4.3: Obrazowanie mitozy na żywo

Mitoza to wysoce zorganizowany i kontrolowany podział zawartości jądrowej, który zachodzi podczas cyklu komórkowego. Mitoza jest fundamentalnie ważna dla prawidłowego rozwoju organizmu oraz dla wzrostu, utrzymania i naprawy tkanek. Zakłócenie tego procesu zostało wskazane w niektórych chorobach, takich jak rak. Obrazowanie żywych komórek za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej jest obecnie jedną z najczęstszych metod badania mitozy w laboratoriach.

W tym filmie pokrótce przedstawimy fazy mitozy, a następnie omówimy rozważania eksperymentalne dotyczące obrazowania żywych komórek tego procesu komórkowego. Zostanie pokazany szczegółowy protokół gromadzenia i analizy danych, a my zakończymy kilkoma zastosowaniami tej techniki.

Aby lepiej zrozumieć, czego naukowcy szukają w tych eksperymentach obrazowych, najpierw przejdźmy przez etapy mitozy.

Cykl komórkowy opisuje ogólny proces wzrostu i podziału komórek. Faza mitotyczna stanowi jedną krótką część tego cyklu, którą można dalej podzielić na sześć faz: mianowicie profazę, prometafazę, metafazę, anafazę, telofazę i cytokinezę.

Podczas profazy DNA kondensuje się w chromatydy siostrzane połączone w centromerze. W cytoplazmie dwie kluczowe organelle zwane centrosomami zaczynają składać struktury mikrotubul - powszechnie znane jako włókna wrzeciona - w kształcie koła.

Następna faza, prometafaza, polega na rozpadzie błony jądrowej i złożeniu kompleksu białek, znanego jako kinetochor, w centromerach. W tej fazie zachodzi również połączenie włókien wrzeciona z kinetochorem.

W metafazie chromosomy ustawiają się w jednej linii na płytce metafazy, wyimaginowanej płaszczyźnie równoodległej od dwóch centromerów. Podczas anafazy chromosomy "rozpadają się" w centromerze, a poszczególne chromatydy siostrzane migrują na przeciwległe końce komórki. W telofazie wrzeciono mitotyczne ulega dekondensacji, a chromatyna zaczyna się dekondensować. Wreszcie, podczas cytokinezy - poprzez skurcz pierścienia aktyna / miozyna, który tworzy "bruzdę rozszczepienia" - komórka rodzicielska dzieli się na dwie komórki potomne.

Mając tak jasne zrozumienie progresji mitotycznej, przyjrzyjmy się praktycznym rozważaniom dotyczącym oglądania tego procesu za pomocą obrazowania żywych komórek.

Pierwsze pytanie, które należy zadać, brzmi: jak oznaczyć komórki, aby uwidocznić mitozę? Najczęściej stosowanymi "znacznikami" w tym eksperymencie są cząsteczki fluorescencyjne, które pochłaniają światło na jednej długości fali i emitują światło na innej długości fali.

Aby oznaczyć kwasy nukleinowe, można użyć przepuszczalnego dla komórek barwnika wiążącego DNA, takiego jak Hoechst. Do znakowania białek, takich jak mikrotubule, można użyć przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie. Są one na ogół nieprzepuszczalne dla membrany, dlatego do wprowadzania ich do próbek stosuje się techniki mikroiniekcji.

Inną strategią jest znakowanie genetyczne, w którym komórkami można manipulować w celu ekspresji fluorescencyjnie znakowanych białek, które oznaczają składniki aktywnie zaangażowane w mitozę, takie jak chromosomy. Podczas pracy z cząsteczkami fluorescencyjnymi należy unikać nadmiernej ekspozycji na światło, aby uniknąć fotowybielania.

Wybór odpowiedniego mikroskopu jest równie ważną decyzją. Dwa najczęściej używane mikroskopy to epifluorescencyjne i konfokalne. Mikroskopia epifluorescencyjna lub szerokokątna przepuszcza światło w całym polu widzenia, podczas gdy mikroskopia konfokalna wykorzystuje lasery do skupiania światła na pojedynczych punktach.

Podczas gdy mikroskopy epifluorescencyjne są zazwyczaj tańsze, preferowane są mikroskopy konfokalne, ponieważ oświetlenie punktowe zapewnia zwiększoną rozdzielczość optyczną, dając wyraźniejsze obrazy. Pojedynczy punkt oświetlenia zmniejsza również fototoksyczność, czyli zwiększoną śmierć komórek spowodowaną nadmierną ekspozycją na światło.

Teraz, gdy przejrzeliśmy kilka zagadnień eksperymentalnych, zobaczmy, jak przeprowadzić eksperyment obrazowania żywych komórek w celu wizualizacji mitozy.

