Pomiar wpływu substancji chemicznych na wzrost i rozmnażanie Caenorhabditis elegans
October 5th, 2017
Opisany jest podstawowy protokół oceny toksyczności substancji chemicznych u zwierzęcia modelowego, Caenorhabditis elegans. Metoda ta jest wygodna i przydatna przy opracowywaniu farmaceutyków, a także przy ocenie ryzyka związanego z różnymi zanieczyszczeniami środowiska.
Ogólnym celem tej procedury jest pomiar wpływu substancji chemicznych, takich jak etopozyd inhibitor topoizomerazy, na wzrost i reprodukcję modelowego zwierzęcia Caenorhabditis elegans. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie toksykologii, takie jak ocena toksykologiczna przy opracowywaniu leków i ocena ryzyka związanego z toksycznymi substancjami środowiskowymi. Główną zaletą tej techniki jest to, że toksyczność różnych substancji chemicznych można sprawdzić w systemach innych niż ssaki, więc technika ta jest wygodna i opłacalna.
Procedurę zademonstruje So Young Lee, doktorant z mojego laboratorium. Na początek przygotuj dwie czyste, 200-mililitrowe szklane butelki, dodając 0,6 grama chlorku sodu, 0,5 grama peptonu, 3,4 grama agaru, 195 mililitrów wody destylowanej i mieszadła magnetycznego do jednej butelki. Następnie dodaj mieszadło magnetyczne do drugiej pustej butelki.
Autoklaw butelek przez 15 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza, a następnie schładzaj butelki w łaźni wodnej przez 30 minut w temperaturze 55 stopni Celsjusza. Następnie do napełnionej butelki dodaj 0,2 mililitra jednego molowego chlorku wapnia, 0,2 mililitra pięciu miligramów na mililitr cholesterolu, 0,2 mililitra jednego molowego siarczanu magnezu i pięć mililitrów jednego molowego fosforanu potasu. Następnie wymieszaj roztwór, mieszając magnetycznie na gorącej płycie w temperaturze 55 stopni Celsjusza.
Wlej połowę zmieszanej pożywki NGM do pustej 200-mililitrowej butelki. Następnie dodaj jeden mililitr DMSO do jednej butelki i użyj mieszania magnetycznego, aby ponownie wymieszać. Drugą butelkę przechowuj w łaźni wodnej w temperaturze 55 stopni Celsjusza.
Następnie podniec trzy mililitry pożywki zawierającej DMSO na szalki Petriego o wymiarach 35 na 10 milimetrów. Wyjmij drugą butelkę z łaźni wodnej i użyj mieszania magnetycznego, aby ją wymieszać. Następnie dodaj jeden mililitr 75-milimolowego etopozydu.
A po ponownym wymieszaniu powtórz procedurę porcjowania. Schłodzić płytki NGM zawierające chemikalia, pozostawiając je w temperaturze pokojowej na około trzy godziny i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia. Do testu chemicznego rozprowadź 100 mikrolitrów inaktywowanej termicznie E.coli OP50 na każdej płytce NGM.
Pozostaw płytki do wyschnięcia na noc w inkubatorze C.elegans w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Przenieś zsynchronizowane z wiekiem jaja C.elegans na płytkę NGM uzupełnioną 1% DMSO lub etopozydem 750-mikromolowym. Umieść C.elegans w inkubatorze w temperaturze 20 stopni Celsjusza na cztery dni.
Codziennie obserwuj i wykonuj zdjęcia mikroskopowe C.elegans pod mikroskopem stereoskopowym. Zrób również zdjęcie mikroskopowe mikrometru stolika mikroskopowego w celu kalibracji rozmiaru robaka. Aby zmierzyć długość ciała C.elegans leczonych DMSO lub etopozydem w każdym punkcie czasowym, w ImageJ, otwórz obraz mikrometru na stoliku mikroskopowym.
Następnie za pomocą narzędzia Linia prosta przeciągnij linię o długości 1 000 mikrometrów na obrazie. Kliknij przycisk Analizuj, a następnie Ustaw skalę i wprowadź wartości 1 000 i mikrometrów odpowiednio w polach Znana odległość i Jednostka długości. Następnie zaznacz opcję Globalne i kliknij przycisk OK. Otwórz obrazy robaków za pomocą Plik, a następnie Otwórz.
Następnie, za pomocą narzędzia Linia odręczna, narysuj linię wzdłuż elementu każdego robaka. Uzyskaj dane dotyczące długości ciała, klikając przycisk Analizuj, a następnie pozycję Zmierz. Powtórz te kroki dla 50 robaków.
Inkubować jaja zsynchronizowane z wiekiem na płytce NGM zawierającej DMSO lub etopozyd w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 64 godziny, aż do stadium młodego dorosłego osobnika. Przenieś pięć dorosłych robaków na nowe płytki NGM bez chemikaliów lub nowe płytki NGM zawierające tę samą chemiczną obróbkę wstępną i inkubuj je przez 24 godziny. Przenieś dorosłe osobniki na nowe płytki NGM, jak właśnie pokazano, i policz liczbę jaj każdego dnia.
