Name: Różnicowanie megakariocytów i tworzenie płytek krwi z ludzkich komórek CD34 + pochodzących z krwi pępowinowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek CD34+ z krwi pępowinowej do badania różnicowania megakariocytów i produkcji płytek krwi. Technika ta umożliwia uzyskanie czystych populacji komórek z 90-99% wydajnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie Australijskiej Rady ds. Zdrowia i Badań Medycznych (grant projektu 1012409 powiązany z BHC).

Ten protokół został zatwierdzony przez Komitet Etyki Badań Naukowych na Ludziach w Południowo-Wschodnim Sydney i ratyfikowany przez Komitet Etyki Badań Naukowych Uniwersytetu Nowej Południowej Walii. Krew pępowinowa pobrana od zdrowych dawców została dostarczona przez Bank Krwi Pępowinowej w Sydney (Sydney, Nowa Południowa Walia, Australia). Do tej procedury użyto objętości około 100 ml.
UWAGA: Pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, stosując technikę aseptyczną. Odkaż zewnętrzną część worka na krew pępowinową za pomocą 70% etanolu. Do tej procedury użyj sterylnych narzędzi (nożyczek, pęsety).
1. Przygotowanie komórek krwi pępowinowej i izolacja komórek CD34+
<ol>
	<li>Przygotować sterylny bufor separacyjny (SB) z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) o pH 7,2 i zawierający 0,5% albuminy surowicy bydlęcej i 2 mM EDTA.</li>
	<li>Dozować 10 ml SB do stożkowej probówki o pojemności 50 ml (wymagana jest jedna probówka na 10 ml krwi). Za pomocą igły G18 umieszczonej na strzykawce o pojemności 10 ml pobrać 10 ml krwi z worka i przelać do probówek o pojemności 50 ml zawierających 10 ml SB.</li>
	<li>Dodać 15 ml pożywki do separacji limfocytów (patrz Tabela Materiałów) na dno probówki zawierającej rozcieńczoną krew, tworząc dwie warstwy. 
	UWAGA: Powoli dozuj media na dnie tuby, aby uniknąć mieszania różnych warstw.</li>
	<li>Probówki wirówkowe o masie 1 200 × g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) bez przerwy i bez przyspieszenia.</li>
	<li>Przenieść warstwę w pobliżu środka probówki zawierającej komórki jednojądrzaste (około 5 - 10 ml z każdej probówki) do nowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety Pasteura. Dodać SB do każdej probówki do całkowitej objętości 50 ml.</li>
	<li>Odwirować przy 400 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ostrożnie zawiesić granulki komórek za pomocą pipety Pasteura w 5 - 10 ml SB. Połączyć zawieszone komórki i zwiększyć objętość do 50 ml za pomocą SB.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym i hemocytometru lub automatycznego licznika komórek (patrz tabela materiałów). Aby określić procentową zawartość komórek CD34+ w próbce, należy ponownie zawiesić 2,5 × 105 komórek w 100 μl SB i wybarwić, dodając 10 μl przeciwciała anty-CD34-PE przez 15 - 30 minut w temperaturze 4 °C. Analizować za pomocą cytometrii przepływowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Probówki wirówkowe o stężeniu 400 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. 
	UWAGA: Jeśli nie jest to wymagane natychmiast, komórki jednojądrzaste można zamrozić na tym etapie.</li>
	<li>Zawieś komórki w 300 μl SB na10-8 komórek. Dodać 100 μl ludzkiej IgG FcR (odczynnik blokujący, patrz tabela materiałów) i 100 μl kulek magnetycznych CD34 na 108 komórek. Delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 - 40 min. 
	UWAGA: Wymagana jest zawiesina pojedynczej komórki (w razie potrzeby przepuść komórki przez filtr 30 μm przed dodaniem odczynników). Użyj opisanych tutaj objętości odczynników dla 10,8 komórek lub mniej. W przypadku więcej niż 108 komórek odpowiednio zwiększ ilość odczynników (SB, roztwór blokujący i kulki magnetyczne CD34).</li>
	<li>Przygotować kolumnę separacyjną LS w okresie inkubacji, umieszczając kolumnę LS w uchwycie magnetycznym i przemłukując ją 3 ml SB. Wyrzucić ścieki. 
	UWAGA: Kolumny separacyjne LS mogą być załadowane łącznie do 2 × 108 komórek. Dostępne są mniejsze i większe kolumny.</li>
	<li>Dodać 5 - 10 ml SB do mieszaniny komórek i odwirować przy 400 × g przez 10 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1,5 ml SB i załadować zawiesinę komórek (1,5 ml) na kolumnę LS. Zebrać przepływ zawierający nieoznakowane komórki w probówce zbiorczej o pojemności 15 ml (frakcja ujemna #1). Pozwól cieczowi spłynąć i umyj kolumnę 1,5 ml SB.</li>
	<li>Załaduj zebrany przepływ (3 ml) z powrotem do kolumny i zbierz przepływ do tej samej probówki zbiorczej o pojemności 15 ml (frakcja ujemna #1). Umyj kolumnę LS 3 razy 3 ml SB. 
	UWAGA: W razie potrzeby komórki we frakcji ujemnej (12 ml) można wybarwić przeciwciałem anty-CD34 w celu zapewnienia wychwycenia komórek CD34 + przez kolumnę LS.</li>
	<li>Wyjąć kolumnę z separatora magnetycznego i powoli przepłukać komórki tłokiem strzykawki do nowej probówki o pojemności 15 ml z 2 ml SB.</li>
	<li>Umieść kolumnę z powrotem na separatorze magnetycznym i załaduj 2 ml komórek z powrotem do kolumny. Zebrać przepływ i przemyć 2 ml SB. Jest to frakcja ujemna #2 (4 ml).</li>
	<li>Wyjmij kolumnę LS z separatora magnetycznego i dodaj 2 ml SB. Równomiernie i stanowczo przepłukać komórki tłokiem strzykawki, aby zebrać frakcję komórek CD34+. Policz komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym i hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Probówkę wirówkową z frakcją dodatnią o stężeniu 400 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w pożywce wolnej od surowicy dla komórek CD34+ (SFM, patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Jeśli nie jest to wymagane natychmiast, komórki można na tym etapie zamrozić w ciekłym azocie.</li>
</ol>
2. Kontrola czystości izolowanych komórek CD34+
<ol>
	<li>Wybarwić 2 x 104 komórki z frakcji dodatniej 10 μl przeciwciała anty-CD34-PE i 20 μl przeciwciała anty-CD45-PerCP przez 15 minut w temperaturze 4 °C (użyć oddzielnej probówki do kontroli izotypu) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Dodaj 1 ml SB do umycia. Wirować przy 400 × g przez 10 min. Zawiesić osad w 200 μl SB.</li>
	<li>Wykonaj analizę cytometrii przepływowej i przelej populację żywych komórek, aby wykluczyć szczątki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Ustaw bramkę dla populacji PE i PerCP dodatnich za pomocą kontroli izotypu PE i PerCP (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B) i określ procent komórek CD34 + / CD45 +.</li>
</ol>
3. Różnicowanie megakariocytów
<ol>
	<li>Nasiona 5 × 105 komórek/ml komórek CD34 + w 2 ml SFM uzupełnionych 50 ng / ml rekombinowanej ludzkiej trombopoetyny (rhTPO) na dołek na płytce 12-dołkowej. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w wilgotnej atmosferze. Jeśli komórki zlewają się, zanim będą potrzebne do analizy, zbierz komórki i podziel je na wiele dołków za pomocą świeżej pożywki i rhTPO. 
