Multipleksowe profilowanie cytokin stymulowanych splenocytów myszy przy użyciu cytometrycznej platformy testów immunologicznych opartych na kulkach

Ogólnym celem tego protokołu jest ilościowe określenie wielu docelowych cytokin jednocześnie w supernatantach hodowli tkankowej pobranych ze stymulowanych splenocytów myszy przy użyciu multipleksowego testu immunologicznego opartego na kulkach i cytometru przepływowego. Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, takie jak: Jakie są unikalne profile cytokin, które koordynują odpowiedź immunologiczną w kontekście określonych stanów chorobowych? Główną zaletą tej techniki jest to, że jednoczesna kwantyfikacja wielu pierścienic może być przeprowadzona przy użyciu znacznie mniejszej objętości próbki niż tradycyjne formaty ELISA, przy jednoczesnym zmniejszeniu niespecyficznego wiązania.

Procedurę zademonstruje Nicholas Johnsen, pracownik naukowy z naszego zespołu ds. rozwoju produktu. Procedurę tę należy rozpocząć od przygotowania próbki biologicznej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przygotować wstępnie zmieszane kulki unieruchomione przeciwciałami, należy poddać sonikę butelki z wstępnie zmieszanymi kulkami przez jedną minutę w kąpieli sonikatora w temperaturze pokojowej.

Następnie wiruj przez 30 sekund przed użyciem. Jeśli kąpiel sonicyjna nie jest dostępna, zwiększ czas wirowania do jednej minuty. Do przygotowania standardowego dodaj 250 mikrolitrów buforu do oznaczania, aby rozpuścić liofilizowany koktajl Mouse Th Cytokine Standard.

Wymieszać przez krótkie wirowanie i pozostawić fiolkę w temperaturze pokojowej na 10 minut. Przenieś standardowy koktajl do polipropylenowej probówki wirówkowej oznaczonej C7. Będzie to używane jako najwyższy standard. Oznacz sześć probówek do mikrowirówek z polipropylenu jako C1 do C6. Dodać 75 mikrolitrów buforu testowego do każdej z tych probówek.

Następnie przenieś 25 mikrolitrów najwyższego wzorca, C7, do probówki C6 i dobrze wymieszaj, wirując. Będzie to standard C6. Kontynuuj wykonywanie seryjnych rozcieńczeń od jednego do czterech, używając nowej końcówki pipety dla każdej probówki, aby dodać 25 mikrolitrów poprzedniego wzorca do 75 mikrolitrów buforu testowego w następnej najniższej probówce wzorcowej.

Podążaj za każdym dodawaniem, wirując. Użyj buforu testowego jako wzorca pikogramów zerowych na mililitr. Aby przeprowadzić test, przed użyciem pozwól wszystkim odczynnikom ogrzać się do temperatury pokojowej.

W tej demonstracji zastosowano polipropylenowe płyty filtracyjne. Absolutnie konieczne jest, aby płytka była utrzymywana w pozycji pionowej podczas całej procedury testowej, w tym etapów mycia, aby uniknąć utraty kulek. Wstępnie zwilż bibułę filtracyjną, dodając 100 mikrolitrów buforu do płukania 1X do każdej studzienki i pozostaw płytki na minutę w temperaturze pokojowej.

Usuń objętość bufora za pomocą kolektora próżniowego. Zetrzyj nadmiar bufora do mycia od spodu talerza, dociskając talerz do stosu czystych ręczników papierowych. Następnie umieść płytkę na odwróconej pokrywie talerza.

W przypadku próbek supernatantu do hodowli komórkowych dodać 25 mikrolitrów buforu do oznaczania do wszystkich studzienek. Dodaj 25 mikrolitrów każdego wzorca do standardowych studzienek. Na koniec dodaj 25 mikrolitrów każdej próbki do dołków na próbki.

Wiruj zmieszane kulki przez 30 sekund. Następnie dodaj 25 mikrolitrów zmieszanych kulek do każdej studzienki, potrząsając butelką z koralikami z przerwami, aby uniknąć osiadania koralików. Uszczelnij płytkę za pomocą uszczelniacza do płyt.

Po uszczelnieniu owiń całą płytę, w tym odwróconą pokrywę płyty, folią aluminiową. Umieść płytkę na wytrząsarce do płytek, zabezpiecz ją i potrząsaj z prędkością około 500 obr./min przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Nie odwracając, umieść płytkę na kolektorze próżniowym i zastosuj podciśnienie jak poprzednio.

Następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu do płukania 1X do każdej studzienki. Usunąć zawartość studzienek na płytce testowej przez filtrację próżniową. Zetrzyj nadmiar buforu myjącego z dna płytki za pomocą wkładki chłonnej lub ręczników papierowych przed powtórzeniem tego kroku jeszcze raz.

