Name: Multipleksowe profilowanie cytokin stymulowanych splenocytów myszy przy użyciu cytometrycznej platformy testów immunologicznych opartych na kulkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Poznaj metodę multipleksowego profilowania cytokin w splenocytach myszy przy użyciu cytometrii przepływowej i platformy opartej na kulkach. Ta technika umożliwia jednoczesne oznaczanie wielu celów przy mniejszej objętości próbek niż tradycyjne ELISA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować zespołowi ds. rozwoju produktu Biomarkers and Immuno-assays w rozwój testu. Ponadto chcielibyśmy podziękować firmie Vigene Tech, Inc. za ich wspólne wysiłki przy projektowaniu pakietów oprogramowania do analizy danych.

<ol><li>Stanley, A. C., Lacy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+for+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Pathways for cytokine secretion.</a> Physiology (Bethesda). 25, 218-229 (2010).</li>
<li>Nicola, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+pleiotropy+and+redundancy%3A+a+view+from+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cytokine pleiotropy and redundancy: a view from the receptor.</a> Stem Cells. 12, (1994).</li>
<li>Miyajima, A., Hara, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+subunits+of+cytokine+receptors+and+the+functional+redundancy+of+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Common subunits of cytokine receptors and the functional redundancy of cytokines.</a> Trends Biochem Sci. 17, 378-382 (1992).</li>
<li>Costantini, S., Castello, G., Colonna, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Cytokinome%3A+a+new+challenge+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformation%22%5BJournal%5D)">Human Cytokinome: a new challenge for systems biology.</a> Bioinformation. 5, 166-167 (2010).</li>
<li>Capone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+Cytokinome+Profile+Evaluation%3A+A+Tool+to+Define+New+Diagnostic+and+Prognostic+Markers+of+Cancer+Using+Multiplexed+Bead-Based+Immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Serum Cytokinome Profile Evaluation: A Tool to Define New Diagnostic and Prognostic Markers of Cancer Using Multiplexed Bead-Based Immunoassays.</a> Mediators Inflamm. , 3064643(2016).</li>
<li>Schett, G., Elewaut, D., McInnes, I. B., Dayer, J. M., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cytokine+networks+fuel+inflammation%3A+Toward+a+cytokine-based+disease+taxonomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">How cytokine networks fuel inflammation: Toward a cytokine-based disease taxonomy.</a> Nat Med. 19, 822-824 (2013).</li>
<li>Tse, E., Kwong, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+lymphoma%3A+Microenvironment-related+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">T-cell lymphoma: Microenvironment-related biomarkers.</a> Semin Cancer Biol. 34, 46-51 (2015).</li>
<li>Reale, M., Greig, N. H., Kamal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+chemo-cytokine+profiles+in+Alzheimer%27s+and+Parkinson%27s+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mini+Rev+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Peripheral chemo-cytokine profiles in Alzheimer's and Parkinson's diseases.</a> Mini Rev Med Chem. 9, 1229-1241 (2009).</li>
<li>Vistnes, M., Christensen, G., Omland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cytokine+biomarkers+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Multiple cytokine biomarkers in heart failure.</a> Expert Rev Mol Diagn. 10, 147-157 (2010).</li>
<li>Gobel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+coagulation+factor+XII+drives+adaptive+immunity+during+neuroinflammation+via+CD87-mediated+modulation+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Blood coagulation factor XII drives adaptive immunity during neuroinflammation via CD87-mediated modulation of dendritic cells.</a> Nat Commun. 7, 11626(2016).</li>
<li>Palm, A. K., Friedrich, H. C., Kleinau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+marginal+zone+B+cells+in+mice%3A+a+novel+subset+with+dormant+self-reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Nodal marginal zone B cells in mice: a novel subset with dormant self-reactivity.</a> Sci Rep. 6, 27687(2016).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Bcl11b+is+specifically+expressed+in+group+2+innate+lymphoid+cells+and+is+essential+for+their+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Bcl11b is specifically expressed in group 2 innate lymphoid cells and is essential for their development.</a> J Exp Med. 212, 865-874 (2015).</li>
<li>Pelly, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4-producing+ILC2s+are+required+for+the+differentiation+of+TH2+cells+following+Heligmosomoides+polygyrus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-4-producing ILC2s are required for the differentiation of TH2 cells following Heligmosomoides polygyrus infection.</a> Mucosal Immunol. 9, 1407-1417 (2016).</li>
<li>LEGENDplex Multiplex Assays. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.biolegend.com/legendplex">https://www.biolegend.com/legendplex</a> (2017).</li>
<li>Autieri, M. <a target="_blank" href="https://www.hindawi.com/journals/isrn/2012/987629/">Pro- and anti-inflammatory networks in atherosclerosis.</a> ISRN Vascular Medicine. 2012, (2012).</li>
<li>West, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+cytokine+networks+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Emerging cytokine networks in colorectal cancer.</a> Nat Rev Immunol. 15, 615-629 (2015).</li>
<li>Becher, B., Spath, S., Goverman, J. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nri/journal/v17/n1/full/nri.2016.123.html">Cytokine networks in neuroinflammation.</a> Nat Rev Immunol. 17, 49-59 (2017).</li>
</ol>

Autorzy są zatrudnieni przez firmę BioLegend, która produkuje odczynniki opisane w tym manuskrypcie. Firma Vigene Tech, Inc. opracowała oprogramowanie do analizy danych LEGENDplex, które służy do analizy danych generowanych z testu opisanego w tym manuskrypcie.