	UWAGA: Dwa lub trzy dołki powinny być przygotowane specjalnie do monitorowania różnicowania w różnych punktach czasowych (np. dni 7, 9 i 10).</li>
	<li>Zbieraj komórki z odłożonych na bok studni w celu monitorowania różnicowania bez zakłócania komórek w innych studzienkach.</li>
	<li>Wybarwić komórki 20 μl przeciwciała anty-GPIIb/CD41-FITC i 10 μl przeciwciała anty-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 w końcowej objętości 100 μl. Ustawić probówkę kontrolną przy użyciu odpowiednich przeciwciał kontrolnych izotypu. Inkubować przez 15 - 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodaj 1 ml SB do umycia. Wirować przy 400 × g przez 10 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 - 300 μl SB. Przeprowadzić analizę za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Dla każdego fluoroforu przeanalizuj kontrole izotypu, aby ustawić bramkowanie dla populacji dodatnich FITC i Alexa Flour 647. Przeanalizuj barwione próbki komórek, aby określić procent podwójnie dodatnich komórek CD41 + / CD42a +, które reprezentują dojrzałe MK (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C).</li>
	<li>Do mikroskopowej wizualizacji markerów powierzchni komórek należy wybarwić komórki, jak opisano w ppkt 3.3.
	<ol>
		<li>Dodaj 1 ml SB do umycia. Wirować przy 400 × g przez 10 min. Zawiesić osad w 100 μl SB i wirować na szkiełku podstawowym o stężeniu 1 000 x g przez 5 minut. Zamocuj komórki na szkiełku, zanurzając je w metanolu na 30 sekund. Wysuszyć na powietrzu, dodać 20 μl podłoża montażowego zawierającego DAPI (patrz Tabela Materiałów), przykryć szkiełkiem nakrywkowym i zobrazować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu wizualizacji antygenów wewnątrzkomórkowych należy ponownie zawiesić komórki w PBS i utrwalić paraformaldehydem (1% stężenie końcowe) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Aby przepuszczalność komórek należy dodać tryton-X 100 (0,1%) i inkubować przez 15 minut. Umyj komórki 2 ml PBS/0,1% triton-X 100. Zawiesić w 100 μl PBS/0,1% tryton-X 100, dodać przeciwciała anty vWf i anty CD62p (rozcieńczenie 1:200) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Przemyć 2 ml PBS/0,1% triton-X 100 i odwirować przy 400 × g przez 10 minut, ponownie zawiesić w 100 μl tego samego buforu i dodać anty-mysie IgG-Alexa 594 i anty-królicze IgG-Alexa 488 (1:100). Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, przemyć 2 ml PBS/0,1% triton-X 100, ponownie zawiesić w 100 μl tego samego buforu i dodać 20 μl anty CD42b-APC. Następnie obrócić komórki na szkiełkach podstawowych zgodnie z opisem w kroku 3.6.1 i przygotować próbki do wizualizacji mikroskopowej, jak opisano w kroku 3.6.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu określenia ploidalności należy zebrać komórki w 12 lub 13 dniu różnicowania. Dodaj 1 ml SB do umycia. Odwirować w temperaturze 400 × g przez 10 minut i wybarwić 20 μl przeciwciała anty-GPIIb/CD41-FITC w końcowej objętości 100 μl. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
	<ol>
		<li>Przemyć raz 1 ml SB i ponownie zawiesić osad w 300 μl hipotonicznego buforu cytrynianowego (1,25 mM cytrynian sodu, 2,5 mM chlorek sodu, 3,5 mM dekstroza) zawierającego 20 μg/ml jodku propidyny i 0,05% Triton-X 100. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.</li>
		<li>Dodać RNazę do końcowego stężenia 20 μg/ml i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem. Określ intensywność jodku propydyny za pomocą cytometrii przepływowej, zbierając od 30 000 do 50 000 zdarzeń populacji CD41-FITC+ (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Liczenie propłytek, oznaczanie liczby płytek krwi i aktywacja płytek krwi
<ol>
	<li>Zebrać komórki (od kroku 3.1) w 8 lub 9 dniu różnicowania i wysiać w 1 ×10 4 komórki/basenik na 48-dołkowych płytkach w 200 μl świeżej SFM uzupełnionej 50 ng/ml rhTPO. Hodowla przez 5 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . 
	UWAGA: W celu oceny ilościowej dołki nasienne należy wykonać w trzech egzemplarzach. Ta niska gęstość jest wymagana do wizualizacji i zliczania MK zawierających propłytki. Propłytki zwykle zaczynają pojawiać się po 2 dniach hodowli. Szczyt przypada na 4 i 5 dzień.</li>
	<li>Policz liczbę MK zawierających propłytki w całym dołku w mikroskopie światła odwróconego przy użyciu obiektywów 10X lub 20X. 
	UWAGA: Preferowany jest podgrzewany (37 °C) stolik mikroskopowy, ponieważ utrzymywanie komórek w temperaturze pokojowej przez dłuższy czas powoduje kurczenie się przedłużeń propłytkowych. Propłytki są obserwowane jako długie wyprostowania od ciała MK. Każdy MK może mieć kilka wypukłości płytkowych. Wraz z rozwojem propłytek ciała MK zmniejsza się.</li>
	<li>Zebrać komórki i odwirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wybarwić komórki 20 μl przeciwciałem antyludzkim CD41-FITC, jak opisano w krokach 3.3 i 3.4. Obliczać procent MK zawierającego propłytki (pbMK): pbMK (%) = [(MK zawierające propłytki/dołek) / (Całkowita liczba komórek CD41+/dołek)] x 100</li>
	<li>Aby policzyć płytki krwi uwolnione do pożywki, delikatnie wymieszaj komórki pipetą Pasteura i zbierz 100 μl w 14 lub 15 dniu hodowli.
	<ol>
		<li>Barwienie 20 μl przeciwciała anty-ludzkiego CD41-FITC przez 20 - 30 min w temperaturze 4 °C. Ustawić probówkę kontrolną przy użyciu odpowiedniego przeciwciała kontrolnego izotypu.</li>
		<li>Dodać 150 μl SB i 50 μl kulek do liczenia.</li>
		<li>W przypadku analizy cytometrii przepływowej należy ustawić FSC i SSC na skalę logarytmiczną. Użyj normalnych płytek krwi ludzkiej z osocza bogatopłytkowego wybarwionego CD41-FITC, jak opisano w sekcji 4.4.1, aby ustawić bramkowanie dla płytek krwi (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A).</li>
		<li>Przeanalizować wybarwione płytki krwi za pomocą kulek zliczających za pomocą cytometrii przepływowej. Zbierz 1,000 zdarzeń liczenia koralików za pomocą wykresu punktowego FSC kontra SSC (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). Oblicz liczbę płytek krwi na podstawie dodatnich zdarzeń CD41-FITC (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B) za pomocą wzoru: 
		Płytki krwi na μl=[(liczba dodatnich zdarzeń CD41-FITC)/1,000 kulek)] x [(liczba kulek w 50 μl)/objętość próbki)]</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przeanalizować aktywację płytek krwi, delikatnie wymieszaj komórki pipetą Pasteura i zbierz 100 μl w 14 lub 15 dniu hodowli. Dodać 1 ml buforu Tyrode'a (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 0,2 mM Na2HPO4, 12 mM NaHCO3, 5,5 mM D-glukozy, pH 6,5) i odwirować przy 200 x g przez 5 minut do komórek osadkowych.
	<ol>
