosowanie w terapii zawału mięśnia sercowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Protokół badania jest zgodny z zasadami etycznymi określonymi w Deklaracji Helsińskiej. Pacjenci wyrazili świadomą zgodę na wykorzystanie tkanki do celów badawczych, a proces pobierania tkanek został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną i komisję bioetyczną Charité - Universitätsmedizin Berlin (EA4/028/12).

Protokół badania jest zgodny z zasadami etycznymi określonymi w Deklaracji Helsińskiej i został zatwierdzony przez instytucjonalną komisję rewizyjną i komisję etyczną Uniwersytetu Medycznego Charité. Wszyscy pacjenci wyrazili pisemną, świadomą zgodę na wykorzystanie tkanki serca do badań eksperymentalnych.
1. Przygotowanie ludzkiego mięśnia sercowego do sekcji
<ol>
	<li>Mięśnia sercowego lewej komory (wielkość różni się w zależności od rodzaju operacji) należy pobrać bezpośrednio z sali operacyjnej i przetransportować w zimnym PBS w sterylnym pojemniku.</li>
	<li>Usuń całą tkankę tłuszczową sterylnym skalpelem z ostrzem nr 10 w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Pokrój mięsień sercowy w kostkę o wymiarach około 1 x 1 x 1 cm za pomocą skalpela.</li>
	<li>Umieść kostki w sterylnych probówkach o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Aby wstrzymać, wykonaj krok 1.5, w przeciwnym razie przejdź do kroku 2.2. Unikaj powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania, aby zapobiec degradacji białek i spadkowi jakości tkanek.</li>
	<li>Probówki zawierające kostki przechowywać w temperaturze -80 °C. Tkanka może być przechowywana przez kilka miesięcy.</li>
</ol>
2. Dzielenie kostek mięśnia sercowego na plasterki
<ol>
	<li>Wyjmij probówkę (probówki) z przygotowanymi kostkami z zamrażarki.</li>
	<li>Transport na lodzie do kriostatu.</li>
	<li>Ustaw temperaturę obiektu i komory na -15 °C. 
	UWAGA: Właściwa temperatura ma kluczowe znaczenie dla zagwarantowania idealnego cięcia.</li>
	<li>Schłodzić puste probówki i stemple o pojemności 50 ml w komorze lub na suchym lodzie.</li>
	<li>Dodaj warstwę (około 0,5 - 1,0 ml) pożywki do kriosekcji na zimny stempel i pozwól mu zamarznąć, aż stanie się biały i stały.</li>
	<li>Dodaj drugą warstwę pożywki do kriosekcji i umieść kostkę mięśnia sercowego na tej warstwie.</li>
	<li>Upewnij się, że pożywka do kriosekcji i mięsień sercowy są całkowicie zamrożone, zanim przejdziesz dalej. 
	UWAGA: Gdy próbka i podłoże do kriosekcji nie zostaną zamrożone, cięcie będzie utrudnione. Całkowicie zamrożone podłoże kriosekcyjne zmienia kolor z płynnego i przezroczystego w stały, biały i nieprzezroczysty. Kostki mięśnia sercowego potrzebują co najmniej 30 minut do 1 godziny, aby całkowicie zamarznąć, jeśli kontynuujesz natychmiast od kroku 1.4. Gdy tkanka jest zamrożona, nie powinna odkształcać się przy dotykaniu/dotykaniu pęsetą.</li>
	<li>Włóż stempel z zamrożonym mięśniem sercowym do uchwytu i dokręć wszystkie.</li>
	<li>Przyciąć powierzchnię tkanki, aż do uzyskania równej powierzchni do cięcia.</li>
	<li>Ustaw grubość przekroju na 300 μm.</li>
	<li>Cięcie zamrożonego mięśnia sercowego z automatycznym cięciem. Gwarantuje to jednolite przekroje cięcia. Z jednej kostki można pokroić około 30 - 40 sekcji.</li>
	<li>Umieść każdy plasterek po luźnym pokrojeniu w schłodzonej probówce o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Nie dociskaj plastrów ani nie pakuj ciasno. W jednej tubie może zmieścić się około 40 plasterków.</li>
	<li>Zamknij napełnione probówki i umieść na lodzie. 
	UWAGA: Aby wstrzymać, przejdź do kroku 2.14, w przeciwnym razie przejdź do kroku 3.2.</li>
	<li>Przechowywać plastry mięśnia sercowego w temperaturze -80 °C. Plastry można przechowywać przez kilka miesięcy.</li>
</ol>
3. Decelularyzacja ludzkich plastrów mięśnia sercowego
<ol>
	<li>Wyjąć z zamrażarki w temperaturze -80 °C niezbędną liczbę probówek o objętości 50 ml zawierających skrawki mięśnia sercowego i transportować na lodzie.</li>
	<li>Przenieść zamrożone fragmenty wszystkich probówek o pojemności 50 ml z kroku 3.1 do jednej sterylnej zlewki. Do zlewki dodaje się około 40 plasterków na probówkę o pojemności 50 ml. Zlewka powinna być trzykrotnie większa od objętości probówek o pojemności 50 ml; na przykład do decelularyzacji jednej probówki o pojemności 50 ml należy użyć zlewki o pojemności 150 ml.</li>
	<li>Dodać 50 ml roztworu do lizy (10 mM Tris, 0,1% w/v EDTA, pH 7,4 in H2O) do probówki o pojemności 50 ml z plastrami mięśnia sercowego.</li>
	<li>Potrząsać plastrami mięśnia sercowego w sterylnej zlewce z prędkością 100 - 150 obr./min w sposób ciągły przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przecedź płyn z plastrami chusteczki przez grube sitko. Przenieś wycinki tkanki pęsetą do nowej sterylnej zlewki. Dodaj 50 ml 0,5% SDS w PBS na początkową 50 ml probówkę plastrów mięśnia sercowego (np. użyj 100 ml roztworu SDS, gdy dwie probówki o pojemności 50 ml skrawków mięśnia sercowego są decelularyzowane).</li>
	<li>Wytrząsać w sposób ciągły przez 6 godzin przy 100 - 150 obr./min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przecedź płyn z plastrami chusteczki przez grube sitko. Przenieś plastry tkanki pęsetą do nowej sterylnej zlewki i przemyj 3 razy 50 ml PBS przez 10 minut każdy, wstrząsając z prędkością 150 obr./min. Następnie umyć przez noc w PBS z 1% penicyliną/streptomycyną i 1% nystatyną (PBS-P/S-N) przy 100-150 obr./min i 4 °C, wstrząsając. 
