Name: Ekspresja antygenów egzogennych w szczepionce BCG przeciwko Mycobacterium bovis poprzez niegenetyczne zdobienie powierzchni za pomocą systemu Avidin-biotyna (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Poznaj metodę dekoracji powierzchni BCG za pomocą systemu avidyna-biotyna jako alternatywę dla podejść genetycznych. Technika ta umożliwia szybkie ekspresowanie antygenów egzogennych i poprawę immunogenności szczepionki przeciwko gruźlicy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. R. Stokesowi za szczep BCG Pasteur i A. Talalowi za wsparcie techniczne. Dziękujemy również GenScript za pomoc w syntezie genów.

Wszystkie zwierzęta były utrzymywane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej. Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami. Numer ubezpieczenia dobrostanu zwierząt to A11-0247.
1. Generacja monomerycznych białek fuzyjnych awidyny eksprymujących plazmidy
<ol>
	<li>Sub-klonuj monomeryczną sekwencję awidyny12 do plazmidu pDEST17 między miejscami "CTC" i "GAA", co odpowiada 133-134bp. (tj. między 6-histagiem a miejscem rekombinacji pDEST17 Attr1), aby otrzymać p17-Avi. 
	UWAGA: Monomeryczna sekwencja DNA awidyny jest pokazana poniżej. Trzy mutacje wprowadzone do awidyny typu dzikiego w celu uzyskania awidyny monomerycznej są pokazane pogrubionymi znakami. 
	gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc 
	agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac 
	acaaGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct 
	tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac 
	attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgccaca cagaaggagt ga</li>
	<li>Zaprojektuj startery otoczone miejscami AttB1 i AttB2 odpowiadającymi sekwencji DNA polipeptydu OVA757-1035 (epitopy ograniczone do I-Ab i H-2Kb). Sekwencje starterów to: Attb1-OVA 
	GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT oraz Attb2-OVA 
	GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Sekwencje Attb1 i Attb2 są pogrubione).
	<ol>
		<li>Sekwencja DNA polipeptydu757-1035 z amplifikacją PCR za pomocą powyższych starterów przy użyciu plazmidu pUC57-OVA jako matrycy.</li>
		<li>Sklonuj produkty PCR do pDONR-221 poprzez specyficzną dla miejsca reakcję rekombinacji in vitro (np. klonazę BP) w celu uzyskania pDONR-OVA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś interesujący gen do p17-Avi za pomocą reakcji LR Clonase w celu uzyskania p17-Avi-OVA. 
	UWAGA: Szczegółowe informacje na temat klonowania rekombinacji BP i LR można znaleźć w instrukcji producenta.</li>
</ol>
2. Ekspresja, oczyszczanie i ponowne fałdowanie monomerycznej fuzji białek awidyny
<ol>
	<li>Przekształć plazmid p17-Avi-OVA w E. coli BL21 i indukować 250 ml hodowli E. coli BL21 za pomocą IPTG (0,1 M) przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Liza bakterii i solubilizacja ciał inkluzyjnych
	<ol>
		<li>Osadzać 250 ml indukowanej kultury BL21 przez 30 minut wirowania w temperaturze 4 000 x g i w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zebrać osady w 10 ml buforu do lizy (50 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, 6 M guanidyna-HCL, pH 1,5-2,5) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 95 °C. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej na rotatorze.</li>
		<li>Odwirować przez 30 minut przy 15 000 x g i temperaturze 4 °C i zebrać supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść Avi-OVA z supernatantu (frakcji rozpuszczonych ciał inkluzyjnych) za pomocą kolumn Ni-NTA.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć ciała inkluzyjne w stosunku 1:2 buforem do lizy.</li>
		<li>Użyj 4 ml żywicy Ni-NTA na 250 ml ciał inkluzyjnych pochodzących z kultur.</li>
		<li>Przemyć 3x 10 ml buforu do lizy (pH 7,0).</li>
		<li>Eluować za pomocą 10 ml buforu elucyjnego (bufor do lizy pH 7,0 z 250 mM imidazolem).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie zformować eluowane białko przez stopniowe rozcieńczanie (1:10) i szybkie wirowanie w buforze Tris (pH 7,5) zawierającym 1 mM DTT, 200 mM NDSB256 (3-(Benzylodimetyloamonio)propanosulfonian), 0,5 mM Tween 80, 500 mM argininy i 200 mM NaCl przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odsalanie i wymiana buforowa ponownie złożonego białka z buforu Tris do PBS z koncentratorami białek zgodnie z protokołami producenta.</li>
	<li>Usunąć agregaty przez odwirowanie przez 30 minut w temperaturze 3 500 x g i w temperaturze 4 °C, a porcje rozpuszczalnego białka przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
3. Biotynylacja powierzchni komórek BCG
<ol>
	<li>Hoduj BCG w bulionie Middlebrook 7H9 z 10% OADC (roztwór kwasu oleinowego, albuminy i dekstrozy) i 0,05% Tween 80 w temperaturze 37 °C na platformie wytrząsającej przy 50 obr./min, aż OD = 0,5-1, 
	UWAGA: BCG jest patogenem o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 i wszystkie eksperymenty dotyczące BCG powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego z odpowiednim sprzętem ochrony osobistej.</li>
	<li>Przemyj 109 BCG 3 razy 500 μl lodowatego PBS wolnego od endotoksyn plus 0,1% Tween80 (PBST) (pH 8,0). Zawiesić granulat BCG w sterylnym PBS wolnym od endotoksyn.</li>
	<li>Bezpośrednio przed użyciem przygotuj 1 ml 10 ml biotyny Sulfo-NHS SS w sterylnej przefiltrowanej wodzie.
	<ol>
		<li>Inkubować bakterie z 1 ml 0,5 mM biotyny Sulfo-NHS SS w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj oznakowane bakterie 3 razy 500 μl lodowatego zimnego PBST, aby usunąć nieprzereagowany odczynnik biotynylacji.
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić osad w 1 ml PBST.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby ocenić skuteczność biotynylacji, należy zabarwić 108 biotynylowane BCG Streptavidin-FITC (1:100, 25 μL) w temperaturze pokojowej przez 20 min.
	<ol>
		<li>Inkubować barwione bakterie w 1 ml 2% PFA przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie zbadać poziomy biotynylacji za pomocą analizy cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Fenotyp biotynylowanych prątków: wzrost i przetrwanie
<ol>
	<li>Hoduj szczepy BCG w bulionie Middlebrook 7H9 z 10% OADC (roztwór kwasu oleinowego, albuminy i dekstrozy) i 0,05% Tween 80 w temperaturze 37 °C na platformie wytrząsającej przy 50 obr./min.
	<ol>
		<li>Zapisać gęstość optyczną (OD600) kultury bakteryjnej w okresie 8 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj BCG-Luc (wcześniej opisanego9) do wykrywania przeżywalności bakterii w makrofagach.
	<ol>
		<li>Zakażone komórki RAW264.7 biotynylowanym BCG-Luc (MOI 10:1) lub nieleczonym BCG-Luc (kontrola) i inkubowane w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.</li>
		<li>Umyj monowarstwy komórek, a następnie poddaj lizie 0,025% SDS, aby uwolnić połknięte bakterie.</li>
		<li>Pomiar produkcji bioluminescencji za pomocą systemu testowego lucyferazy i luminometru. 
		UWAGA: Sygnał luminescencji wskazuje na żywotność bakterii. Proszę zapoznać się z instrukcją producenta, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat testu lucyferazy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Wiązanie monomerycznego białka fuzji awidyny z biotynylowaną powierzchnią BCG
<ol>
	<li>Wymieszaj 5 x 108 biotynylowanych BCG z białkiem Avi (10 μg/ml końcowy w PBS-T) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na platformie wytrząsarki.</li>
	<li>Przemyć bakterie 3 razy 500 μl mrożonego zimnego PBST i zabarwić przeciwciałem anty-awidynowym królika (Ab) (rozcieńczenie 1:100, wcześniej opisane10) przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie sprzężoną z kozią anty-króliczą IgG Ab w FITC w tych samych warunkach.</li>