		<li>Zebrać sklarowany osad i odwirować przy sile 800 x g przez 10 minut, aby uzyskać osadzanie cząstek wielkości płytek krwi.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 100 μl buforu Tyrode. Dodać 20 μl przeciwciała PAC1-FITC i difosforanu adenozyny (ADP) do końcowego stężenia 20 μM. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 min. Analiza za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia odsetka pozytywnych zdarzeń FITC. Należy użyć świeżych ludzkich płytek krwi potraktowanych w taki sam sposób, jak kontrola pozytywna (<silna klasa="xfig">Ryc. 3C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Nakeff, A., Maat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+megakaryocytes+from+mouse+bone+marrow+by+velocity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation.</a> Blood. 43 (4), 591-595 (1974).</li>
<li>Zeigler, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+megakaryocytopoietic+and+thrombopoietic+activity+of+c-mpl+ligand+%28TPO%29+on+purified+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells.</a> Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).</li>
<li>Reems, J. -A., Pineault, N., Sun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Megakaryocyte+Production+and+Platelet+Biogenesis%3A+State+of+the+Art%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).</li>
<li>Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+generated+in+vitro+from+proplatelet-displaying+human+megakaryocytes+are+functional%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional.</a> Blood. 85 (2), 402-413 (1995).</li>
<li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monopartite+sequence+is+essential+for+p45+NF-E2+nuclear+translocation%2C+transcriptional+activity+and+platelet+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production.</a> J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).</li>
<li>Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profile+of+primary+human+CD34%2BCD38lo+cells+differentiating+along+the+megakaryocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage.</a> Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).</li>
<li>Feng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+generation+of+universal+platelets+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).</li>
<li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+megakaryocyte+differentiation+of+fresh+and+ex-vivo+expanded+cord+blood+cells%3A+rapid+and+transient+megakaryocyte+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution.</a> Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).</li>
<li>Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+thrombocytopenia%3A+antiplatelet+autoantibodies+inhibit+proplatelet+formation+by+megakaryocytes+and+impair+platelet+production+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro.</a> Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).</li>
<li>Lev, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+proplatelet+formation+in+immune+thrombocytopenia%3A+a+novel+mechanism+contributing+to+decreased+platelet+count%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count.</a> Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).</li>
<li>Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+for+generating+platelet-like+fragments+from+megakaryocytic+cell+lines+and+human+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol.+Dis%22%5BJournal%5D)">A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells.</a> Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).</li>
<li>Lu, S. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+generated+from+human+embryonic+stem+cells+are+functional+in+vitro+and+in+the+microcirculation+of+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice.</a> Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).</li>
<li>Moreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+production+of+megakaryocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+by+chemically+defined+forward+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commun%22%5BJournal%5D)">Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming.</a> Nature Commun. 7, 11208(2016).</li>
<li>De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+of+megakaryocyte+progenitor+cells%3A+cord+blood+versus+mobilized+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood.</a> Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).</li>
<li>Nimgaonkar, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+population+of+CD34%2B+cells+in+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">A unique population of CD34+ cells in cord blood.</a> Stem cells. 13 (2), Dayton, Ohio. 158-166 (1995).</li>
<li>Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+proplatelet+elaboration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Mechanics of proplatelet elaboration.</a> J Thromb Haemost. 5, Suppl 1. 18-23 (2007).</li>
<li>Matsunaga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+large-scale+generation+of+human+platelets+from+cord+blood+CD34%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells.</a> Stem cells. 24 (12), Dayton, Ohio. 2877-2887 (2006).</li>
<li>Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+continuous+in+vitro+human+platelet+production+using+three-dimensional+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds.</a> Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).</li>
<li>Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+ex+vivo+expansion+of+megakaryocytes+from+human+cord+blood+CD34%2B-enriched+cells+in+the+presence+of+thrombopoietin+and+limiting+amounts+of+stem+cell+factor+and+Flt-3+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hematother.+Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand.</a> J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).</li>
<li>Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+megakaryocytes+do+not+complete+maturation%2C+as+indicated+by+impaired+establishment+of+endomitosis+and+low+expression+of+G1%2FS+cyclins+upon+thrombopoietin-induced+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation.</a> Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).</li>
<li>Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23714310">Drug-induced Immune Thrombocytopenia.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).</li>
<li>Stasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+thrombocytopenic+purpura%3A+Current+concepts+in+pathophysiology+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management.</a> Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół jest odpowiedni do konsekwentnego wytwarzania MK i płytek krwi w posiewie z krwi pępowinowej. Komórki te mogą być wykorzystywane do badania różnych procesów, takich jak wpływ leków lub aktywności biologicznej na proliferację MK, różnicowanie, tworzenie propłytek krwi i produkcję płytek krwi.
W literaturze przedstawiono różnorodne kombinacje pożywek hodowlanych i cytokin. Dodanie cytokin, takich jak czynnik komórek macierzystych, ligand Flt-3, IL-3 i IL-6 wspomaga prolife...

