Name: Pomiar wpływu substancji chemicznych na wzrost i rozmnażanie Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Poznaj metodę oceny toksyczności chemikaliów na wzroście i rozmnażaniu Caenorhabditis elegans. Technika ta jest wygodna i ekonomiczna dla badań toksykologicznych oraz oceny ryzyka środowiskowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant badawczy Koreańskiego Instytutu Nauki i Technologii (2E27513) oraz Program Rozwoju Technologii Żywności o Wysokiej Wartości (IPET) finansowany przez Ministerstwo Rolnictwa, Żywności i Spraw Wiejskich (315067-03).

UWAGA: Cały eksperyment musi być przeprowadzony w czystym, odizolowanym laboratorium utrzymywanym w temperaturze 20 °C z niskim zapyleniem i z minimalizacją zanieczyszczeń podczas pracy z robakami i bakteriami. W tym celu eksperymenty muszą być przeprowadzane pod płomieniem lampy alkoholowej lub przy użyciu czystej ławki.
1. Utrzymanie C. elegans i przygotowanie jaj do testu chemicznego
<ol>
	<li>Utrzymuj C. elegans N2 (var. Bristol) na płytce agarowej NGM karmionej żywym E. coli OP50 w temperaturze 20 °C12,13.</li>
	<li>Przygotuj jaja zsynchronizowane z wiekiem, korzystając z roztworu wybielacza5, lub metody składania jaj w czasie6,14,15. 
	UWAGA: Przed przygotowaniem jaj należy pokryć płytkę NGM zawierającą etopozyd inaktywowanym termicznie E. coli OP50, jak opisano poniżej. Inaktywowana termicznie E. coli OP50 służy do minimalizacji aktywności metabolicznej E. coli6,16.</li>
</ol>
2. Przygotowanie inaktywowanej termicznie E. coli OP50 do karmienia C. elegans podczas badania toksyczności
<ol>
	<li>Przygotować 500 ml pożywki z podwójnym tryptonem drożdżowym (DYT) zgodnie z opisem w Tabeli 1 i zaszczepić pojedynczą kolonię E. coli OP50 hodowaną na płytce agarowej Luria-Bertani (LB)5.</li>
	<li>Inkubować E. coli OP50 w inkubatorze z wytrząsaniem przez 14 godzin w temperaturze 37 °C i przy prędkości 150 obr./min.</li>
	<li>Po odwirowaniu przez 30 minut w temperaturze 3,220 x g i temperaturze 20 °C, usunąć całe sklarowane nad osadem podłoże DYT i dodać wstępną mieszaninę 25 ml buforu S, 250 μl 1 MMgSO4 i 25 μL 5 mg/ml cholesterolu (rozpuszczonego w etanolu). Wszystkie te roztwory są sterylne.</li>
	<li>Ponownie zawieś bakterie i przenieś je do jednorazowej plastikowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>W celu inaktywacji termicznej inkubować ponownie zawieszoną E. coli OP50 w łaźni wodnej przez 30 minut w temperaturze 65 °C.</li>
	<li>Schłodzić do temperatury pokojowej i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Można go przechowywać przez okres do jednego miesiąca.</li>
</ol>
3. Przygotowanie płytek NGM zawierających 1% DMSO lub etopozyd 750 μM
<ol>
	<li>Przygotuj dwie czyste szklane butelki o pojemności 200 ml. Do jednej butelki dodać 0,6 g NaCl, 0,5 g peptonu, 3,4 g agaru i 195 ml wody destylowanej oraz mieszadło magnetyczne. Dodaj mieszadło magnetyczne do drugiej pustej butelki.</li>
	<li>Obie butelki należy sterylizować w autoklawie przez 15 minut w temperaturze 121 °C, a następnie schłodzić je w łaźni wodnej przez 30 minut w temperaturze 55 °C.</li>
	<li>Dodać 0,2 ml 1 M CaCl2, 0,2 ml 5 mg/ml cholesterolu, 0,2 ml 1 MMgSO4 i 5 ml 1 M KPO4 (wszystkie te roztwory są sterylne), a następnie wymieszać je mieszając magnetycznie na gorącej płycie w temperaturze 55 °C.</li>
	<li>Podziel zmieszaną pożywkę NGM na dwie butelki o tej samej objętości (100 ml każda). Następnie dodaj 1 ml DMSO do jednej butelki, ponownie wymieszaj za pomocą mieszania magnetycznego. Drugą butelkę należy przechowywać w łaźni wodnej w temperaturze 55 °C do następnego etapu. Podwielokrotność 3 ml pożywki zawierającej DMSO na każdą szalkę Petriego o wymiarach 35 x 10mm2. Na tym etapie można wykonać około 33 płyt NGM zawierających DMSO.</li>
	<li>Wymieszać drugą butelkę za pomocą mieszadła magnetycznego, dodać 1 ml 75 mM etopozydu (bulion rozpuszczony w DMSO), ponownie wymieszać i powtórzyć procedurę podwielokrotności (krok 3.4). Na tym etapie można wykonać około 33 płytek NGM zawierających etopozyd (750 μM). 
