Name: Różnicowanie megakariocytów i tworzenie płytek krwi z ludzkich komórek CD34 + pochodzących z krwi pępowinowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek CD34+ z krwi pępowinowej do badania różnicowania megakariocytów i produkcji płytek krwi. Technika ta umożliwia uzyskanie czystych populacji komórek z 90-99% wydajnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie Australijskiej Rady ds. Zdrowia i Badań Medycznych (grant projektu 1012409 powiązany z BHC).

Ten protokół został zatwierdzony przez Komitet Etyki Badań Naukowych na Ludziach w Południowo-Wschodnim Sydney i ratyfikowany przez Komitet Etyki Badań Naukowych Uniwersytetu Nowej Południowej Walii. Krew pępowinowa pobrana od zdrowych dawców została dostarczona przez Bank Krwi Pępowinowej w Sydney (Sydney, Nowa Południowa Walia, Australia). Do tej procedury użyto objętości około 100 ml.
UWAGA: Pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, stosując technikę aseptyczną. Odkaż zewnętrzną część worka na krew pępowinową za pomocą 70% etanolu. Do tej procedury użyj sterylnych narzędzi (nożyczek, pęsety).
1. Przygotowanie komórek krwi pępowinowej i izolacja komórek CD34+
<ol>
	<li>Przygotować sterylny bufor separacyjny (SB) z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) o pH 7,2 i zawierający 0,5% albuminy surowicy bydlęcej i 2 mM EDTA.</li>
	<li>Dozować 10 ml SB do stożkowej probówki o pojemności 50 ml (wymagana jest jedna probówka na 10 ml krwi). Za pomocą igły G18 umieszczonej na strzykawce o pojemności 10 ml pobrać 10 ml krwi z worka i przelać do probówek o pojemności 50 ml zawierających 10 ml SB.</li>
	<li>Dodać 15 ml pożywki do separacji limfocytów (patrz Tabela Materiałów) na dno probówki zawierającej rozcieńczoną krew, tworząc dwie warstwy. 
	UWAGA: Powoli dozuj media na dnie tuby, aby uniknąć mieszania różnych warstw.</li>
	<li>Probówki wirówkowe o masie 1 200 × g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) bez przerwy i bez przyspieszenia.</li>
	<li>Przenieść warstwę w pobliżu środka probówki zawierającej komórki jednojądrzaste (około 5 - 10 ml z każdej probówki) do nowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety Pasteura. Dodać SB do każdej probówki do całkowitej objętości 50 ml.</li>
	<li>Odwirować przy 400 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ostrożnie zawiesić granulki komórek za pomocą pipety Pasteura w 5 - 10 ml SB. Połączyć zawieszone komórki i zwiększyć objętość do 50 ml za pomocą SB.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym i hemocytometru lub automatycznego licznika komórek (patrz tabela materiałów). Aby określić procentową zawartość komórek CD34+ w próbce, należy ponownie zawiesić 2,5 × 105 komórek w 100 μl SB i wybarwić, dodając 10 μl przeciwciała anty-CD34-PE przez 15 - 30 minut w temperaturze 4 °C. Analizować za pomocą cytometrii przepływowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Probówki wirówkowe o stężeniu 400 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. 
	UWAGA: Jeśli nie jest to wymagane natychmiast, komórki jednojądrzaste można zamrozić na tym etapie.</li>
	<li>Zawieś komórki w 300 μl SB na10-8 komórek. Dodać 100 μl ludzkiej IgG FcR (odczynnik blokujący, patrz tabela materiałów) i 100 μl kulek magnetycznych CD34 na 108 komórek. Delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 - 40 min. 
	UWAGA: Wymagana jest zawiesina pojedynczej komórki (w razie potrzeby przepuść komórki przez filtr 30 μm przed dodaniem odczynników). Użyj opisanych tutaj objętości odczynników dla 10,8 komórek lub mniej. W przypadku więcej niż 108 komórek odpowiednio zwiększ ilość odczynników (SB, roztwór blokujący i kulki magnetyczne CD34).</li>
	<li>Przygotować kolumnę separacyjną LS w okresie inkubacji, umieszczając kolumnę LS w uchwycie magnetycznym i przemłukując ją 3 ml SB. Wyrzucić ścieki. 
	UWAGA: Kolumny separacyjne LS mogą być załadowane łącznie do 2 × 108 komórek. Dostępne są mniejsze i większe kolumny.</li>
	<li>Dodać 5 - 10 ml SB do mieszaniny komórek i odwirować przy 400 × g przez 10 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1,5 ml SB i załadować zawiesinę komórek (1,5 ml) na kolumnę LS. Zebrać przepływ zawierający nieoznakowane komórki w probówce zbiorczej o pojemności 15 ml (frakcja ujemna #1). Pozwól cieczowi spłynąć i umyj kolumnę 1,5 ml SB.</li>
	<li>Załaduj zebrany przepływ (3 ml) z powrotem do kolumny i zbierz przepływ do tej samej probówki zbiorczej o pojemności 15 ml (frakcja ujemna #1). Umyj kolumnę LS 3 razy 3 ml SB. 
	UWAGA: W razie potrzeby komórki we frakcji ujemnej (12 ml) można wybarwić przeciwciałem anty-CD34 w celu zapewnienia wychwycenia komórek CD34 + przez kolumnę LS.</li>
	<li>Wyjąć kolumnę z separatora magnetycznego i powoli przepłukać komórki tłokiem strzykawki do nowej probówki o pojemności 15 ml z 2 ml SB.</li>
	<li>Umieść kolumnę z powrotem na separatorze magnetycznym i załaduj 2 ml komórek z powrotem do kolumny. Zebrać przepływ i przemyć 2 ml SB. Jest to frakcja ujemna #2 (4 ml).</li>
	<li>Wyjmij kolumnę LS z separatora magnetycznego i dodaj 2 ml SB. Równomiernie i stanowczo przepłukać komórki tłokiem strzykawki, aby zebrać frakcję komórek CD34+. Policz komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym i hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Probówkę wirówkową z frakcją dodatnią o stężeniu 400 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w pożywce wolnej od surowicy dla komórek CD34+ (SFM, patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Jeśli nie jest to wymagane natychmiast, komórki można na tym etapie zamrozić w ciekłym azocie.</li>
</ol>
2. Kontrola czystości izolowanych komórek CD34+
<ol>
	<li>Wybarwić 2 x 104 komórki z frakcji dodatniej 10 μl przeciwciała anty-CD34-PE i 20 μl przeciwciała anty-CD45-PerCP przez 15 minut w temperaturze 4 °C (użyć oddzielnej probówki do kontroli izotypu) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Dodaj 1 ml SB do umycia. Wirować przy 400 × g przez 10 min. Zawiesić osad w 200 μl SB.</li>
	<li>Wykonaj analizę cytometrii przepływowej i przelej populację żywych komórek, aby wykluczyć szczątki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Ustaw bramkę dla populacji PE i PerCP dodatnich za pomocą kontroli izotypu PE i PerCP (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B) i określ procent komórek CD34 + / CD45 +.</li>
</ol>
3. Różnicowanie megakariocytów
<ol>
	<li>Nasiona 5 × 105 komórek/ml komórek CD34 + w 2 ml SFM uzupełnionych 50 ng / ml rekombinowanej ludzkiej trombopoetyny (rhTPO) na dołek na płytce 12-dołkowej. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w wilgotnej atmosferze. Jeśli komórki zlewają się, zanim będą potrzebne do analizy, zbierz komórki i podziel je na wiele dołków za pomocą świeżej pożywki i rhTPO. 