Izolacja odpowiedniej liczby pierwotnych ludzkich megakariocytów (MK) do regularnego użytku laboratoryjnego nie jest możliwa ze względu na ich niską częstotliwość w szpiku kostnym, gdzie stanowią ~0,01% komórek jądrzastych1. Dogodną alternatywą jest ekspansja i różnicowanie ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w obecności określonych czynników wzrostu. Szereg cytokin, w tym czynnik komórek macierzystych (SCF; ligand c-kit) oraz interleukina (IL)-3 i IL-11, zostały wykorzystane w systemach hodowlanych do produkcji MK. Trombopoetyna (TPO) jest najskuteczniejszym czynnikiem wzrostu i różnicowania dla kultur megakariocytarnych i jest skuteczna samodzielnie lub z innymi cytokinami, takimi jak SCF i IL-32. TPO może oddziaływać na populacje komórek macierzystych, powodując zarówno proliferację, jak i dojrzewanie MKs2.
MK wytwarzają płytki krwi z wypukłości cytoplazmatycznych zwanych proplateletkami, a in vivo, około 1 x10 11 płytek krwi jest tworzonych dziennie, aby utrzymać liczbę płytek krwi na poziomie 150 - 400 x 109/L. Produkcja płytek krwi in vitro jest do 1000 razy niższa niż szacunki in vivo3, co spowodowało powstanie licznych warunków hodowli przy użyciu CD34+ hematopoetyczne komórki progenitorowe w celu poprawy produkcji MK i płytek krwi in vitro. Pierwotnym źródłem komórek CD34+ wykorzystywanych do różnicowania MK była ludzka krew obwodowa4. Inne źródła komórek to szpik kostny5,6, embrionalne komórki macierzyste/indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (ESC/iPSC)7, oraz krew pępowinowa (UCB)8,9,10. Ludzki szpik kostny CD34+ 11 i ujemne komórki szpiku kostnego linii myszy5 wytwarzają MK i płytki krwi in vitro; niemniej jednak brak dostępności ludzkiego szpiku kostnego ogranicza jego wykorzystanie jako źródła komórek CD34+. Natomiast ESC i iPSC stanowią nieograniczone źródło komórek do produkcji płytek krwi in vitro. Produkcja płytek krwi z tych komórek wymaga komórek żywicielskich, takich jak mysie komórki OP9 i dłuższych okresów hodowli. Płytki krwi uzyskane w warunkach wolnych od karmowadnika wydają się być mniej funkcjonalne12. Płytki krwi pochodzące z iPSC mogą być przydatne w warunkach klinicznych, ponieważ można je rozszerzyć na dużą skalę. Proces ten wymaga transdukcji czynników transkrypcyjnych za pośrednictwem lentiwirusa i długotrwałej hodowli komórek13.
UCB jest dostępnym źródłem komórek CD34+, które mogą być łatwo wykorzystane w warunkach badawczych. Sam TPO może sprzyjać różnicowaniu komórek CD34 + pochodzących z krwi pępowinowej, co prowadzi do powstania wysoce czystych, dojrzałych MK bez potrzeby suplementacji surowicy lub kohodowli z komórkami zasilającymi. Inne cytokiny, takie jak SCF, mogą zmniejszać różnicowanie z komórkami UCB CD34 +, podczas gdy ligand Flt-3 i IL-11 promują produkcję niedojrzałych megakariocytów14. Protokół ten opisuje produkcję wysoce czystych kultur MK z komórek CD34+ krwi pępowinowej w warunkach wolnych od surowicy.