Format testu opisany w tym protokole może zapewnić solidną kwantyfikację rozpuszczalnych profili mediatorów w próbkach biologicznych, pod warunkiem, że eksperymentator ma dobrą technikę laboratoryjną i przestrzega zalecanego protokołu.
Istnieje kilka kluczowych kroków, które należy wykonać, aby zagwarantować wiarygodne wyniki. Po pierwsze, należy dopuścić do rozpuszczenia wzorców rekombinowanych w buforze do oznaczania przez zalecany pełny czas, a następnie jedynie po rozcieńczeniu w probówkach polipropylenowych. Rurki polistyrenowe mogą sprzyjać przyleganiu białek do ścianki rurek, co może prowadzić do niskich sygnałów podczas generowania krzywej standardowej. Po drugie, kluczowe znaczenie ma prawidłowe wstrząsanie podczas etapów inkubacji. Bez odpowiedniego mieszania właściwości wiązania kulek testowych mogą być poważnie utrudnione. Ponadto wymagane jest również odpowiednie mycie między etapami inkubacji. Eksperymentator musi zapewnić, że nadmiar odczynników zostanie usunięty ze studzienek przed rozpoczęciem następnego kroku w protokole. Należy również zoptymalizować ustawienia przyrządów dla cytometru przepływowego używanego do badania kulek testowych. W szczególności należy dostosować ustawienia PMT, aby zapewnić odpowiednią separację ściegów i szerokie zakresy dynamiki dla krzywych standardowych. Wreszcie, tuż przed analizą na cytometrze, kulki muszą zostać zawirowane, aby zapewnić prawidłowe zawieszenie i uniknąć tworzenia się agregatów, które mogą zniekształcić wyniki.
Protokół ten może być potencjalnie zmodyfikowany w celu analizy homogenatów tkankowych, a także typów próbek omówionych w tym manuskrypcie, pod warunkiem, że badacz jest skłonny zoptymalizować swój protokół lizy przed wykonaniem dużych, pełnych testów płytkowych. Rzeczywista technika będzie się oczywiście różnić w zależności od rodzaju tkanki; jednak ogólnie rzecz biorąc, w protokole należy stosować bufor o neutralnym pH zawierający fizjologiczne stężenia soli jonowych, bez chemikaliów denaturujących i najlepiej bez detergentów. Jeśli konieczne jest użycie detergentu, stężenie detergentu niejonowego powinno być utrzymywane na minimalnym poziomie (np. nie więcej niż 1%). Bufor powinien również zawierać wystarczającą ilość inhibitorów proteazy, aby zapobiec proteolitycznej degradacji białek docelowych. Niezależnie od zastosowanego protokołu lizy, końcowe preparaty powinny zostać odwirowane w celu usunięcia cząstek stałych przed analizą.
Jeśli chodzi o ograniczenia testu, stężenia docelowych analitów w typach próbek biologicznych mogą się znacznie różnić. Aby prawidłowo określić ilościowo stężenia analitu, muszą one mieścić się w górnej i dolnej wartości krzywej standardowej. Ekstrapolacja wartości krzywej niekoniecznie jest wiarygodna i nie jest zalecana. W związku z tym badacze muszą zoptymalizować rozcieńczenia swoich poszczególnych próbek w eksperymentach pilotażowych przed przeprowadzeniem testu na pełnej płytce. Ponadto staranne przygotowanie próbek biologicznych do oznaczenia ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia tego formatu testu. Próbki, które są lipemiczne, hemolizowane lub zawierają szczątki białka, wpłyną na interakcje przeciwciał antygenowych, które definiują podstawową zasadę tego testu immunologicznego, i spowodują wyniki, które są nieinterpretowalne.
Test ten jest istotny w odniesieniu do istniejących metod oznaczania ilościowego z kilku powodów. Przy prawidłowym uruchomieniu format testu może oznaczać ilościowo do 13 analitów z próbki przy użyciu znacznie mniejszych objętości niż byłoby to wymagane do analizy próbki przy użyciu tradycyjnych testów ELISA. Ten format testu również nie wymaga specjalnego oprzyrządowania do jego przeprowadzenia. Jest to zaleta w porównaniu z innymi dostępnymi na rynku testami immunologicznymi opartymi na kulkach, ponieważ test można przeprowadzić przy użyciu dowolnej liczby powszechnie stosowanych cytometrów przepływowych.
Badania naukowe nad rolą, jaką odgrywają wydzielane czynniki i sieci cytokin w zdrowiu i chorobie, rozwijają się. Format testu opisany w tym manuskrypcie może być cennym narzędziem dla badaczy starających się zrozumieć te wieloaspektowe i złożone zjawiska. Aktywne programy badań biomedycznych zaczynają badać rolę sieci cytokin nie tylko w obszarach takich jak uogólnione zapalenie6, ale także w kontekście określonych stanów chorobowych, takich jak miażdżyca, rak i zapalenie nerwów 15,16,17. Niewątpliwie badania w tych dziedzinach będą się rozwijać wraz z rozwojem poszukiwania nowych metod leczenia tych przewlekłych schorzeń. Potrzeba dokładnej i wiarygodnej kwantyfikacji rozpuszczalnych mediatorów związanych z tymi chorobami pozostanie kluczowym priorytetem badawczym.

