Test migracji Transwell
Migracja komórek w odpowiedzi na sygnały chemiczne ma kluczowe znaczenie dla rozwoju, odporności i stanów chorobowych, takich jak rak. Aby określić il…
Test migracji transwell jest klasyczną techniką, która pozwala naukowcom określić ilościowo ruch komórek. Migracja odnosi się do zdolności komórki do poruszania się pojedynczo lub w klastrach. Ruchy komórek są możliwe dzięki precyzyjnej restrukturyzacji ich cytoszkieletu, a migracja zwykle następuje w odpowiedzi na bodźce, które działają jak wskazówki.
Dzisiaj omówimy test migracji transwell, który wykorzystuje prostą konfigurację komory do oceny migracji w odpowiedzi na sygnały przyciągające.
Zaczniemy od przedstawienia podstawowych informacji na temat komory transwell.
Aparatura została po raz pierwszy zaprojektowana przez dr Stephena Boydena w 1961 roku, który używał jej do badania migracji leukocytów. Dlatego ta metoda jest również znana jako test komorowy Boydena.
W prostej komorze Boydena zewnętrzna ściana składa się ze studzienek, podobnie jak w przypadku płyty 96-dołkowej. Wewnątrz każdej studzienki umieszcza się transwell, który jest cylindryczną wkładką. Wkład posiada membranę poliwęglanową o określonej wielkości porów. Po umieszczeniu w studni dzieli komorę na dwie komory. Górny przedział to miejsce, w którym zostaną wysiane komórki, których zachowanie migracyjne ma być badane, a dolny zbiornik to miejsce, w którym umieszcza się roztwór chemoatraktantu. Z definicji chemoatraktant to cząsteczka, która ma zdolność promowania ruchliwości komórek poprzez "przyciąganie komórek".
Ze względu na te siły przyciągania komórki w górnej komorze migrują przez pory do dolnego zbiornika. Jeśli komórki mają właściwości przylegające, jak niektóre komórki czerniaka, po ruchu "przykleją się" do spodu błony. W takim przypadku membranę można utrwalić, wybarwić, a komórki policzyć pod mikroskopem. Z drugiej strony nieprzylegające komórki, takie jak plemniki, będą migrować do dolnego zbiornika. W takim przypadku komórki w roztworze zbiornikowym można policzyć za pomocą hemocytometru.
Chociaż konfiguracja tego testu jest prosta, jest kilka rzeczy, które należy wziąć pod uwagę przed eksperymentem. Przyjrzyjmy się niektórym z nich.
Zaczynając od roztworu do wysiewu, musisz upewnić się, że gęstość jest zoptymalizowana, aby obserwować migrację komórek. Zbyt mała liczba komórek może spowodować niewykrywalną migrację, a większe zagęszczenie spowoduje przepełnienie błony, co utrudni wyliczenie migracji. Drugą kwestią jest wielkość porów wkładki. Powinien być starannie dobrany w zależności od typu ogniwa. Jeśli rozmiar porów jest zbyt mały, komórki nie będą w stanie przez nie przejść.
Alternatywnie, jeśli rozmiar porów jest zbyt duży, komórki po prostu przejdą, co nie jest migracją. Wreszcie, należy pamiętać o stężeniu chemoatraktantu i czasie inkubacji, które należy przewidzieć dla migracji, ponieważ są one współzależne. Optymalne stężenie przy odpowiednim czasie inkubacji, podczas którego utrzymywany jest gradient stężeń między przedziałami, indukuje migrację komórek z powodu chemoprzyciągania. I odwrotnie, przedłużonym inkubacjom może towarzyszyć równoważenie chemoatraktantu w całej komorze, co prowadzi do utraty gradientu chemicznego, co może zakłócić analizę uzyskanych wyników.
Mając na uwadze te rozważania, omówmy protokół używany do pomiaru migracji przylegających komórek.
Komórki, które mają być badane, są przygotowywane w pożywce wolnej od proteazy, ponieważ proteazy mogą denaturować ważne receptory błonowe i ostatecznie wpływać na migrację. Po przygotowaniu komórek zawiesinę należy rozcieńczyć do optymalnej gęstości wysiewu. W celu przygotowania komory, transwelle umieszcza się w studzienkach na płycie wielodołkowej. Zawiesinę komórkową należy pipetować do transwella bez dotykania membrany lub wprowadzania pęcherzyków powietrza.
Roztwór chemoatraktantu pipetuje się do dolnego zbiornika, upewniając się, że roztwór dotyka membrany wkładu. Czas inkubacji migracji będzie zależał od uwarunkowań eksperymentalnych. Po inkubacji membrany są mocowane poprzez zanurzenie wkładki w 70% etanolu. Po pozostawieniu wkładu do wyschnięcia dodaje się roztwór do barwienia komórek.