	UWAGA: Dokładne mycie ma kluczowe znaczenie dla całkowitego usunięcia wszelkich pozostałości SDS. Pozostałe ślady SDS są toksyczne, gdy ECM jest używany w połączeniu z komórkami.</li>
	<li>Usunąć roztwór myjący i dodać 25 ml podgrzanego FBS (37 °C) z 1% penicyliną/streptomycyną i 1% nystatyną do pozbawionych komórek plastrów na początkową probówkę 50 ml plastrów mięśnia sercowego.</li>
	<li>Inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C. Na tym etapie wszelkie pozostałe DNA są usuwane z macierzy ze względu na wewnętrzną aktywność DNazy FBS.</li>
	<li>Przenieś plastry do nowej sterylnej zlewki i umyj 3 razy 50 ml PBS przez 10 minut, wstrząsając z prędkością 150 obr./min. 
	UWAGA: Warstwy ECM można przechowywać w PBS-P/S-N w temperaturze 4 °C przez kilka dni. Zaleca się jednak natychmiastowe kontynuowanie.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie decelularnego cECM na proszek
<ol>
	<li>Umieść plastry ECM luźno na nowej sterylnej płytce 6-dołkowej. Zamrażać ECM w temperaturze -80 °C i liofilizować przez 2 dni w liofilizatorze. 
	UWAGA: W jednym dołku można umieścić więcej niż jeden plasterek. Ułóż plastry tak, aby całkowicie pokryły powierzchnię studni. Nakładanie się plastrów nie ma wpływu na późniejszy sukces proszkowania.</li>
	<li>Do sproszkowania warstwy ECM należy użyć specjalnych rurek do mielenia (patrz Tabela materiałów) zawierających kulki ceramiczne o średnicy 1,4 mm. Napełnij probówki luźno liofilizowanym ECM za pomocą sterylnej, pęsety. W celu uzyskania optymalnych rezultatów zalecana jest całkowita masa ECM w zakresie 10 - 20 mg. 
	UWAGA: Jeśli ECM zostanie zbyt ciasno upakowany w rurkach frezujących, będzie to miało negatywny wpływ na proces proszkowania.</li>
	<li>Zamrozić probówki w ciekłym azocie. 
	UWAGA: Ciekły azot ma bardzo niską temperaturę, należy nosić odpowiednią ochronę osobistą.</li>
	<li>Włóż zamrożone rurki do frezarki i sproszkowaj ECM.
	<ol>
		<li>Ustaw czas trwania 30 s i maksymalną prędkość i uruchom urządzenie.</li>
		<li>Po zakończeniu wyjmij probówki i ponownie zamroź w ciekłym azocie.</li>
		<li>Powtórz pięć razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj mikrocząsteczki z probówek, dodając 1 ml ddH2O na probówkę i wstrząśnij lub zwiruj w celu całkowitego rozpuszczenia. Przefiltrować niejednorodny roztwór przez siatkę 200 μm do probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Zamrozić probówkę w temperaturze -80 °C lub ciekłym azocie.</li>
	<li>Zastąp standardową pokrywę rurki filtrem 0.22 μm. Ta pokrywka filtra zapobiega wypływaniu proszku z tuby, ale umożliwia cyrkulację powietrza w celu odparowania wody.</li>
	<li>Włóż probówki do liofilizatora i ponownie liofilizuj, aby usunąć wodę z etapu (krok 4.5) 
	UWAGA: Liofilizacja na tym etapie może potrwać do 3 dni.</li>
	<li>Przechowywać proszek w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania lub przejść do kroku 5.1.</li>
</ol>
5. Enzymatyczna homogenizacja mikrocząstek cECM
<ol>
	<li>Rozpuścić wieprzową pepsynę w 0,01 M HCl (pH 2,0) do stężenia 1 mg/ml. Umieść na wytrząsarce obrotowej w temperaturze pokojowej, aż całkowicie się rozpuści.</li>
	<li>Rozpuścić liofilizowany ludzki proszek ECM (krok 4.8) w roztworze pepsyny do końcowego stężenia 10 mg/ml. Dokładnie wymieszać przez pipetowanie. Całkowita objętość zależy od ilości potrzebnego roztworu ECM. Na przykład rozpuść 10 mg proszku ECM w 1 ml roztworu pepsyny. 
	UWAGA: Rozpuszczanie cząstek może odbywać się poprzez delikatne wirowanie (1,000 - 1,500 obr./min). Pozostałe grudki mikrocząstek negatywnie wpłyną na trawienie.</li>
	<li>Przenieść roztwór do probówek o pojemności 2 ml o objętości 1 ml na probówkę.</li>
	<li>Umieścić probówki w wytrząsarce do probówek na 48 godzin w temperaturze 27 °C i 1 200 obr./min.</li>
	<li>Wyjmij probówki z shakera i umieść je na lodzie lub wstępnie schłodzonym uchwycie na probówki.</li>
	<li>Zmieszać 1/9 objętości roztworu ECM zimnego 10x PBS (pH 7,4) z 1/10 objętości roztworu ECM zimnego 0,1M NaOH we wstępnie schłodzonej probówce i umieścić na lodzie. Mieszanina ta zneutralizuje strawiony roztwór ECM i nieodwracalnie dezaktywuje pepsynę.</li>
	<li>Dodać roztwór ECM do mieszaniny neutralizacyjnej i dokładnie wymieszać przez pipetowanie lub wirowanie.</li>
	<li>Ustaw ECM na żądane stężenie za pomocą 1x PBS (pH 7,4). pH roztworu można sprawdzić za pomocą papieru do pH. 
	UWAGA: Przykładowe obliczenie dla 10 ml strawionego roztworu ECM: 
	Dodać 10 mg pepsyny wieprzowej do 10 ml HCl (pH 2,0). 
	Dodać 100 mg proszku ECM do roztworu pepsyny. 
	UWAGA: Przykładowe obliczenia dla neutralizacji 10 ml strawionego roztworu ECM i ustawienia stężenia na 8 mg/mL: 
	Objętośćkońcowa = cstart xpoczątek objętości / cKońcowy = 10 mg/ml x 10 ml / 8 mg/ml = 12,5 ml 
	Objętość10xPBS =Początek objętości / 9 = 1/9 z 10 ml = 1,11 ml 10x PBS 
	ObjętośćNaOH = początekobjętości / 10 = 1/10 od 10 ml = 1 ml 
	Objętość1xPBS =Pojemność końcowa -Objętość początkowa - Objętość10xPBS - ObjętośćNaOH = 12,5 ml - 10 ml - .11 ml - 1 ml = 0,39 ml</li>
</ol>