	<li>Umyj bakterie 3 razy 500 μl PBST i przeanalizuj za pomocą cytometrii przepływowej, aby ocenić stopień dekoracji powierzchni.</li>
</ol>
6. Liofilizacja prątków
<ol>
	<li>Biotynylować bakterie zgodnie z krokami 3.1-3.4 i pokryć biotynylowane bakterie Avi-OVA zgodnie z krokiem 5.1.</li>
	<li>Podwielokrotne biotynylowane i powlekane bakterie (108), przemyć PBS i ponownie zawiesić w 0,5 ml pożywki liofilizacyjnej (25% pożywki Sauton, 75% H2O i 1,5% Na-glutaminianu).</li>
	<li>Przenieść bakterie do szklanych fiolek i zamrozić w zamrażarce o temperaturze -80 °C przez noc.</li>
	<li>Liofilizować napełnione i zamrożone szklane fiolki przez 24 godziny za pomocą liofilizatora.</li>
	<li>Suszone próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej i w razie potrzeby rozpuścić w PBS.</li>
	<li>Powtórz krok 3.5, aby ocenić biotynylację i stabilność powłoki powierzchniowej.</li>
</ol>
7. Test fagocytozy
<ol>
	<li>Hoduj komórki makrofagów RAW 264.7 w szalkach hodowlanych o średnicy 10 cm w pożywce DMEM zawierającej 5% FCS, po 1% L-glutaminy, HEPES, aminokwasów endogennych oraz penicyliny i streptomycyny do 70-80% konfluencji.</li>
	<li>Wysiewaj 2 x 106 RAW 264,7 komórek makrofagów na 6-dołkowej płytce. Pozostawić komórki do przylegania przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Wygeneruj DsRed BCG (wcześniej opisany9) ozdobiony Avi-OVA (DsRed BCG-Avi-OVA) zgodnie z krokami 3.1-3.4 i 5.1.</li>
	<li>Zakażone komórki RAW DsRed BCG-Avi-OVA lub nieleczonym DsRed BCG w MOI 20:1 przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umyj komórki trzy razy i trypsynizuj za pomocą 1 ml 0,25% trypsyny w temperaturze 37 °C przez 10 minut, aby usunąć częściowo oderwane bakterie.</li>
	<li>Utrwalić w 2,5% PFA w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć 3x PBS i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
8. Wewnątrzkomórkowy transport biotynylowanego BCG ozdobionego OVA w makrofagach
<ol>
	<li>Mikroskopia fluorescencyjna
	<ol>
		<li>Wysiew 3 x 105 RAW 264,7 komórek makrofagów na szkiełkach nakrywkowych w 24-dołkowej płytce. Pozostawić komórki do przylegania przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Zakażenie komórek makrofagów prątkami (MOI 10:1) w pożywce podtrzymującej bez antybiotyków w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4 do 24 godzin.</li>
		<li>Umyj komórki i trypsynizuj, aby usunąć przyczepione do powierzchni, niepołknięte bakterie, jak w kroku 7.5.</li>
		<li>Utrwal zainfekowane komórki w 2,5% PFA w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wykonaj 3 przemycia PBS.</li>
		<li>Przepuszczalność komórek w buforze blokującym/permeabilizacyjnym (0,1% Triton X-100, 3% BSA w PBS) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
		<ol>
			<li>Stosować specyficzne przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania (np. królicze przeciwciało anty-awidynę Ab) w dawce 10 μg/ml w buforze permeabilizacyjnym przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przeciwciało drugorzędowe (np. FITC-kozia anty-królicza IgG) przez 20 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umyj komórki 3x PBS, raz wodą i zamontuj na szkiełkach w 10 μl wodnego podłoża montażowego, aby zminimalizować fotowybielanie fluorescencyjne.</li>
		<li>Badaj preparaty za pomocą cyfrowej mikroskopii konfokalnej przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw planapochromatyczny 63x/1,4. Rejestruj obrazy za pomocą kamery cyfrowej sprzężonej z oprogramowaniem mikroskopu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunozłotem i mikroskopia elektronowa
	<ol>
		<li>Wysiew 2 x 106 RAW 264,7 komórek makrofagów na płytkach 6-dołkowych.</li>
		<li>Napraw makrofagi zakażone BCG za pomocą 4% PFA przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Próbki należy przemyć dwukrotnie PBS.</li>
		<li>Zanurz próbki w 4% agarozie o niskiej temperaturze topnienia i odwadnij w 70% etanolu.</li>
		<li>Przenieść próbki na żywicę akrylową i polimeryzować w temperaturze 50 °C.</li>
		<li>Wytnij odcinki 60 nm za pomocą mikrotomu i zbierz skrawki na siatkach niklowych.</li>
		<li>Oznaczyć próbki 10 μg/ml przeciwciała awidyny przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub 4 °C przez noc w roztworze inkubacyjnym (PBS i 0,1% BSA), a następnie przemyć roztworem inkubacyjnym F(ab')2 ultra-małej koziej anty-króliczej IgG (1/20) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w roztworze inkubacyjnym.</li>
		<li>Umyć skrawki w wodzie destylowanej, zabarwić w 2% aldehydzie glutarowym, ponownie umyć, wysuszyć na powietrzu i zbadać mikroskopem elektronowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. Szczepienia zwierząt i przetwarzanie narządów
UWAGA: Wszystkie kroki powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Przepuść biotynylowane i pokryte białkiem bakterie przez igłę 271/2G 10 razy, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.</li>
	<li>Weź 1 x 106 bakterii w 100 μl PBS wolnego od endotoksyn i uodpornij samicę myszy C57BL / 6 (I-Ab, H-2Kb, 5-6 tygodniowe) podskórnie w kark szyi.
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć myszom kontrolnym 100 μl samego PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eutanazja uodpornionych myszy 20 dni po szczepieniu przez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
	<ol>
		<li>Wyizoluj śledzionę i przenieś ją do pożywki RPMI.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozgnieć śledzionę przez sitko o wielkości 70 μm za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 5 ml.
	<ol>
		<li>Umyć 5 ml RPMI. Odwirować (800 x g, 3 min) w celu wyizolowania zawiesiny jednokomórkowej.</li>
		<li>Zubożyć RBC za pomocą zestawu do pozytywnej selekcji biotyny myszy z biotyną-Ter119 / komórkami erytroidalnymi Ab.</li>
		<li>Odwiruj i ponownie zawieś komórki w 10 ml pełnego RPMI (10% FCS, 1% L-glutamina, 1% penicylina, 1% streptomycyna i 50 μM 2-ME).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. Barwienie tetrameru I-Ab w celu określenia częstości występowania limfocytów T CD4+ specyficznych dla antygenu oraz barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych w celu określenia częstotliwości uwalniania cytokin przez limfocyty T specyficzne dla antygenu u uodpornionych zwierząt
<ol>
	<li>Barwienie tetramerowe
	<ol>
		<li>Wybarwić splenocyty od myszy kontrolnych i immunizowanych (~20 x 106 komórek) tetramerami I-Ab-OVA 323-339 sprzężonymi z PE (rozcieńczenie 1/12,5) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w buforze wiążącym (PBS z 2% FCS i 0,1% NaN3).</li>
		<li>Dodaj AF647 CD4 Ab (1:25) i 7-AAD (w celu wykrycia martwych komórek) do splenocytów na 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Analizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Uzyskaj 500 000 zdarzeń w regionie CD4 dodatnim, aby określić częstotliwość zdarzeń tetramerowych. 
		UWAGA: Całkowite splenocyty są definiowane przez plamę punktową SSC / FSC, żywe komórki przez wykluczenie pozytywnych zdarzeń 7-AAD, a podzbiory CD4 przez bramkowanie pozytywnych zdarzeń AF647.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Częstotliwość wewnątrzkomórkowych limfocytów T uwalniających cytokiny specyficzne dla antygenu
	<ol>
		<li>Przenieść około 1 × 107 splenocytów do 4 ml kompletnej pożywki RPMI na sześciodołkowych płytkach z rekombinowanym OVA lub bez niego (10 μg/ml) i inkubować przez 16 godzin.</li>
		<li>Leczyć komórki preparatem Brefeldin A (1:1 000) przez dodatkowe 5 godzin.</li>
		<li>Przemyć PBS i poddać barwieniu cytokinami wewnątrzkomórkowymi w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Próbki komórek barwić PE-CD8 lub PE-Cy7-CD4 Ab (1:50 w buforze wiążącym) w temperaturze pokojowej przez 30 min.</li>