Następnie komórki inkubuje się przez około 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji wkładki są myte za pomocą bufora płuczącego. Na koniec membranę można wyciąć i umieścić na szkiełku mikroskopowym. Komórki na spodniej stronie błony reprezentują liczbę komórek, które migrowały w obecności i pod nieobecność chemoatraktantów.
Skoro już wiesz o protokole, przyjrzyjmy się pokrótce, w jaki sposób badacze wykorzystują tę metodę w swoich badaniach.
Jednym z najczęstszych zastosowań tego testu jest ocena właściwości chemoatraktantu nieznanych związków. W tym przypadku naukowcy byli zainteresowani zbadaniem ścieżek pływania plemników żab w obecności alluryny, która jest substancją wydzielaną przez jaja płazów. W tym celu najpierw pipetowali aktywne plemniki żab do górnej części wkładek transwell. Na dno dodali allurynę. Po umożliwieniu migracji komórek policzyli plemniki w roztworze rezerwuarowym pod mikroskopem. Korzystając z tej techniki, byli w stanie wygenerować krzywą stężenie-odpowiedź przedstawiającą wpływ stężenia alluryny na migrację plemników.
Kiedy komórka jest atakowana przez patogeny, wysyła chemoatraktanty w celu rekrutacji komórek odpornościowych, które migrują, przyłączają się, a następnie rozwiązują infekcję. Aby przetestować to zjawisko, naukowcy przeprowadzili hodowlę komórek nabłonkowych na spodniej stronie wkładek. Następnie zainfekowali te komórki różnymi szczepami bakterii. Na koniec wprowadzili komórki odpornościowe do górnej komory. Wiadomo, że zakażone komórki wytwarzają kilka chemoatraktantów, które indukują migrację komórek odpornościowych. Wyniki tego eksperymentu wykazały różne stopnie migracji neutrofili w odpowiedzi na różne rodzaje infekcji bakteryjnych.
Wreszcie, inwazja komórek rakowych i przerzuty przez macierz zewnątrzkomórkową zawsze intrygowały biologów komórkowych. W tym przypadku naukowcy chcieli ustalić, w jaki sposób określone chemoatraktanty mogą przyczyniać się do takiej migracji za pomocą matrycy 3D. Naukowcy zmodyfikowali genetycznie dwie oddzielne pule komórek: jedną wyrażającą białko zielonej fluorescencji, a drugą czerwoną fluorescencyjną. Następnie pipetowali macierz zewnątrzkomórkową naśladującą do górnej części transwelli.
Po zestaleniu się odwrócili transwell i zasiali dwie pule komórek na spodniej stronie membrany. Następnie umieścili wkładkę w płytce wielodołkowej i odpipetowali roztwór chemoatraktantu do górnej komory. To spowodowało, że komórki na dole przesunęły się w górę i przechodziły przez matrycę 3D. Za pomocą obrazowania konfokalnego badacze zrekonstruowali migrację komórek w 3D i wyróżnili wzorce migracji dwóch grup komórek.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat testu migracji transwell. Dzięki zrozumieniu składników i protokołu tej metody wiesz już, dlaczego jest ona tak szeroko stosowana przez biologów komórkowych. Pomimo prostoty tej konfiguracji, zakres konfiguracji, które ta metoda może dostosować, sprawia, że jest ona niezbędna do badań ruchliwości komórek. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Test migracji transwell jest klasyczną techniką, która pozwala naukowcom określić ilościowo ruch komórek. Migracja odnosi się do zdolności komórki do poruszania się pojedynczo lub w klastrach. Ruchy komórek są możliwe dzięki precyzyjnej restrukturyzacji ich cytoszkieletu, a migracja zwykle następuje w odpowiedzi na bodźce, które działają jak wskazówki.
Dzisiaj omówimy test migracji transwell, który wykorzystuje prostą konfigurację komory do oceny migracji w odpowiedzi na sygnały przyciągające.
Zaczniemy od przedstawienia podstawowych informacji na temat komory transwell.
Aparatura została po raz pierwszy zaprojektowana przez dr Stephena Boydena w 1961 roku, który używał jej do badania migracji leukocytów. Dlatego ta metoda jest również znana jako test komorowy Boydena.