<ol><li>Elliott, R., Hoehn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Commercial+Porcine+Skin+for+Wound+Dressings%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+reconstructive+surgery%22%5BJournal%5D)">Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings.</a> Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).</li>
<li>Rienks, M., Papageorgiou, A. -P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Extracellular+Matrix%3A+An+Ever-Changing+and+Diverse+Entity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity.</a> Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).</li>
<li>Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biological+Basis+for+Cardiac+Repair+After+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction.</a> Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).</li>
<li>Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramyocardial+Delivery+of+Notch+Ligand-Containing+Hydrogels+Improves+Cardiac+Function+and+Angiogenesis+Following+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction.</a> Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).</li>
<li>Gaetani, R., Yin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+derived+extracellular+matrix+enhances+cardiogenic+properties+of+human+cardiac+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells.</a> Cell Transplant. , (2015).</li>
<li>Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+microvascular+grafts+for+cardiac+tissue+preservation+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction.</a> Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).</li>
<li>Zhang, J., Klos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+The+matrix+sandwich+method%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li>
<li>Fong, A. H., Romero-López, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Adult+Cardiac+Extracellular+Matrix+Promotes+Maturation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).</li>
<li>DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+High+Yielding+Method+for+Preparing+Tissue+Specific+Extracellular+Matrix+Coatings+for+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture.</a> PLoS ONE. 5 (9), e13039(2010).</li>
<li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues%3A+Structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li>
<li>Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+extracellular+matrix+hydrogels+as+scaffolds+for+spinal+cord+injury+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair.</a> Tissue Eng Part A. , (2016).</li>
<li>Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+rheological+characterization+of+a+gel+form+of+the+porcine+urinary+bladder+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix.</a> Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).</li>
<li>Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catheter-deliverable+hydrogel+derived+from+decellularized+ventricular+extracellular+matrix+increases+endogenous+cardiomyocytes+and+preserves+cardiac+function+post-myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction.</a> Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).</li>
<li>Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cardiac+extracellular+matrix+from+an+intact+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart.</a> Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).</li>
<li>Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiac+extracellular+matrix+supports+myocardial+lineage+commitment+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cardiothorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells.</a> Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).</li>
<li>Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cardiac+extracellular+matrix+scaffolds+by+decellularization+of+human+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).</li>
<li>Kappler, B., Anic, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoprotective+capacity+of+processed+human+cardiac+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Science%3A+Materials+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).</li>
<li>Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+localization+of+cardiac+collagen+type+VI.+Associations+with+other+extracellular+matrix+components%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components.</a> Circulation Research. 70 (5), (1992).</li>
<li>Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+protection+by+inhalation+of+exogenous+solubilized+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix.</a> PLOS ONE. 12 (2), e0171165(2017).</li>
<li>Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+zebrafish+cardiac+extracellular+matrix+induces+mammalian+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration.</a> Science Advances. 2 (11), e1600844(2016).</li>
<li>Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+scaffold+provides+a+cell+delivery+platform+for+cardiovascular+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).</li>
<li>Sarig, U., Sarig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+myocardial+ECM+patch+drives+cardiac+progenitor+based+restoration+even+after+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring.</a> Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).</li>
<li>Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+derived+myocardial+matrix+as+an+injectable+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podczas przygotowywania ECM mięśnia sercowego u człowieka celem jest osiągnięcie następujących celów: usunięcie odpowiedniego immunogennego materiału komórkowego, zachowanie integralności i bioaktywności ECM, sterylność, nietoksyczność produktu końcowego, zgodność procesu GMP oraz przydatność produktu do danego zastosowania pod względem obsługi. Łącząc nasz 3-etapowy protokół decelularyzacji z dalszym przetwarzaniem na mikrocząstki lub samoorganizujący się hydrożel, uzyskuje się materiał ECM ludzkiego serca, który posiad...

