Charakterystyka strukturalna polisacharydów ściany komórkowej Mannanów w roślinach przy użyciu PACE

Ogólnym celem tego eksperymentu jest scharakteryzowanie polisacharydów ściany komórkowej roślin. Ta metoda może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii ściany komórkowej roślin, w tym strukturę i ilość glukomannanu. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga specjalistycznego szkolenia ani drogiego sprzętu.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności z interpretacją żeli, więc włączenie i zrozumienie wszystkich opisanych kontroli ma kluczowe znaczenie. Alkohol i rozpuszczalna pozostałość, czyli POWIETRZE, są uprzednio przygotowywane z zebranego materiału roślinnego, jak opisano w protokole tekstowym. Zważ sześć miligramów POWIETRZA do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i dodaj wodę do końcowego stężenia dwóch miligramów na mililitr.

Vortex, aby uzyskać równomierne zawieszenie. Podaniec 500 mikrogramów do probówek do mikrofuge. Wysuszyć porcje za pomocą wirówki próżniowej w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc.

Wstępną obróbkę POWIETRZA, w tym podwielokrotność do bezenzymatycznej kontroli POWIETRZA, jednym molowym wodorotlenkiem sodu przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po godzinie dodaj 200 mikrolitrów wody i 20 mikrolitrów jednego molowego kwasu solnego do każdej probówki, aby zneutralizować wodorotlenek sodu. Sprawdź, czy pH wynosi około sześciu do siedmiu, usuwając jeden mikrolitr i umieszczając go na papierowych paskach wskaźnika pH.

Dodaj 50 mikrolitrów jednego molowego buforu octanu amonu o pH 6,0 i dodaj wodę do całkowitej objętości 500 mikrolitrów do każdej probówki. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj z góry określoną ilość mannanaz do podwielokrotności AIR i buforu. Obejmują one odpowiednie kontrole ujemne, jak również kontrolę dodatnią.

Wirować, a następnie krótko obracać, aby zebrać mieszaninę reakcyjną na dnie probówki. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem przez noc. Następnego dnia zatrzymaj reakcję, inkubując w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Wirować z maksymalną prędkością przez 10 minut. Zachowaj supernatant i ponownie zawieś każdą granulkę w 250 mikrolitrach wody. Ponownie odwirować i zachować supernatant.

Połącz oba supernatanty i susz w wirówce próżniowej w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez około trzy godziny. Przed zabiegiem derywatyzacji należy przygotować niezbędne odczynniki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Podgrzej roztwór podstawowy 0,2 molowego ANTS do 60 stopni Celsjusza, aby całkowicie rozpuścić ciało stałe.

Do każdej próbki dodaj pięć mikrolitrów ANTS, pięć mikrolitrów boranu dwupikolinowego i 10 mikrolitrów buforu do derywatyzacji. Krótko zakręć, aby zebrać się na dnie tuby, dokładnie zwirować, a następnie ponownie krótko zakręć. Próbki inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem.

Następnego dnia wysuszyć próbki w wirówce próżniowej w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez około dwie godziny. Zawiesić każdą próbkę w wzorcu oligosacharydowym i 100 mikrolitrach trzech molowych mocznika. Przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, chronić przed światłem do czasu, gdy będzie to wymagane.

Montaż sprzętu do odlewania żelu będzie zależał od marki. W przypadku sprzętu użytego w tej demonstracji jeden żel odpowiada 50 mililitrom. W 50-mililitrowej probówce wirówkowej wymieszaj 20,2 mililitra wody, pięć mililitrów 10-krotnego buforu PACE, 24,6 mililitra 40% akrylamidu/bis-akrylamidu, 200 mikrolitrów APS i 20 mikrolitrów TEMED.

Delikatnie odwróć do mieszania, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Użyj pipety serologicznej lub innej pipety o dużej objętości, aby wlać żel rozdzielczy do około czterech centymetrów poniżej górnej części szklanych płytek. Ostrożnie pokryj żel alkoholem izopropylowym.

Pozostaw żel do polimeryzacji przez 20 do 30 minut. Zdjąć wierzchnią warstwę. Osusz nadmiar płynu za pomocą bibuły.

Następnie przygotuj żel do układania w stosy. W 15-mililitrowej probówce wirówkowej wymieszaj 6,8 mililitra wody, jeden mililitr 10x buforu PACE, 2,8 mililitra akrylamidu/bis-akrylamidu, 80 mikrolitrów APS i osiem mikrolitrów TEMED. Odwróć, aby wymieszać i nałóż na wierzch spolimeryzowanego żelu rozdzielczego.