<table><tbody><tr><td>Cell Culture Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human TPO</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-013</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM II</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>9605</td><td>Pożywka bez surowicy dla komórek CD34 +</td></tr> <tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Odczynniki izolacyjne CD34</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD34 Zestaw mikrokulek ultraczysty</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-453</td><td>Ten zestaw zawiera ludzki odczynnik blokujący IgG FcR i mikrogranulki CD34. Koraliki te zawierają klon przeciwciała anty-CD34 QBEND/10. Użyj innego klonu anty-CD34 do kontroli czystości (np. klon 8G12).</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies</td><td>1114545</td><td>Pożywka do separacji limfocytów (gęstość 1,077 g / ml)</td></tr> <tr><td>Sterylny bufor separacyjny (SB)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td>Ten bufor zawiera sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), pH 7,2 zawierającą 0,5% albuminy surowicy bydlęcej i 2 mM EDTA. Można go przygotować przy użyciu sterylnych składników klasy hodowli komórkowych. Odgazuj przed użyciem, ponieważ pęcherzyki powietrza mogą zablokować kolumnę.</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</strong</td><td>>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Cytometria przepływowa i odczynniki do barwienia komórek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Mysz anty-ludzka CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>340669</td><td>klon 8G12. Można to wykorzystać do kontroli czystości CD34. Końcowe stężenie przeciwciał rozcieńczenie 1:10.</td></tr><tr><td>Mysz PerCP anty-ludzka CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>347464</td><td>Rozcieńczenie 1:10</td></tr><tr><td>Kontrola izotypu PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>349044</td><td>Rozcieńczenie 1:10</td></tr><tr><td>FITC Mysz anty-ludzka CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>340929</td><td>Końcowe stężenie przeciwciał 1:5 rozcieńczenie.</td></tr><tr><td>APC Mysz anty-ludzka CD42b</td><td>BD Biosciences</td><td>551061</td><td>To przeciwciało może być również używane do wykrywania dojrzałych MK (odsetek komórek dodatnich w zwykle niższy niż w przypadku anty CD42a). Końcowe stężenie przeciwciał rozcieńczenie 1:10.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mysz anty-ludzka CD42a</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1227A647T</td><td>Obecnie dystrybuowany przez Bio-Rad. Końcowe stężenie przeciwciał rozcieńczenie 1:10.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mysz Negative Control</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA928A647</td><td>Obecnie dystrybuowany przez Bio-Rad. Przeciwciało kontrolujące izotyp</td></tr><tr><td>Czynnik anty von Willebranda królik poliklonalny</td><td>Abcam</td><td>AB6994</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>V450 mysi anty-humna CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>58425</td><td>1: 20 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>V450 kontrola izotypu</td><td>BD Biosciences</td><td>580373</td><td>rozcieńczenie 1:20</td></tr><tr><td>przeciwciało PAC1-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>340507</td><td>1:10 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Mysz anty CD62p monoklonalny</td><td>Abcam</td><td>AB6632</td><td>rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 koza anty królik IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:100 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 koza anty mysie IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11020</td><td>1:100 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Ig Isotype Control cocktail-C</td><td>BD Biosciences</td><td>558659</td><td>Przeciwciało kontrolne izotypu</td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting Beads</td><td>Sondy molekularne, Invitrogen</td><td>C36950</td><td>Koraliki do liczenia</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS kolumny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Mniejsze i większe kolumny są również dostępne w handlu</td></tr><tr><td>MidiMACS Separator magnetyczny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5mL okrągłe rurki polipropylenowe FACS, z zatrzaskiem, sterylne</td><td>technologie In Vitro</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>Menzel-Glaser</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Nośniki montażowe z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Nośnik montażowy Antifade z DAPI</td></tr><<tr><td>strong>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td></td><td>Leica</td><td>DMIRB</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>Vert.A1</td><td></td></tr><tr><td>Analizator komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka cytospinowa</td><td>ThermoScientific</td><td>Cytospin 4</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Katalog Number</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell analyser</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Diva Software</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy pojedynczych komórek</td><td>Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do mikroskopu fluorescencyjnego</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2 blue edition</td><td></td></tr></tbody></table>