W swojej roli rozpuszczalnych cząsteczek sygnałowych, cytokiny pośredniczą w wysoce skoordynowanych i wieloczynnikowych procesach, które regulują odpowiedzi immunologiczne gospodarza. Ulegają one ekspresji na wszystkich etapach procesu zapalnego, od jego zainicjowania do ustąpienia, i regulują złożoną sieć interakcji, która obejmuje ich własną syntezę oraz syntezę receptorów komórkowych1. Ta sieć komunikacyjna jest złożona ze złożonością, która wykracza poza synergiczne lub antagonistyczne relacje, które mogą istnieć między poszczególnymi komponentami. Rzeczywiście, wiadomo, że wiele cytokin ma nadmiarowe lub przynajmniej częściowo nakładające się funkcje2,3.
Zintegrowane podejścia do biologii systemowej, które jednocześnie określają ilościowo wiele analitów cytokin, obecnie dostarczają coraz bardziej wszechstronnego zrozumienia unikalnych cytokinomów, które koordynują reakcje immunologiczne leżące u podstaw wielu stanów chorobowych4,5. Te stany chorobowe obejmują uogólnione stany zapalne po raka, stany neurodegeneracyjne i choroby układu krążenia6,7,8,9.
Takie sieci cytokin mogą być skutecznie badane za pomocą testów immunologicznych opartych na koralikach LEGENDplex. Testy te opierają się na tej samej zasadzie, co test immunoenzymatyczny typu sandwich (ELISA) i wykorzystują mikrosfery kodowane fluorescencją z przeciwciałami wychwytującymi węzłencyjnie przyłączonymi do ich powierzchni. Przeciwciała te są unieruchomione na powierzchniach znacznie mniejszych niż te wymagane przez tradycyjne formaty ELISA. Umożliwia to wykonywanie takich testów przy znacznie mniejszej objętości próbki, przy jednoczesnym zmniejszeniu niespecyficznego wiązania i zapewnieniu multipleksowanej analizy kilku analitów.
Test opisany w tym protokole wykorzystuje tę technologię do ilościowego oznaczania do 13 celów jednocześnie. Dane z tego testu można uzyskać za pomocą szerokiej gamy powszechnie dostępnych cytometrów przepływowych i w przeciwieństwie do innych dostępnych testów nie wymaga użycia dedykowanego oprzyrządowania specyficznego dla testu. Dzięki rozszerzającemu się katalogowi zwalidowanych paneli analitowych, testy te zostały wykorzystane w kilku trwających projektach badań biomedycznych10,11,12,13.
Aby zademonstrować łatwość i użyteczność formatu testu, w tym eksperymencie używamy panelu cytokin T pomocniczych myszy do ilościowego oznaczania 13 oddzielnych stężeń cytokin z supernatantów z hodowli tkankowej uzyskanych z mysich splenocytów hodowanych w wielu warunkach stymulujących. Oprócz supernatantów do hodowli tkankowych test ten można również przeprowadzić przy użyciu próbek surowicy lub osocza.

<table><tbody><tr><td>Wirówka Allegra 6R z adapterem nośnika MICROPLUS</td><td>366816 redlic Beckman</td><td></td><td>Do testów LEGENDplex jest uruchamiana w mikroprobówkach, 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V lub U (opcjonalnie)</td></tr><tr><td>Panel cytokin LEGENDplex Mouse T helper</td><td>BioLegend</td><td>740005</td><td>Multiplex Immunoassay (13-plex)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD3 i epsilon;</td><td>BioLegend</td><td>100314</td><td>Clone 145-2C11, niska endotoksyna, format wolny od azydku</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD28</td><td>BioLegend</td><td>102112</td><td>Clone 37.51, niska endotoksyna, format wolny od azydków</td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>EMD Millipore</td><td>WP6111560</td><td>Do testów LEGENDplex przy użyciu płytek filtracyjnych (zalecane)</td></tr><tr><td>Kolektor próżniowy</td><td>EMD Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td>Do testów LEGENDplex przy użyciu płytek filtracyjnych (zalecane)</td></tr><tr><td>Sterylne jednorazowe zbiorniki na odczynniki</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-130</td><td>Lub równoważne</td></tr><tr><td>probówki MicroFACS z polipropylenu</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-842-90</td><td>Do testów LEGENDplex przeprowadza się w mikroprobówkach, 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V lub U (opcjonalnie)</td></tr><tr><td>Zestaw pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-388-100</td><td>Cztery rozmiary pipet (0,2-2 i mikro; L, 2-20 i mikro; L, 20-200 i mikro; L, 100-1000 i mikro; L)</td></tr> <tr><td>Pipeta wielokanałowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>FA10011G</td><td>zdolna do dozowania 5 &mu; L do 200 &mu; L</td></tr><tr><td>Wytrząsarka do mikropłytek</td><td>Fisher Scientific 88880023</td><td></td><td>Lub równoważna</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Fisher Scientific</td><td>75002410</td><td>Lub równoważne</td></tr><tr><td>probówki FACS</td><td>Fisher Scientific NC9885747</td><td></td><td>12 x 75 mm z okrągłym dnem</td></tr><tr><td>PMA (12-mirystynian 13-octanu forbolu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharyd (LPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-8274</td><td>Escherichia coli O26:B6</td></tr><tr><td>Jonomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa Branson B200</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z305359</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505</td><td>1,5 ml probówki polipropylenowe</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>Różne</td><td>Różne</td><td>Cytometr wyposażony w pojedynczy laser (488nm niebieski) lub dwa lasery (488nm niebieski lub 532nm zielony + 633nm czerwony) zdolny do odczytu długości fal emisji przy 575nm i 660nm</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka polipropylenowa</td><td>VWR</td><td>82050-662</td><td>Do testów LEGENDplex jest uruchamiany w mikroprobówkach, 96-dołkowej płytce V-lub U-bottom (opcjonalnie)</td></tr></tbody></table>

multipleksowe profilowanie cytokin stymulowanych splenocytów myszy przy użyciu cytometrycznej platformy testów immunologicznych opartych na kulkach

Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

Testy immunologiczne oparte na koralikach wykorzystują tę samą podstawową zasadę, co testy immunologiczne kanapkowe. Kulki wychwytujące, które można rozróżnić na podstawie wielkości i intensywności fluorescencji wewnętrznej allofikocyjaniny (APC), są sprzężone z przeciwciałami specyficznymi dla danego analitu. Następnie wybrany panel zdefiniowanych zestawów kulek wychwytujących jest inkubowany z próbką biologiczną zawierającą docelowe anality specyficzne dla przeciwciał wychwytujących. Dodaje się biotynylowany koktajl przeciwciał detekcyjnych, który prowadzi do powstania kanapek z przeciwciałami wykrywającymi perełki i anality.
Na koniec, dodaje się streptawidynę-fikoerytrynę (SA-PE), która wiąże się z biotynylowanymi przeciwciałami detekcyjnymi, zapewniając intensywność sygnału fluorescencyjnego proporcjonalnie do ilości związanego analitu. Sygnał fluorescencyjny PE regionów kulek specyficznych dla analitu jest oznaczany ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej, a stężenia poszczególnych analitów są oznaczane za pomocą oprogramowania do analizy danych i krzywej wzorcowej wygenerowanej w teście.
W tym eksperymencie używamy mysiego panelu cytokin pomocniczych T, aby jednocześnie określić stężenie 13 oddzielnych celów cytokin w supernatantach do hodowli tkankowych pobranych z mysich splenocytów hodowanych w różnych warunkach stymulujących.