Delikatnie włóż grzebień, unikając zatrzymywania pęcherzyków powietrza pod zębami grzebienia. Po polimeryzacji żelu zawiń go w wilgotną chusteczkę, a następnie w folię spożywczą i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie to potrzebne. Aby pomóc w śledzeniu kolejności załadunku i określeniu, gdzie znajdują się studzienki po wyjęciu grzebienia, użyj trwałego markera, aby oznaczyć pozycje studni na szkle.

Wyjmij grzebień. Napełnij studnie buforem one-X PACE. Użyj mikrostrzykawki o pojemności 10 mikrolitrów, aby załadować dwa mikrolitry wzorców i próbek do studzienek.

Należy unikać korzystania z najbardziej zewnętrznych pasów, które mają tendencję do słabego prowadzenia próbek, i pozostawiania pustego pasa między próbkami. Zmontować górną komorę aparatu do pracy żelu i umieścić żel w chłodzonym zbiorniku roboczym zawierającym bufor jednokrotny PACE. Napełnij górną komorę buforem one-X PACE.

Włącz zasilanie i uruchom żel pod napięciem 200 woltów przez 30 minut. Po 30 minutach zwiększ napięcie do 1 000 woltów na godzinę i 40 minut. Chroń żel przed światłem.

Zacznij od przetarcia systemu obrazowania żelem wilgotną, niestrzępiącą się chusteczką, aby upewnić się, że jest wolny od kurzu. Wyjmij żel ze zbiornika PACE i view krótko, gdy żel jest jeszcze w szklanych płytkach, aby określić, czy przód barwnika nadal znajduje się na żelu. Użyj narzędzia klinowego, aby otworzyć żel i gdy żel nadal znajduje się na jednej szklanej płytce, użyj noża do pizzy, aby usunąć zarówno żel do układania, jak i spód żelu, jeśli przód barwnika nadal znajduje się na żelu.

Dozuj około pięciu mililitrów wody na powierzchnię transiluminatora, a następnie przenieś żel bezpośrednio na transiluminator. Za pomocą oprogramowania ustaw filtr na UV 605 i włącz długofalowy transiluminator UV. Zrób kilka zdjęć w różnych czasach ekspozycji, upewniając się, że światło UV jest wyłączone między obrazami, aby uniknąć degradacji fluorescencji.

Upewnij się, że co najmniej dwa obrazy nie mają nasyconych pasm. Zapisz pliki jako obrazy TIFF o wysokiej rozdzielczości. Pokazano reprezentatywny żel standardowego testu PACE na zawartość mannanu w ścianie komórkowej.

Pasy pierwszy, drugi i trzeci pokazują drabinę komercyjnie zakupionych oligosacharydów o stężeniach odpowiednio pięciu, 10 i 50 pikomoli. Ścieżka czwarta pokazuje trawienie mannanazą glukomannanu konjac, który służy jako pozytywna kontrola zarówno trawienia enzymatycznego, jak i reakcji derywatyzacji w obecności enzymu i soli buforowych. Pas piąty pokazuje odcisk palca PACE łodygi rzodkiewnika typu dzikiego.

Pas szósty pokazuje odcisk palca PACE łodygi z rośliny Arabidopsis, która nie ma głównej syntazy mannanu łodygi. W porównaniu z typem dzikim, obecna jest tylko niewielka ilość mannanu, o czym świadczy zmniejszona intensywność pasma dla wszystkich oligosacharydów pochodzących z mannanazy. Tor 10 pokazuje odcisk palca PACE drewna sosnowego, które zawiera galaktoglukomannan i ma wzór uwolnionych oligosacharydów wyraźnie różniący się od tego u Arabidopsis.

Pas siódmy, ósmy, dziewiąty i jedenasty to różne kontrole ujemne, które ujawniają niespecyficzne pasma oznaczone gwiazdkami, które powinny być wyłączone z analizy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć naprawdę dobre zrozumienie, jak analizować strukturę mannan za pomocą PACE. Po opanowaniu technikę tę można zastosować do innych interesujących polisacharydów przy użyciu różnych hydrolaz glikozylu.

Odnieśliśmy sukces stosując tę technikę do wielu innych gatunków roślin oprócz rzodkiewnika, a także do innych gatunków niebędących roślinami, takich jak drożdże mannan.