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) zapewnia nie tylko wsparcie strukturalne, ale jest również ważna dla funkcji komórek biologicznych i tkanek1. W sercu ECM uczestniczy w regulacji reakcji patofizjologicznych, takich jak zwłóknienie, stan zapalny, angiogeneza, funkcja skurczowa i żywotność kardiomiocytów oraz los rezydentnych komórek progenitorowych. Oprócz swoich podstawowych składników - glikoprotein włóknistych, glikozaminoglikanów i proteoglikanów - zawiera wiele wydzielanych czynników wzrostu, cytokin i pęcherzyków błoniastych zawierających kwasy nukleinowe i białka2,3.
Ostatnio stało się jasne, że bezkomórkowe preparaty ECM są nie tylko nieocenione do badania interakcji komórka-macierz, ale także do potencjalnych zastosowań terapeutycznych opartych na komórkach. Obecnie powszechnie uznaje się, jak ważne jest zapewnienie odpowiedniego środowiska dla terapeutycznych produktów komórkowych lub tkanek inżynieryjnych. Podjęto próby łączenia zawiesin komórkowych lub związków aktywnych ze zdefiniowanymi hydrożelami biopolimerowymi4,5,6 lub z koktajlami białkowymi wydzielanymi przez komórki mięsaka mysiego (tj. Matrigel, Geltrex)7. Jednak te pierwsze mają ograniczoną bioaktywność, te drugie są problematyczne w procesach klasy GMP i oba nie mają specyficznej tkankowo bioaktywności ECM serca (cECM)8,9,10,11,12,13.
Decelularyzacja mięśnia sercowego była wcześniej wykonywana poprzez perfuzję całego serca przez naczynia wieńcowe14,15. Chociaż jest to możliwe w sercach zwierzęcych, nienaruszone serca ludzkie są rzadko dostępne. Dlatego preferowany był proces zanurzenia, który pozwala na manipulowanie próbkami tkanek uzyskanymi na sali operacyjnej. Nasz "3-etapowy" protokół zawiera 3 oddzielne etapy inkubacji, a mianowicie lizę, solubilizację i usunięcie DNA. Daje ludzki ECM mięśnia sercowego z w dużej mierze zachowanym białkiem i glikozaminoglikanem skład16,17. Te plastry cECM pozwalają na badania in vitro interakcji komórka-macierz, ale słabo nadają się do potencjalnych zastosowań terapeutycznych na skalę ludzką. Proces produkcyjny został następnie rozszerzony o liofilizowane mikrocząstki cECM lub hydrożel cECM 18.
Ten protokół pozwala na decelularyzację ludzkiego mięśnia sercowego uzyskanego z próbek chirurgicznych, zachowując główne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej mięśnia sercowego (ECM) i ich aktywność biologiczną. Protokół ten jest zalecany, gdy do eksperymentalnych badań interakcji komórka-macierz wymagany jest ECM ludzkiego serca z zachowaną bioaktywnością specyficzną dla tkanki lub gdy potrzebne jest odpowiednie środowisko do podejść do regeneracji mięśnia sercowego opartego na komórkach. Zasadniczo możliwe jest również dostosowanie tego protokołu do warunków klasy GMP, tak aby zastosowanie przetworzonego cECM było możliwe w przyszłych zastosowaniach terapeutycznych.