różnicowanie megakariocytów i tworzenie płytek krwi z ludzkich komórek cd34 + pochodzących z krwi pępowinowej

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Produkcja płytek krwi zachodzi głównie w szpiku kostnym w procesie znanym jako trombopoeza. Podczas trombopoezy krwiotwórcze komórki progenitorowe różnicują się, tworząc prekursory płytek krwi zwane megakariocytami, które ostatecznie różnicują się, uwalniając płytki krwi z długich procesów cytoplazmatycznych zwanych propłytkami. Megakariocyty są rzadkimi komórkami ograniczonymi do szpiku kostnego i dlatego trudno je pobrać w wystarczającej liczbie do użytku laboratoryjnego. Wydajną produkcję ludzkich megakariocytów można osiągnąć in vitro poprzez hodowlę komórek CD34+ w odpowiednich warunkach. Szczegółowo opisany tutaj protokół opisuje izolację komórek CD34 + przez magnetyczne sortowanie komórek z próbek krwi pępowinowej. Opisano etapy niezbędne do wytworzenia wysoce czystych, dojrzałych megakariocytów w warunkach wolnych od surowicy. Podano również szczegóły analizy fenotypowej różnicowania megakariocytów oraz oznaczania tworzenia i wytwarzania propłytek krwi. Efektory, które wpływają na różnicowanie megakariocytów i/lub tworzenie propłytek, takie jak przeciwciała przeciwpłytkowe lub mimetyki trombopoetyny, można dodać do hodowanych komórek w celu zbadania funkcji biologicznych.

Niniejszy protokół umożliwia przygotowanie wysokiej czystości kultur MK z komórek CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej. Procent komórek CD34+ w krwi pępowinowej wynosi około 1,3%15 (Rycina 1A), a całkowita liczba komórek mononuklearnych (krok 1.8) mieści się w zakresie od 90 do 30 x 106 na jednostkę UCB. Czystość komórek CD34+/CD45+ po izolacji wynosi od 90 do 9% (Rycina 1B</strong...

Wysoce czystą populację megakariocytów można uzyskać z komórek CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej. Opisano tutaj metodę izolacji komórek CD34+ i różnicowania megakariocytów.

Różnicowanie megakariocytów i tworzenie płytek krwi z ludzkich komórek CD34 + pochodzących z krwi pępowinowej