			<li>Utrwalić w 4% PFA w temperaturze pokojowej przez 20 min.</li>
			<li>Przepuszczalność za pomocą roztworu do przepuszczalności, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
			<li>Umyj komórki i oznacz IFN-γ Ab (1:50) sprzężonym z AF647 przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Umyć komórki i poddać analizie cytometrii przepływowej, jak opisano powyżej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Horwitz, M. A., Harth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vaccine+against+tuberculosis+affords+greater+survival+after+challenge+than+the+current+vaccine+in+the+guinea+pig+model+of+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis.</a> Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).</li>
<li>Pym, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+BCG+exporting+ESAT-6+confers+enhanced+protection+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis.</a> Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).</li>
<li>Grode, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+vaccine+efficacy+against+tuberculosis+of+recombinant+Mycobacterium+bovis+bacille+Calmette-Guerin+mutants+that+secrete+listeriolysin%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin.</a> The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).</li>
<li>Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Mycobacterium+bovis+BCG%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Recombinant Mycobacterium bovis BCG.</a> Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).</li>
<li>Mederle, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmidic+versus+insertional+cloning+of+heterologous+genes+in+Mycobacterium+bovis+BCG%3A+impact+on+in+vivo+antigen+persistence+and+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses.</a> Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).</li>
<li>Singh, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Approach+to+Cancer+Immunotherapy+Tumor+Cells+Decorated+with+CD80+Generate+Effective+Antitumor+Immunity+A+Novel+Approach+to+Cancer+Immunotherapy+Tumor+Cells+Decorated+with+CD80+Generate+Effective+Antitumor+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity.</a> Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).</li>
<li>Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+requirements+for+enhanced+antigen+cross-presentation+to+CD8+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes.</a> J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).</li>
<li>Sharif-Paghaleh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+efficacy+of+dendritic+cell+vaccination+by+early+detection+of+%2899m%29+Tc-HMPAO-labelled+CD4%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells.</a> Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broad-range+of+recombination+cloning+vectors+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria.</a> Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).</li>
<li>Laitinen, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+an+active+avidin+monomer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rational design of an active avidin monomer.</a> J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).</li>
<li>Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+interferon+gamma+in+resistance+to+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection.</a> J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).</li>
<li>Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+immunogenicity+of+the+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccine+by+non-genetic+bacterial+surface+decoration+using+the+avidin-biotin+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system.</a> PLoS ONE. 10 (12), e0145833(2015).</li>
<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin+and+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Avidin and streptavidin.</a> Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).</li>
<li>Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+quantum+dots+to+surface+proteins+in+living+cells+with+biotin+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase.</a> PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).</li>
<li>Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin-biotin+technology+in+targeted+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Avidin-biotin technology in targeted therapy.</a> Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).</li>
<li>Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioimmunotherapy+of+brain+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Res%22%5BJournal%5D)">Radioimmunotherapy of brain tumor.</a> Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).</li>
<li>Cummings, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+immunogenicity+of+a+plant-produced+recombinant+monomer+hemagglutinin-based+influenza+vaccine+derived+from+influenza+A+%28H1N1%29pdm09+virus%3A+a+Phase+1+dose-escalation+study+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults.</a> Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).</li>
<li>Kolotilin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-based+solutions+for+veterinary+immunotherapeutics+and+prophylactics%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics.</a> Vet Res. 45, 114-117 (2014).</li>
<li>Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+engineering+of+streptavidin+monomer+with+a+reduced+biotin+dissociation+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate.</a> Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).</li>
<li>Deghmane, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoamide+dehydrogenase+mediates+retention+of+coronin-1+on+BCG+vacuoles%2C+leading+to+arrest+in+phagosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation.</a> J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).</li>
<li>Soualhine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+bovis+bacillus+Calmette-Guerin+secreting+active+cathepsin+S+stimulates+expression+of+mature+MHC+class+II+molecules+and+antigen+presentation+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages.</a> J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).</li>
<li>Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+antibodies+to+avidin+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22ImmunolLett%22%5BJournal%5D)">Natural antibodies to avidin in human serum.</a> ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).</li>
<li>Petronzelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+use+of+avidin+is+not+hampered+by+antiavidin+antibodies+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biother+Radiopharm%22%5BJournal%5D)">Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans.</a> Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).</li>
<li>Bigini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fate+of+avidin-nucleic+acid+nanoassemblies+as+multifunctional+diagnostic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools.</a> ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu opisaliśmy niegenetyczne podejście do szybkiego i skutecznego wyświetlania białek egzogennych na powierzchni BCG w celu dodania specyficznych antygenów lub określonych właściwości funkcjonalnych, które mają skutecznie poprawić immunogenność bakterii. Wykazaliśmy, że powierzchnię komórki BCG można łatwo biotynylować w celu natychmiastowej dekoracji powierzchni białkami fuzyjnymi awidyny. Cała procedura może być wykonana w ciągu 2 godzin, podczas gdy transformacja genetyczna i selekcja pozytywnych klonów wyma...

