Określanie szybkości zaniku transkryptów w całym genomie w proliferujących i spoczynkowych ludzkich fibroblastach
2 stycznia 2018
Opisujemy protokół generowania proliferujących i spokojnych pierwotnych ludzkich fibroblastów skórnych, monitorowania tempa zaniku transkryptu i identyfikacji genów rozkładających się w różny sposób.
Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie szybkości zaniku transkryptu w proliferujących i spoczynkowych fibroblastach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii molekularnej, takie jak to, czy zmiany w ekspresji genów wynikają ze zmian w szybkości zaniku transkryptu. Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarcza ona informacji na temat szybkości zaniku transkryptu, a nie tylko obfitości transkryptu.
Aby rozpocząć protokół, ustal proliferujące i spoczynkowe kultury fibroblastów. Namnażające się fibroblasty powinny być regularnie trypsynizowane. Kultury spoczynkowe można ustanowić, pozwalając płytkom osiągnąć zbieg z regularnymi zmianami podłoża.
Dodać ActD 150 mikrolitrów do wstępnie podgrzanego podłoża 10 mililitrów dla wszystkich płytek do hodowli komórkowych replik biologicznych. Dodać ActD w stężeniu 15 mikrogramów na mililitr pożywki. Dobrze wymieszaj roztwór.
Odessać starą pożywkę i dodać do komórek pożywkę zawierającą ActD. Aby pobrać próbkę punktu zerowego w czasie, delikatnie odessać pożywkę ActD i odpipetować od pięciu do 10 mililitrów wstępnie podgrzanego PBS na 100-milimetrową płytkę, pięć mililitrów roztworu na 100-milimetrową płytkę, dwa mililitry na studzienkę sześciodołkową i jeden mililitr na studzienkę 12-dołkowej. Delikatnie zassać PBS.
Następnie dodać roztwór izotiocyjanianu fenolu i guanidyny bezpośrednio do płytki do hodowli tkankowej. Kilkakrotnie odpipetować mieszaninę komórek roztworu izotiocyjanianu fenolu i guanidyny w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną mieszaninę. Zbierz każdy punkt czasowy po upływie odpowiedniej ilości czasu, korzystając z metody opisanej wcześniej.
Inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie kompleksów białkowych RNA. Następnie wprowadź kontrolowane transkrypcje ze skokami, które można wykryć za pomocą zastosowanej metodologii. Wprowadzić te kontrole do każdej próbki w znanej ilości i stężeniu.
Za pomocą pipety przenieś mieszaninę roztworu izotiocyjanianu fenyloguanidyny do 2,0-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie dodać 0,2 mililitra chloroformu do mieszaniny roztworu izotiocyjanianu fenyloganidyny na każdy mililitr użytego roztworu izotiocyjanianu fenyloguanidyny. Potrząsać energicznie probówką do mikrowirówki przez 15 sekund, a następnie inkubować izotiocyjanian fenyloguanidyny z chloroformu.
Po inkubacji wirować próbki pod ciśnieniem 12 000 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Próbka powinna zostać podzielona na trzy warstwy. Przenieś warstwę wodną do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2,0 mililitra za pomocą mikropipety i uważaj, aby nie zakłócić interfazy podczas tego procesu.
Odrzuć frakcje interfazowe i organiczne. Następnie dodaj równą objętość 2-propanolu do frakcji wodnej i odwróć probówkę 10 razy. Dodaj do jednego mikrolitra 20 miligramów na mililitr wodnego glikogenu na 20 mikrolitrów próbki, zwłaszcza jeśli oczekuje się, że wydajność będzie niska.
Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po inkubacji odwirować próbki. Upewnij się, że pod koniec wirowania RNA wytrąciło się, tworząc chwilową osadkę na dnie probówki.
Za pomocą pipety usunąć i wyrzucić supernatant, zwracając szczególną uwagę, aby nie naruszyć białej osadki RNA. Dodaj jeden mililitr 75% etanolu na jeden mililitr odczynnika w roztworze izotiocyjanianu fenyloguanidyny, aby przepłukać osad. Obracać próbki pod ciśnieniem 12 000 g przez 10 minut.
