Różnicowanie megakariocytów i tworzenie płytek krwi z ludzkich komórek CD34 ⁺ pochodzących z krwi pępowinowej

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie próbek ludzkiej krwi pępowinowej do wyizolowania czystych komórek CD34-dodatnich w celu zbadania wpływu określonych leków będących przedmiotem zainteresowania na różnicowanie megakariocytów, tworzenie propłytek krwi i produkcję płytek krwi. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące megakariocytów i płytek krwi, takie jak wpływ określonego leczenia na różnicowanie megakariocytów oraz produkcję i funkcję płytek krwi. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona metodę konsekwentnej izolacji żywotnych komórek CD34-dodatnich ze świeżej krwi pępowinowej.

Dzięki tej metodzie można również uzyskać wgląd w megakariopoezę, inne typy komórek, takie jak limfocyty, erytrocyty i makrofagi. Zacznij od dodania 10 mililitrów buforu separacyjnego do 150-mililitrowej stożkowej probówki na 10 mililitrów krwi pępowinowej. Za pomocą igły o rozmiarze 18 zamontowanej na 10-mililitrowej strzykawce, przenieś 10 mililitrów krwi do każdej probówki, a następnie dodaj 15 mililitrów pożywki do separacji limfocytów na dno każdej probówki.

Oddziel komórki przez wirowanie w gradiacji gęstości, a następnie pod koniec wirowania ostrożnie zbierz od pięciu do 10 mililitrów komórki jednojądrowej zawierającej warstwę kożucha do jednej nowej probówki na próbkę. Doprowadzić całkowitą objętość w każdej probówce do 50 mililitrów za pomocą świeżego buforu separacyjnego i ponownie odwirować komórki. Ponownie zawiesić granulki w pięciu do 10 mililitrach świeżego buforu separacyjnego i zebrać próbki komórek.

Dostosuj objętość do 50 mililitrów ze świeżym buforem separacyjnym do liczenia i odłóż 100 mikrolitrów komórek, aby określić procent komórek CD34 dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej. Ponownie odwirować komórki i ponownie zawiesić osad w 300 mikrolitrach buforu separacyjnego, 100 mikrolitrach ludzkiego odczynnika blokującego receptor FC IgG i 100 mikrolitrach kulek magnetycznych CD34 na jeden razy 10 do ósmej komórki. Delikatnie wymieszaj komórki przed umieszczeniem ich w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 30 do 40 minut inkubacji.

Podczas inkubacji umieścić odpowiednio dobraną kolumnę do separacji kulek magnetycznych w odpowiednim uchwycie magnetycznym i przemyć kolumnę trzema mililitrami buforu separacyjnego. Pod koniec inkubacji usunąć niezwiązane kulki przez odwirowanie w pięciu do 10 mililitrach buforu separacyjnego i ponownie zawiesić kulkę magnetyczną i osad komórkowy w 1,5 mililitra świeżego buforu do separacji. Załaduj oznaczone komórki do kolumny i zbierz nieoznakowany przepływ do 15-mililitrowej probówki zbiorczej.

Załaduj ścieki z powrotem do kolumny i zbierz drugą rundę przepływu do tej samej probówki zbiorczej. Następnie umyj kolumnę trzykrotnie trzema mililitrami buforu separacyjnego i wyjmij kolumnę z magnesu. Za pomocą tłoka kolumny stopniowo przepłukuj dwa mililitry buforu separacyjnego przez kolumnę do nowej rurki o pojemności 15 mililitrów i zwróć kolumnę do magnesu.

Załaduj opróżnione komórki z powrotem do kolumny. Zebrać przepływ i przemyć kolumnę dwoma mililitrami buforu separacyjnego, jak pokazano powyżej. Po wyjęciu kolumny z magnesu, przepłucz kolumnę dwoma mililitrami świeżego buforu separacyjnego, aby zebrać frakcję komórek CD34-dodatnich, jak właśnie pokazano, i zbierz komórki CD34-dodatnie przez odwirowanie.