Zaproponowano różne strategie zastąpienia obecnej szczepionki BCG przeciwko gruźlicy, w tym systemy adiuwantów białkowych, technologie wektorów wirusowych, atenuowane żywe szczepy M.tb i genetycznie modyfikowane szczepy BCG, albo w celu wprowadzenia genów nadmiernie eksprymujących antygeny BCG, które nie są wystarczająco wyrażane podczas infekcji1 lub antygeny specyficzne dla Mtb, które nie występują w BCG2. Inżynieria genetyczna napotyka jednak wiele barier, w tym niepewny poziom bezpieczeństwa, czasochłonny proces i niską wydajność wektorów ekspresji4,5. Jeśli chodzi o poprawę BCG, potrzebne jest alternatywne podejście, aby poprawić immunogenność bez konieczności niepewnych zmian genetycznych.
W tym badaniu wprowadzamy nową strategię wyświetlania interesujących rekombinowanych białek na powierzchni komórek BCG, która opiera się na dobrze znanej interakcji awidyny o wysokim powinowactwie z biotyną. Takie podejście pozwala na szybkie i powtarzalne przyłączanie rekombinowanych białek fuzyjnych awidyny do powierzchni biotynylowanego BCG, co ułatwia szerokie manipulacje BCG w celu osiągnięcia maksymalnej poprawy jego skuteczności przy zachowaniu doskonałych wyników bezpieczeństwa, obserwowanych przez dziesięciolecia stosowania.
Powinowactwo awidyny do biotyny jest niezwykle wysokie (Kd = 10−15 M), a raz uformowany, kompleks biotyna-awidyna jest bardzo stabilny i może zostać zakłócony tylko w warunkach denaturacji6. Jednak, aby ten rodzaj interakcji służył jako alternatywna metoda transferu genów, wymagane jest długotrwałe, ale odwracalne wyświetlanie rekombinowanych białek. W ten sposób wprowadziliśmy tutaj monomeryczną awidynę o niskim powinowactwie (Kd = 10-7 M), która prowadzi do odwracalnego uwalniania białka z ozdobionego powierzchnią BCG po spożyciu wewnątrz komórek prezentujących antygen. Aby udowodnić słuszność koncepcji, przetestowaliśmy tę metodę przy użyciu monomerycznego białka chimerycznego awidyny odpowiadającego antygenowi zastępczemu pochodzącemu z albuminy jaja kurzego (OVA)7,8. Wyniki pokazały, że powierzchnię komórki BCG można łatwo i szybko ozdobić monomerycznymi białkami fuzyjnymi awidyny, a to wiązanie z powierzchnią BCG jest stabilne i powtarzalne bez wykrywalnych zmian we wzroście i przeżywalności bakterii. Odkryliśmy również, że BCG ozdobiony monomeryczną awidyną połączoną z OVA (AviOVA) może indukować odpowiedź immunologiczną podobną do tej indukowanej przez BCG wykazującą genetyczną ekspresję tego samego antygenu zarówno in vitro, jak i in vivo. Ta technologia odwracalnego wyświetlania interesujących białek na powierzchni bakterii jest zatem skutecznym zamiennikiem tradycyjnych metod transferu genów i może stanowić platformę do szerokich manipulacji BCG i dalszych zastosowań w opracowywaniu szczepionek.