<table><tbody><tr><td>Balance</td><td>DR Precisa, Dietikon, Szwajcaria</td><td>Precisa XR 205SM</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza Nr.10 Skalpell Nr.3</td><td>InstrumenteNRW, Erftstadt, Niemcy</td><td>SK-10-004</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych (6-dołkowe)</td><td>Greiner, Frickenhausen, Niemcy</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat CM</td><td>Leica, Wetzlar, Niemcy</td><td>3050S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>8043.3</td><td></td></tr><tr><td>Probówki reakcyjne Eppendorf (1,5 lub 2 ml)</td><td>Greiner, Frickenhausen, Niemcy</td><td>616201, 623201</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15ml, 50ml</td><td>Greiner, Frickenhausen, Niemcy</td><td>188271, 227270</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Biochrome, Berlin, Niemcy</td><td>S 0115</td><td></td></tr><tr><td>System liofilizacji</td><td>Labconco, Kansas City, Stany</td><td>Zjednoczone 7670520</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka (-80&deg; C)</td> <td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>Forma 900 Series</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>281.1</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotomy Ostrza Typ 819</td><td>Leica, Wetzlar, Niemcy</td><td>14035838925</td><td></td></tr><tr><td>Minilys Homogenizator</td><td>PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Niemcy</td><td>91-PCSM</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>K021.1</td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>PAN Biotech, Aidenbach, Niemcy</td><td>P06-07800</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Niemcy</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy</td><td>P6887-1G</td><td></td></tr><tr><td>Precellys Keramik-Kit 1,4 mm</td><td>Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Niemcy</td><td>91-PCS-CK14</td><td></td></tr><tr><td>Rotamax 120 Wytrząsarka płytkowa</td><td>Heidolph, Schwabach, Niemcy</td><td>544-41200-00</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>CN30.3</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica, Wetzlar, Niemcy</td><td>M125</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP, 0,22 &mikro; m</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Niemcy</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Stuart analogowe miksery kołyskowe i rolkowe</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy</td><td>Z675113-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek O.C.T compound</td><td>Hartenstein, Würzburg, Niemcy</td><td>Zestaw do</td> transfuzji TTEK <td></td></tr><tr><td>200&micro; m</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Niemcy</td><td>798.200.500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>5429.3</td><td></td></tr><tr><td>vedena Skalpellgriff Rys. 3, standardowy, 125 mm</td><td>Najważniejsze informacje medyczne, Rohrdorf, Niemcy</td><td>CV102-003</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie2</td><td>Scientific Industry, Nowy Jork, USA</td><td>SI-0256</td><td></td></tr></tbody></table>

