Określanie szybkości zaniku transkryptów w całym genomie w proliferujących i spoczynkowych ludzkich fibroblastach
January 2nd, 2018
Opisujemy protokół generowania proliferujących i spokojnych pierwotnych ludzkich fibroblastów skórnych, monitorowania tempa zaniku transkryptu i identyfikacji genów rozkładających się w różny sposób.
Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie szybkości zaniku transkryptu w proliferujących i spoczynkowych fibroblastach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii molekularnej, takie jak to, czy zmiany w ekspresji genów wynikają ze zmian w szybkości zaniku transkryptu. Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarcza ona informacji na temat szybkości zaniku transkryptu, a nie tylko obfitości transkryptu.
Aby rozpocząć protokół, ustal proliferujące i spoczynkowe kultury fibroblastów. Namnażające się fibroblasty powinny być regularnie trypsynizowane. Kultury spoczynkowe można ustanowić, pozwalając płytkom osiągnąć zbieg z regularnymi zmianami podłoża.
Dodać ActD 150 mikrolitrów do wstępnie podgrzanego podłoża 10 mililitrów dla wszystkich płytek do hodowli komórkowych replik biologicznych. Dodać ActD w stężeniu 15 mikrogramów na mililitr pożywki. Dobrze wymieszaj roztwór.
Odessać starą pożywkę i dodać do komórek pożywkę zawierającą ActD. Aby pobrać próbkę punktu zerowego w czasie, delikatnie odessać pożywkę ActD i odpipetować od pięciu do 10 mililitrów wstępnie podgrzanego PBS na 100-milimetrową płytkę, pięć mililitrów roztworu na 100-milimetrową płytkę, dwa mililitry na studzienkę sześciodołkową i jeden mililitr na studzienkę 12-dołkowej. Delikatnie zassać PBS.
Następnie dodać roztwór izotiocyjanianu fenolu i guanidyny bezpośrednio do płytki do hodowli tkankowej. Kilkakrotnie odpipetować mieszaninę komórek roztworu izotiocyjanianu fenolu i guanidyny w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną mieszaninę. Zbierz każdy punkt czasowy po upływie odpowiedniej ilości czasu, korzystając z metody opisanej wcześniej.
Inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie kompleksów białkowych RNA. Następnie wprowadź kontrolowane transkrypcje ze skokami, które można wykryć za pomocą zastosowanej metodologii. Wprowadzić te kontrole do każdej próbki w znanej ilości i stężeniu.
Za pomocą pipety przenieś mieszaninę roztworu izotiocyjanianu fenyloguanidyny do 2,0-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie dodać 0,2 mililitra chloroformu do mieszaniny roztworu izotiocyjanianu fenyloganidyny na każdy mililitr użytego roztworu izotiocyjanianu fenyloguanidyny. Potrząsać energicznie probówką do mikrowirówki przez 15 sekund, a następnie inkubować izotiocyjanian fenyloguanidyny z chloroformu.
Po inkubacji wirować próbki pod ciśnieniem 12 000 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Próbka powinna zostać podzielona na trzy warstwy. Przenieś warstwę wodną do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2,0 mililitra za pomocą mikropipety i uważaj, aby nie zakłócić interfazy podczas tego procesu.
Odrzuć frakcje interfazowe i organiczne. Następnie dodaj równą objętość 2-propanolu do frakcji wodnej i odwróć probówkę 10 razy. Dodaj do jednego mikrolitra 20 miligramów na mililitr wodnego glikogenu na 20 mikrolitrów próbki, zwłaszcza jeśli oczekuje się, że wydajność będzie niska.
Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po inkubacji odwirować próbki. Upewnij się, że pod koniec wirowania RNA wytrąciło się, tworząc chwilową osadkę na dnie probówki.
Za pomocą pipety usunąć i wyrzucić supernatant, zwracając szczególną uwagę, aby nie naruszyć białej osadki RNA. Dodaj jeden mililitr 75% etanolu na jeden mililitr odczynnika w roztworze izotiocyjanianu fenyloguanidyny, aby przepłukać osad. Obracać próbki pod ciśnieniem 12 000 g przez 10 minut.
Po usunięciu większości supernatantu użyj pipety, aby usunąć jak najwięcej etanolu, ale nie naruszaj osadu. Obraca próbki, aby pokryć cały nadmiar etanolu. Na tym etapie pastylka RNA jest mniej zwarta i ma tendencję do poruszania się.
Po wirowaniu usuń cały nadmiar etanolu z rurki, nie naruszając granulki. Pozostaw osad RNA do wyschnięcia na powietrzu przez pięć minut. Dodaj 50 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do osadu RNA i ponownie zawieś osad w wodzie wolnej od nukleaz
.Potraktuj próbki jednej mikrolitrowej dekanazy w celu usunięcia DNA, a następnie dezaktywuj dekanazę i kationy. Przechowuj próbki RNA w 2,0-mililitrowych probówkach do mikrowirówek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Określ ilościowo RNA i sprawdź jego czystość za pomocą spektrofotometru.
Po sprawdzeniu czystości przeanalizuj RNA za pomocą 1% żelu agarozowego, aby zobrazować stopień degradacji. Dwa wyraźne prążki reprezentujące 18S i 28S rRNA powinny być wyraźnie widoczne. Jeśli te prążki nie są widoczne, RNA może ulec degradacji.