<table><tbody><tr><td>Technologie komórek macierzystych RPMI 1640 bez endotoksyn</td><td>&nbsp;</td><td>36750</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS SS biotyna</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>21328</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna sprzężona z FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3762</td><td></td></tr><tr><td>Fikoerytryna (PE) sprzężona I-Ab-OVA323-339 tetramer&nbsp;</td><td>MBL Międzynarodowy&nbsp;</td><td>TS-M710-1</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>TALON polihistydyna-Żywica oczyszczająca Tag&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>635501</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor (AF) 647 sprzężony szczurzy anty-mysz CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557681</tr><tr><td>AF647 przeciw myszom IFN-g</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557735</tr><tr><td>AF647 szczur przeciw myszom I-A/I-E</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>562367</tr><tr><td>PeCy7 szczur anty-mysi CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>552775</tr><tr><td>PE szczur anty-mysi CD8 Ab</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>561095</tr><tr><td>AF 647 szczurzy anty-mysi H-2kb</td><td>BD Bioscience</td><td>562832</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw królikowi koniugowane w FITC Thermo</td><td>Fisher</td><td>31635</td><td></td></tr><tr><td>AF 647 szczurze przeciwciało przeciw myszom CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td>557681</tr><tr><td>Ultra-małe, sprzężone ze złotem kozie anty-królicze IgG</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>25100</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 bulion</td><td>BD Systemy diagnostyczne 271310</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Systemy diagnostyczne</td><td>OADC</td> BD <td>B11886</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 mysie linie komórkowe makrofagów</td><td>typu amerykańskiego Kolekcja</td><td></td><td></td>kultur</tr><tr><td>plazmidowych pDEST17&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11803012</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pUC57-OVA&nbsp;</td><td>Klonaza GenScript</td><td>SD1176</td><td></td></tr><tr><td>BP&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>LR clonase&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791043</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pDONR221</td><td>Kolumny Invitrogen</td><td>12536017</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>Koncentratory białka Pierce&nbsp;</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>88527</td><td></td></tr> Mikroskop epifluorescencyjny <tr><td>Flurosave</td><td>Calbiochem-Novabiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan II</td><td>Aparat cyfrowy CCD Carl Zeiss Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Retiga EX, mikroskop elektronowy QImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai G2 200kV&nbsp;</td><td>FEI Firma</td><td>G2 200Kv&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>70&mu; m Sitko do komórek Falcon&nbsp;</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>87712</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw pozytywnej selekcji biotyny myszy EasyStep&nbsp;</td><td>StemCell</td><td>18556</td><td></td></tr><tr><td>biotyna-Ter119/Ertyroid przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>116203</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>BD Pharmingen</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm kit&nbsp;</td><td></td> System testowy lucyferazy Bright-Glo 554714 <td></td>BD <td>Pharmingen</td></tr><tr><td></td><td>Promega</td><td>e2620</td><td></td></tr><tr><td>Turner Biosystem&nbsp;</td><td>Mikrotom Promega</td><td>TD-20/20</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM UC6</td><td>&nbsp; Liofilizator Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Novalyphe NL 500</td><td>Savant Instruments</td><td>&nbsp;NL 50</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki ze szkła boroscilicate</td><td>Wheaton Wheaton</td><td>&nbsp; VWR 66011-675</td><td></td></tr></tbody></table>