Następnie dodaj 25 mikrolitrów przeciwciał wykrywających do każdej studzienki. Po uszczelnieniu płytki świeżym uszczelniaczem do płyt, owiń całą płytkę, łącznie z odwróconą pokrywą płyty, folią aluminiową. Umieścić płytkę na wytrząsarce i wstrząsać z prędkością około 500 obr./min przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Bez odkurzania dodaj 25 mikrolitrów odczynnika fikoerytryny streptawidyny bezpośrednio do każdej studzienki. Uszczelnij i zawiń płytkę jak poprzednio. Następnie umieść płytkę na wytrząsarce do płytek i potrząsaj z prędkością około 500 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Po dwukrotnym powtórzeniu kroku filtracji próżniowej dodaj 200 mikrolitrów bufora myjącego 1X do każdej studzienki. Ponownie zawieś koraliki na wytrząsarce talerzy na jedną minutę. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś próbki z płytki filtracyjnej do probówek FACS w celu odczytania próbek na cytometrze przepływowym.

Uruchom cytometr przepływowy i oprogramowanie do akwizycji zgodnie z instrukcjami producenta dostarczonymi z przyrządem. Utwórz wykres punktowy z punktem punktowym do przodu na osi X i bocznym punktem punktowym dla osi Y. Ustaw rozproszenie do przodu i rozproszenie boczne na tryb liniowy.

Obracaj fiolkę z surowymi kulkami dołączonymi do zestawu przez 30 sekund, aby ponownie zawiesić koraliki. Przenieś 400 mikrolitrów surowych kulek do nowej probówki FACS. Ustaw natężenie przepływu cytometru przepływowego na niskie.

Uruchom surowe koraliki, ostrożnie dostosowując wzmocnienie i napięcie dla rozproszenia do przodu i rozpraszania bocznego, tak aby populacje tych koralików o obu rozmiarach były widocznie oddzielone i łatwe do bramkowania. Dostosuj próg rozproszenia do przodu, aby wykluczyć niechciane zdarzenia. Na wykresie punktowym do przodu i z boku narysuj bramę, która zawiera wszystkie populacje ściegów.

Wyświetla populacje bramkowanych ściegów z wykresu punktowego do przodu i z boku na drugim wykresie punktowym z PE na osi X i APC na osi Y. Dostosuj napięcie PMT dla kanału fluorescencji APC tak, aby sygnał APC dla wszystkich populacji koralików miał medianę intensywności fluorescencji (MFI) mieszczącą się w zakresie od 10 do 5 000. Następnie wiruj fiolkę z kulkami PE przez 30 sekund, aby ponownie zawiesić kulki.

Przenieś 400 mikrolitrów ponownie zawieszonych kulek PE do nowej rurki FACS. Zastąp rurkę z surowymi kulkami w cytometrze przepływowym rurką z kulkami PE. Dostosuj napięcie lampy fotopowielacza dla ustawienia kanału fluorescencji PE tak, aby MFI kulek PE mieściło się w zakresie specyficznym dla partii, który znajduje się na fiolce z kulkami PE.

Aby przeprowadzić akwizycję danych, ustaw liczbę zdarzeń ściegu, które mają zostać pobrane, na około 300 na anolit. Wirować każdą próbkę przez pięć sekund przed analizą. Następnie zapoznaj się z próbkami.

Podczas odczytu próbek należy najpierw ustawić cytometr przepływowy w trybie konfiguracji i poczekać, aż populacja kulek ustabilizuje się przed przełączeniem w tryb akwizycji. Przed wykonaniem analizy danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym należy wyeksportować tylko zdarzenia bramkowane, a nie zdarzenia łączne. Reprezentatywne krzywe standardowe dla docelowych anolitów wygenerowano przy użyciu mysiego panelu cytokin pomocniczych T.

Prawidłowo przeprowadzone testy pokażą krzywe z szerokimi zakresami dynamiki, jak pokazano tutaj. Krzywe standardowe muszą być uruchamiane za każdym razem, gdy przeprowadzany jest test. Mysie splenocyty hodowano w różnych warunkach przez 48 godzin.

Zebrano supernatanty hodowlane, a następnie określono ilościowo stężenia 13 celów za pomocą mysiego panelu cytokin pomocniczych T. Zróżnicowane profile ekspresji cytokin, w odpowiedzi na warunki stymulacji, są wyraźnie widoczne. Po opanowaniu, laboratoryjna praca laboratoryjna tej techniki może zostać wykonana w mniej niż pięć i pół godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Czas akwizycji danych i dalszej analizy będzie się różnić w zależności od liczby próbek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zastosować ten protokół, określić ilościowo stężenia anolitu w próbkach biologicznych za pomocą cytometrycznego testu immunologicznego opartego na kulkach. Obejmuje to przygotowanie odczynnika, etapy inkubacji i konfigurację cytometru przepływowego do pozyskiwania danych.