	UWAGA: Dwa lub trzy dołki powinny być przygotowane specjalnie do monitorowania różnicowania w różnych punktach czasowych (np. dni 7, 9 i 10).</li>
	<li>Zbieraj komórki z odłożonych na bok studni w celu monitorowania różnicowania bez zakłócania komórek w innych studzienkach.</li>
	<li>Wybarwić komórki 20 μl przeciwciała anty-GPIIb/CD41-FITC i 10 μl przeciwciała anty-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 w końcowej objętości 100 μl. Ustawić probówkę kontrolną przy użyciu odpowiednich przeciwciał kontrolnych izotypu. Inkubować przez 15 - 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodaj 1 ml SB do umycia. Wirować przy 400 × g przez 10 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 - 300 μl SB. Przeprowadzić analizę za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Dla każdego fluoroforu przeanalizuj kontrole izotypu, aby ustawić bramkowanie dla populacji dodatnich FITC i Alexa Flour 647. Przeanalizuj barwione próbki komórek, aby określić procent podwójnie dodatnich komórek CD41 + / CD42a +, które reprezentują dojrzałe MK (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C).</li>
	<li>Do mikroskopowej wizualizacji markerów powierzchni komórek należy wybarwić komórki, jak opisano w ppkt 3.3.
	<ol>
		<li>Dodaj 1 ml SB do umycia. Wirować przy 400 × g przez 10 min. Zawiesić osad w 100 μl SB i wirować na szkiełku podstawowym o stężeniu 1 000 x g przez 5 minut. Zamocuj komórki na szkiełku, zanurzając je w metanolu na 30 sekund. Wysuszyć na powietrzu, dodać 20 μl podłoża montażowego zawierającego DAPI (patrz Tabela Materiałów), przykryć szkiełkiem nakrywkowym i zobrazować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu wizualizacji antygenów wewnątrzkomórkowych należy ponownie zawiesić komórki w PBS i utrwalić paraformaldehydem (1% stężenie końcowe) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Aby przepuszczalność komórek należy dodać tryton-X 100 (0,1%) i inkubować przez 15 minut. Umyj komórki 2 ml PBS/0,1% triton-X 100. Zawiesić w 100 μl PBS/0,1% tryton-X 100, dodać przeciwciała anty vWf i anty CD62p (rozcieńczenie 1:200) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Przemyć 2 ml PBS/0,1% triton-X 100 i odwirować przy 400 × g przez 10 minut, ponownie zawiesić w 100 μl tego samego buforu i dodać anty-mysie IgG-Alexa 594 i anty-królicze IgG-Alexa 488 (1:100). Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, przemyć 2 ml PBS/0,1% triton-X 100, ponownie zawiesić w 100 μl tego samego buforu i dodać 20 μl anty CD42b-APC. Następnie obrócić komórki na szkiełkach podstawowych zgodnie z opisem w kroku 3.6.1 i przygotować próbki do wizualizacji mikroskopowej, jak opisano w kroku 3.6.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu określenia ploidalności należy zebrać komórki w 12 lub 13 dniu różnicowania. Dodaj 1 ml SB do umycia. Odwirować w temperaturze 400 × g przez 10 minut i wybarwić 20 μl przeciwciała anty-GPIIb/CD41-FITC w końcowej objętości 100 μl. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
	<ol>
		<li>Przemyć raz 1 ml SB i ponownie zawiesić osad w 300 μl hipotonicznego buforu cytrynianowego (1,25 mM cytrynian sodu, 2,5 mM chlorek sodu, 3,5 mM dekstroza) zawierającego 20 μg/ml jodku propidyny i 0,05% Triton-X 100. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.</li>
		<li>Dodać RNazę do końcowego stężenia 20 μg/ml i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem. Określ intensywność jodku propydyny za pomocą cytometrii przepływowej, zbierając od 30 000 do 50 000 zdarzeń populacji CD41-FITC+ (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Liczenie propłytek, oznaczanie liczby płytek krwi i aktywacja płytek krwi
<ol>
	<li>Zebrać komórki (od kroku 3.1) w 8 lub 9 dniu różnicowania i wysiać w 1 ×10 4 komórki/basenik na 48-dołkowych płytkach w 200 μl świeżej SFM uzupełnionej 50 ng/ml rhTPO. Hodowla przez 5 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . 
	UWAGA: W celu oceny ilościowej dołki nasienne należy wykonać w trzech egzemplarzach. Ta niska gęstość jest wymagana do wizualizacji i zliczania MK zawierających propłytki. Propłytki zwykle zaczynają pojawiać się po 2 dniach hodowli. Szczyt przypada na 4 i 5 dzień.</li>
	<li>Policz liczbę MK zawierających propłytki w całym dołku w mikroskopie światła odwróconego przy użyciu obiektywów 10X lub 20X. 
	UWAGA: Preferowany jest podgrzewany (37 °C) stolik mikroskopowy, ponieważ utrzymywanie komórek w temperaturze pokojowej przez dłuższy czas powoduje kurczenie się przedłużeń propłytkowych. Propłytki są obserwowane jako długie wyprostowania od ciała MK. Każdy MK może mieć kilka wypukłości płytkowych. Wraz z rozwojem propłytek ciała MK zmniejsza się.</li>
	<li>Zebrać komórki i odwirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wybarwić komórki 20 μl przeciwciałem antyludzkim CD41-FITC, jak opisano w krokach 3.3 i 3.4. Obliczać procent MK zawierającego propłytki (pbMK): pbMK (%) = [(MK zawierające propłytki/dołek) / (Całkowita liczba komórek CD41+/dołek)] x 100</li>
	<li>Aby policzyć płytki krwi uwolnione do pożywki, delikatnie wymieszaj komórki pipetą Pasteura i zbierz 100 μl w 14 lub 15 dniu hodowli.
	<ol>
		<li>Barwienie 20 μl przeciwciała anty-ludzkiego CD41-FITC przez 20 - 30 min w temperaturze 4 °C. Ustawić probówkę kontrolną przy użyciu odpowiedniego przeciwciała kontrolnego izotypu.</li>
		<li>Dodać 150 μl SB i 50 μl kulek do liczenia.</li>
		<li>W przypadku analizy cytometrii przepływowej należy ustawić FSC i SSC na skalę logarytmiczną. Użyj normalnych płytek krwi ludzkiej z osocza bogatopłytkowego wybarwionego CD41-FITC, jak opisano w sekcji 4.4.1, aby ustawić bramkowanie dla płytek krwi (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A).</li>
		<li>Przeanalizować wybarwione płytki krwi za pomocą kulek zliczających za pomocą cytometrii przepływowej. Zbierz 1,000 zdarzeń liczenia koralików za pomocą wykresu punktowego FSC kontra SSC (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). Oblicz liczbę płytek krwi na podstawie dodatnich zdarzeń CD41-FITC (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B) za pomocą wzoru: 
		Płytki krwi na μl=[(liczba dodatnich zdarzeń CD41-FITC)/1,000 kulek)] x [(liczba kulek w 50 μl)/objętość próbki)]</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przeanalizować aktywację płytek krwi, delikatnie wymieszaj komórki pipetą Pasteura i zbierz 100 μl w 14 lub 15 dniu hodowli. Dodać 1 ml buforu Tyrode'a (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 0,2 mM Na2HPO4, 12 mM NaHCO3, 5,5 mM D-glukozy, pH 6,5) i odwirować przy 200 x g przez 5 minut do komórek osadkowych.
	<ol>