ekspresja antygenów egzogennych w szczepionce bcg przeciwko mycobacterium bovis poprzez niegenetyczne zdobienie powierzchni za pomocą systemu avidin-biotyna

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Gruźlica (TB) jest poważną chorobą zakaźną i jedyną dostępną szczepionką M. bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) jest bezpieczna i skuteczna w ochronie przed ciężkim gruźliczym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych u dzieci i niektórymi formami rozsianej gruźlicy, ale nie chroni przed gruźlicą płuc, która jest najbardziej rozpowszechnioną formą choroby. Obiecujące strategie poprawy BCG opierają się obecnie albo na jego transformacji za pomocą genów kodujących immunodominujące antygeny specyficzne dla M. tuberculosis (Mtb), albo na uzupełnieniu genami kodującymi kofaktory, które stymulowałyby komórki prezentujące antygen. Główne ograniczenia tych podejść obejmują niską wydajność, niską stabilność i niepewny poziom bezpieczeństwa wektorów ekspresji. W tym badaniu przedstawiamy alternatywne podejście do ulepszania szczepionek, które polega na uzupełnieniu BCG egzogennymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania na powierzchni bakterii, a nie na transformacji z plazmidami kodującymi odpowiednie geny. Najpierw interesujące białka są wyrażane w fuzji z monomeryczną awidyną w standardowych systemach ekspresji E. coli, a następnie wykorzystywane do dekoracji powierzchni biotynylowanego BCG. Doświadczenia na zwierzętach z użyciem powierzchni BCG ozdobionej zastępczym antygenem albuminy jaja kurzego wykazują, że zmodyfikowana bakteria jest w pełni immunogenna i zdolna do indukowania specyficznych odpowiedzi limfocytów T. Podsumowując, przedstawione tutaj dane zdecydowanie wspierają nowatorską i skuteczną metodę przekształcania obecnej szczepionki BCG, która zastępuje pracochłonne konwencjonalne podejście do uzupełniania egzogennymi kwasami nukleinowymi.

Z zastosowaniem opisanych powyżej ogólnych procedur zbadano wykonalność biotinylacji powierzchni BCG oraz dekoracji zastępczym antygenem OVA. Następnie przetestowano immunogenność zmodyfikowanego BCG in vivo. Powierzchnia bakteryjna została łatwo oznakowana biotyną w celu szybkiej ekspozycji chimerycznych antygenów awidynowych, bez żadnych wykrywalnych zmian w fenotypach bakteryjnych. Otrzymane zmodyfikowane BCG jest wydajnie pochłaniane przez komórki prezentujące antygen i może ...

Prezentowana jest nowatorska technika szybkiego wyświetlania antygenu na powierzchni bakteryjnej, która polega na powierzchniowej biotynylacji, a następnie ekspozycji na interesujące białka podczas fuzji z monomeryczną awidyną. Ładowanie BCG wybranymi antygenami skutecznie poprawia jego immunogenność, co sugeruje, że dekoracja powierzchni może zastąpić tradycyjne podejścia genetyczne.

Ekspresja antygenów egzogennych w szczepionce BCG przeciwko Mycobacterium bovis poprzez niegenetyczne zdobienie powierzchni za pomocą systemu Avidin-biotyna