przetwarzanie ludzkiej tkanki serca w kierunku samoorganizującego się hydrożelu macierzy zewnątrzkomórkowej do zastosowań in vitro i in vivo

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Bezkomórkowe preparaty macierzy zewnątrzkomórkowej są przydatne do badania interakcji komórka-matryca i ułatwiają zastosowania regeneracyjnej terapii komórkowej. Kilka komercyjnych produktów macierzy zewnątrzkomórkowej jest dostępnych w postaci hydrożeli lub membran, ale nie mają one specyficznej dla tkanki aktywności biologicznej. Ponieważ decelularyzacja perfuzyjna zwykle nie jest możliwa w przypadku ludzkiej tkanki serca, opracowaliśmy 3-etapowy proces decelularyzacji przez zanurzenie. Ludzkie wycinki mięśnia sercowego pozyskane podczas operacji są najpierw traktowane bezdetergentowym buforem do lizy hiperosmolarnej, a następnie inkubacja z jonowym detergentem, dodecylosiarczanem sodu, a proces ten kończy się wykorzystaniem wewnętrznej aktywności DNazy płodowej surowicy bydlęcej. Technika ta prowadzi do uzyskania bezkomórkowych arkuszy macierzy zewnątrzkomórkowej serca z w dużej mierze zachowaną architekturą tkanki włóknistej i składem biopolimerowym, które, jak wykazano, dostarczają określonych wskazówek środowiskowych dla populacji komórek serca i pluripotencjalnych komórek macierzystych. Arkusze macierzy zewnątrzkomórkowej serca mogą być następnie dalej przetwarzane na proszek mikrocząsteczkowy bez dalszej modyfikacji chemicznej lub, poprzez krótkotrwałe trawienie pepsyny, w samoorganizujący się hydrożel macierzy zewnątrzkomórkowej serca o zachowanej bioaktywności.