		<li>Zebrać sklarowany osad i odwirować przy sile 800 x g przez 10 minut, aby uzyskać osadzanie cząstek wielkości płytek krwi.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 100 μl buforu Tyrode. Dodać 20 μl przeciwciała PAC1-FITC i difosforanu adenozyny (ADP) do końcowego stężenia 20 μM. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 min. Analiza za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia odsetka pozytywnych zdarzeń FITC. Należy użyć świeżych ludzkich płytek krwi potraktowanych w taki sam sposób, jak kontrola pozytywna (<silna klasa="xfig">Ryc. 3C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Nakeff, A., Maat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+megakaryocytes+from+mouse+bone+marrow+by+velocity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation.</a> Blood. 43 (4), 591-595 (1974).</li>
<li>Zeigler, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+megakaryocytopoietic+and+thrombopoietic+activity+of+c-mpl+ligand+%28TPO%29+on+purified+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells.</a> Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).</li>
<li>Reems, J. -A., Pineault, N., Sun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Megakaryocyte+Production+and+Platelet+Biogenesis%3A+State+of+the+Art%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).</li>
<li>Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+generated+in+vitro+from+proplatelet-displaying+human+megakaryocytes+are+functional%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional.</a> Blood. 85 (2), 402-413 (1995).</li>
<li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monopartite+sequence+is+essential+for+p45+NF-E2+nuclear+translocation%2C+transcriptional+activity+and+platelet+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production.</a> J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).</li>
<li>Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profile+of+primary+human+CD34%2BCD38lo+cells+differentiating+along+the+megakaryocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage.</a> Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).</li>
<li>Feng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+generation+of+universal+platelets+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).</li>
<li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+megakaryocyte+differentiation+of+fresh+and+ex-vivo+expanded+cord+blood+cells%3A+rapid+and+transient+megakaryocyte+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution.</a> Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).</li>
<li>Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+thrombocytopenia%3A+antiplatelet+autoantibodies+inhibit+proplatelet+formation+by+megakaryocytes+and+impair+platelet+production+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro.</a> Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).</li>
<li>Lev, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+proplatelet+formation+in+immune+thrombocytopenia%3A+a+novel+mechanism+contributing+to+decreased+platelet+count%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count.</a> Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).</li>
<li>Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+for+generating+platelet-like+fragments+from+megakaryocytic+cell+lines+and+human+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol.+Dis%22%5BJournal%5D)">A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells.</a> Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).</li>
<li>Lu, S. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+generated+from+human+embryonic+stem+cells+are+functional+in+vitro+and+in+the+microcirculation+of+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice.</a> Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).</li>
<li>Moreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+production+of+megakaryocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+by+chemically+defined+forward+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commun%22%5BJournal%5D)">Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming.</a> Nature Commun. 7, 11208(2016).</li>
<li>De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+of+megakaryocyte+progenitor+cells%3A+cord+blood+versus+mobilized+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood.</a> Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).</li>
<li>Nimgaonkar, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+population+of+CD34%2B+cells+in+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">A unique population of CD34+ cells in cord blood.</a> Stem cells. 13 (2), Dayton, Ohio. 158-166 (1995).</li>
<li>Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+proplatelet+elaboration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Mechanics of proplatelet elaboration.</a> J Thromb Haemost. 5, Suppl 1. 18-23 (2007).</li>
<li>Matsunaga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+large-scale+generation+of+human+platelets+from+cord+blood+CD34%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells.</a> Stem cells. 24 (12), Dayton, Ohio. 2877-2887 (2006).</li>
<li>Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+continuous+in+vitro+human+platelet+production+using+three-dimensional+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds.</a> Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).</li>
<li>Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+ex+vivo+expansion+of+megakaryocytes+from+human+cord+blood+CD34%2B-enriched+cells+in+the+presence+of+thrombopoietin+and+limiting+amounts+of+stem+cell+factor+and+Flt-3+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hematother.+Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand.</a> J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).</li>
<li>Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+megakaryocytes+do+not+complete+maturation%2C+as+indicated+by+impaired+establishment+of+endomitosis+and+low+expression+of+G1%2FS+cyclins+upon+thrombopoietin-induced+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation.</a> Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).</li>
<li>Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23714310">Drug-induced Immune Thrombocytopenia.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).</li>
<li>Stasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+thrombocytopenic+purpura%3A+Current+concepts+in+pathophysiology+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management.</a> Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół jest odpowiedni do konsekwentnego wytwarzania MK i płytek krwi w posiewie z krwi pępowinowej. Komórki te mogą być wykorzystywane do badania różnych procesów, takich jak wpływ leków lub aktywności biologicznej na proliferację MK, różnicowanie, tworzenie propłytek krwi i produkcję płytek krwi.
W literaturze przedstawiono różnorodne kombinacje pożywek hodowlanych i cytokin. Dodanie cytokin, takich jak czynnik komórek macierzystych, ligand Flt-3, IL-3 i IL-6 wspomaga prolife...