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

Ogólnym celem tej procedury jest ekspresja białek powierzchniowych na prątkach przy użyciu dekoracji powierzchni za pomocą rekombinowanych białek jako alternatywy dla tradycyjnych podejść opartych na genetyce. Metody te mogą pomóc w znalezieniu odpowiedzi na ważne pytania badawcze w dziedzinie mikobakteriologii, zwłaszcza w obszarze interakcji szpitalnych i opracowywania szczepionek. Technika ta może być stosowana do badań przesiewowych pod kątem potencjalnych czynników interferencyjnych lub kandydatów na antygeny.Może to być i szybko porównane do wybrednych i czasochłonnych tradycyjnych podejść opartych na genetyce. Tę procedurę zademonstruje Amina Talal, asystentka naukowa w moim laboratorium. Ta część protokołu rozpoczyna się od przekształcenia plazmidu P17 Aviden OVA w E.Coli BL21.Aby to zrobić, wyindukuj 250 mililitrów kultury E.Coli BL21 za pomocą IPTG przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po trzech godzinach poddać bakterie lizie w celu rozpuszczenia ciał inkluzyjnych, najpierw granulując indukowaną kulturę BL21 i odrzucając supernatant. Następnie ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach buforu do lizy i pozostawić komórki do lizy przez 15 minut.Następnie kontynuuj inkubację w temperaturze pokojowej za pomocą rotatora do mieszania i pozostaw na noc. Rano odwiruj mieszaninę przez pół godziny. Następnie zebrać supernatant zawierający rozpuszczone ciała inkluzyjne.Następnie należy oczyścić białka Aviden OVA za pomocą niklowej kolumny NTA. Najpierw rozcieńczyć supernatant jeden do dwóch w buforze do lizy i oszacować objętość. Następnie przygotować kolumnę zawierającą cztery mililitry żywicy niklowej NTA na 250 mililitrów rozcieńczonego supernatantu i załadować rozcieńczony roztwór do kolumny.Następnie umyj kolumnę trzykrotnie za pomocą 10 mililitrów buforu do lizy o pH siedem na pranie. W celu zebrania rekombinowanego białka należy przemyć kolumnę buforem do lizy zawierającym imidazol i zebrać eluat. Jeśli twoje rekombinowane białko jest wolne od ciał inkluzyjnych, poniższa procedura będzie dobra dla wielu białek w naszym laboratorium.Najpierw dostosuj pH roztworu do ponownego fałdowania tak, aby było o jedną jednostkę powyżej lub poniżej punktu izoelektrycznego białka. Następnie stopniowo wirować i rozcieńczać białko do rozcieńczenia od 1 do 10 w roztworze do ponownego fałdowania. Następnie inkubuj białko na mieszadle magnetycznym przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby zakończyć proces ponownego składania.Następnie odsolić i buforować ponownie sfałdowane białka w PBS za pomocą koncentratora białek. Następnie odwiruj kolumnę i przechowuj alokwaty rozpuszczalnego białka w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu środków ochrony osobistej, ponieważ BCG jest patogenem poziomu 2.Aby biotynylować powierzchnię komórek BCG, najpierw hoduj komórki na platformie wytrząsającej do odpowiedniej gęstości. Zbierz około miliarda komórek i umyj je trzykrotnie za pomocą 500 mikrolitrów lodowatego, wolnego od endotoksyn PBST. Następnie odwiruj komórki i zawieś je w sterylnym, wolnym od endotoksyn PBS.Następnie przygotuj świeżą 10-milimolową biotynę sulfo-NHSSS w sterylnej przefiltrowanej wodzie. Następnie inkubuj bakterie w jednym mililitrze bulionu zawierającym 0,5 milimola sulfo-NHSSS Biotyny. Inkubację w temperaturze pokojowej należy wykonywać przez 30 minut.Następnie umyj teraz oznaczone bakterie trzykrotnie 500 mikrolitrami lodowatego PBST, tak jak poprzednio, aby usunąć nieprzereagowany odczynnik. Następnie ponownie zawiesić granulat w jednym mililitrze PBST. Aby ocenić skuteczność biotynylacji, należy zabarwić alokwat 100 milionów biotynylowanych BCG za pomocą 25 mikrolitrów Strepravidin-FITC.Następnie krótko inkubuj barwione bakterie w para-formaldehydzie, a następnie zmierz poziom biotynylacji za pomocą cytometrii przepływowej. Po ocenie wzrostu i przeżywalności biotynylowanych prątków, przystąp do wiązania z nimi białka fuzyjnego Aviden. Najpierw wymieszaj 500 milionów biotynylowanych BCG z białkiem fuzyjnym Aviden, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mikrogramów białka na mililitr.Pozwól tej reakcji trwać przez godzinę w temperaturze pokojowej na shakerze. Następnie umyj bakterie trzykrotnie 500 mikrolitrami lodowatego PBST. Następnie barwić bakterie króliczym przeciwciałem anty-Aviden przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Po 20 minutach wykonaj jeden etap prania z użyciem 500 mikrolitrów lodowatego PBST. Następnie wybarwić bakterie sprzężonym z FITC kozim przeciwciałem anty-króliczym IGG. Następnie umyj bakterie za pomocą 500 mikrolitrów lodowatego PBST i przeanalizuj bakterie za pomocą cytometrii przepływowej, aby ocenić dekorację powierzchni.Po zastosowaniu opisanego protokołu, cytologia wykazuje, że istniały minimalne poziomy wiązania OVA z bakteriami niebiotynylowanymi i znaczne poziomy wiązania OVA z bakteriami biotynylowanymi. Co ważne, poziomy Aviden OVA na powierzchni bakterii pozostały stabilne i wykrywalne miesiąc po liofilizacji i przechowywaniu w temperaturze pokojowej. Następnie wykorzystano komórki RAW i bakterie dsRed do przeprowadzenia testu fagocytozy.Cieszy fakt, że fenotyp makrofagów nie miał żadnego wpływu odstraszającego. Aby zbadać los BCG zdobionych Aviden OVA w makrofagach, przylegające komórki RAW zostały zakażone i zbadane za pomocą mikroskopii florescencyjnej. Aviden OVA był nie tylko obecny na powierzchni bakterii, ale także odrywał się i przemieszczał do cytoplazmy z dala od bakterii.Eksperyment barwienia immunologicznego złotem wykazał, że antygeny Aviden OVA mogą odrywać się od powierzchni BCG, przenikać przez błonę fagosomalną i przemieszczać się w kierunku cytozolu. Makrofagi zakażone Aviden OVA BCG wykazywały kolokalizację Avi OVA z cząsteczkami IA. Sugeruje to, że białka fuzyjne Aviden odłączają się i przemieszczają do przedziałów prezentujących antygen, które mają zostać załadowane na cząsteczki MHC2.Peptydy Aviden OVA również ulegały kolokalizacji z cząsteczkami klasy I w fagosomach BCG, jak wykazano przez barwienie H2K. W związku z tym istnieje potencjalna prezentacja antygenu Avi OVA do limfocytów T CD8-dodatnich przez makrofagi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ekspresja białek w prątkach, a organizm ten jest trudny do manipulowania za pomocą obecnych metod genetycznych.Po technice używamy jej z powodzeniem do załadowania szczepionki antygenem prątków w ilości sześciu. Następnie wykazaliśmy, że zmodyfikowane szczepionki mogą być wykorzystane jako swoista odpowiedź immunologiczna w modelu mysim. Obecnie współpracujemy z firmą w celu zbadania tego podejścia w teratynie Zaproponowaliśmy użycie BCG ulepszonego wybranym antygenem lub immunobulatorami.

expression-exogenous-antigens-mycobacterium-bovis-bcg-vaccine-via-non

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy alternatywne podejście do enumeracji prątków in vitro, w którym zamiast jednostek tworzących kolonie (CFU) wykorzystuje się prątki oznakowane genem reporterowym. „Przeżywalność” organizmów oraz markery odpowiedzi gospodarza są mierzone jednocześnie, co zapewnia niskokosztowy, wszechstronny i funkcjonalny system do badań interakcji gospodarz-patogen w kontekście gruźlicy.

Funkcjonalny test z wykorzystaniem krwi pełnej do pomiaru żywotności prątków, z użyciem BCG lub M.Tb znakowanych genem reporterowym (BCG lux/M.Tb lux)

Ten film pokazuje indukcję ogólnoustrojowego stanu zapalnego u znieczulonej myszy. Wstrzyknięcie zapasów antygenu prątkowego z adiuwantem wyzwala uwalnianie cytokin i miejscowy stan zapalny. Naczynia limfatyczne otwierają się, umożliwiając wnikanie komórek odpornościowych do węzłów chłonnych i aktywację limfocytów T, które uwalniają cytokiny prozapalne, prowadząc do rozległego stanu zapalnego.