	UWAGA: W skorelowanym poprzednim artykule6, przetestowaliśmy 0, 250, 500 i 1,000 μM etopozydu. Na podstawie tych danych wybraliśmy w tym artykule dawkę etopozydu wynoszącą 750 μM.</li>
	<li>Schłodzić płytki NGM zawierające chemikalia do temperatury pokojowej, pozostawiając je w temperaturze pokojowej na około 3 godziny i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia. 
	UWAGA: W przypadku chemikaliów wrażliwych na światło należy blokować światło, aby zminimalizować rozkład wywołany światłem. 
	UWAGA: Opcjonalnie należy wykonać normalną płytkę NGM bez chemikaliów do testu składania jaj, który można przeprowadzić przy użyciu dwóch różnych warunków obróbki chemicznej, jak opisano poniżej.</li>
	<li>Dodać 100 μl inaktywowanej termicznie E. coli OP50 (jak opisano w sekcji 2) i rozprowadzić na każdej płytce NGM. Pozostawić do wyschnięcia na noc w inkubatorze C. elegans w temperaturze 20 °C do przeprowadzenia testu chemicznego.</li>
</ol>
4. Pomiar wzrostu C. elegans
<ol>
	<li>Przenieś zsynchronizowane z wiekiem jaja C. elegans na płytkę NGM uzupełnioną 1% DMSO lub etopozydem 750 μM.</li>
	<li>Inkubować C. elegans w inkubatorze w temperaturze 20 °C przez 4 dni. Obserwuj robaki za pomocą mikroskopu stereoskopowego i codziennie rób zdjęcia mikroskopowe. Zwykle 20-krotne powiększenie (soczewka obiektywowa 1X, powiększenie 2X zoom i 10-krotna soczewka okularowa) jest odpowiednie do obserwacji wzrostu C. elegans. Wykonaj również obraz mikroskopowy mikrometru stolikowego mikroskopu w celu kalibracji rozmiaru ślimaka. 
	UWAGA: Głód wpływa na test toksyczności. Dlatego nakarm się wystarczającą ilością bakterii lub na początku dostosuj liczbę przenoszonych jaj C. elegans. Obserwuj do 3 dni, aby wykluczyć możliwość głodu.</li>
	<li>Zmierz długość ciała C. elegans poddanych działaniu DMSO lub etopozydu w każdym punkcie czasowym za pomocą oprogramowania ImageJ. 
	UWAGA: Do każdego pomiaru próbki wystarczy 50 robaków do analizy statystycznej.
	<ol>
		<li>W ImageJ otwórz obraz mikrometru na stoliku mikroskopu ("Plik" → "Otwórz"). 
		UWAGA: Obraz mikrometru i obrazy robaka (krok 4.2) muszą mieć to samo powiększenie.</li>
		<li>Przeciągnij linię o długości 1 000 μm na obrazie kalibracji mikrometru za pomocą narzędzia "Linia prosta".</li>
		<li>Kliknij "Analizuj" → "Ustaw skalę" i wprowadź 1,000 i μm odpowiednio w polach "Znana odległość" i "Jednostka długości". Zaznacz "Globalne" i kliknij "OK".</li>
		<li>Otwórz obrazy robaka ("Plik" → "Otwórz"). Narysuj linię wzdłuż cechy każdego robaka za pomocą narzędzia "Linia odręczna". Uzyskaj dane dotyczące długości ciała, klikając "Analizuj" → "Zmierz".</li>
		<li>Powtórz te kroki dla 50 robaków.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Test składania jaj przez C. elegans
<ol>
	<li>Jaja zsynchronizowane z wiekiem wysiadywać na płytce NGM zawierającej DMSO lub etopozyd przez 64 godziny (przed pierwszym urodzeniem) aż do stadium młodego dorosłego osobnika w temperaturze 20 °C. 
	UWAGA: Użycie robaków z eksperymentów pomiaru wzrostu jest opcjonalne. Wygodnie jest wykonać jednocześnie pomiar wzrostu i test składania jaj.</li>
	<li>Przenieść 5 dorosłych robaków na nową płytkę NGM bez chemikaliów (warunek 1, obróbka chemiczna w określonym czasie, od stadium jaj do młodego dorosłego osobnika) lub nową płytkę NGM zawierającą tę samą chemiczną obróbkę wstępną (warunek 2, ciągłe narażenie na chemikalia przez cały okres doświadczalny), a następnie inkubować je przez 24 godziny 
	UWAGA: Zaleca się wykonywanie powtórzeń przy użyciu płytek 3-5 NGM do każdego zabiegu; Powtórzenia te można wykorzystać do analizy statystycznej.</li>
	<li>Przenieś na nową płytkę NGM zgodnie z powyższym opisem i policz liczbę jaj każdego dnia. Policz robaki, które wypełzły z domu, umarły i wykluły się wewnętrznie.</li>
	<li>Powtarzaj te kroki, aż robaki przestaną składać jaja, zwykle w ciągu 5 dni.</li>
	<li>Oblicz liczbę jaj złożonych na robaka z każdej płytki i sumuj te wartości codziennie przez 5 dni, aby określić całkowitą liczbę złożonych jaj. 
	UWAGA: Z obliczeń należy wykluczyć liczbę robaków, które wypełzły i wykluły się wewnętrznie.</li>
</ol>