Izolacja odpowiedniej liczby pierwotnych ludzkich megakariocytów (MK) do regularnego użytku laboratoryjnego nie jest możliwa ze względu na ich niską częstotliwość w szpiku kostnym, gdzie stanowią ~0,01% komórek jądrzastych1. Dogodną alternatywą jest ekspansja i różnicowanie ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w obecności określonych czynników wzrostu. Szereg cytokin, w tym czynnik komórek macierzystych (SCF; ligand c-kit) oraz interleukina (IL)-3 i IL-11, zostały wykorzystane w systemach hodowlanych do produkcji MK. Trombopoetyna (TPO) jest najskuteczniejszym czynnikiem wzrostu i różnicowania dla kultur megakariocytarnych i jest skuteczna samodzielnie lub z innymi cytokinami, takimi jak SCF i IL-32. TPO może oddziaływać na populacje komórek macierzystych, powodując zarówno proliferację, jak i dojrzewanie MKs2.
MK wytwarzają płytki krwi z wypukłości cytoplazmatycznych zwanych proplateletkami, a in vivo, około 1 x10 11 płytek krwi jest tworzonych dziennie, aby utrzymać liczbę płytek krwi na poziomie 150 - 400 x 109/L. Produkcja płytek krwi in vitro jest do 1000 razy niższa niż szacunki in vivo3, co spowodowało powstanie licznych warunków hodowli przy użyciu CD34+ hematopoetyczne komórki progenitorowe w celu poprawy produkcji MK i płytek krwi in vitro. Pierwotnym źródłem komórek CD34+ wykorzystywanych do różnicowania MK była ludzka krew obwodowa4. Inne źródła komórek to szpik kostny5,6, embrionalne komórki macierzyste/indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (ESC/iPSC)7, oraz krew pępowinowa (UCB)8,9,10. Ludzki szpik kostny CD34+ 11 i ujemne komórki szpiku kostnego linii myszy5 wytwarzają MK i płytki krwi in vitro; niemniej jednak brak dostępności ludzkiego szpiku kostnego ogranicza jego wykorzystanie jako źródła komórek CD34+. Natomiast ESC i iPSC stanowią nieograniczone źródło komórek do produkcji płytek krwi in vitro. Produkcja płytek krwi z tych komórek wymaga komórek żywicielskich, takich jak mysie komórki OP9 i dłuższych okresów hodowli. Płytki krwi uzyskane w warunkach wolnych od karmowadnika wydają się być mniej funkcjonalne12. Płytki krwi pochodzące z iPSC mogą być przydatne w warunkach klinicznych, ponieważ można je rozszerzyć na dużą skalę. Proces ten wymaga transdukcji czynników transkrypcyjnych za pośrednictwem lentiwirusa i długotrwałej hodowli komórek13.
UCB jest dostępnym źródłem komórek CD34+, które mogą być łatwo wykorzystane w warunkach badawczych. Sam TPO może sprzyjać różnicowaniu komórek CD34 + pochodzących z krwi pępowinowej, co prowadzi do powstania wysoce czystych, dojrzałych MK bez potrzeby suplementacji surowicy lub kohodowli z komórkami zasilającymi. Inne cytokiny, takie jak SCF, mogą zmniejszać różnicowanie z komórkami UCB CD34 +, podczas gdy ligand Flt-3 i IL-11 promują produkcję niedojrzałych megakariocytów14. Protokół ten opisuje produkcję wysoce czystych kultur MK z komórek CD34+ krwi pępowinowej w warunkach wolnych od surowicy.