Podskórne wstrzyknięcie antygenu bakteryjnego w celu wywołania ogólnoustrojowego stanu zapalnego w modelu mysim

Ten film demonstruje przygotowanie i kwantyfikację inokulum Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin lux za pomocą testu bioluminescencyjnego i liczenia jednostek tworzących kolonie. Przygotowane inokulum można wykorzystać do badań nad infekcjami.

Przygotowanie i oznaczanie ilościowe inokulum Mycobacterium bovis BCG lux do zakażenia

Ten film demonstruje metodę generowania szczepionek przeciwko pęcherzykom błony zewnętrznej (OMV) wyświetlającym wiele wartości. Komórki ssaków są transfekowane w celu ekspresji i wydzielania antygenów wirusowych połączonych ze znacznikiem SpyTag i znacznikiem polihistydyny. Antygeny te są następnie oczyszczane przy użyciu kolumny powinowactwa do kwasu niklowo-nitrylotryoctowego (Ni-NTA). Oczyszczony antygen miesza się z pęcherzykami błony zewnętrznej wykazującymi ekspresję powierzchniowego...

Wytwarzanie wielowalentnej szczepionki pęcherzykowej z błoną zewnętrzną

Film demonstruje technikę ładowania antygenów na Mycobacterium bovis BCG w celu poprawy jego właściwości immunogennych. Metoda wykorzystuje system awidyna-biotyna do pokrycia powierzchni bakterii antygenami egzogennymi.

Technika koniugacji awidyny i biotyny do prezentacji antygenów docelowych na Mycobacterium bovis BCG

Długoterminowy test immunologiczny związany z interferonem γ enzymem jest używany jako miara odpowiedzi pamięci centralnej i koreluje z ochronnymi odpowiedziami na szczepionkę przeciw prątkom. Dzięki temu testowi komórki jednojądrzaste krwi obwodowej są stymulowane antygenami prątkami i interleukiną-2 przez 14 dni, umożliwiając różnicowanie i ekspansję limfocytów T pamięci centralnej.

Zastosowanie długotrwale hodowanego testu immunologicznego związanego z enzymem interferonu γ do oceny odpowiedzi efektorowych i pamięciowych limfocytów T u bydła

Szczegółowo opisujemy metodologię stosowaną do porównania skuteczności ochronnej i odpowiedzi immunologicznej płuc indukowanej przez donosowe i podskórne szczepienie z BCG w modelu mysim. Nasze wyniki pokazują korzyści płynące ze szczepienia płuc i sugerują rolę odpowiedzi za pośrednictwem IL17 w ochronie indukowanej szczepionką.

Skuteczność ochronna i odpowiedź immunologiczna płuc po podaniu podskórnym i donosowym BCG myszom

Obecny protokół opisuje bioinżynierię pęcherzyków błony zewnętrznej jako platformę szczepionki typu "Plug-and-Display", obejmującą produkcję, oczyszczanie, biokoniugację i charakterystykę.

Platforma szczepionkowa nanocząsteczkowa typu "plug-and-display" oparta na pęcherzykach błony zewnętrznej wykazujących domenę wiążącą receptor SARS-CoV-2

Ten protokół szczegółowo opisuje wzbogacanie natywnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków (mEV) z aksonicznych kultur Mycobacterium smegmatis (Msm) oraz jak można projektować i wzbogacać rekombinowane MsmEV zawierające mCherry (czerwony fluorescencyjny reporter). Na koniec zweryfikowano nowatorskie podejście polegające na wzbogaceniu MsmEV zawierających białko EsxA Mycobacterium tuberculosis.

Wzbogacanie natywnych i rekombinowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Tutaj prezentujemy alternatywny protokół aktywnego wywoływania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u myszy C57BL/6, przy użyciu immunogennej epitopowej oligodendrocytów glikoproteiny mielinowej (MOG)35-55 zawieszonej w niekompletnym adiuwancie Freunda zawierającym zabity termicznie Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis.

Działanie adiuwantowe Mycobacterium paratuberculosis w zwiększaniu immunogenności autoantygenów podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Oznaczanie jednostek tworzących kolonie (CFU) jest złotym standardem w ilościowym oznaczaniu bakterii, w tym Mycobacterium tuberculosis, które mogą potrzebować tygodni na utworzenie widocznych kolonii. W tym miejscu opisujemy mikro-CFU do oznaczania CFU ze zwiększoną wydajnością czasową, zmniejszoną przestrzenią laboratoryjną i kosztami odczynników oraz skalowalnością do eksperymentów o średniej i wysokiej przepustowości.

Test jednostkowy tworzenia mikrokolonii do oceny skuteczności szczepionek przeciwko gruźlicy

Poznaj metodę dekoracji powierzchni BCG za pomocą systemu avidyna-biotyna jako alternatywę dla podejść genetycznych. Technika ta umożliwia szybkie ekspresowanie antygenów egzogennych i poprawę immunogenności szczepionki przeciwko gruźlicy.

Ekspresja antygenów egzogennych w szczepionce BCG przeciwko Mycobacterium bovis poprzez niegenetyczne zdobienie powierzchni za pomocą systemu Avidin-biotyna (Wideo) | JoVE Journal

Ekspresja antygenów egzogennych w szczepionce BCG przeciwko Mycobacterium bovis poprzez niegenetyczne zdobienie powierzchni za pomocą systemu Avidin-biotyna

Przeglądaj więcej filmów