<ol><li>Blomme, E. A., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicology+strategies+for+drug+discovery%3A+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Toxicology strategies for drug discovery: present and future.</a> Chem. Res. Toxicol. 29 (4), 473-504 (2016).</li>
<li>Lilienblum, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+methods+to+safety+studies+in+experimental+animals%3A+role+in+the+risk+assessment+of+chemicals+under+the+new+European+Chemicals+Legislation+%28REACH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH).</a> Arch. Toxicol. 82 (4), 211-236 (2008).</li>
<li>Honnen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+powerful+alternative+model+organism+to+promote+research+in+genetic+toxicology+and+biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a powerful alternative model organism to promote research in genetic toxicology and biomedicine.</a> Arch. Toxicol. , In Press (2017).</li>
<li>Hunt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+model+in+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The C. elegans model in toxicity testing.</a> J. Appl. Toxicol. 37 (1), 50-59 (2017).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019(2012).</li>
<li>Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicological+evaluation+of+the+topoisomerase+inhibitor%2C+etoposide%2C+in+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans+and+3T3-L1+normal+murine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells.</a> Environ. Toxicol. 32 (6), 1836-1843 (2017).</li>
<li>Imanikia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+the+comet+assay+to+assess+the+genotoxicity+of+environmental+pollutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Environ. Toxicol. Pharmacol. 45, 356-361 (2016).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfluorooctane+sulfonate+exposure+causes+gonadal+developmental+toxicity+in+Caenorhabditis+elegans+through+ROS-induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Perfluorooctane sulfonate exposure causes gonadal developmental toxicity in Caenorhabditis elegans through ROS-induced DNA damage.</a> Chemosphere. 155, 115-126 (2016).</li>
<li>Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+screening+platform+for+the+rapid+assessment+of+chemical+disruption+of+germline+function%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">A C. elegans screening platform for the rapid assessment of chemical disruption of germline function.</a> Environ. Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).</li>
<li>Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lead+phytochemicals+for+anticancer+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Lead phytochemicals for anticancer drug development.</a> Front. Plant Sci. 7, 1667(2016).</li>
<li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+topoisomerase+inhibitor%2C+daurinol%2C+suppresses+growth+of+HCT116+cells+with+low+hematological+toxicity+compared+to+etoposide%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide.</a> Neoplasia. 13 (11), 1043-1057 (2011).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293(2011).</li>
<li>Zarse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin%2FIGF1+signaling+extends+life+span+by+promoting+mitochondrial+L-proline+catabolism+to+induce+a+transient+ROS+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal.</a> Cell Metab. 15 (4), 451-465 (2012).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> J. Vis. Exp. (27), e1152(2009).</li>
<li>Weimer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D-Glucosamine+supplementation+extends+life+span+of+nematodes+and+of+ageing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice.</a> Nat. Commun. 5, 3563(2014).</li>
<li>Schmeisser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+ROS+signaling+rather+than+AMPK%2Fsirtuin-mediated+energy+sensing+links+dietary+restriction+to+lifespan+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension.</a> Mol. Metab. 2 (2), 92-102 (2013).</li>
<li>Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+assessment+of+germline+chemical+toxicity+using+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J. Vis. Exp. (96), e52445(2015).</li>
<li>Hahm, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+maximum+velocity+correlates+with+healthspan+and+is+maintained+in+worms+with+an+insulin+receptor+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation.</a> Nat. Commun. 6, 8919(2015).</li>
<li>Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+spreading+and+toxicity+of+prion-like+proteins+using+the+metazoan+model+organism+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (95), e52321(2015).</li>
<li>Schmidt, B. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+acute+and+developmental+neurotoxicity+screening%3A+an+overview+of+cellular+platforms+and+high-throughput+technical+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities.</a> Arch. Toxicol. 91 (1), 1-33 (2017).</li>
<li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+drug+toxicity+using+3D+spheroids+constructed+from+an+immortal+human+hepatocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line.</a> Toxicol. Sci. 127 (2), 403-411 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule opisujemy ocenę toksyczności substancji chemicznych w C. elegans, nicieniu glebowym, na przykładzie etopozydu. W tym celu wykorzystaliśmy dwa warunki eksperymentalne. W pierwszym zestawie C. elegans hodowano na płytkach zawierających etopozyd od jaj do stadium młodego dorosłego osobnika, a następnie robakom pozwolono składać jaja na normalnych płytkach NGM bez chemikaliów. W drugim zestawie eksperymentalnym C. elegans były stale leczone etopozydem przez cały okres eksperymentalny...