<table><tbody><tr><td>Cell Culture Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human TPO</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-013</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM II</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>9605</td><td>Pożywka bez surowicy dla komórek CD34 +</td></tr> <tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Odczynniki izolacyjne CD34</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD34 Zestaw mikrokulek ultraczysty</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-453</td><td>Ten zestaw zawiera ludzki odczynnik blokujący IgG FcR i mikrogranulki CD34. Koraliki te zawierają klon przeciwciała anty-CD34 QBEND/10. Użyj innego klonu anty-CD34 do kontroli czystości (np. klon 8G12).</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies</td><td>1114545</td><td>Pożywka do separacji limfocytów (gęstość 1,077 g / ml)</td></tr> <tr><td>Sterylny bufor separacyjny (SB)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td>Ten bufor zawiera sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), pH 7,2 zawierającą 0,5% albuminy surowicy bydlęcej i 2 mM EDTA. Można go przygotować przy użyciu sterylnych składników klasy hodowli komórkowych. Odgazuj przed użyciem, ponieważ pęcherzyki powietrza mogą zablokować kolumnę.</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</strong</td><td>>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Cytometria przepływowa i odczynniki do barwienia komórek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Mysz anty-ludzka CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>340669</td><td>klon 8G12. Można to wykorzystać do kontroli czystości CD34. Końcowe stężenie przeciwciał rozcieńczenie 1:10.</td></tr><tr><td>Mysz PerCP anty-ludzka CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>347464</td><td>Rozcieńczenie 1:10</td></tr><tr><td>Kontrola izotypu PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>349044</td><td>Rozcieńczenie 1:10</td></tr><tr><td>FITC Mysz anty-ludzka CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>340929</td><td>Końcowe stężenie przeciwciał 1:5 rozcieńczenie.</td></tr><tr><td>APC Mysz anty-ludzka CD42b</td><td>BD Biosciences</td><td>551061</td><td>To przeciwciało może być również używane do wykrywania dojrzałych MK (odsetek komórek dodatnich w zwykle niższy niż w przypadku anty CD42a). Końcowe stężenie przeciwciał rozcieńczenie 1:10.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mysz anty-ludzka CD42a</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1227A647T</td><td>Obecnie dystrybuowany przez Bio-Rad. Końcowe stężenie przeciwciał rozcieńczenie 1:10.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mysz Negative Control</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA928A647</td><td>Obecnie dystrybuowany przez Bio-Rad. Przeciwciało kontrolujące izotyp</td></tr><tr><td>Czynnik anty von Willebranda królik poliklonalny</td><td>Abcam</td><td>AB6994</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>V450 mysi anty-humna CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>58425</td><td>1: 20 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>V450 kontrola izotypu</td><td>BD Biosciences</td><td>580373</td><td>rozcieńczenie 1:20</td></tr><tr><td>przeciwciało PAC1-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>340507</td><td>1:10 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Mysz anty CD62p monoklonalny</td><td>Abcam</td><td>AB6632</td><td>rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 koza anty królik IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:100 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 koza anty mysie IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11020</td><td>1:100 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Ig Isotype Control cocktail-C</td><td>BD Biosciences</td><td>558659</td><td>Przeciwciało kontrolne izotypu</td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting Beads</td><td>Sondy molekularne, Invitrogen</td><td>C36950</td><td>Koraliki do liczenia</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS kolumny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Mniejsze i większe kolumny są również dostępne w handlu</td></tr><tr><td>MidiMACS Separator magnetyczny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5mL okrągłe rurki polipropylenowe FACS, z zatrzaskiem, sterylne</td><td>technologie In Vitro</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>Menzel-Glaser</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Nośniki montażowe z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Nośnik montażowy Antifade z DAPI</td></tr><<tr><td>strong>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td></td><td>Leica</td><td>DMIRB</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>Vert.A1</td><td></td></tr><tr><td>Analizator komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka cytospinowa</td><td>ThermoScientific</td><td>Cytospin 4</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Katalog Number</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell analyser</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Diva Software</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy pojedynczych komórek</td><td>Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do mikroskopu fluorescencyjnego</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2 blue edition</td><td></td></tr></tbody></table>