Niniejszy protokół demonstruje, w jaki sposób platforma do immunoanalizy oparta na koralikach może być wykorzystana do jednoczesnego oznaczania ilościowego profili cytokin w próbkach biologicznych przy użyciu cytometru przepływowego. Próbki biologiczne użyte w tym przykładzie stanowiły nadsączki z kultur komórkowych splenocytów myszych, które wcześniej inkubowano w różnych warunkach aktywujących, choć format analizy został również zwalidowany do użytku z próbkami surowicy lub osocza.
Dane uzyskane z analizy są wykorzystywane do stworzenia krzywych wzorcowych dla wszystkich analitów w panelu multipleksowym. Oprogramowanie do analizy danych klasyfikuje każdy konkretny analit na podstawie unikalnego rozmiaru kuleczki i intensywności APC, a następnie kwantyfikuje go przy użyciu reportera PE. Zakresy dynamiczne, a także czułość analizy, zostały przedstawione na wykresie w skali logarytmicznej na Rysunku 2A. Oprogramowanie wykorzystuje dane z analizy oraz algorytm dopasowania krzywej 5-parametrowej do dokładnego obliczenia nie tylko stężeń analitów w dostarczonych przez użytkownika próbkach biologicznych, ale także granic wykrywalności zarówno dla górnego, jak i dolnego zakresu wszystkich krzywych wzorcowych (Tabela 1). Format opisany w niniejszym protokole zapewnia również bardzo wysoką precyzję analizy. Na Rysunku 2B oraz 2C przedstawiono dane obrazujące zmienność wewnątrzanalizy dla każdego analitu. W jednej analizie przebadano dwa oddzielne stężenia białek wzorcowych (wysokie i niskie), wykonując 16 powtórzeń dla każdej próbki. Rysunek 2C oraz 2D przedstawiają zmienność międzyanalizową docelowych analitów z trzech niezależnych analiz. Podobnie jak w eksperymentach dotyczących precyzji wewnątrzanalizy, wysokie i niskie stężenia wzorcowe analizowano w 3 powtórzeniach w każdym z niezależnych doświadczeń. Wyraźnie widoczna jest minimalna zmienność obliczonego stężenia białek docelowych.
Aby zademonstrować użyteczność cytometrycznych testów opartych na koralikach w badaniu profili ekspresji cytokin, splenocyty mysie inkubowano w różnych warunkach aktywujących. Oprócz niepobudzonej kontroli, komórki inkubowano również z LPS, przeciwciałami anty-CD3/anty-CD28 lub forbolu 12-mirystynianem 13-octanem i jonomycyną. Nadnadkrawki z hodowli komórkowych zebrano po 48 h i poddano analizie z wykorzystaniem panelu cytokin dla mysich limfocytów T pomocniczych. Wyniki ilościowe z tego eksperymentu przedstawiono na Rysunku 3, gdzie wyraźnie zarysowano wpływ warunków stymulacji na stężenia cytokin.
Opisane powyżej wyniki są typowe, pod warunkiem że osoba przeprowadzająca eksperyment stosuje poprawną technikę laboratoryjną i przestrzega dostarczonego protokołu analizy. Źródła błędów w tym formacie analizy mogą wynikać z odchyleń w czasach inkubacji, objętościach odczynników, procesie płukania lub z nieprawidłowych ustawień PMT w cytometrze przepływowym wykorzystanym do analizy próbek. Na Rysunku 4A wykres rozproszenia z pomyślnie przeprowadzonej analizy pokazuje 2 wyraźnie zdefiniowane, odrębne populacje kuleczek. Można to zestawić z Rysunkiem 4B, gdzie niewystarczające płukanie i nieprzestrzeganie protokołu doprowadziły do powstania agregatów kuleczek, które zacierają granice między dwiema populacjami. Ponadto, co potwierdza obecność debris w lewym dolnym kwadrancie, do analizy wyeksportowano całkowitą liczbę zdarzeń z cytometru, zamiast preferowanego formatu obejmującego wyłącznie zdarzenia bramkowane. Prawidłowa konfiguracja cytometru jest kluczowa dla uzyskania wiarygodnych danych w tej analizie. Na Rysunku 4C właściwe ustawienia PMT pozwalają na rozdzielenie każdego z 6 analitów w kanale klasyfikacji APC. Nieprawidłowe ustawienia PMT doprowadzą do uzyskania danych podobnych do tych przedstawionych na Rysunku 4D, gdzie w kanale APC populacje kuleczek mają nakładające się intensywności klasyfikacji. Unieważni to wynik analizy, ponieważ obliczenie stężeń analitów będzie niemożliwe bez wyraźnie zdefiniowanych populacji kuleczek analitycznych.
<img alt="Wykres profilowania cytokin i wykresy słupkowe; analiza MFI w stosunku do stężenia cytokin, badanie zmienności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Zakresy krzywych wzorcowych i precyzja analizy. (A) Reprezentatywna krzywa wzorcowa wygenerowana przy użyciu panelu cytokin pomocniczych mysich limfocytów T. Krzywa wzorcowa musi być wyznaczana przy każdym badaniu. (B-C) Precyzja wewnątrzanalizy. Dwie próbki o różnych stężeniach białek docelowych (wysokim i niskim) przeanalizowano w jednym badaniu, wykonując 16 powtórzeń dla każdej próbki. Dane przedstawiono jako średnia + odchylenie standardowe. (D-E) Precyzja międzyanalizami. Dwie próbki o różnych stężeniach białek docelowych (wysokim i niskim) przeanalizowano w trzech niezależnych badaniach, wykonując 3 powtórzenia dla każdej próbki. Dane przedstawiono jako średnia + odchylenie standardowe. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy uwalniania cytokin pokazujący odpowiedzi IL-10 do IL-13, IFN-γ, IL-5, TNF-α, IL-2 pod wpływem stymulacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Ilościowe określenie reprezentatywnych wyników. Splenocyty mysie (1 x 106 komórek) hodowano w temperaturze 37 °C + 5% CO2 w różnych warunkach: bez stymulacji, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µg/mL naniesione na płytkę) + αCD28 (1 µg/mL rozpuszczalne), PMA (20 ng/mL) + jonomycyna (500 ng/mL). Nadnadkłady hodowlane zebrano po 48 h, a następnie poddano analizie ilościowej przy użyciu panelu cytokin pomocniczych mysich limfocytów T. Wyraźnie widoczne są zróżnicowane profile ekspresji cytokin w odpowiedzi na warunki stymulacji. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza cytometryczna; wykresy kropkowe (SSC vs. FSC, APC vs. PE) do identyfikacji populacji komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Wyniki z testów udanych i nieudanych. (A) Udane testy wykażą wyraźne populacje kulek dla populacji mikrosfer. (B) Nieudane testy wykażą słabą separację populacji, agregaty kulek oraz zbyt dużą liczbę zarejestrowanych zdarzeń. (C) Udane testy charakteryzują się wyraźnie zdefiniowanymi intensywnościami w kanale fluorescencji klasyfikacyjnej, które są łatwe do wyznaczania bramkowania i kwantyfikacji. (D) Nieudane testy wykażą słabo rozdzielone intensywności klasyfikacyjne, które nakładają się na wiele populacji kulek, co utrudnia kwantyfikację. Wielu z tych błędów można uniknąć dzięki ścisłemu przestrzeganiu protokołu testu. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Krzywa wzorcowa</td>
			<td colspan="2">Czułość (pg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analit</td>
			<td>Wzór dopasowania</td>
			<td>CV</td>
			<td>R2</td>
			<td>Min.</td>
			<td>Maks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-γ</td>
			<td>5-P.log(4,43, 14,40, 0,54, 9,11, 0,01)</td>
			<td>1.77%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.1</td>
			<td>18105.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-5</td>
			<td>5-P.log(4,36, 12,68, 0,64, 5,73, 0,36)</td>
			<td>1.32%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>14514.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-α</td>
			<td>5-P.log(4,36, 11,63, 0,79, 5,45, 0,37)</td>
			<td>1.48%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>1.9</td>
			<td>20109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>5-P.log(4,46, 12,62, 0,78, 5,07, 0,34)</td>
			<td>1.34%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>25109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6</td>
			<td>5-P.log(4,58, 11,66, 0,64, 5,77, 0,37)</td>
			<td>1.70%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.0</td>
			<td>7022.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>5-P.log(4,27, 12,23, 0,62, 5,72, 0,36)</td>
			<td>1.36%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>13273.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10</td>
			<td>5-P.log(4,67, 11,65, 1,20, 6,28, 0,61)</td>
			<td>1.81%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.2</td>
			<td>5190.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-9</td>
			<td>5-P.log(4.32, 13.86, 0.86, 5.90, 0.45)</td>
			<td>1.82%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>12602.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17A</td>
			<td>5-P.log(4,06, 14,03, 0,47, 6,52, 0,32)</td>
			<td>0.99%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>12285.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17F</td>
			<td>5-P.log(4.52, 12.15, 0.61, 5.52, 0.34)</td>
			<td>0.92%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>14841.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-21</td>
			<td>5-P.log(4,90, 8,03, 1,77, 4,74, 1,11)</td>
			<td>0.79%</td>
			<td>1</td>
			<td>9.0</td>
			<td>12943.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-22</td>
			<td>5-P.log(4,57, 12,56, 0,63, 6,06, 0,39)</td>
			<td>1.16%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>6408.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-13</td>
			<td>5-P.log(4,40, 11,44, 0,22, 3,19, 1,45)</td>
			<td>1.11%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
			<td>16728.0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Dopasowanie krzywej wzorcowej i czułość testu. Oprogramowanie do analizy danych zostało wykorzystane do wygenerowania krzywych wzorcowych dla wszystkich analitów zawartych w teście multipleksowym. Ta w pełni zautomatyzowana analiza stosuje odporny algorytm dopasowania krzywej 5-parametrycznej do standardów z serii rozcieńczeń z testu i została również wykorzystana do określenia czułości testu przy użyciu teoretycznych granic wykrywalności.