Po usunięciu większości supernatantu użyj pipety, aby usunąć jak najwięcej etanolu, ale nie naruszaj osadu. Obraca próbki, aby pokryć cały nadmiar etanolu. Na tym etapie pastylka RNA jest mniej zwarta i ma tendencję do poruszania się.
Po wirowaniu usuń cały nadmiar etanolu z rurki, nie naruszając granulki. Pozostaw osad RNA do wyschnięcia na powietrzu przez pięć minut. Dodaj 50 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do osadu RNA i ponownie zawieś osad w wodzie wolnej od nukleaz
.Potraktuj próbki jednej mikrolitrowej dekanazy w celu usunięcia DNA, a następnie dezaktywuj dekanazę i kationy. Przechowuj próbki RNA w 2,0-mililitrowych probówkach do mikrowirówek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Określ ilościowo RNA i sprawdź jego czystość za pomocą spektrofotometru.
Po sprawdzeniu czystości przeanalizuj RNA za pomocą 1% żelu agarozowego, aby zobrazować stopień degradacji. Dwa wyraźne prążki reprezentujące 18S i 28S rRNA powinny być wyraźnie widoczne. Jeśli te prążki nie są widoczne, RNA może ulec degradacji.
Następnie monitoruj obfitość transkryptu w zebranych podwielokrotnościach RNA w porównaniu z wzbogaconym wzorcem wewnętrznym za pomocą qPCR w czasie rzeczywistym. Można również zastosować mikromacierze, sekwencjonowanie RNA lub northern blot. Intensywność fluorescencji w czasie odpowiada ekspresji genów.
Podczas gdy fibroblasty zostają zahamowane kontaktowo, kodujący transkrypt kolagen 3A1, bardzo ważny gen do tworzenia macierzy zewnątrzkomórkowej odkładającej się podczas gojenia się ran, staje się bardziej stabilny i nie rozpada się tak szybko. Nie zapominaj, że praca z fenolem może być niezwykle niebezpieczna i ważne jest, aby nie dopuścić do jego dotknięcia skóry. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak monitorować tempo zaniku transkryptu w proliferujących i uśpionych fibroblastach.
Zmiany w szybkości zaniku transkryptu mogą być ważnym mechanizmem triangulacji genów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje protokół generowania pierwotnych ludzkich fibroblastów skóry w obu stanach: proliferującym oraz spoczynkowym. Koncentruje się on na monitorowaniu szybkości degradacji transkryptów i identyfikacji genów ulegających różnicowej degradacji, co pozwala na uzyskanie informacji na temat dynamiki ekspresji genów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia molekularna
- Biologia komórki
- Ekspresja genów
Wstęp
- Zrozumienie szybkości rozpadu transkryptów jest kluczowe dla wyjaśnienia regulacji ekspresji genów.
- Fibroblasty służą jako model do badania procesów komórkowych w tkankach ludzkich.
- Stany proliferacyjne i spoczynkowe fibroblastów mogą wpływać na wyniki ekspresji genów.
- Celem niniejszego protokołu jest odróżnienie efektów rozpadu transkryptów od samej obfitości transkryptów.
Cel badania
- Aby monitorować tempo degradacji transkrypty w różnych stanach kultur fibroblastów.
- Aby zbadać, w jaki sposób zmiany w ekspresji genów wiążą się z tempem degradacji transkrypty.
- Aby zapewnić wiarygodną metodę badania dynamiki ekspresji genów w fibroblastach.
Zastosowane metody
- Utworzenie kultur proliferujących i spoczywających fibroblastów.
- Regularna trypsynizacja proliferujących fibroblastów.
- Utworzenie kultur spoczywających w oparciu o stopień konfluencji wraz ze zmianami pożywki.
- Monitorowanie szybkości degradacji transkryptów za pomocą protokołów eksperymentalnych.
Główne wyniki
- Identyfikacja genów o różnym tempie degradacji pomiędzy stanem proliferacyjnym a spoczynkowym.
- Wgląd w zależność między degradacją transkryptu a zmianami w ekspresji genów.
- Wykazanie zalet pomiaru szybkości degradacji transkryptów.
- Dostarczenie szczegółowego protokołu do przyszłych badań w dziedzinie biologii molekularnej.