różnicowanie megakariocytów i tworzenie płytek krwi z ludzkich komórek cd34 + pochodzących z krwi pępowinowej

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Produkcja płytek krwi zachodzi głównie w szpiku kostnym w procesie znanym jako trombopoeza. Podczas trombopoezy krwiotwórcze komórki progenitorowe różnicują się, tworząc prekursory płytek krwi zwane megakariocytami, które ostatecznie różnicują się, uwalniając płytki krwi z długich procesów cytoplazmatycznych zwanych propłytkami. Megakariocyty są rzadkimi komórkami ograniczonymi do szpiku kostnego i dlatego trudno je pobrać w wystarczającej liczbie do użytku laboratoryjnego. Wydajną produkcję ludzkich megakariocytów można osiągnąć in vitro poprzez hodowlę komórek CD34+ w odpowiednich warunkach. Szczegółowo opisany tutaj protokół opisuje izolację komórek CD34 + przez magnetyczne sortowanie komórek z próbek krwi pępowinowej. Opisano etapy niezbędne do wytworzenia wysoce czystych, dojrzałych megakariocytów w warunkach wolnych od surowicy. Podano również szczegóły analizy fenotypowej różnicowania megakariocytów oraz oznaczania tworzenia i wytwarzania propłytek krwi. Efektory, które wpływają na różnicowanie megakariocytów i/lub tworzenie propłytek, takie jak przeciwciała przeciwpłytkowe lub mimetyki trombopoetyny, można dodać do hodowanych komórek w celu zbadania funkcji biologicznych.