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie próbek ludzkiej krwi pępowinowej do wyizolowania czystych komórek CD34-dodatnich w celu zbadania wpływu określonych leków będących przedmiotem zainteresowania na różnicowanie megakariocytów, tworzenie propłytek krwi i produkcję płytek krwi. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące megakariocytów i płytek krwi, takie jak wpływ określonego leczenia na różnicowanie megakariocytów oraz produkcję i funkcję płytek krwi. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona metodę konsekwentnej izolacji żywotnych komórek CD34-dodatnich ze świeżej krwi pępowinowej.Dzięki tej metodzie można również uzyskać wgląd w megakariopoezę, inne typy komórek, takie jak limfocyty, erytrocyty i makrofagi. Zacznij od dodania 10 mililitrów buforu separacyjnego do 150-mililitrowej stożkowej probówki na 10 mililitrów krwi pępowinowej. Za pomocą igły o rozmiarze 18 zamontowanej na 10-mililitrowej strzykawce, przenieś 10 mililitrów krwi do każdej probówki, a następnie dodaj 15 mililitrów pożywki do separacji limfocytów na dno każdej probówki.Oddziel komórki przez wirowanie w gradiacji gęstości, a następnie pod koniec wirowania ostrożnie zbierz od pięciu do 10 mililitrów komórki jednojądrowej zawierającej warstwę kożucha do jednej nowej probówki na próbkę. Doprowadzić całkowitą objętość w każdej probówce do 50 mililitrów za pomocą świeżego buforu separacyjnego i ponownie odwirować komórki. Ponownie zawiesić granulki w pięciu do 10 mililitrach świeżego buforu separacyjnego i zebrać próbki komórek.Dostosuj objętość do 50 mililitrów ze świeżym buforem separacyjnym do liczenia i odłóż 100 mikrolitrów komórek, aby określić procent komórek CD34 dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej. Ponownie odwirować komórki i ponownie zawiesić osad w 300 mikrolitrach buforu separacyjnego, 100 mikrolitrach ludzkiego odczynnika blokującego receptor FC IgG i 100 mikrolitrach kulek magnetycznych CD34 na jeden razy 10 do ósmej komórki. Delikatnie wymieszaj komórki przed umieszczeniem ich w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 30 do 40 minut inkubacji.Podczas inkubacji umieścić odpowiednio dobraną kolumnę do separacji kulek magnetycznych w odpowiednim uchwycie magnetycznym i przemyć kolumnę trzema mililitrami buforu separacyjnego. Pod koniec inkubacji usunąć niezwiązane kulki przez odwirowanie w pięciu do 10 mililitrach buforu separacyjnego i ponownie zawiesić kulkę magnetyczną i osad komórkowy w 1,5 mililitra świeżego buforu do separacji. Załaduj oznaczone komórki do kolumny i zbierz nieoznakowany przepływ do 15-mililitrowej probówki zbiorczej.Załaduj ścieki z powrotem do kolumny i zbierz drugą rundę przepływu do tej samej probówki zbiorczej. Następnie umyj kolumnę trzykrotnie trzema mililitrami buforu separacyjnego i wyjmij kolumnę z magnesu. Za pomocą tłoka kolumny stopniowo przepłukuj dwa mililitry buforu separacyjnego przez kolumnę do nowej rurki o pojemności 15 mililitrów i zwróć kolumnę do magnesu.Załaduj opróżnione komórki z powrotem do kolumny. Zebrać przepływ i przemyć kolumnę dwoma mililitrami buforu separacyjnego, jak pokazano powyżej. Po wyjęciu kolumny z magnesu, przepłucz kolumnę dwoma mililitrami świeżego buforu separacyjnego, aby zebrać frakcję komórek CD34-dodatnich, jak właśnie pokazano, i zbierz komórki CD34-dodatnie przez odwirowanie.Następnie ponownie zawiesić osad w podłożu bez surowicy dla komórek CD34-dodatnich. W celu różnicowania megakariocytów wysiewaj pięć x 10 do piątych komórek CD34-dodatnich na mililitr w 2 mililitrach pożywki bez surowicy, uzupełnionej rekombinowaną ludzką trombopoetyną na studzienkę na 12-dołkową płytkę do ich inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w wilgotnej atmosferze. W odpowiednich punktach czasowych monitorowania różnicowania należy pobrać komórki z dwóch do trzech dołków na punkt czasowy bez zakłócania pracy komórek w innych dołkach i wybarwić zebrane komórki przeciwciałami anty-CD41 i anty-CD42a w celu określenia procentu dojrzałych megakariocytów w kulturach.W celu mikroskopowej wizualizacji na markerach powierzchni komórek, umyj zebrane komórki w 1 mililitrze buforu separacyjnego i ponownie zawieś osad w 100 mikrolitrach świeżego buforu. Użyj cytospiny, aby zasiać komórki na szklanym szkiełku i przymocuj komórki do szkiełka za pomocą 30-sekundowego zanurzenia w metanolu. Po wysuszeniu na powietrzu oznacz komórki 20 mikrolitrami pożywki montażowej uzupełnionej DAPI i przykryj komórki szkiełkiem nakrywkowym w celu wizualizacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.Aby policzyć propłytki, należy zebrać komórki w ósmym lub dziewiątym dniu różnicowania i wysiać zebrane komórki w jednej x 10 do czwartej komórki na 200 mikrolitrów świeżej pożywki bez surowicy, uzupełnionej rekombinowaną ludzką trombopoetyną na dołek na 48-dołkową płytkę. Po pięciu dniach w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla policz liczbę megakariocytów zawierających propłytki w studzience pod mikroskopem światła odwróconego, używając obiektywu 10 lub 20 razy. Aby przeanalizować aktywację płytek krwi, w 14 lub 15 dniu hodowli delikatnie wymieszaj komórki za pomocą pipety Pasteura i zbierz 100 mikrolitrów komórek.Dodaj 1 mililitr buforu Tyrode'a do komórek i osadź je przez odwirowanie. Zebrać supernatant do odwirowania, aby osadzać cząstki wielkości płytek krwi i ponownie zawiesić cząstki w 100 mikrolitrach świeżego buforu Tyrode, a następnie oznaczyć cząstki przeciwciałem anty-PAK1, aktywować je difosforanem adenozyny przez 20 minut w temperaturze pokojowej i przeanalizować procent pozytywnych zdarzeń PAK1 za pomocą cytometrii przepływowej. Typowy odsetek komórek CD34-dodatnich we krwi pępowinowej wynosi około 1,3%, a czystość komórek CD34-dodatnich CD45 po izolacji waha się od 90 do 99% Megakariocyty CD41-dodatnie obserwuje się wcześnie w hodowlach komórkowych CD34-dodatnich bez surowicy, przy czym odsetek dojrzałych megakariocytów CD41-dodatnich CD42a osiąga 30 do 40% do 7 dnia, a najwyższe poziomy komórek podwójnie dodatnich obserwuje się między 10 a 12 dniem różnicowania.Hodowane megakariocyty pojawiają się jako duże, zwykle wielojądrzaste komórki, które wyrażają czynnik von Willebranda CD42b i selektynę P w swojej cytoplazmie. W tych hodowlach komórkowych powszechnie obserwuje się również co najmniej trzy klasy ploidalności. Odsetek megakariocytów, które zawierają propłytki, długie, perełkowate włókna, które wystają z ciała megakariocytów, wynosi zwykle około 1,3%Większość płytek krwi w supernatancie hodowli komórkowej mieści się w bramie analitycznej płytek krwi obwodowej, są dodatnie dla markera płytek krwi CD41, mogą być aktywowane przez agonistów płytek krwi, takich jak difosforan adenozyny, co wykazano przez zwiększone wiązanie przeciwciała monoklonalnego PAK1 specyficznego dla aktywacji.Po obejrzeniu tego filmu będziesz dobrze wiedział, jak wyizolować komórki CD34-dodatnie z krwi pępowinowej. Będziesz także w stanie skonfigurować kultury różnicowania megakariocytów, policzyć propłytki krwi oraz analizować płytki krwi i megakariocyty wytworzone in vitro. Nie zapominaj, że praca z próbkami ludzkimi może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak praca w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.