W prostej komorze Boydena zewnętrzna ściana składa się ze studzienek, podobnie jak w przypadku płyty 96-dołkowej. Wewnątrz każdej studzienki umieszcza się transwell, który jest cylindryczną wkładką. Wkład posiada membranę poliwęglanową o określonej wielkości porów. Po umieszczeniu w studni dzieli komorę na dwie komory. Górny przedział to miejsce, w którym zostaną wysiane komórki, których zachowanie migracyjne ma być badane, a dolny zbiornik to miejsce, w którym umieszcza się roztwór chemoatraktantu. Z definicji chemoatraktant to cząsteczka, która ma zdolność promowania ruchliwości komórek poprzez "przyciąganie komórek".
Ze względu na te siły przyciągania komórki w górnej komorze migrują przez pory do dolnego zbiornika. Jeśli komórki mają właściwości przylegające, jak niektóre komórki czerniaka, po ruchu "przykleją się" do spodu błony. W takim przypadku membranę można utrwalić, wybarwić, a komórki policzyć pod mikroskopem. Z drugiej strony nieprzylegające komórki, takie jak plemniki, będą migrować do dolnego zbiornika. W takim przypadku komórki w roztworze zbiornikowym można policzyć za pomocą hemocytometru.
Chociaż konfiguracja tego testu jest prosta, jest kilka rzeczy, które należy wziąć pod uwagę przed eksperymentem. Przyjrzyjmy się niektórym z nich.
Zaczynając od roztworu do wysiewu, musisz upewnić się, że gęstość jest zoptymalizowana, aby obserwować migrację komórek. Zbyt mała liczba komórek może spowodować niewykrywalną migrację, a większe zagęszczenie spowoduje przepełnienie błony, co utrudni wyliczenie migracji. Drugą kwestią jest wielkość porów wkładki. Powinien być starannie dobrany w zależności od typu ogniwa. Jeśli rozmiar porów jest zbyt mały, komórki nie będą w stanie przez nie przejść.
Alternatywnie, jeśli rozmiar porów jest zbyt duży, komórki po prostu przejdą, co nie jest migracją. Wreszcie, należy pamiętać o stężeniu chemoatraktantu i czasie inkubacji, które należy przewidzieć dla migracji, ponieważ są one współzależne. Optymalne stężenie przy odpowiednim czasie inkubacji, podczas którego utrzymywany jest gradient stężeń między przedziałami, indukuje migrację komórek z powodu chemoprzyciągania. I odwrotnie, przedłużonym inkubacjom może towarzyszyć równoważenie chemoatraktantu w całej komorze, co prowadzi do utraty gradientu chemicznego, co może zakłócić analizę uzyskanych wyników.
Mając na uwadze te rozważania, omówmy protokół używany do pomiaru migracji przylegających komórek.
Komórki, które mają być badane, są przygotowywane w pożywce wolnej od proteazy, ponieważ proteazy mogą denaturować ważne receptory błonowe i ostatecznie wpływać na migrację. Po przygotowaniu komórek zawiesinę należy rozcieńczyć do optymalnej gęstości wysiewu. W celu przygotowania komory, transwelle umieszcza się w studzienkach na płycie wielodołkowej. Zawiesinę komórkową należy pipetować do transwella bez dotykania membrany lub wprowadzania pęcherzyków powietrza.
Roztwór chemoatraktantu pipetuje się do dolnego zbiornika, upewniając się, że roztwór dotyka membrany wkładu. Czas inkubacji migracji będzie zależał od uwarunkowań eksperymentalnych. Po inkubacji membrany są mocowane poprzez zanurzenie wkładki w 70% etanolu. Po pozostawieniu wkładu do wyschnięcia dodaje się roztwór do barwienia komórek.
Następnie komórki inkubuje się przez około 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji wkładki są myte za pomocą bufora płuczącego. Na koniec membranę można wyciąć i umieścić na szkiełku mikroskopowym. Komórki na spodniej stronie błony reprezentują liczbę komórek, które migrowały w obecności i pod nieobecność chemoatraktantów.
Skoro już wiesz o protokole, przyjrzyjmy się pokrótce, w jaki sposób badacze wykorzystują tę metodę w swoich badaniach.
Jednym z najczęstszych zastosowań tego testu jest ocena właściwości chemoatraktantu nieznanych związków. W tym przypadku naukowcy byli zainteresowani zbadaniem ścieżek pływania plemników żab w obecności alluryny, która jest substancją wydzielaną przez jaja płazów. W tym celu najpierw pipetowali aktywne plemniki żab do górnej części wkładek transwell. Na dno dodali allurynę. Po umożliwieniu migracji komórek policzyli plemniki w roztworze rezerwuarowym pod mikroskopem. Korzystając z tej techniki, byli w stanie wygenerować krzywą stężenie-odpowiedź przedstawiającą wpływ stężenia alluryny na migrację plemników.
