Wprowadzenie do ruchliwości i migracji komórek

Ruchliwość komórek jest wymagana w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych, w tym w migracji komórek podczas rozwoju embrionalnego, ruchu białych krwinek w odpowiedzi na infekcję i komórek rakowych poddawanych przerzutom. Dwa białka komórkowe, aktyna i miozyna, stanowią główne elementy budulcowe aparatu motorycznego.

W tym filmie wprowadzającym dokonamy przeglądu niektórych z przełomowych odkryć w dziedzinie ruchliwości i migracji komórek. Następnie podkreślimy kilka pytań bez odpowiedzi dotyczących ruchliwości komórek, a następnie omówimy klasyczne i zaawansowane narzędzia używane do badania ruchliwości. Na koniec podsumujemy kilka przykładowych eksperymentów.

Zacznijmy od przyjrzenia się ważnym odkryciom związanym z tą dziedziną.

W XVI TAG_11 TAG_10 I wieku Anton van Leeuwenhoek, za pomocą mikroskopu, stał się pierwszą osobą, która zaobserwowała ruch plemników i bakterii. Kilka wieków później Theodor Wilhelm Engelmann i Wilhelm Pfeffer odkryli ruch bakterii napędzany bodźcami, w tym: fototaksis, czyli ruch pod wpływem światła; chemotaksja – ruch w kierunku różnych substancji chemicznych; i aerotaksja – ruch w odpowiedzi na tlen. Mniej więcej w tym samym czasie Ilya Metchnikoff przeprowadził fascynujący eksperyment, w którym nakłuł przezroczystą larwę rozgwiazdy kolcem róży i obserwował komórki przemieszczające się z innych części ciała do rany. Doprowadziło to do powstania koncepcji leukocytów migrujących do miejsca urazu, co zapoczątkowało rozwój immunologii.

Zrozumienie mechanizmu ruchu komórek rozpoczęło się kilka lat wcześniej, podczas badania pozornie niezwiązanego z nim zjawiska – skurczu mięśni. W 1859 roku Wilhelm Kühne wyizolował białko mięśniowe, które jego zdaniem było odpowiedzialne za jego sztywność i nazwał je miozyną.

W 1942 roku Brunó Ferenc Straub odkrył, że preparaty "miozyny" w rzeczywistości zawierają wtórne białko, aktynę. Wiemy teraz, że aktyna i miozyna oddziałują na siebie, tworząc kompleks aktomiozyny, który powoduje skurcz. W 1974 roku Margaret Clarke, pracując pod kierunkiem Jamesa Spudisha, scharakteryzowała struktury podobne do aktomiozyny w śluzowcu Dictyostelium i zasugerowała jej udział w ruchu komórek niemięśniowych.

W 1983 roku Spudich, wraz z Michaelem Sheetzem, opracowali model aktomiozyny in vitro, który utorował drogę do naszego dzisiejszego zrozumienia ich mechanizmu. Wiemy teraz, że ATP, "wysokoenergetyczna" cząsteczka w komórkach, wiąże się z miozyną i napędza cząsteczkę miozyny do "czołgania się" wzdłuż równoległej cząsteczki aktyny, generując w ten sposób siłę skurczu, która w komórkach niemięśniowych może ciągnąć komórkę do przodu podczas migracji.

Po krótkim zarysie historycznym omówmy kilka pytań dotyczących ruchliwości komórek, które zadają sobie dziś naukowcy.

Naukowcy są zainteresowani dowiedzeniem się, w jaki sposób sygnały środowiskowe kierują ruchem komórek. Komórki poruszają się w odpowiedzi na różne sygnały, w tym te, które napędzają rozwój embrionalny lub ostrzegają komórki odpornościowe o miejscach infekcji. Sygnały te są zwykle związkami chemicznymi uwalnianymi przez niektóre komórki w celu wywołania migracji określonego typu komórek w ich kierunku. Dlatego badanie mechanizmu tej indukcji chemotaksji może pomóc naukowcom lepiej zrozumieć zaburzenia, w których migracja komórek jest zakłócona.

Innym ważnym obszarem badań jest maszyneria molekularna, której komórki używają do poruszania się. Oprócz aparatu aktomiozynowego, który umożliwia komórkom o elastycznych kształtach wysuwanie się i "pełzanie" po powierzchniach, naukowcy starają się również zrozumieć, w jaki sposób ruchliwość komórek może być napędzana przez inne elementy cytoszkieletu, takie jak mikrotubule tworzące "trzon" ogonów plemników, a także złożone maszyny molekularne, które tworzą wici bakteryjne.

Wreszcie, niektórzy naukowcy badają, w jaki sposób komórki oddziałują ze sobą i migrują razem w grupach, które zachodzą we wczesnej embriogenezie, a także w procesie gojenia się ran.