Ocena toksykologiczna jest niezbędna do rozwoju farmaceutyków, nutraceutyków i kosmeceutyków, a także do oceny ryzyka różnych toksyn środowiskowych. Model gryzoni jest jednym z najpopularniejszych systemów eksperymentalnych in vivo w tym badaniu toksykologicznym; alternatywnie szeroko stosowane są również organizmy inne niż ssaki, takie jak C. elegans. Modele oceny toksykologicznej u zwierząt innych niż ssaki są korzystne nie tylko ze względu na kwestie etyczne zwierząt, ale także ze względu na ich wygodę i użyteczność, biorąc pod uwagę opłacalność, łatwość konserwacji, szybkość i odtwarzalność1,2,3,4.
C. elegans, robak okrągły glebowy, był wykorzystywany jako zwierzę modelowe w różnych podstawowych i stosowanych badaniach biologicznych i chemicznych. Jest to przezroczysty nicień o długości 1 mm, który jest po prostu utrzymywany w stałym lub płynnym pożywce wzrostowej nicieni (NGM) karmionej szczepem bakteryjnym Escherichia coli OP50. C. elegans ma krótki cykl życiowy, a C. elegans typu dzikiego N2 składa około 300 jaj. Dlatego można go łatwo rozmnażać i wykorzystać jako materiały eksperymentalne3,4,5. C. elegans jest również szeroko stosowany w badaniach toksykologicznych wielu leków i zanieczyszczeń środowiska6,7,8,9.
Ponieważ wiele leków przeciwnowotworowych celuje w szybko dzielące się komórki rakowe, mogą one również uszkadzać szybko dzielące się normalne komórki, takie jak szpik kostny, nabłonek jelitowy i komórki mieszków włosowych. Na przykład leki przeciwnowotworowe hamujące topoizomerazę są ukierunkowane na proces replikacji DNA komórek rakowych; W związku z tym hamują również szybko dzielące się normalne komórki. Każdy żywy organizm ma topoizomerazy, a te inhibitory topoizomerazy najprawdopodobniej wpływają na ekosystemy środowiskowe6,10,11. W związku z tym platforma oceny toksykologicznej leków z wykorzystaniem zwierzęcia modelowego jest cenna zarówno dla opracowywania leków, jak i oceny ryzyka środowiskowego.
W tym artykule opisujemy szczegółowe protokoły testowania toksyczności etopozydu, który jest klinicznym środkiem przeciwnowotworowym ukierunkowanym na topoizomerazę II, jako modelowej toksycznej substancji chemicznej u C. elegans. W tym celu opiszemy metodę pomiaru wielkości ciała i całkowitej liczby jaj składanych u C. elegans traktowanych etopozydem.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Affymetrix, Stany Zjednoczone</td><td>10906</td><td></td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans</td><td>N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Cholesterol typu dzikiego</td></tr><tr><td></td><td>Sigma, USA</td><td>C3045</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma, USA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50</td><td>Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etopozyd</td><td>Sigma, USA</td><td>E1383</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Image J (wer. 1.4)</td><td>Natinoal Institute of Health, USA</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Kamera mikroskopowa</td><td>Jenopitk, Progress Gryphax, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Merck, USA</td><td>107213</td><td></td></tr><tr><td>35 i razy; 10 mm szalka Petriego</td><td>SPL Life Sciences, Korea Południowa</td><td>10035</td><td></td></tr><tr><td>90 & razy; 15 mm szalka Petriego</td><td>SPL Life Sciences, Korea Południowa</td><td>10090</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon, Japonia</td><td>SMZ800N</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar wpływu substancji chemicznych na wzrost i rozmnażanie caenorhabditis elegans