Niniejszy protokół umożliwia przygotowanie wysokiej czystości kultur MK z komórek CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej. Procent komórek CD34+ w krwi pępowinowej wynosi około 1,3%15 (Rycina 1A), a całkowita liczba komórek mononuklearnych (krok 1.8) mieści się w zakresie od 90 do 30 x 106 na jednostkę UCB. Czystość komórek CD34+/CD45+ po izolacji wynosi od 90 do 9% (Rycina 1B</strong...

Wysoce czystą populację megakariocytów można uzyskać z komórek CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej. Opisano tutaj metodę izolacji komórek CD34+ i różnicowania megakariocytów.

Różnicowanie megakariocytów i tworzenie płytek krwi z ludzkich komórek CD34 + pochodzących z krwi pępowinowej

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie próbek ludzkiej krwi pępowinowej do wyizolowania czystych komórek CD34-dodatnich w celu zbadania wpływu określonych leków będących przedmiotem zainteresowania na różnicowanie megakariocytów, tworzenie propłytek krwi i produkcję płytek krwi. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące megakariocytów i płytek krwi, takie jak wpływ określonego leczenia na różnicowanie megakariocytów oraz produkcję i funkcję płytek krwi. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona metodę konsekwentnej izolacji żywotnych komórek CD34-dodatnich ze świeżej krwi pępowinowej.Dzięki tej metodzie można również uzyskać wgląd w megakariopoezę, inne typy komórek, takie jak limfocyty, erytrocyty i makrofagi. Zacznij od dodania 10 mililitrów buforu separacyjnego do 150-mililitrowej stożkowej probówki na 10 mililitrów krwi pępowinowej. Za pomocą igły o rozmiarze 18 zamontowanej na 10-mililitrowej strzykawce, przenieś 10 mililitrów krwi do każdej probówki, a następnie dodaj 15 mililitrów pożywki do separacji limfocytów na dno każdej probówki.Oddziel komórki przez wirowanie w gradiacji gęstości, a następnie pod koniec wirowania ostrożnie zbier

megakaryocyte-differentiation-platelet-formation-from-human-cord

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje technikę różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi. Hematopoetyczne komórki progenitorowe macierzyste — wyizolowane z ludzkiej krwi pępowinowej — różnicują się w dojrzałe megakariocyty w obecności trombopoetyny. Dojrzałe megakariocyty wytwarzają cytoplazmatyczne rozszerzenia zwane propłytkami, które dają początek pojedynczym płytkom krwi.