Przedstawiony tutaj 3-etapowy protokół decelularyzacji ludzkiego mięśnia sercowego pozwala na niemal całkowite usunięcie materiału komórkowego, przy jednoczesnym zachowaniu kluczowych komponentów ECM oraz włóknistej struktury ECM. Po decelularyzacji makroskopowe usunięcie komórek z tkanki jest widoczne poprzez zmianę koloru (Rysunek 1A). Analiza histologiczna z wykorzystaniem barwień H&amp;E oraz trichromem Massona wykazała całkowity brak pozostałych nienarus...

Ten protokół opisuje całkowitą decelularyzację ludzkiego mięśnia sercowego przy jednoczesnym zachowaniu jego składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Dalsze przetwarzanie macierzy zewnątrzkomórkowej powoduje produkcję mikrocząstek i cytoprotekcyjnego hydrożelu samoorganizującego się.

Przetwarzanie ludzkiej tkanki serca w kierunku samoorganizującego się hydrożelu macierzy zewnątrzkomórkowej do zastosowań in vitro i in vivo

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Ogólnym celem tej procedury jest przetworzenie macierzy zewnątrzkomórkowej serca do hydrożelu, co umożliwia badanie wpływu macierzy w różnych testach komórkowych. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie serca, takie jak to, jak macierz zewnątrzkomórkowa wpływa na zachowanie komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia ona wykorzystanie macierzy zewnątrzkomórkowej do przeprowadzania eksperymentów na dużą skalę in vitro lub in vivo.Zastosowania tej techniki można rozszerzyć w kierunku terapii zawału mięśnia sercowego, ponieważ matryca może dostarczyć niezbędnych wskazówek dotyczących przeżycia. Aby rozpocząć eksperyment, za pomocą sterylnego skalpela z ostrzem numer dziesięć, należy usunąć tkankę tłuszczową z uzyskanego wcześniej mięśnia sercowego lewej komory. Pokrój mięsień sercowy w kostkę około 1 na 1 na 1 cm za pomocą skalpela.Następnie umieść kostki w sterylnej probówce o pojemności 50 ml. Probówki zawierające kostki przechowuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Wyjmij probówkę z przygotowanymi kostkami z zamrażarki i przetransportuj ją na lodzie do kriostatu.Ustaw temperaturę obiektu i komory kriostatu na 15 stopni Celsjusza. Schłodzić pu

processing-human-cardiac-tissue-toward-extracellular-matrix-self

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano metody przygotowania wstrzykiwalnego żelu macierzy z tkanki decelularyzowanej oraz jego wstrzykiwania do mięśnia sercowego szczura in vivo.

Wytwarzanie biologicznych materiałów wstrzykiwalnych do inżynierii tkankowej mięśnia sercowego

Opisujemy izolację kardiomiocytów noworodkowych oraz przygotowanie komórek do enkapsulacji w konstrukcjach z hydrożelu fibrynowego na potrzeby inżynierii tkankowej. Przedstawiamy metody analizy zmodyfikowanego w sposób tkankowo-inżynieryjny mięśnia sercowego po okresie hodowli, w tym pomiar aktywnej siły generowanej podczas stymulacji elektrycznej, ocenę żywotności komórek oraz barwienie immunohistologiczne.

Enkapsulacja kardiomiocytów w hydrożelu fibrynowym w inżynierii tkanki serca

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Ten manuskrypt opisuje tworzenie zdefiniowanych tkanek serca za pomocą ekspresji markerów powierzchniowych i sortowania komórek. Zdefiniowane tkanki mogą być następnie wykorzystane w bioreaktorze wielotkankowym do zbadania mechanizmów terapii komórkami serca w celu zapewnienia funkcjonalnego, a jednocześnie kontrolowanego systemu modelowego ludzkiego serca.