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Ocena toksykologiczna jest kluczowa dla zrozumienia wpływu chemikaliów na organizmy żywe w podstawowych i stosowanych dziedzinach nauk biologicznych. Caenorhabditis elegans, niewystępujący u ssaków, jest cennym organizmem modelowym do badań toksykologicznych ze względu na wygodę i brak problemów etycznych u zwierząt w porównaniu z systemami ssaków. W protokole tym opisano szczegółową procedurę oceny toksykologicznej substancji chemicznych C. elegans. Kliniczny lek przeciwnowotworowy, etopozyd, który jest ukierunkowany na ludzką topoizomerazę II i hamuje replikację DNA ludzkich komórek nowotworowych, został wybrany jako modelowa substancja chemiczna do testów. Jaja C. elegans zsynchronizowane z wiekiem były wystawione na działanie dimetylosulfotlenku (DMSO) lub etopozydu, a następnie wzrost C. elegans monitorowano codziennie przez 4 dni za pomocą obserwacji mikroskopu stereoskopowego. Całkowita liczba jaj złożonych z C. elegans traktowanych DMSO lub etopozydem została również policzona za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Leczenie etopozydem znacząco wpłynęło na wzrost i reprodukcję C. elegans. Porównując całkowitą liczbę jaj złożonych z robaków z różnymi okresami leczenia chemikaliami, można stwierdzić, że szkodliwy wpływ substancji chemicznych na rozrodczość C. elegans jest odwracalny lub nieodwracalny. Protokoły te mogą być pomocne zarówno w opracowywaniu różnych leków, jak i ocenie ryzyka związanego z toksycznymi substancjami środowiskowymi.