megakaryocyte-differentiation-platelet-formation-from-human-cord

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje technikę różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi. Hematopoetyczne komórki progenitorowe macierzyste — wyizolowane z ludzkiej krwi pępowinowej — różnicują się w dojrzałe megakariocyty w obecności trombopoetyny. Dojrzałe megakariocyty wytwarzają cytoplazmatyczne rozszerzenia zwane propłytkami, które dają początek pojedynczym płytkom krwi.

Metoda in vitro do różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), używane do różnicowania hPSC na hematopoetyczne komórki progenitorowe CD34+. Metoda ta wykorzystuje specyficzną dla etapu manipulację kanoniczną sygnalizacją WNT w celu określenia komórek wyłącznie do ostatecznego lub pierwotnego programu krwiotwórczego.

Ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki immunofenotypowej i indukowanego cytokinami różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej do czterech linii szpikowych. Zastosowania tego protokołu obejmują badania nad wpływem mutacji choroby szpikowej lub małych cząsteczek na różnicowanie szpiku komórek CD34+.

Różnicowanie szpikowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej

Ta metoda opisuje oczyszczanie za pomocą cytometrii przepływowej MEP i MKp z kości udowych, piszczelowych i miednicy myszy.

Izolacja progenitorów megakariocytów myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje wszystkie etapy związane z uzyskaniem hematopoetycznych progenitorów CD34+ pochodzących z leukofiltrów oraz ich różnicowaniem in vitro i dojrzewaniem do megakariocytów zawierających propłytki, które są w stanie uwalniać płytki krwi w pożywce hodowlanej. Ta procedura jest przydatna do dogłębnej analizy mechanizmów komórkowych i molekularnych kontrolujących megakariopoezę.

Komórki CD34 + pochodzące z filtrów Leukodepletion jako źródło komórek do badania różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi

Tutaj prezentujemy strategię immunofenotypowania do charakterystyki różnicowania megakariocytów i pokazujemy, jak ta strategia pozwala na sortowanie megakariocytów na różnych etapach za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją. Metodologia ta może być stosowana do pierwotnych tkanek ludzkich, ale także do megakariocytów wytwarzanych w hodowli in vitro.

Immunofenotypowanie i sortowanie komórek ludzkich MK ze źródeł pierwotnych u ludzi lub zróżnicowanych in vitro z progenitorów hematopoetycznych

Modelowanie erytropoezy daje cenną szansę na zrozumienie biologicznego znaczenia aktorów w tym procesie i ocenę nowych podejść terapeutycznych, które mogą złagodzić wady różnicowania. W tym miejscu opisujemy prostą i niezawodną metodę skutecznego różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ ex vivo.

Kompleksowy proces oceny skuteczności erytropoezy u ludzi in vitro i ex vivo

Opisujemy metodę generowania limfocytów T regulatorowych, pamięci oraz naiwnych od jednego ludzkiego dawcy krwi. Spolaryzowane limfocyty Treg mogą być następnie porównywane z innymi subpopulacjami w różnych zastosowaniach genetycznych i funkcjonalnych przy zachowaniu homogeniczności genetycznej, w tym w teście supresji, który również został tutaj szczegółowo opisany.

Generowanie indukowanych limfocytów T regulatorowych z pierwotnych ludzkich naiwnych limfocytów T oraz limfocytów T pamięci

wyrażające specyficzny dla CD19 receptor antygenu chimerycznego (CAR) są podawane jako eksperymentalne leczenie nowotworów złośliwych komórek B w naszych pierwszych badaniach klinicznych terapii genowej u ludzi. Opisujemy modyfikację genetyczną limfocytów T przy użyciu systemu Śpiącej Królewny (SB) w celu wprowadzenia specyficznego dla CD19 CAR i selektywnej propagacji na zaprojektowanych sztucznych komórkach prezentujących antygen CD19 +.

Kliniczne zastosowanie śpiącej królewny i sztucznych komórek prezentujących antygen do genetycznej modyfikacji limfocytów T z krwi obwodowej i pępowinowej

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Poznaj metodę izolacji komórek CD34+ z krwi pępowinowej do badania różnicowania megakariocytów i produkcji płytek krwi. Technika ta umożliwia uzyskanie czystych populacji komórek z 90-99% wydajnością.

Różnicowanie megakariocytów i tworzenie płytek krwi z ludzkich komórek CD34 ⁺ pochodzących z krwi pępowinowej

Przeglądaj więcej filmów