Metoda in vitro do różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), używane do różnicowania hPSC na hematopoetyczne komórki progenitorowe CD34+. Metoda ta wykorzystuje specyficzną dla etapu manipulację kanoniczną sygnalizacją WNT w celu określenia komórek wyłącznie do ostatecznego lub pierwotnego programu krwiotwórczego.

Ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki immunofenotypowej i indukowanego cytokinami różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej do czterech linii szpikowych. Zastosowania tego protokołu obejmują badania nad wpływem mutacji choroby szpikowej lub małych cząsteczek na różnicowanie szpiku komórek CD34+.

Różnicowanie szpikowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej

Ta metoda opisuje oczyszczanie za pomocą cytometrii przepływowej MEP i MKp z kości udowych, piszczelowych i miednicy myszy.

Izolacja progenitorów megakariocytów myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje wszystkie etapy związane z uzyskaniem hematopoetycznych progenitorów CD34+ pochodzących z leukofiltrów oraz ich różnicowaniem in vitro i dojrzewaniem do megakariocytów zawierających propłytki, które są w stanie uwalniać płytki krwi w pożywce hodowlanej. Ta procedura jest przydatna do dogłębnej analizy mechanizmów komórkowych i molekularnych kontrolujących megakariopoezę.

Komórki CD34 + pochodzące z filtrów Leukodepletion jako źródło komórek do badania różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi

Tutaj prezentujemy strategię immunofenotypowania do charakterystyki różnicowania megakariocytów i pokazujemy, jak ta strategia pozwala na sortowanie megakariocytów na różnych etapach za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją. Metodologia ta może być stosowana do pierwotnych tkanek ludzkich, ale także do megakariocytów wytwarzanych w hodowli in vitro.

Immunofenotypowanie i sortowanie komórek ludzkich MK ze źródeł pierwotnych u ludzi lub zróżnicowanych in vitro z progenitorów hematopoetycznych

Modelowanie erytropoezy daje cenną szansę na zrozumienie biologicznego znaczenia aktorów w tym procesie i ocenę nowych podejść terapeutycznych, które mogą złagodzić wady różnicowania. W tym miejscu opisujemy prostą i niezawodną metodę skutecznego różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ ex vivo.

Kompleksowy proces oceny skuteczności erytropoezy u ludzi in vitro i ex vivo

Opisujemy metodę generowania limfocytów T regulatorowych, pamięci oraz naiwnych od jednego ludzkiego dawcy krwi. Spolaryzowane limfocyty Treg mogą być następnie porównywane z innymi subpopulacjami w różnych zastosowaniach genetycznych i funkcjonalnych przy zachowaniu homogeniczności genetycznej, w tym w teście supresji, który również został tutaj szczegółowo opisany.

Generowanie indukowanych limfocytów T regulatorowych z pierwotnych ludzkich naiwnych limfocytów T oraz limfocytów T pamięci

wyrażające specyficzny dla CD19 receptor antygenu chimerycznego (CAR) są podawane jako eksperymentalne leczenie nowotworów złośliwych komórek B w naszych pierwszych badaniach klinicznych terapii genowej u ludzi. Opisujemy modyfikację genetyczną limfocytów T przy użyciu systemu Śpiącej Królewny (SB) w celu wprowadzenia specyficznego dla CD19 CAR i selektywnej propagacji na zaprojektowanych sztucznych komórkach prezentujących antygen CD19 +.

Kliniczne zastosowanie śpiącej królewny i sztucznych komórek prezentujących antygen do genetycznej modyfikacji limfocytów T z krwi obwodowej i pępowinowej

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Poznaj metodę izolacji komórek CD34+ z krwi pępowinowej do badania różnicowania megakariocytów i produkcji płytek krwi. Technika ta umożliwia uzyskanie czystych populacji komórek z 90-99% wydajnością.

Różnicowanie megakariocytów i tworzenie płytek krwi z ludzkich komórek CD34 ⁺ pochodzących z krwi pępowinowej

Przeglądaj więcej filmów