Ten protokół opisuje kwantyfikację wielu celów cytokin jednocześnie w supernatantach hodowli tkankowej pobranych ze stymulowanych mysich splenocytów przy użyciu platformy testów immunologicznych opartych na multipleksie i cytometru przepływowego.

Multipleksowe profilowanie cytokin stymulowanych splenocytów myszy przy użyciu cytometrycznej platformy testów immunologicznych opartych na kulkach

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal ...

Ogólnym celem tego protokołu jest ilościowe określenie wielu docelowych cytokin jednocześnie w supernatantach hodowli tkankowej pobranych ze stymulowanych splenocytów myszy przy użyciu multipleksowego testu immunologicznego opartego na kulkach i cytometru przepływowego. Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, takie jak: Jakie są unikalne profile cytokin, które koordynują odpowiedź immunologiczną w kontekście określonych stanów chorobowych? Główną zaletą tej techniki jest to, że jednoczesna kwantyfikacja wielu pierścienic może być przeprowadzona przy użyciu znacznie mniejszej objętości próbki niż tradycyjne formaty ELISA, przy jednoczesnym zmniejszeniu niespecyficznego wiązania.Procedurę zademonstruje Nicholas Johnsen, pracownik naukowy z naszego zespołu ds. rozwoju produktu. Procedurę tę należy rozpocząć od przygotowania próbki biologicznej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przygotować wstępnie zmieszane kulki unieruchomione przeciwciałami, należy poddać sonikę butelki z wstępnie zmieszanymi kulkami przez jedną minutę w kąpieli sonikatora w temperaturze pokojowej.Następnie wiruj przez 30 sekund przed użyciem. Jeśli kąpiel sonicyjna nie jest dostępna, zwiększ czas wirowania do jednej minuty. Do przygotowania standardowego dodaj 250 mikrolitrów buforu do oznaczania, aby rozpuścić liofilizowany koktajl Mouse Th Cytokine Standard.Wymieszać przez krótkie wirowanie i pozostawić fiolkę w temperaturze pokojowej na 10 minut. Przenieś standardowy koktajl do polipropylenowej probówki wirówkowej oznaczonej C7. Będzie to używane jako najwyższy standard. Oznacz sześć probówek do mikrowirówek z polipropylenu jako C1 do C6. Dodać 75 mikrolitrów buforu testowego do każdej z tych probówek.Następnie przenieś 25 mikrolitrów najwyższego wzorca, C7, do probówki C6 i dobrze wymieszaj, wirując. Będzie to standard C6. Kontynuuj wykonywanie seryjnych rozcieńczeń od jednego do czterech, używając nowej końcówki pipety dla każdej probówki, aby dodać 25 mikrolitrów poprzedniego wzorca do 75 mikrolitrów buforu testowego w następnej najniższej probówce wzorcowej.Podążaj za każdym dodawaniem, wirując. Użyj buforu testowego jako wzorca pikogramów zerowych na mililitr. Aby przeprowadzić test, przed użyciem pozwól wszystkim odczynnikom ogrzać się do temperatury pokojowej.W tej demonstracji zastosowano polipropylenowe płyty filtracyjne. Absolutnie konieczne jest, aby płytka była utrzymywana w pozycji pionowej podczas całej procedury testowej, w tym etapów mycia, aby uniknąć utraty kulek. Wstępnie zwilż bibułę filtracyjną, dodając 100 mikrolitrów buforu do płukania 1X do każdej studzienki i pozostaw płytki na minutę w temperaturze pokojowej.Usuń objętość bufora za pomocą kolektora próżniowego. Zetrzyj nadmiar bufora do mycia od spodu talerza, dociskając talerz do stosu czystych ręczników papierowych. Następnie umieść płytkę na odwróconej pokrywie talerza.W przypadku próbek supernatantu do hodowli komórkowych dodać 25 mikrolitrów buforu do oznaczania do wszystkich studzienek. Dodaj 25 mikrolitrów każdego wzorca do standardowych studzienek. Na koniec dodaj 25 mikrolitrów każdej próbki do dołków na próbki.Wiruj zmieszane kulki przez 30 sekund. Następnie dodaj 25 mikrolitrów zmieszanych kulek do każdej studzienki, potrząsając butelką z koralikami z przerwami, aby uniknąć osiadania koralików. Uszczelnij płytkę za pomocą uszczelniacza do płyt.Po uszczelnieniu owiń całą płytę, w tym odwróconą pokrywę płyty, folią aluminiową. Umieść płytkę na wytrząsarce do płytek, zabezpiecz ją i potrząsaj z prędkością około 500 obr./min przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Nie odwracając, umieść płytkę na kolektorze próżniowym i zastosuj podciśnienie jak poprzednio.Następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu do płukania 1X do każdej studzienki. Usunąć zawartość studzienek na płytce testowej przez filtrację próżniową. Zetrzyj nadmiar buforu myjącego z dna płytki za pomocą wkładki chłonnej lub ręczników papierowych przed powtórzeniem tego kroku jeszcze raz.Następnie dodaj 25 mikrolitrów przeciwciał wykrywających do każdej studzienki. Po uszczelnieniu płytki świeżym uszczelniaczem do płyt, owiń całą płytkę, łącznie z odwróconą pokrywą płyty, folią aluminiową. Umieścić płytkę na wytrząsarce i wstrząsać z prędkością około 500 obr./min przez godzinę w temperaturze pokojowej.Bez odkurzania dodaj 25 mikrolitrów odczynnika fikoerytryny streptawidyny bezpośrednio do każdej studzienki. Uszczelnij i zawiń płytkę jak poprzednio. Następnie umieść płytkę na wytrząsarce do płytek i potrząsaj z prędkością około 500 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Po dwukrotnym powtórzeniu kroku filtracji próżniowej dodaj 200 mikrolitrów bufora myjącego 1X do każdej studzienki. Ponownie zawieś koraliki na wytrząsarce talerzy na jedną minutę. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś próbki z płytki filtracyjnej do probówek FACS w celu odczytania próbek na cytometrze przepływowym.Uruchom cytometr przepływowy i oprogramowanie do akwizycji zgodnie z instrukcjami producenta dostarczonymi z przyrządem. Utwórz wykres punktowy z punktem punktowym do przodu na osi X i bocznym punktem punktowym dla osi Y. Ustaw rozproszenie do przodu i rozproszenie boczne na tryb liniowy.Obracaj fiolkę z surowymi kulkami dołączonymi do zestawu przez 30 sekund, aby ponownie zawiesić koraliki. Przenieś 400 mikrolitrów surowych kulek do nowej probówki FACS. Ustaw natężenie przepływu cytometru przepływowego na niskie.Uruchom surowe koraliki, ostrożnie dostosowując wzmocnienie i napięcie dla rozproszenia do przodu i rozpraszania bocznego, tak aby populacje tych koralików o obu rozmiarach były widocznie oddzielone i łatwe do bramkowania. Dostosuj próg rozproszenia do przodu, aby wykluczyć niechciane zdarzenia. Na wykresie punktowym do przodu i z boku narysuj bramę, która zawiera wszystkie populacje ściegów.Wyświetla populacje bramkowanych ściegów z wykresu punktowego do przodu i z boku na drugim wykresie punktowym z PE na osi X i APC na osi Y. Dostosuj napięcie PMT dla kanału fluorescencji APC tak, aby sygnał APC dla wszystkich populacji koralików miał medianę intensywności fluorescencji (MFI) mieszczącą się w zakresie od 10 do 5 000. Następnie wiruj fiolkę z kulkami PE przez 30 sekund, aby ponownie zawiesić kulki.Przenieś 400 mikrolitrów ponownie zawieszonych kulek PE do nowej rurki FACS. Zastąp rurkę z surowymi kulkami w cytometrze przepływowym rurką z kulkami PE. Dostosuj napięcie lampy fotopowielacza dla ustawienia kanału fluorescencji PE tak, aby MFI kulek PE mieściło się w zakresie specyficznym dla partii, który znajduje się na fiolce z kulkami PE.Aby przeprowadzić akwizycję danych, ustaw liczbę zdarzeń ściegu, które mają zostać pobrane, na około 300 na anolit. Wirować każdą próbkę przez pięć sekund przed analizą. Następnie zapoznaj się z próbkami.Podczas odczytu próbek należy najpierw ustawić cytometr przepływowy w trybie konfiguracji i poczekać, aż populacja kulek ustabilizuje się przed przełączeniem w tryb akwizycji. Przed wykonaniem analizy danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym należy wyeksportować tylko zdarzenia bramkowane, a nie zdarzenia łączne. Reprezentatywne krzywe standardowe dla docelowych anolitów wygenerowano przy użyciu mysiego panelu cytokin pomocniczych T.Prawidłowo przeprowadzone testy pokażą krzywe z szerokimi zakresami dynamiki, jak pokazano tutaj. Krzywe standardowe muszą być uruchamiane za każdym razem, gdy przeprowadzany jest test. Mysie splenocyty hodowano w różnych warunkach przez 48 godzin.Zebrano supernatanty hodowlane, a następnie określono ilościowo stężenia 13 celów za pomocą mysiego panelu cytokin pomocniczych T. Zróżnicowane profile ekspresji cytokin, w odpowiedzi na warunki stymulacji, są wyraźnie widoczne. Po opanowaniu, laboratoryjna praca laboratoryjna tej techniki może zostać wykonana w mniej niż pięć i pół godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Czas akwizycji danych i dalszej analizy będzie się różnić w zależności od liczby próbek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zastosować ten protokół, określić ilościowo stężenia anolitu w próbkach biologicznych za pomocą cytometrycznego testu immunologicznego opartego na kulkach. Obejmuje to przygotowanie odczynnika, etapy inkubacji i konfigurację cytometru przepływowego do pozyskiwania danych.