Komórki powinny być hodowane na naczyniach ze szklanym dnem lub na szkiełkach nakrywkowych, co pozwala na najlepszą wizualizację mitozy. Następnie należy je przechowywać w kontrolowanym środowisku do czasu wykonania etykietowania. Jak wspomniano wcześniej, wybór techniki etykietowania zależy od przeprowadzanego eksperymentu. Po oznakowaniu umieść naczynie do hodowli komórkowych w specjalistycznej komorze na mikroskopie. Pozwala to na utrzymanie warunków hodowli komórkowej podczas obrazowania.

Następnie, w zależności od cząsteczki znakującej, ustaw długości fal wzbudzenia i emisji na mikroskopie. Do zbierania danych ustaw punkty czasowe i pozycję do przechwytywania obrazu. W tym kontekście punkty czasowe to przypadki, w których obrazy zostaną uzyskane, aby zapewnić pełne pokrycie wizualne wszystkich etapów mitotycznych. Pozycje odnoszą się do współrzędnych X-Y na naczyniu hodowlanym. Dodatkowo dla każdej pozycji można uzyskać obrazy o różnej głębi ostrości. Każdy obraz reprezentuje przekrój optyczny na osi Z. Dlatego są one zbiorczo znane jako stosy Z. Po wprowadzeniu wszystkich parametrów przetestuj ustawienia, a następnie usiądź wygodnie i ciesz się!

Po uzyskaniu danych poklatkowych istnieje kilka sposobów na ich przedstawienie. Omówmy kilka z tych sposobów.

Montaż jest jednym z najczęstszych sposobów prezentowania danych poklatkowych, w którym wiele obrazów jest ułożonych w siatkę opartą na czasie. Mogą one wyraźnie pokazywać progresję mitotyczną i umożliwiać naukowcom określenie informacji, takich jak czas spędzony w poszczególnych fazach mitotycznych. Sekwencyjne łączenie tych obrazów w celu stworzenia "filmu" może być bardziej dynamiczną prezentacją.

Wreszcie, stosy Z uzyskane za pomocą mikroskopu konfokalnego można połączyć, aby przedstawić odtworzenie próbki w 3D. Może to dokładnie ujawnić relacje przestrzenne między częściami maszynerii mitotycznej. Jest to ważne, ponieważ komponenty, które wyglądają obok siebie w 2D, mogą w rzeczywistości być daleko od siebie w trzech wymiarach.

Teraz, gdy wiesz już, jak przeprowadzić eksperyment z obrazowaniem żywych komórek, przyjrzyjmy się niektórym zastosowaniom tej techniki.

Mitoza jest istotną częścią rozwoju. Naukowcy wyizolowali embrionalne mózgi myszy, aby zaobserwować mitozę w nerwowych komórkach progenitorowych. Kontrolowany podział tych komórek ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego wzrostu i funkcjonowania mózgu. Po izolacji, mózgi zostały podzielone na sekcje za pomocą wibratomu, wybarwione przepuszczalnym dla błony barwnikiem wiążącym kwasy nukleinowe i zobrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej, aby wyraźnie uwidocznić mitozę nerwowych komórek progenitorowych.

Naprawa DNA jest krytycznym procesem komórkowym, który bierze udział we wzroście i podziale komórek. W tym eksperymencie naukowcy badali białko naprawy DNA, które tworzy ogniska, które są punktowymi plamami powstałymi w odpowiedzi na uszkodzenie DNA. Wyniki obrazowania żywych komórek i analizy 3D podkreśliły lokalizację białka naprawy DNA w całym procesie podziału komórki.

Wreszcie, naukowcy badają mitotyczne punkty kontrolne, które są punktami "pauzy", w których warunki komórkowe są oceniane przed kontynuacją podziału. W mitozie punkt kontrolny montażu wrzeciona lub SAC zapewnia prawidłowe połączenie między wrzecionem mitotycznym a chromosomami. Aby to zbadać, naukowcy wstrzyknęli mikroodczynniki indukujące SAC do transgenicznych zarodków much i przeanalizowali mitozę za pomocą obrazowania żywych komórek. Wyniki pokazują zatrzymane kinetochory, co świadczy o tym, że komórki nie przechodzą przez mitozę.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat obrazowania mitozy na żywych komórkach. Po wprowadzeniu do etapów mitozy, w tym filmie przedstawiono ważne zagadnienia i techniki analizy danych dotyczące obrazowania żywych komórek. Na koniec zaprezentowano zastosowania tej techniki. Obrazowanie żywych komórek znacznie pomogło naukowcom w zrozumieniu mechanizmów mitotycznych związanych z rozwojem, utrzymaniem tkanek i chorobami. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!