Dodatkowo, ponieważ komórki w organizmie faktycznie istnieją w siatce cząsteczek znanej jako macierz zewnątrzkomórkowa, w skrócie ECM, badanie, w jaki sposób komórki oddziałują i atakują ECM, może pomóc w zrozumieniu zjawisk takich jak przerzuty raka.

Teraz, gdy mamy już pojęcie o pytaniach zadawanych w tej dziedzinie, dowiedzmy się o niektórych ważnych stosowanych technikach.

Test zadrapań służy do modelowania, w jaki sposób komórki nabłonkowe ponownie zasiedlają otwarty obszar - proces podobny do gojenia się ran. W tej procedurze rana jest tworzona przez przepuszczenie końcówki pipety przez naczynie do hodowli komórkowej. Gdy komórki z czasem wrastają z powrotem w tę lukę, ich trajektorie ruchu mogą być śledzone za pomocą oprogramowania śledzącego w celu oceny prędkości ruchu i przemieszczenia.

Test migracji transwell jest kolejną klasyczną metodą stosowaną do badania chemoatrakcyjności, czyli procesu chemicznego przyciągania komórek. W tym teście roztwór chemoatraktantu dodaje się do studzienek, następnie komory transwell umieszcza się w tych studzienkach, a na koniec dodaje się typ komórek migrujących po górnej stronie membrany. Liczbę komórek migrujących w kierunku chemoatraktantu można policzyć za pomocą mikroskopu i hemocytometru.

Postęp w technikach inżynieryjnych pozwolił na skonstruowanie urządzeń mikroprzepływowych, składających się z mikroprefabrykowanych kanałów wytrawionych na odpowiedniej powierzchni. W przypadku eksperymentów migracyjnych kanał ma zwykle dwa porty: jeden do dodawania zawiesiny komórkowej, a drugi do dodawania bodźca chemicznego. Wpływ bodźca na zachowanie migracyjne komórek można następnie badać pod mikroskopem.

Aby zbadać inwazję komórek do ECM, naukowcy mogą przeprowadzić testy inwazji 3D. W tej metodzie naukowcy hodują komórki w trójwymiarowych matrycach wykonanych ze składników takich jak kolagen. Następnie, za pomocą zaawansowanego oprogramowania, mogą śledzić inwazję w trzech wymiarach. Metoda ta jest szczególnie przydatna do badania rozwoju guza.

Wreszcie, poklatkowa mikroskopia fluorescencyjna może być wykorzystana do śledzenia żywych komórek in vivo. Geny kodujące białka fluorescencyjne można wprowadzić do modelu zwierzęcego. Ścieżkę migracji komórek wykazujących obecnie ekspresję białek fluorescencyjnych można prześledzić za pomocą zaawansowanych metod obrazowania, takich jak mikroskopia dwufotonowa.

Przyjrzyjmy się teraz niektórym obecnym zastosowaniom tych testów ruchliwości i migracji komórek.

Jak wspomniano, migracja komórek odgrywa kluczową rolę w przerzutach guza. W tym przypadku naukowcy wyhodowali komórki nowotworowe osadzone w matrycy wraz z wycinkami mózgu w komorze transwell. Po inkubacji próbki barwiono i analizowano za pomocą immunofluorescencji. Wyniki wykazały inwazję komórek nowotworowych do wycinków mózgu.

Po zakażeniu komórki uwalniają chemokiny, które są białkami chemoatraktantowymi, które indukują migrację neutrofili. Neutrofile to komórki fagocytarne, które stanowią integralną część wrodzonego układu odpornościowego. W tym przypadku naukowcy ocenili to zjawisko za pomocą testu migracji transwell. Umieścili oni zakażone bakteriami komórki nabłonkowe na spodniej stronie błony, podczas gdy neutrofile hodowano na górnej stronie. Wyniki wykazały znaczną migrację neutrofili w obecności zakażonych komórek.

Wreszcie, testy w komorze mikroprzepływowej można wykorzystać do zbadania chemotaksji bakteryjnej. Naukowcy ocenili właściwości atraktantów i repelentów dwóch substancji – L-asparaginianu i siarczanu niklu – za pomocą specjalistycznej komory mikroprzepływowej, która mogła przetestować kilka stężeń w jednym eksperymencie. Uzyskane dane wykazały, że wraz ze wzrostem stężenia atraktantu i repelentu zwiększyła się również odpowiednio migracja bakterii w kierunku i od badanych cząsteczek.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do ruchliwości i migracji komórek. W tej prezentacji dokonaliśmy przeglądu głównych kamieni milowych w badaniu ruchliwości i migracji komórek. Następnie omówiliśmy niektóre aktualne pytania i narzędzia używane obecnie w laboratoriach. Wreszcie, kilka przykładowych eksperymentów uwypukliło zastosowania tych technik. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!