multiplex-cytokine-profiling-stimulated-mouse-splenocytes-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejsza procedura opisuje detekcję i izolację leukocytów TH17 myszy, które po stymulacji aktywnie wydzielają IL-17.

Wykrywanie i izolacja żywych limfocytów T wydzielających IL-17 u myszy

Ten film demonstruje test immunologiczny oparty na multipleksie do ilościowego oznaczania wielu celów cytokin w próbce. Mieszanina odrębnych mikrosfer sprzężonych z przeciwciałami specyficznymi dla cytokin służy do wiązania cytokin obecnych w próbce. Reporterki znakowane streptawidyną są unieruchamiane na związanych cytokinach za pomocą biotynylowanych przeciwciał wykrywających. Cytometria przepływowa identyfikuje związane cytokiny na podstawie unikalnych rozmiarów i intensywności wewnętrznej...

Multipleksowy test immunologiczny oparty na kulkach do ilościowego określania wielu celów cytokin

Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

Analiza cytokin filmu łzowego pomaga w badaniu różnych chorób oczu. Testy multipleksowe oparte na kulkach są proste i czułe oraz umożliwiają testowanie wielu celów w próbkach o małych objętościach. W tym miejscu opisujemy protokół profilowania cytokin filmu łzowego za pomocą testu multipleksowego opartego na kulkach.

Test multipleksowy oparty na kulkach do analizy profili cytokin łzowych

Tutaj opisujemy proteomiczne podejście pojedynczej komórki do oceny immunologicznych zmian fenotypowych i funkcjonalnych (indukcja cytokin wewnątrzkomórkowych) w próbkach krwi pełnej z obwodu, analizowanych za pomocą cytometrii masowej.

Jednokomórkowa analiza immunofenotypu i produkcji cytokin w obwodowej krwi pełnej za pomocą cytometrii masowej

Użycie referencyjnych odczynników do testów uwalniania cytokin pozwala na bardziej powtarzalne i standaryzowane profile bezpieczeństwa in vitro immunoterapeutycznych przeciwciał monoklonalnych. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób testy uwalniania cytokin mogą być stosowane wraz z referencyjnym panelem odczynników do przewidywania bezpieczeństwa niektórych terapeutycznych przeciwciał monoklonalnych.

Stosowanie odczynników referencyjnych w celu potwierdzenia odporności testów uwalniania cytokin w celu przewidywania bezpieczeństwa przeciwciał monoklonalnych

Protokół opisuje zaawansowaną platformę mikroprzepływową do ilościowego pomiaru dynamiki wydzielania cytokin w pojedynczych ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej. Platforma mierzy równolegle do trzech cytokin (IL-6, TNFα i IL-1β) dla każdej pojedynczej komórki stymulowanej lipopolisacharydem, na przykład.

Podejście mikroprzepływowe do rozwiązywania jednoczesnego i sekwencyjnego wydzielania cytokin w poszczególnych komórkach wielofunkcyjnych

Testy immunologiczne oparte na krwi pełnej dostarczają łatwego i zasobooszczędnego narzędzia do analizy odporności specyficznej dla antygenu do celów diagnostycznych i badawczych. W tym artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół oparty na krwi pełnej z podwójną kostymulacją do kompleksowej analizy odporności gospodarza na patogeny grzybowe i wirusowe, w tym wersję o małej objętości dla pacjentów pediatrycznych i małych zwierząt.

Test krwi pełnej z podwójną kostymulacją do specyficznej dla antygenu analizy odporności gospodarza na patogeny grzybowe i wirusowe

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Opracowaliśmy protokół, który jest szybki, czuły i powtarzalny do profilowania ekspresji genów patogenów podczas infekcji.

Profilowanie ekspresji genów zakażonych drobnoustrojów za pomocą cyfrowej platformy kodów kreskowych

Poznaj metodę multipleksowego profilowania cytokin w splenocytach myszy przy użyciu cytometrii przepływowej i platformy opartej na kulkach. Ta technika umożliwia jednoczesne oznaczanie wielu celów przy mniejszej objętości próbek niż tradycyjne ELISA.

Multipleksowe profilowanie cytokin stymulowanych splenocytów myszy przy użyciu cytometrycznej platformy testów immunologicznych opartych na kulkach (Wideo) | JoVE Journal

Multipleksowe profilowanie cytokin stymulowanych splenocytów myszy przy użyciu cytometrycznej platformy testów immunologicznych opartych na kulkach

Przeglądaj więcej filmów