Następnie monitoruj obfitość transkryptu w zebranych podwielokrotnościach RNA w porównaniu z wzbogaconym wzorcem wewnętrznym za pomocą qPCR w czasie rzeczywistym. Można również zastosować mikromacierze, sekwencjonowanie RNA lub northern blot. Intensywność fluorescencji w czasie odpowiada ekspresji genów.
Podczas gdy fibroblasty zostają zahamowane kontaktowo, kodujący transkrypt kolagen 3A1, bardzo ważny gen do tworzenia macierzy zewnątrzkomórkowej odkładającej się podczas gojenia się ran, staje się bardziej stabilny i nie rozpada się tak szybko. Nie zapominaj, że praca z fenolem może być niezwykle niebezpieczna i ważne jest, aby nie dopuścić do jego dotknięcia skóry. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak monitorować tempo zaniku transkryptu w proliferujących i uśpionych fibroblastach.
Zmiany w szybkości zaniku transkryptu mogą być ważnym mechanizmem triangulacji genów.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje protokół do generowania zarówno rozmnażających się, jak i spoczynkowych pierwotnych ludzkich fibroblastów skórnych. Skupia się na monitorowaniu szybkości rozpadu transkryptów i identyfikacji genów o różnej szybkości rozpadu, zapewniając wgląd w dynamikę ekspresji genów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia Molekularna
- Biologia Komórki
- Ekspresja Genów
Tło
- Rozumienie szybkości rozpadu transkryptów jest kluczowe dla wyjaśnienia regulacji ekspresji genów.
- Fibroblasty służą jako model do badania procesów komórkowych w tkankach ludzkich.
- Stany rozmnażania i spoczynku fibroblastów mogą wpływać na wyniki ekspresji genów.
- Ten protokół ma na celu odróżnienie efektów rozpadu transkryptów od samej obfitości transkryptów.
Cel badania
- Monitorowanie szybkości rozpadu transkryptów w różnych stadiach kultur fibroblastów.
- Badanie, jak zmiany w ekspresji genów wiążą się z szybkością rozpadu transkryptów.
- Dostarczenie niezawodnej metody do badania dynamiki ekspresji genów w fibroblastach.
Stosowane metody
- Ustanowienie kultur fibroblastów rozmnażających się i spoczynkowych.
- Regularne trypsynizowanie fibroblastów rozmnażających się.
- Ustanowienie kultur spoczynkowych na podstawie konfluencji z wymianami pożywki.
- Monitorowanie szybkości rozpadu transkryptów poprzez protokoły eksperymentalne.
Główne wyniki
- Identyfikacja genów o różnej szybkości rozpadu między stanami rozmnażającymi się i spoczynkowymi.
- Wgląd w związek między rozpadem transkryptów a zmianami ekspresji genów.
- Wykazanie zalet pomiaru szybkości rozpadu transkryptów.
- Dostarczenie szczegółowego protokołu dla przyszłych badań w dziedzinie biologii molekularnej.
Wnioski
- Protokół skutecznie rozróżnia pomiędzy obfitością transkryptów a szybkością ich rozpadu.
- Wyniki przyczyniają się do głębszego zrozumienia regulacji ekspresji genów.
- Ta metoda może być stosowana w różnych badaniach w dziedzinie biologii molekularnej i komórkowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Genome-wide measurement of transcript decay rates in proliferating and quiescent human fibroblasts enables biopharma teams to distinguish regulatory mechanisms driving gene expression changes beyond transcriptional control. This approach supports mechanistic de-risking and enhances predictive confidence in target validation by clarifying whether observed gene expression differences are due to altered mRNA stability or transcriptional activity. Integrating transcript decay profiling at early discovery inflection points informs portfolio triage and prioritization of disease-relevant targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene expression regulation by separating transcriptional and post-transcriptional effects.
- Supports functional target validation by identifying genes with altered mRNA stability in disease-relevant states.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying the contribution of transcript decay to phenotype.
- Improves predictive confidence for advancing targets with robust regulatory profiles.
Screening & Assay Development
- Establishes validated biological systems for downstream transcriptomic and functional assays.
- Provides quantitative decay rate measurements for assay standardization and reproducibility.
- Enables screening of compounds or genetic perturbations affecting mRNA stability.
- Supports platform reuse for comparative studies across cell states or conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns transcript decay signatures with disease-relevant cellular states for translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by tracking regulatory mechanisms.
- De-risks advancement decisions by confirming mechanistic relevance of candidate targets.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, providing a reusable capability for transcriptomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating transcript decay as a regulatory variable.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative decay rate outputs for assay development.
- Analytics: Enables statistical comparison of decay rates between proliferating and quiescent states.
- Translational Research: Connects decay rate changes to disease-relevant cellular phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized workflow adaptable to diverse cell models and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies.
- Operational Value: Provides standardized, reproducible, and scalable transcript decay measurements.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying regulatory mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with validated regulatory profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, RNA extraction, and quantitative transcript analysis.
- Needs access to instrumentation for qPCR, microarray, or RNA sequencing.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample handling and time-point collection.
- Adaptable to various cell types but may require optimization for different biological systems.
- Limited by Actinomycin D toxicity, restricting the time course for decay measurement.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
ActD Time Course
2:13
Isolation of Total RNA from Phenol-guanidine Isothiocyanate Solution Lysate
5:16
Analysis of Transcript Abundance
6:02
Results: Clear Contrast in Transcript Decay Between Proliferating and Quiescent Fibroblasts
6:28
Conclusion