Następnie ponownie zawiesić osad w podłożu bez surowicy dla komórek CD34-dodatnich. W celu różnicowania megakariocytów wysiewaj pięć x 10 do piątych komórek CD34-dodatnich na mililitr w 2 mililitrach pożywki bez surowicy, uzupełnionej rekombinowaną ludzką trombopoetyną na studzienkę na 12-dołkową płytkę do ich inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w wilgotnej atmosferze. W odpowiednich punktach czasowych monitorowania różnicowania należy pobrać komórki z dwóch do trzech dołków na punkt czasowy bez zakłócania pracy komórek w innych dołkach i wybarwić zebrane komórki przeciwciałami anty-CD41 i anty-CD42a w celu określenia procentu dojrzałych megakariocytów w kulturach.

W celu mikroskopowej wizualizacji na markerach powierzchni komórek, umyj zebrane komórki w 1 mililitrze buforu separacyjnego i ponownie zawieś osad w 100 mikrolitrach świeżego buforu. Użyj cytospiny, aby zasiać komórki na szklanym szkiełku i przymocuj komórki do szkiełka za pomocą 30-sekundowego zanurzenia w metanolu. Po wysuszeniu na powietrzu oznacz komórki 20 mikrolitrami pożywki montażowej uzupełnionej DAPI i przykryj komórki szkiełkiem nakrywkowym w celu wizualizacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Aby policzyć propłytki, należy zebrać komórki w ósmym lub dziewiątym dniu różnicowania i wysiać zebrane komórki w jednej x 10 do czwartej komórki na 200 mikrolitrów świeżej pożywki bez surowicy, uzupełnionej rekombinowaną ludzką trombopoetyną na dołek na 48-dołkową płytkę. Po pięciu dniach w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla policz liczbę megakariocytów zawierających propłytki w studzience pod mikroskopem światła odwróconego, używając obiektywu 10 lub 20 razy. Aby przeanalizować aktywację płytek krwi, w 14 lub 15 dniu hodowli delikatnie wymieszaj komórki za pomocą pipety Pasteura i zbierz 100 mikrolitrów komórek.

Dodaj 1 mililitr buforu Tyrode'a do komórek i osadź je przez odwirowanie. Zebrać supernatant do odwirowania, aby osadzać cząstki wielkości płytek krwi i ponownie zawiesić cząstki w 100 mikrolitrach świeżego buforu Tyrode, a następnie oznaczyć cząstki przeciwciałem anty-PAK1, aktywować je difosforanem adenozyny przez 20 minut w temperaturze pokojowej i przeanalizować procent pozytywnych zdarzeń PAK1 za pomocą cytometrii przepływowej. Typowy odsetek komórek CD34-dodatnich we krwi pępowinowej wynosi około 1,3%, a czystość komórek CD34-dodatnich CD45 po izolacji waha się od 90 do 99% Megakariocyty CD41-dodatnie obserwuje się wcześnie w hodowlach komórkowych CD34-dodatnich bez surowicy, przy czym odsetek dojrzałych megakariocytów CD41-dodatnich CD42a osiąga 30 do 40% do 7 dnia, a najwyższe poziomy komórek podwójnie dodatnich obserwuje się między 10 a 12 dniem różnicowania.

Hodowane megakariocyty pojawiają się jako duże, zwykle wielojądrzaste komórki, które wyrażają czynnik von Willebranda CD42b i selektynę P w swojej cytoplazmie. W tych hodowlach komórkowych powszechnie obserwuje się również co najmniej trzy klasy ploidalności. Odsetek megakariocytów, które zawierają propłytki, długie, perełkowate włókna, które wystają z ciała megakariocytów, wynosi zwykle około 1,3%Większość płytek krwi w supernatancie hodowli komórkowej mieści się w bramie analitycznej płytek krwi obwodowej, są dodatnie dla markera płytek krwi CD41, mogą być aktywowane przez agonistów płytek krwi, takich jak difosforan adenozyny, co wykazano przez zwiększone wiązanie przeciwciała monoklonalnego PAK1 specyficznego dla aktywacji.

Po obejrzeniu tego filmu będziesz dobrze wiedział, jak wyizolować komórki CD34-dodatnie z krwi pępowinowej. Będziesz także w stanie skonfigurować kultury różnicowania megakariocytów, policzyć propłytki krwi oraz analizować płytki krwi i megakariocyty wytworzone in vitro. Nie zapominaj, że praca z próbkami ludzkimi może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak praca w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.