Leczenie etoposydem (24-96 h) znacząco zahamowało wzrost C. elegans. Po 96 h inkubacji nicienie traktowane etoposydem osiągnęły długość ciała 0,86 mm, podczas gdy nicienie traktowane nośnikiem osiągnęły 1,04 mm (Rycina 1). Zahamowanie wzrostu było również widoczne podczas obserwacji pod mikroskopem stereoskopowym (Rycina 2). Jaja u nicieni traktowanych nośnikiem zaczęły pojawiać się po 72 h inkubacji. Z kolei jaja zaobse...

Opisany jest podstawowy protokół oceny toksyczności substancji chemicznych u zwierzęcia modelowego, Caenorhabditis elegans. Metoda ta jest wygodna i przydatna przy opracowywaniu farmaceutyków, a także przy ocenie ryzyka związanego z różnymi zanieczyszczeniami środowiska.

Pomiar wpływu substancji chemicznych na wzrost i rozmnażanie Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar wpływu substancji chemicznych, takich jak etopozyd inhibitor topoizomerazy, na wzrost i reprodukcję modelowego zwierzęcia Caenorhabditis elegans. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie toksykologii, takie jak ocena toksykologiczna przy opracowywaniu leków i ocena ryzyka związanego z toksycznymi substancjami środowiskowymi. Główną zaletą tej techniki jest to, że toksyczność różnych substancji chemicznych można sprawdzić w systemach innych niż ssaki, więc technika ta jest wygodna i opłacalna.Procedurę zademonstruje So Young Lee, doktorant z mojego laboratorium. Na początek przygotuj dwie czyste, 200-mililitrowe szklane butelki, dodając 0,6 grama chlorku sodu, 0,5 grama peptonu, 3,4 grama agaru, 195 mililitrów wody destylowanej i mieszadła magnetycznego do jednej butelki. Następnie dodaj mieszadło magnetyczne do drugiej pustej butelki.Autoklaw butelek przez 15 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza, a następnie schładzaj butelki w łaźni wodnej przez 30 minut w temperaturze 55 stopni Celsjusza. Następnie do napełnionej butelki dodaj 0,2 mililitra jednego molowego chlorku wapnia, 0,2 mililitra pięciu mili

measuring-effect-chemicals-on-growth-reproduction-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

C. elegans podczas składania jaj może dostarczyć ważnych informacji w badaniach rozwojowych, reprodukcyjnych i anatomicznych. Ten film przedstawia ważne etapy testu składania jaj i pokazuje próbkę eksperymentu, w którym lek jest testowany pod kątem toksyczności reprodukcyjnej.

Test składania jaj: metoda ilościowego określania zachowania C. elegans podczas składania jaj

Test EIW (egg-in-worm) jest użyteczną metodą do ilościowego określenia zachowania podczas składania jaj. Zmiany w składaniu jaj mogą być reakcją behawioralną organizmu modelowego Caenorhabditis elegans na potencjalnie szkodliwe substancje środowiskowe, takie jak te wytwarzane przez bakterie chorobotwórcze.

Pomiar wpływu bakterii na zachowanie C. elegans za pomocą testu retencji jaj

Opisujemy szczegółowe etapy wysokoprzepustowego testu chemicznego u nicieni Caenorhabditis elegans używanych do oceny toksyczności linii zarodkowej. W tym teście zaburzenie funkcji linii zarodkowej po narażeniu na działanie substancji chemicznych jest monitorowane za pomocą fluorescencyjnego reportera specyficznego dla zarodków aneuploidalnych.