Wnioski
- Protokół pozwala na skuteczne rozróżnienie pomiędzy obfitością transkryptów a szybkością ich rozkładu.
- Wyniki przyczyniają się do głębszego zrozumienia regulacji ekspresji genów.
- Metodę tę można zastosować w różnych badaniach z zakresu biologii molekularnej i komórkowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Pomiar tempa rozpadu transkrypcyjnego w całej genomie w proliferujących i spoczywających fibroblastach ludzkich umożliwia zespołom biofarmaceutycznym rozróżnienie mechanizmów regulacyjnych napędzających zmiany w ekspresji genów poza kontrolą transkrypcyjną. Podejście to wspomaga mechanistyczną redukcję ryzyka i zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych, wyjaśniając, czy obserwowane różnice w ekspresji genów wynikają ze zmienionej stabilności mRNA, czy z aktywności transkrypcyjnej. Integracja profilowania rozpadu transkryptów we wczesnych punktach zwrotnych procesu odkrywania leków pozwala na lepszą selekcję portfela i priorytetyzację celów istotnych dla danej choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie regulacji ekspresji genów poprzez oddzielenie efektów transkrypcyjnych od potranskrypcyjnych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez identyfikację genów o zmiennej stabilności mRNA w stanach istotnych dla przebiegu choroby.
- Ułatwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez wyjaśnienie wpływu degradacji transkryptu na fenotyp.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy wyborze celów o stabilnych profilach regulacyjnych.
Przesiewy i rozwój analizy
- Ustanawia zwalidowane systemy biologiczne dla późniejszych analiz transkrypcyjnych i funkcjonalnych.
- Zapewnia ilościowe pomiary szybkości rozkładu w celu standaryzacji i powtarzalności analizy.
- Umożliwia przesiewanie związków lub perturbacji genetycznych wpływających na stabilność mRNA.
- Wspiera ponowne wykorzystanie platformy do badań porównawczych w różnych stanach lub warunkach komórkowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje sygnatury rozkładu transkrypcji ze stanami komórkowymi istotnymi dla choroby w celu odkrywania biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez śledzenie mechanizmów regulacyjnych.
- Minimalizuje ryzyko decyzji dotyczących dalszego rozwoju poprzez potwierdzenie istotności mechanistycznej potencjalnych celów terapeutycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania – od wczesnego testowania hipotez, przez identyfikację wiodących związków, aż po walidację przedkliniczną, zapewniając możliwość wielokrotnego wykorzystania w analizie transkryptomicznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez izolację rozpadu transkryptu jako zmiennej regulacyjnej.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki tempa rozpadu niezbędne do opracowania testów analitycznych.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie tempa rozpadu pomiędzy stanami proliferacyjnymi i spoczynkowymi.
- Badania translacyjne: Łączy zmiany tempa rozpadu z fenotypami komórkowymi istotnymi dla przebiegu chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje zestandaryzowany schemat postępowania, który można dostosować do różnych modeli komórkowych i warunków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad regulacją genów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ustandaryzowane, reprodukowalne i skalowalne pomiary rozpadu transkryptu.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i zwiększa efektywność kapitałową poprzez wyjaśnienie mechanizmów regulacyjnych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów o zwalidowanych profilach regulacyjnych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w hodowli komórkowej, ekstrakcji RNA oraz ilościowej analizie transkrypcyjnej.
- Wymagany jest dostęp do aparatury do qPCR, mikromacierzy lub sekwencjonowania RNA.
- Niezbędna jest rygorystyczna standaryzacja obchodzenia się z próbkami i pobierania ich w określonych punktach czasowych we wszystkich zespołach.
- Metoda jest dostosowalna do różnych typów komórek, lecz może wymagać optymalizacji dla różnych systemów biologicznych.
- Ograniczeniem jest toksyczność Actinomycin D, co zwęża zakres czasowy pomiaru rozpadu.
Częste pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
ActD Time Course
2:13
Isolation of Total RNA from Phenol-guanidine Isothiocyanate Solution Lysate
5:16
Analysis of Transcript Abundance
6:02
Results: Clear Contrast in Transcript Decay Between Proliferating and Quiescent Fibroblasts
6:28
Conclusion