Kiedy komórka jest atakowana przez patogeny, wysyła chemoatraktanty w celu rekrutacji komórek odpornościowych, które migrują, przyłączają się, a następnie rozwiązują infekcję. Aby przetestować to zjawisko, naukowcy przeprowadzili hodowlę komórek nabłonkowych na spodniej stronie wkładek. Następnie zainfekowali te komórki różnymi szczepami bakterii. Na koniec wprowadzili komórki odpornościowe do górnej komory. Wiadomo, że zakażone komórki wytwarzają kilka chemoatraktantów, które indukują migrację komórek odpornościowych. Wyniki tego eksperymentu wykazały różne stopnie migracji neutrofili w odpowiedzi na różne rodzaje infekcji bakteryjnych.
Wreszcie, inwazja komórek rakowych i przerzuty przez macierz zewnątrzkomórkową zawsze intrygowały biologów komórkowych. W tym przypadku naukowcy chcieli ustalić, w jaki sposób określone chemoatraktanty mogą przyczyniać się do takiej migracji za pomocą matrycy 3D. Naukowcy zmodyfikowali genetycznie dwie oddzielne pule komórek: jedną wyrażającą białko zielonej fluorescencji, a drugą czerwoną fluorescencyjną. Następnie pipetowali macierz zewnątrzkomórkową naśladującą do górnej części transwelli.
Po zestaleniu się odwrócili transwell i zasiali dwie pule komórek na spodniej stronie membrany. Następnie umieścili wkładkę w płytce wielodołkowej i odpipetowali roztwór chemoatraktantu do górnej komory. To spowodowało, że komórki na dole przesunęły się w górę i przechodziły przez matrycę 3D. Za pomocą obrazowania konfokalnego badacze zrekonstruowali migrację komórek w 3D i wyróżnili wzorce migracji dwóch grup komórek.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat testu migracji transwell. Dzięki zrozumieniu składników i protokołu tej metody wiesz już, dlaczego jest ona tak szeroko stosowana przez biologów komórkowych. Pomimo prostoty tej konfiguracji, zakres konfiguracji, które ta metoda może dostosować, sprawia, że jest ona niezbędna do badań ruchliwości komórek. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the transwell migration assay and why is it used in cell biology?
The transwell migration assay, also called the Boyden chamber assay, is a classical technique designed in 1961 to quantify cell movement in response to chemical cues. It uses a simple chamber setup with a polycarbonate membrane separating two compartments. Scientists seed cells in the top chamber and place chemoattractant solution below, then count migrated cells to measure cell motility and cell invasion and chemo attraction responses.
Q2: How does the transwell chamber separate cells and chemoattractants?
The transwell chamber consists of a cylindrical insert with a polycarbonate membrane of defined pore size placed inside a multiwell plate well. This membrane divides the chamber into two compartments: the top compartment holds cells to be studied, and the bottom reservoir contains chemoattractant solution. Cells migrate through the membrane pores toward the attracting chemical gradient in the lower compartment.
Q3: What factors must be optimized before running a transwell migration assay?
Three critical factors require optimization: cell seeding density must be balanced to detect migration without overpopulation; pore size must match the cell type so cells can pass through without falling through; and chemoattractant concentration with appropriate incubation time must maintain a chemical gradient. Prolonged incubation can equilibrate the chemoattractant throughout the chamber, eliminating the gradient and confounding results.
Q4: How are adherent cells counted after migration in a transwell assay?
After incubation, the transwell membrane is fixed by dipping the insert into 70% ethanol and allowed to dry. Cell staining solution is then applied for approximately 30 minutes at room temperature. Following washing with buffer, the membrane is excised and placed on a microscope slide. Cells on the membrane's underside represent those that migrated and can be counted microscopically.
Q5: Why is protease-free medium used when preparing cells for the transwell assay?
Protease-free medium is essential because proteases can denature important membrane receptors that are critical for cell migration. Damaged receptors would impair the cell's ability to respond to chemoattractant signals, compromising the accuracy of migration measurements and potentially underestimating or misrepresenting the cell's true migratory capacity.
Q6: What are common research applications of the transwell migration assay?
Researchers use the transwell assay to evaluate chemoattractant properties of unknown compounds, test immune cell recruitment in response to infection, and study cancer cell invasion through extracellular matrices. The assay's adaptability allows scientists to examine migration in various contexts, from simple 2D membrane assays to complex 3D matrix invasion studies using fluorescent cell tracking.
Q7: How do adherent and non-adherent cells differ in transwell migration assays?
Adherent cells, like melanoma cells, stick to the membrane's underside after migration and are counted by fixing, staining, and microscopic observation of the membrane. Non-adherent cells, like sperm, migrate into the bottom reservoir solution and are counted using a hemocytometer. The counting method depends on the cell type's inherent adhesive properties.