Budowa zdefiniowanych tkanek serca zaprojektowanych przez człowieka w celu zbadania mechanizmów terapii komórkami serca

Ta metoda umożliwia decelularyzację złożonego stałego organu przy użyciu prostego protokołu opartego na szoku osmotycznym i perfuzji jonowego detergentu przy minimalnym naruszeniu macierzy narządu. Obejmuje on nowatorską technikę decelularyzacji ludzkich serc w woreczku ciśnieniowym z monitorowaniem w czasie rzeczywistym dynamiki przepływu i odpływu zanieczyszczeń komórkowych.

Decellularyzacja całego ludzkiego serca w woreczku ciśnieniowym w orientacji odwróconej

Obecny protokół generuje siatkowe tkanki serca zawierające komórki sercowo-naczyniowe pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, aby umożliwić badanie terapii implantacji komórek w chorobach serca.

Przygotowanie zmodyfikowanych tkanek serca w kształcie siatki pochodzących z ludzkich komórek iPS do naprawy mięśnia sercowego in vivo

Terapia oparta na komórkach macierzystych pojawiła się jako skuteczna strategia naprawy uszkodzonych tkanek serca po zawale mięśnia sercowego. Zapewniamy optymalną aplikację in vivo do przeszczepu komórek macierzystych przy użyciu hydrożeli żelatynowych, które mogą być sieciowane enzymatycznie.

Domięśniowe przeszczepienie hydrożeli iniekcyjnej obciążających MSC po zawale mięśnia sercowego w modelu mysim

Celem tego protokołu jest wyjaśnienie i zademonstrowanie rozwoju trójwymiarowego (3D) modelu mikroprzepływowego wysoce wyrównanej tkanki serca ludzkiego, składającej się z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych hodowanych wspólnie z fibroblastami serca (CF) w biomimetycznym hydrożelu na bazie kolagenu, do zastosowań w inżynierii tkankowej serca, badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób.

Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Prezentowany tutaj jest zestaw protokołów do generowania i kriokonserwacji sferoid serca (CS) z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, hodowanych w wysokoprzepustowym, wielowymiarowym formacie. Ten trójwymiarowy model funkcjonuje jako solidna platforma do modelowania chorób, wysokoprzepustowych badań przesiewowych i zachowuje swoją funkcjonalność po krioprezerwacji.

Generowanie, wysokoprzepustowe badania przesiewowe i biobankowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych sferoid serca pochodzących z komórek macierzystych

Fibroblasty wyizolowane z serca dorosłego człowieka zostały wyhodowane do zbiegu na naczyniach pokrytych żelatyną, aby wytworzyć specyficzną dla mięśnia sercowego matrycę zewnątrzkomórkową. Po decelularyzacji substrat ten może być wykorzystany do hodowli i badania innych komórek serca oraz interakcji komórka-macierz.

Produkcja macierzy zewnątrzkomórkowej serca z fibroblastów dorosłego człowieka do powlekania naczyń hodowlanych

Przedstawiono powtarzalną metodę generowania 3D tkanek mięśnia sercowego, łączących rusztowania polikaprolaktonu (PCL) i hydrożele fibrynowe pochodzące z hiPSC. Technika ta zapewnia precyzyjną kontrolę nad architekturą rusztowania i może być stosowana w przedklinicznych testach leków i modelowaniu chorób serca.

Generowanie 3D ludzkiej tkanki mięśnia sercowego przy użyciu elektroprzędzenia stopionego zapisu rusztowań polikaprolaktonowych i komórek serca pochodzących z hiPSC

Poznaj metodę dekompozycji ludzkiego mięknięcia sercowego w samoorganizujący się hydrożel macierzy zewnątrzkomórkowej. Technika umożliwia badania in vitro i in vivo oraz ma zastosowanie w terapii zawału mięśnia sercowego.

Przetwarzanie ludzkiej tkanki serca w kierunku samoorganizującego się hydrożelu macierzy zewnątrzkomórkowej do zastosowań in vitro i in vivo (Wideo) | JoVE Journal

Przetwarzanie ludzkiej tkanki serca w kierunku samoorganizującego się hydrożelu macierzy zewnątrzkomórkowej do zastosowań in vitro i in vivo

Przeglądaj więcej filmów