Ponadto policz robaki, które się wypełzły, umarły lub wykluły się wewnętrznie. Wykonaj obliczenia zgodnie z protokołem tekstowym. Jak wykazano tutaj, leczenie etopozydem w ciągu 24 do 96 godzin znacznie opóźniło wzrost C. elegans.
Po 96 godzinach inkubacji robaki leczone etopozydem urosły do 0,86 milimetra długości ciała, podczas gdy robaki poddane działaniu nośnika osiągnęły 1,04 milimetra. Opóźnienie wzrostu obserwowano również pod mikroskopem stereoskopowym, co widać na tych obrazach robaków leczonych etopozydem, w porównaniu z robakami leczonymi kontrolnie. Po 72 godzinach inkubacji zaobserwowano jaja robaków poddanych działaniu nośnika.
Natomiast jaja obserwowano po 96 godzinach leczenia etopozydem, co zwiększa prawdopodobieństwo, że leczenie etopozydem opóźniło pierwszy poród C. Elegans. Jak pokazano na tych wykresach, zaobserwowano zmniejszenie całkowitej liczby jaj po leczeniu etopozydem, gdy młode dorosłe robaki były hodowane, w obecności lub bez ciągłego leczenia etopozydem. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednego tygodnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić toksyczność chemiczną u C.elegans, nicienia modelowego.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje protokół do oceny toksyczności chemikaliów przy użyciu organizmu modelowego Caenorhabditis elegans. Metoda ta jest szczególnie przydatna w rozwoju farmaceutyków i ocenie ryzyka środowiskowego.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Toksykologia
- Rozwój farmaceutyków
- Nauki środowiskowe
Tło
- Caenorhabditis elegans to organizm modelowy niebędący ssakiem.
- Protokół ocenia wpływ różnych chemikaliów na wzrost i rozmnażanie.
- Przedstawia efektywny kosztowo sposób testowania toksyczności.
- Technika ta może ocenić zarówno farmaceutyki, jak i zanieczyszczenia środowiskowe.
Cel badania
- Zmierzyć wpływ chemikaliów, takich jak etoposyd, na C. elegans.
- Ułatwić oceny toksykologiczne w rozwoju leków.
- Ocenić zagrożenia wynikające z toksyn środowiskowych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie pożywki wzrostowej z chlorkiem sodu, peptonem, agarem i wodą destylowaną.
- Wykorzystanie szklanych butelek do hodowania organizmów.
- Ocenienie wskaźników wzrostu i rozmnażania.
- Ocena toksyczności chemikaliów w kontrolowanym środowisku.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia systematyczną ocenę toksyczności chemikaliów.
- Pokazuje wykonalność wykorzystania C. elegans do badań toksykologicznych.
- Dostarcza informacji na temat wpływu konkretnych chemikaliów na systemy biologiczne.
- Podkreśla zalety systemów testowania niebędących ssakami.
Wnioski
- Opisana metoda jest skuteczna w ocenie toksyczności chemikaliów.
- Wspiera zarówno rozwój leków, jak i oceny ryzyka środowiskowego.
- Wykorzystanie C. elegans oferuje wygodne i ekonomiczne podejście.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables early-stage toxicological evaluation using a non-mammalian model, supporting drug development and environmental risk assessment with reduced ethical and cost burdens. By measuring growth and reproduction endpoints in C. elegans, it provides quantitative data for mechanistic de-risking of chemical candidates. The approach aids in prioritizing compounds with favorable safety profiles before mammalian testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chemical effects on fundamental biological processes like growth and reproduction.
- Operational Value: Offers a scalable, ethically favorable system for initial toxicity screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible, quantitative phenotypic data on growth retardation and fecundity changes.
- Operational Value: Standardized protocol supports assay reproducibility across laboratories and timepoints.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates assessment of reversible versus irreversible reproductive toxicity, informing risk characterization.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical evaluation using consistent phenotypic readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within discovery biology to inform lead identification by providing early toxicity signals that guide compound progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding chemical impact on developmental and reproductive pathways.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable outputs for compound comparison and hit validation.
- Analytics: Provides measurable endpoints such as body length and egg count for dose-response analysis.
- Translational Research: Connects early phenotypic effects to later-stage risk assessment through reversible/irreversible toxicity determination.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable toxicology platform applicable across therapeutic areas and chemical classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking chemical exposure to functional phenotypes.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized culture, exposure, and imaging procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by identifying toxic liabilities early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on reversible or irreversible reproductive effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nematode culture, synchronization, and microscopic phenotyping.
- Dependent on access to stereo microscopes, incubators, and image analysis tools like ImageJ.
- Necessitates standardization of chemical preparation, exposure duration, and environmental controls.
- Adaptation considerations include chemical solubility, stability in medium, and species-specific sensitivity.
- Practical limitations include throughput constraints for large-scale screening and reliance on manual counting for fecundity.