Kompleksowa ocena toksyczności chemicznej linii rozrodczej z wykorzystaniem nicienia Caenorhabditis elegans

C. elegans jest przydatnym modelem do badania wpływu alkoholu etylowego na zachowanie. Prezentujemy test behawioralny, który ilościowo określa wpływ alkoholu etylowego na szybkość poruszania się pełzających dżdżownic; zarówno początkową wrażliwość, jak i rozwój ostrej tolerancji funkcjonalnej na alkohol etylowy można zmierzyć za pomocą tego testu.

Badanie wpływu alkoholu etylowego na prędkość poruszania się Caenorhabditis elegans

Tutaj szczegółowo opisujemy protokoły specjalnie zaprojektowane do monitorowania wad morfogenicznych, które występują podczas wczesnych i późnych faz wydłużania się embrionalnego nicienia Caenorhabditis elegans. Ostatecznie protokoły te mają na celu identyfikację genów, które regulują te fazy i scharakteryzowanie ich zróżnicowanych wymagań wzdłuż przednio-tylnej osi zarodka.

Nowe wskaźniki charakteryzujące wydłużenie embrionalne nicieni Caenorhabditis elegans

Metoda ilościowa została opracowana do identyfikacji i przewidywania ostrej toksyczności chemikaliów poprzez automatyczną analizę profilowania fenotypowego Caenorhabditis elegans. Protokół ten opisuje, jak leczyć robaki chemikaliami w 384-dołkowej płytce, przechwytywać filmy i określać ilościowo fenotypy związane z toksykologią.

Wysokoprzepustowy test do przewidywania toksyczności chemicznej za pomocą zautomatyzowanego profilowania fenotypowego Caenorhabditis elegans

Trans- i wielopokoleniowe skutki trwałych chemikaliów są niezbędne do oceny ich długoterminowych konsekwencji dla środowiska i zdrowia ludzkiego. Udostępniamy nowatorskie szczegółowe metody badania efektów trans- i wielopokoleniowych z wykorzystaniem wolno żyjących nicieni Caenorhabditis elegans.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badania trans- i wielopokoleniowych skutków substancji toksycznych

Ten protokół opisuje, jak mierzyć przepuszczalność jelit Caenorhabditis elegans. Metoda ta jest pomocna w podstawowych badaniach biologicznych nad zdrowiem jelit związanych z interakcją między bakteriami jelitowymi a ich gospodarzem oraz w badaniach przesiewowych w celu identyfikacji czynników probiotycznych i chemicznych w leczeniu zespołu nieszczelnego jelita i chorób zapalnych jelit.

Pomiar wpływu bakterii i substancji chemicznych na przepuszczalność jelit Caenorhabditis elegans

Młode dorosłe nicienie Caenorhabditis elegans są narażone na różne stężenia komercyjnych pestycydów lub innych substancji toksycznych przez 2-24 godziny. Następnie można wizualizować różne neurony za pomocą szczepów wykazujących ekspresję fluorescencyjną. W artykule pokazano, w jaki sposób można wystawić nicienie na działanie pestycydów i ocenić uszkodzenia neuronów.

Badanie wpływu pestycydów na neurony Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy ogólną metodę określania żywotności embrionalnej i całkowitej liczby wyprodukowanych zarodków (czerwiu) za pomocą organizmu modelowego C. elegans.

Pomiar żywotności zarodka i wielkości lęgu u Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę oceny toksyczności chemikaliów na wzroście i rozmnażaniu Caenorhabditis elegans. Technika ta jest wygodna i ekonomiczna dla badań toksykologicznych oraz oceny ryzyka środowiskowego.

Pomiar wpływu substancji chemicznych na wzrost i rozmnażanie Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów