Name: Całościowe oczyszczanie i barwienie organów kwiatowych Arabidopsis i krzemianek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Poznaj techniki preparowania kwiatów i krzemianek Arabidopsis oraz całościowe oczyszczanie i barwienie struktur rozrodczych. Ta metoda umożliwia badanie rozwoju kwiatów i analizę mutacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Uniwersytet w Zurychu, grant IEF Marie Curie (grant nr. TransEpigen-254797 do A.H.), Advanced Grant Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (grant nr. MEDEA-250358 do U.G.) oraz projekt badawczo-rozwojowy (grant MecanX dla U.G.) z SystemsX.ch, Szwajcarskiej Inicjatywy w Biologii Systemów.

1. Fiksacja kwiatów i krzemionki
<ol>
	<li>Zbieraj kwiaty i łuski z roślin zsynchronizowanych przy otwarciu pierwszego kwiatu. 
	UWAGA: W zastosowanych tutaj warunkach eksperymentalnych rośliny zaczynają kwitnąć około 21 dni po przesadzeniu z płytek Murashige i Skoog (MS) do gleby. Nasiona są stratyfikowane przez 3–4 dni w temperaturze 4 °C i kiełkowane/hodowane na płytkach MS w temperaturze 22 °C/16 h światła i 18 °C/8 godzin ciemności przez 8 do 10 dni, przed przesadzeniem sadzonek na glebę bogatą w składniki odżywcze w doniczkach utrzymywanych w tych samych warunkach (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Liczba powtórzeń zależy od konkretnego celu badania, ale zaleca się co najmniej 5 kwiatostanów (z 5 pojedynczych roślin) dla każdego zabiegu. Jeśli jednostką doświadczalną są kwiaty, zaleca się co najmniej 10 kwiatów na powtórzenie.</li>
	<li>Wytnij kwiatostany lub kwiaty (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1E-H) za pomocą małych nożyczek (np. nożyczek do paznokci) i natychmiast umieść je w probówce do mikrowirówki (do utrwalania pojedynczego kwiatostanu/kwiatu) lub stożkowej probówce (do zbiorczych mocowań) zawierającej świeżo wykonane utrwalacze Carnoya, metanol/kwas octowy lub FPA50 (w zależności od zastosowania, patrz poniżej) na lodzie. 
	UWAGA: Próbki powinny być całkowicie zanurzone w utrwalaczu.</li>
	<li>Pozostawić tkankę w utrwalaczu na 4 godziny do nocy w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Infiltracja próżniowa może być stosowana w celu przyspieszenia penetracji utrwalacza do tkanki, ale może to być szkodliwe dla zachowania struktury tkanki. Autorzy nie stosują infiltracji próżniowej.</li>
	<li>Usunąć utrwalacz, dodać tyle 70% etanolu, aby pokryć próbki, i przywrócić je do temperatury 4 °C na co najmniej 24 godziny; próbki mogą pozostawać w tym roztworze przez czas nieokreślony. Po usunięciu etanolu przejdź natychmiast do następnego kroku; albo rozwarstwienie, albo oczyszczenie SDS.</li>
</ol>
2. Sekcja pod mikroskopem stereoskopowym
<ol>
	<li>Umieść świeżo przygotowany 70% etanol w szkiełku zegarmistrza umieszczonym na małej szalce Petriego dla podparcia.</li>
	<li>Umieść kwiatostan/kwiat/krzemionkę na tym świeżo przygotowanym utrwalaczu i wypreparuj pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą kleszczy i strzykawki z igłą.
	<ol>
		<li>Użyj szkła zegarmistrzowskiego lub podobnego urządzenia, które pozwala na całkowite pokrycie próbek etanolem (zalecane) do preparowania kwiatostanów i do rozrywania organów kwiatowych dojrzałych kwiatów (na tym etapie można wyciąć działki, płatki i pręcik), aby uniknąć ryzyka wyschnięcia próbek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypreparuj krzemionki i małe pąki kwiatowe na szkiełku, jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Odłóż na bok szkiełko zegarmistrza z wstępnie przetworzonymi próbkami i użyj zwykłego szkiełka do ostatecznego rozbioru.</li>
		<li>Przenieś interesującą Cię próbkę na szkiełko i dodaj 10 μl świeżego 70% etanolu. Pracuj szybko nad końcowym rozbieraniem i w razie potrzeby dodaj 10 μl etanolu, aby próbka była wilgotna bez nadmiaru płynu.</li>
		<li>Informacje na temat uwalniania ziaren pyłku z pręcików znajdują się w kroku 5.1. W przypadku preparowania owocolistków i zalążków postępuj zgodnie z procedurą opisaną w Rysunek 2. Procedura ta ma zastosowanie do wszystkich etapów rozwoju owocolistka, w tym do etapu rozwoju zielonych krzemianków. 
		UWAGA: Nie należy dodawać etanolu, jeśli w wyniku przenoszenia próbek pozostała wystarczająca ilość etanolu; Analizowanie bardzo małych próbek jest znacznie łatwiejsze w minimalnej ilości cieczy. Na zjeżdżalni należy zawsze trzymać tylko interesujące nas narządy (działki, płatki, pręciki, owocolistki, zalążki, nasiona lub ziarna pyłku). Procedura ta zapewni jednolitą grubość między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym, odpowiadającą grubości badanego narządu, co skutkuje większą jednorodnością, a tym samym skutecznością w badaniach mikroskopowych (większa liczba docelowych próbek w tej samej płaszczyźnie ogniskowej).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj małego kawałka bibuły, aby wchłonąć i usunąć jak najwięcej etanolu. Szybko przejdź do następnego kroku (sekcja 3, 4 lub 6), zanim próbka wyschnie.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie na bazie hydratu chloralu i kombinowane oczyszczanie-barwienie
UWAGA: Najlepsze wyniki dla oczyszczania na bazie hydratów chloralu uzyskuje się przy użyciu stałego materiału FPA50.
<ol>
	<li>Umieścić 20 μl roztworu klarującego (hydrat chloralu/glicerol, zmodyfikowana pożywka Hoyera, roztwory Herra 41/2 lub Herr's IKI-41/2) na szkiełku zawierającym próbkę. Używając pary strzykawek z igłami podskórnymi, ustaw próbki zgodnie z potrzebami, zmniejszając przestrzeń między nimi i odwracając te, w których narząd zainteresowania jest skierowany w dół. Usunąć wszelkie pozostałe pęcherzyki powietrza za pomocą igły.</li>
	<li>Opuść szkiełko nakrywkowe na boki i delikatnie je ułóż, bardzo delikatnie dociskając, i poczekaj, aż roztwór czyszczący wypełni przestrzeń pomiędzy. W razie potrzeby dodać minimalną ilość roztworu czyszczącego, aby wypełnić całą przestrzeń pod szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Umieść szkiełko na uchwycie szkiełka i pozostaw je pod wyciągiem. Do obserwacji mikroskopowych należy przystąpić po upływie co najmniej 4 godzin i w ciągu kolejnych 4–5 dni.</li>
</ol>
4. Połączone barwienie Alexandra i oczyszczanie pylników przez Herr's 41/2
UWAGA: Oryginalny protokół Alexandra opiera się na uwalnianiu ziaren pyłku na szkiełku przed barwieniem. Skuteczną i bardziej pouczającą, zmodyfikowaną procedurą barwienia i oczyszczania Alexandra jest barwienie dojrzałych ziaren pyłku w dojrzałych, ale nierozwarstwiających się pylnikach.
<ol>
	<li>Wybieraj świeżo zebrane pąki kwiatowe, które mają się otworzyć z nierozwarstwiającymi się pylnikami. 
	UWAGA: Nie bierz młodszych pąków kwiatowych, ponieważ barwienie Alexandra jest przeznaczone dla dojrzałych ziaren pyłku i nie barwi skutecznie niedojrzałych ziaren pyłku. Zaleca się minimum 5 kwiatów na zabieg zebranych z różnych roślin i kwiatostanów.</li>
	<li>Przygotuj 96-dołkową płytkę z wystarczającą ilością roztworu Alexandra, aby zanurzyć pączek kwiatowy. Odsłoń pylniki, usuwając działki kielicha i płatki i zanurz je w roztworze Alexandra. Próbki należy przechowywać pod wyciągiem przez 1–3 godziny.</li>
	<li>Zastąp roztwór Alexandra roztworem Herra 41/2 i umieść płytkę wielodołkową z powrotem pod wyciągiem w celu inkubacji przez noc.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy delikatnie przesuń oczyszczone pąki kwiatowe na nową szkiełko. Ponieważ może dojść do pewnego przeniesienia roztworu Alexandra, użyj bibuły, aby usunąć jak najwięcej roztworu czyszczącego.</li>
	<li>Wypreparuj pręciki i usuń wszystkie inne tkanki. Postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi w sekcji 3, używając roztworu Herra 41/2.</li>
</ol>
5. Usuwanie egzyny z ziaren pyłku
UWAGA: Zalecamy użycie utrwalacza Carnoya do barwienia DAPI.
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z procedurami utrwalania i rozwarstwiania opisanymi w punktach 1 i 2. Do tej pory na szkiełku powinien znajdować się od jednego do wielu pręcików w minimalnej ilości 70% etanolu.</li>
	<li>Użyj bibuły, aby usunąć nadmiar etanolu i dodaj 5–10 μl roztworu DAPI. Używając kilku strzykawek z igłami, uwolnij ziarna pyłku w tej niewielkiej ilości roztworu (np. użyj jednej strzykawki do unieruchomienia pręcika, a drugiej do uwolnienia ziaren pyłku). Dodaj kolejne 5 μl DAPI, jeśli roztwór wyschnie.</li>
	<li>Usunięcie wszystkich zanieczyszczeń z pręcika jest krytycznym krokiem, tak aby między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym pozostały tylko ziarna pyłku.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku z próbką, opuszczając je na boki i dodaj minimalną ilość roztworu DAPI wymaganą do wypełnienia przestrzeni. Połóż palec wskazujący na szkiełku nakrywkowym i bez zbytniego zgniatania wykonuj szybki, stanowczy i krótki ruch ślizgowy. 
	UWAGA: Aby ocenić niezbędną siłę i amplitudę ruchu ślizgowego, krok ten należy przećwiczyć kilka razy, sprawdzając wyniki za każdym razem pod mikroskopem.</li>
	<li>W razie potrzeby dodać roztwór DAPI i umieścić szkiełko w wilgotnym pudełku w ciemności w temperaturze 4 °C na 15 minut do 1 godziny. Przystąpić do obserwacji próbek pod wpływem fluorescencji szerokokątnej lub mikroskopii konfokalnej w ciągu 24 godzin. Spróbuj połączyć tę procedurę z czyszczeniem SDS, aby sprawdzić, czy można uzyskać dalszą poprawę.</li>
</ol>
6. Oczyszczanie dodecylosiarczanu sodu (SDS)
UWAGA: W zależności od analizowanego organu kwiatowego i umiejętności badacza w zakresie preparowania bardzo miękkich i małych okazów, zabieg SDS może być przeprowadzony przed (dla doświadczonych badaczy) lub po etapie sekcji (dla mniej doświadczonych badaczy) na materiale utrwalonym metanolem i kwasem octowym.
<ol>
	<li>Użyj szkła zegarmistrza, wklęsłego szkiełka lub probówki mikrowirówkowej do inkubacji wypreparowanych lub niewypreparowanych próbek w 1% roztworze SDS i 0,2 N NaOH przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Z urządzeniem należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ próbka jest bardzo miękka i ma przezroczysty wygląd. Spłucz kilkakrotnie wodą. 
	UWAGA: Resztki roztworu SDS mogą prowadzić do wytrącania się podczas dodawania roztworu barwiącego, np. błękitu anilinowego.</li>
	<li>W przypadku próbek niepoddanych preparacji należy postępować zgodnie z procedurą preparacji opisaną w sekcji 2, używając wody zamiast 70% etanolu. Po wycięciu pożądanej tkanki usuń wszelkie resztki i zanieczyszczenia oraz nadmiar wody bibułą, a następnie dodaj 20–40 μl roztworu barwiącego i przejdź do kroku 6.5.</li>
	<li>W przypadku próbek wypreparowanych ostrożnie wyjmij próbkę z roztworu myjącego i umieść ją na czystym szkiełku, a następnie dodaj 20–40 μl roztworu barwiącego.</li>
	<li>Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku, opuszczając je na boki. Uważaj, aby nie zgnieść preparatu. Jeśli tkanka jest zbyt miękka, umieść cienki separator między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym w jego rogach (np. taśma lub złamane szkiełko nakrywkowe), pozostawiając przestrzeń przypominającą komorę między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym, tak aby szkiełko nakrywkowe nie zgniatało próbki.</li>
	<li>Umieścić wszystkie szkiełka w wilgotnym pudełku, przykryć je folią aluminiową i umieścić w temperaturze 4 °C na co najmniej 1 godzinę. W ciągu 24 godzin należy przystąpić do obserwacji preparatu za pomocą fluorescencji szerokokątnej lub mikroskopii konfokalnej</li>.
</ol>

<ol><li>Crane, P. R., Friis, E. M., Pedersen, K. R. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/374027a0">The origin and early diversification of angiosperms.</a> Nature. 374 (6517), 27-33 (1995).</li>
<li>Friedman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meaning+of+Darwin%27s+%27abominable+mystery%27%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">The meaning of Darwin's 'abominable mystery'.</a> Am J Bot. 96 (1), 5-21 (2009).</li>
<li>Sun, G., Dilcher, D. L., Zheng, S., Zhou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+the+first+flower%3A+A+Jurassic+angiosperm%2C+Archaefructus%2C+from+Northeast+China%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In search of the first flower: A Jurassic angiosperm, Archaefructus, from Northeast China.</a> Science. 282 (5394), 1692-1695 (1998).</li>
<li>Mulcahy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+of+the+angiosperms%3A+a+genecological+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The rise of the angiosperms: a genecological factor.</a> Science. 206 (4414), 20-23 (1979).</li>
<li>Friedman, W. E., Moore, R. C., Purugganan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">The evolution of plant development.</a> Am J Bot. 91 (10), 1726-1741 (2004).</li>
<li>Endress, P. K. Angiosperm floral evolution: morphological developmental framework. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0065229606440015">Advances in botanical research Volume 44: Developmental genetics of the flower</a>. Soltis, D., Soltis, P., Leebens-Mack, J. , Academic Press. 1-61 (2006).</li>
<li>Alvarez-Buylla, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flower+development%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Flower development.</a> Arabidopsis Book. 8, 30127(2010).</li>
<li>Beddington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+security%3A+contributions+from+science+to+a+new+and+greener+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Food security: contributions from science to a new and greener revolution.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 365 (1537), 61-71 (2010).</li>
<li>Godfray, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+security%3A+The+challenge+of+feeding+9+billion+people%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Food security: The challenge of feeding 9 billion people.</a> Science. 327 (5967), 812-818 (2010).</li>
<li>Burkle, L. A., Alarcón, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+plant-pollinator+diversity%3A+understanding+interaction+networks+across+time%2C+space%2C+and+global+change%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">The future of plant-pollinator diversity: understanding interaction networks across time, space, and global change.</a> Am J Bot. 98 (3), 528-538 (2011).</li>
<li>Meyerowitz, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+and+molecular+model+for+flower+development+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Suppl%22%5BJournal%5D)">A genetic and molecular model for flower development in Arabidopsis thaliana.</a> Dev Suppl. 1, 157-167 (1991).</li>
<li>Hafidh, S., Fíla, J., Honys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+gametophyte+development+and+function+in+angiosperms%3A+a+general+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Reprod%22%5BJournal%5D)">Male gametophyte development and function in angiosperms: a general concept.</a> Plant Reprod. 29 (1-2), 31-51 (2016).</li>
<li>Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+germline+formation%3A+common+concepts+and+developmental+flexibility+in+sexual+and+asexual+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Plant germline formation: common concepts and developmental flexibility in sexual and asexual reproduction.</a> Development. 142 (2), 229-241 (2015).</li>
<li>Sprunck, S., Dresselhaus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+cell+fusions+during+double+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Three cell fusions during double fertilization.</a> Cell. 161 (4), 708-709 (2015).</li>
<li>Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+mechanisms+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Fertilization mechanisms in flowering plants.</a> Curr Biol. 26 (3), R125-R139 (2016).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+flower+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).</li>
<li>Roeder, A. H., Yanofsky, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Fruit development in Arabidopsis.</a> Arabidopsis Book. 4, e0075(2006).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%2C+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale, a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li>
<li>Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB.+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB. a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nmeth.2481">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
<li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACT-PRESTO%3A+rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+%283D%29+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">ACT-PRESTO: rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Sci Rep. 6, 18631(2016).</li>
<li>Endress, P. K. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2995533">Evolution and floral diversity: the phylogenetic surroundings of Arabidopsis and Antirrhinum.</a> Int J Plant Sci. 153 (3, Part 2), S106-S122 (1992).</li>
<li>Reyes-Olalde, J. I., Zuñiga-Mayo, V. M., Chávez Montes, R. A., Marsch-Martínez, N., de Folter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside+the+gynoecium%3A+at+the+carpel+margin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Inside the gynoecium: at the carpel margin.</a> Trends Plant Sci. 18 (11), 644-655 (2013).</li>
<li>Hill, J. P., Lord, E. M. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/b89-375#.WhXEGbQ-dZ0">Floral development in Arabidopsis thaliana: a comparison of the wild type and the homeotic pistillata mutant.</a> Can J Bot. 67 (10), 2922-2936 (1989).</li>
<li>Sessions, R. A., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7789281">Arabidopsis gynoecium structure in the wild type and in ettin mutants.</a> Development. 121 (5), 1519-1532 (1995).</li>
<li>Schneitz, K., Hülskamp, M., Pruitt, R. E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-313X.1995.07050731.x/abstract">Wild-type ovule development in Arabidopsis thaliana: a light microscope study of cleared whole-mount tissue.</a> Plant J. 7 (5), 731-749 (1995).</li>
<li>Sundberg, E., Ferrándiz, C. Gynoecium patterning in Arabidopsis: a basic plan behind a complex structure. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books?hl=en&lr=&id=pzu4SVKg1PcC&oi=fnd&pg=PA35&dq=Sundberg,+E+%22Annual+Plant+Reviews%22&ots=G8KcTeYQ7v&sig=KxClSALK76vqi5_xDvnDOlhXfg4#v=onepage&q=Sundberg%2C%20E%20%22Annual%20Plant%20Reviews%22&f=false">Annual Plant Reviews Volume 38: Fruit Development and Seed Dispersal</a>. Østergaard, L. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 35-69 (2009).</li>
<li>Meinke, D. W. <a target="_blank" href="http://cshmonographs.org/index.php/monographs/article/view/3103">10 seed development in Arabidopsis thaliana.</a> Cold Spring Harbor Monograph Archive. 27, 253-295 (1994).</li>
<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeigel%2C+D+%22Arabidopsis%3A+a+laboratory+manual%22">Arabidopsis: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring Harbour, N.Y. (2002).</li>
<li>Herr, J. M. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2441475">A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms.</a> Am J Bot. 58 (8), 785-790 (1971).</li>
<li>Alexander, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+stain+for+pollen+fungi%2C+yeast+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technol%22%5BJournal%5D)">A versatile stain for pollen fungi, yeast and bacteria.</a> Stain Technol. 55 (1), 13-18 (1980).</li>
<li>Herr, J. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.jstor.org/stable/24334877">Applications of a new clearing technique for the investigation of vascular plant morphology.</a> J Elisha Mitchell Sci Soc Chapel Hill N C. 88 (3), 137-143 (1972).</li>
<li>Herr, J. M. Clearing techniques for the study of vascular plant tissues in whole structures and thick sections. <a target="_blank" href="http://www.ableweb.org/volumes/vol-5/5-herr.pdf">Tested studies for laboratory teaching. Proceedings of the Fifth Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE)</a>. Goldman, C. A., Hauta, P. L., O'Donnell, M. A., Andrews, S. E., van der Heiden, R. 5, Toronto, Ontario, Canada. 63-84 (1993).</li>
<li>Colcombet, J., Boisson-Dernier, A., Ros-Palau, R., Vera, C. E., Schroeder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+somatic+embryogenesis+receptor+kinases1+and+2+are+essential+for+tapetum+development+and+microspore+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis somatic embryogenesis receptor kinases1 and 2 are essential for tapetum development and microspore maturation.</a> Plant Cell. 17 (12), 3350-3361 (2005).</li>
<li>Heslop-Harrison, J., Heslop-Harrison, Y., Shivanna, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evaluation+of+pollen+quality+and+a+further+appraisal+of+the+fluorochromatic+%28FCR%29+test+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Theor+Appl+Genet%22%5BJournal%5D)">The evaluation of pollen quality and a further appraisal of the fluorochromatic (FCR) test procedure.</a> Theor Appl Genet. 67 (4), 367-379 (1984).</li>
<li>Stone, J. L., Thomson, J. D., Dent-Acosta, S. J. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2446073">Assessment of pollen viability in handpollination experiments: A review.</a> Amer J Bot. 82 (9), 1186-1197 (1995).</li>
<li>Dafni, A., Firmage, D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00984098">Pollen viability and longevity: practical, ecological and evolutionary implications.</a> Plant Syst Evol. 222 (1-4), 113-132 (2000).</li>
<li>Lora, J., Testillano, P. S., Risueño, M. C., Hormaza, J. I., Herrero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollen+development+in+Annona+cherimola+Mill.+%28Annonaceae%29.+Implications+for+the+evolution+of+aggregated+pollen%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Pollen development in Annona cherimola Mill. (Annonaceae). Implications for the evolution of aggregated pollen.</a> BMC Plant Biol. 9, 129(2009).</li>
<li>Ross, K. J., Fransz, P., Jones, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light+microscopic+atlas+of+meiosis+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">A light microscopic atlas of meiosis in Arabidopsis thaliana.</a> Chromosome Res. 4 (7), 507-516 (1996).</li>
<li>Park, S. K., Howden, R., Twell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+thaliana+gametophytic+mutation+gemini+pollen1+disrupts+microspore+polarity%2C+division+asymmetry+and+pollen+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis thaliana gametophytic mutation gemini pollen1 disrupts microspore polarity, division asymmetry and pollen cell fate.</a> Development. 125 (19), 3789-3799 (1998).</li>
<li>Haseloff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old+botanical+techniques+for+new+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Old botanical techniques for new microscopes.</a> BioTechniques. 34 (6), 1174-1182 (2003).</li>
<li>Truernit, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+whole-mount+imaging+of+three-dimensional+tissue+organization+and+gene+expression+enables+the+study+of+phloem+development+and+structure+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).</li>
<li>Hedhly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starch+turnover+and+metabolism+during+flower+and+early+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development.</a> Plant Physiol. 172 (4), 2388-2402 (2016).</li>
<li>Crane, C. F., Carman, J. G. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2443827?seq=1#page_scan_tab_contents">Mechanisms of apomixis in Elymus rectisetus from eastern Australia and New Zealand.</a> Am J Bot. 74 (4), 477-496 (1987).</li>
<li>Young, B. A., Sherwood, R. T., Bashaw, E. C. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/b79-204">Cleared-pistil and thick-sectioning techniques for detecting aposporous apomixis in grasses.</a> Can J Bot. 57 (15), 1668-1672 (1979).</li>
<li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearSee%3A+a+rapid+optical+clearing+reagent+for+whole-plant+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging.</a> Development. 142, 4168-4179 (2015).</li>
<li>Warner, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+clearing+technique+for+plant+tissues+allowing+deep+imaging+and+compatible+with+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Phys%22%5BJournal%5D)">An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with Fluorescence Microscopy.</a> Plant Phys. 166, 1684-1687 (2014).</li>
<li>Hasegawa, J., Sakamoto, Y., Nakagami, S., Aida, M., Sawa, S., Matsunaga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+plant+organs+using+a+simple+and+rapid+transparency+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique.</a> Plant Cell Physiol. 57 (3), 462-472 (2016).</li>
<li>Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Versatile+Optical+Clearing+Protocol+for+Deep+Tissue+Imaging+of+Fluorescent+Proteins+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Versatile Optical Clearing Protocol for Deep Tissue Imaging of Fluorescent Proteins in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS ONE. 11 (8), e0161107(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnienie wielu pąków kwiatowych w jednym kwiatostanie rzodkiewnika, obejmujących wszystkie etapy rozwoju kwiatów, stwarza wyjątkową okazję do badań mających na celu scharakteryzowanie efektu zabiegu lub cechy rozwojowej jednocześnie na różnych etapach rozwoju kwiatów. Dobrym punktem odniesienia między różnymi pojedynczymi roślinami jest otwarcie pierwszego kwiatu głównego kwiatostanu. Rośliny traktuje się w taki sposób, aby kwitnienie było w jak największym stopniu zsynchronizowane (np. 3–4-dniowa stra...

Kwiaty są jednymi z najważniejszych organów definiujących rośliny okrytozalążkowe. Rośliny kwitnące pojawiły się około 90-130 milionów lat temu1, i zróżnicowały się tak szybko, że ich gwałtowne pojawienie się zostało opisane jako "obrzydliwa tajemnica" przez Karola Darwina2. Zainteresowania badaczy roślin w zakresie rozwoju kwiatów są różnorodne. Niektóre badania koncentrowały się na zrozumieniu ewolucyjnego pochodzenia kwiatu jako całości lub ewolucji określonych właściwości anatomicznych, strukturalnych i funkcjonalnych kwiatów3,4,5,6. Duża zmienność formy i struktury kwiatów, a także zależne od nich sposoby rozmnażania płciowego i bezpłciowego sprawiają, że kwiat ma bardzo złożoną strukturę. Doprowadziło to do różnorodnych wysiłków mających na celu scharakteryzowanie anatomii i cech strukturalnych organów kwiatowych przy użyciu technik mikroskopii świetlnej i elektronowej, które można połączyć z badaniami genetycznymi i molekularnymi7. Ponadto, jako źródło owoców i nasion, kwiaty mają ogromne znaczenie w żywieniu ludzi i zwierząt. W związku z tym charakterystyka rozwoju kwiatów i owoców ma wiele implikacji dla badań stosowanych, w tym dla bezpieczeństwa żywnościowego dla stale rosnącej populacji ludzkiej i strategii ochrony środowiska w zmieniającym się środowisku8,9,10.
Rozwój kwiatów u Arabidopsis rozpoczyna się od indukcji kwitnienia i przekształcenia merystemu wegetatywnego w merystem kwiatostanu (grupy kwiatów). Zawiązki kwiatowe są inicjowane bocznie na boku kwiatostanu meristem11. Zawiązki narządów kwiatowych tworzą się stopniowo w koncentrycznych okółkach od zewnątrz do środka kwiatu i ostatecznie przekształcają się w działki, płatki, pręciki i słupki7. Te narządy kwiatowe spełniają różne role odżywcze, ochronne i funkcjonalne (np. przyciąganie zapylaczy) u różnych gatunków roślin, przy czym narządy płciowe podtrzymują rozwój gametofitów męskich i żeńskich, odpowiednio12,13. Z kolei gametofity różnicują parę gamet męskich (plemniki) i żeńskich (komórka jajowa i komórka centralna), które łączą się po podwójnym zapłodnieniu, tworząc następne pokolenie, zygotę i pierwotne bielmo, końcową tkankę wspierającą rozwój zarodka14,15. Rozwój owoców i nasion wspomaga wzrost, dojrzewanie i zachowanie zarodka, a ostatecznie jego rozproszenie. Przeprowadzono szeroko zakrojone badania w celu scharakteryzowania rozwoju kwiatów i zarodków u różnych gatunków roślin, zwłaszcza u gatunku modelowego Arabidopsis7,16,17.
Wczesne analizy mikroskopowe rozwoju kwiatów opierały się na czasochłonnym przetwarzaniu próbek i technikach obserwacji, takich jak osadzanie i cięcie parafiny lub żywicy, w połączeniu z mikroskopią świetlną lub elektronową. Te tradycyjne techniki mikroskopowe były często stosowane w połączeniu z molekularnymi badaniami genetycznymi, takimi jak analizy mikroskopowe mutantów, lokalizacja RNA przez hybrydyzację in situ lub immunodetekcja białek. Niedawny postęp w szerokokątnej i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej, w najnowocześniejszych komputerowych analizach obrazów 3D oraz ciągłe udoskonalanie metod molekularnych, które można stosować na minimalnie przetworzonych próbkach w całości, doprowadziły do zapotrzebowania na wydajne i minimalne techniki przetwarzania próbek, które są preferencyjnie podatne na analizy ilościowe. W ostatnich latach poczyniono znaczne postępy w opracowywaniu technik oczyszczania całych okazów zwierząt. Nadają one próbce przezroczystość za pomocą wodnych odczynników na bazie mocznika lub cukru (np. SCALE, SeeDB, CUBIC)18,19,20, albo selektywnie usuwając lipidy (przy użyciu detergentu SDS) po zanurzeniu próbek w stabilnych hydrożelach; usuwanie lipidów można osiągnąć albo przez dyfuzję bierną (np. zmodyfikowany protokół CLARITY21, PACT-PARS-RIMS22) lub aktywnie przez elektroforezę (oryginalny protokół CLARITY23 i ACT-PRESTO24). Zachęceni tym szybkim postępem, pojawiają się również pewne techniki pochodne do stosowania u roślin.
W tym artykule poświęconym modelowi Arabidopsis, opisujemy procedurę prawidłowego rozcinania pąków kwiatowych, kwiatów i młodych krzemionek oraz oczyszczania całych próbek do różnych procedur barwienia i obserwacji przy użyciu klasycznej lub najnowszej metody oczyszczania opartej na SDS. Podano przykłady barwienia skrobią, modzelą i chromatyną. Chociaż procedury te mogą wymagać dalszych ulepszeń i adaptacji, gdy są stosowane w odniesieniu do innych gatunków, mamy nadzieję, że przygotują one grunt pod dalsze badania nad tymi prostymi, ale krytycznymi metodami, które są punktem wyjścia wielu projektów badawczych.

<table><tbody><tr><td> Odczynniki i materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Scharlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Applichem</td><td>A3686,2500</td><td>100% klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Biologia molekularna Metanol</td></tr><tr><td></td><td>Scharlau</td><td>ME03062500</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Kwas propionowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81910-250 ml</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat chloralu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15307</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Guma arabska</td><td>Fluka</td><td>51198</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mlekowy</td><td>Fluka</td><td>69773</td><td></td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77607-250ML</td><td>Użyliśmy płynnego fenolu (użyj gęstości, aby znaleźć wymaganą objętość dla swojego roztworu)</td></tr> <tr><td>Olejek goździkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8392-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Roth</td><td>4436.1</td><td></td></tr><tr><td>Jod</td><td>Fluka</td><td>57665</td><td></td></tr><tr><td>Jodek potasu</td><td>Merck</td><td>5043</td><td></td></tr><tr><td>Zieleń malachitowa</td><td>Fluka</td><td>63160</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fuksynowy</td><td>Fluka</td><td>84600</td><td></td></tr><tr><td>Pomarańczowy G</td><td>Sigma</td><td>7252</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>Biologia molekularna</td></tr><tr><td>Klasa Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodorofosforan sodu</td><td>Applichem</td><td>A1047,1000</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04347</td><td></td></tr><tr><td>Aplikacja EDTA</td><td></td><td>A2937,1000</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor</td><td>Sigma</td><td>F6259</td><td>Rozjaśniacz fluorescencyjny 28</td></tr><tr><td>Auramina</td><td>Chroma</td><td>10120</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>toksyczny</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Błękit anilinowy</td><td>Merck</td><td>1275</td><td></td></tr><tr><td>MS medium</td><td>Carolina</td><td>19-57030</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże bogate w składniki odżywcze</td><td>Einheitserde</td><td>ED73</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko</td><td></td><td></td> zegarmistrzowskie <td>Brak konkretnej marki</td></tr><tr><td>15 ml probówki wirówkowe Falcon</td><td>VWR</td><td>62406-200</td><td></td></tr><tr><td>Dumond Kleszcze</td><td>Actimed</td><td>0208-5SPSF-PS</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>DUMONT BIOLOGY</td><td>0108-5</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>BD</td><td>BD Plastipak 300013</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Igła do preparatu</td><td>BD</td><td>Microlance 304000</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143562CE</td><td>krawędzie cięte</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>DV40008</td><td></td></tr><tr><td>Wilgotne pudełko</td><td></td><td></td><td>Plastikowe pudełko z wilgotnym ręcznikiem papierowym i ślizgowymi wspornikami wewnątrz</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fixatives</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Utrwalacz <td></td><td></td><td>Carnoy's (Farmer's)</td><td>Absolutny etanol: lodowaty kwas octowy, 3:1 (ml:ml)</td></tr><tr><td>Metanol/kwas octowy utrwalacz</td><td></td><td></td><td>50 % (v/v) metanol, 10 % (v/v) lodowaty kwas octowy w wodzie dejonizowanej</td></tr><tr><td>FPA50 utrwalacz</td><td></td><td></td><td>Formalina, kwas propionowy, 50% etanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)</td></tr><tr><td><silny>Roztwory czyszczące</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrat chloralu/glicerol</td><td></td><td></td><td>Hydrat chloralu : glicerol : woda, 8:1:2 (g:ml:ml). Może być stosowany na wszystkich etapach rozwoju kwiatów oraz do rozwoju krzemionki za pomocą mikroskopii DIC. Najlepszym utrwalaczem jest modyfikowana</td></tr><tr>guma<td>Hoyer</td><td></td><td></td><td>arabek na bazie formaliny FPA50 7,5 g, hydrat chloralu 100 g, glicerol 5 ml, woda 30 ml. Może być stosowany na wszystkich etapach rozwoju kwiatów oraz do rozwoju krzemionki za pomocą mikroskopii DIC. Najlepszym utrwalaczem jest FPA50 na bazie formaliny</td></tr><tr><td>Herr's 4&frac12; płyn</td><td></td><td></td> oczyszczający <td>Kwas mlekowy, hydrat chloralu, kryształy fenolu, olejek goździkowy, ksylen; 2:2:2:2:1, wagowo. Może być stosowany na wszystkich etapach rozwoju kwiatów (szczególnie do rozwoju pręcików) oraz do rozwoju krzemionki za pomocą mikroskopii DIC. Najlepszym utrwalaczem jest</td></tr> roztwór <tr><td></td><td></td> FPA50<td>SDS/NaOH</td> na bazie formaliny <td>Rozcieńczyć SDS i roztwór podstawowy NaOH do 1% SDS / 0,2 N NaOH (10x rozcieńczenie). Na wszystkie etapy rozwoju kwiatów i krzemionek. Najlepszym utrwalaczem jest utrwalacz metano/kwas octowy; Można również użyć pozostałych dwóch utrwalaczy. Może być łączony z kalkofluorem, auraminą, DAPI i roztworem do barwienia błękitem anilinowym.</td></tr><tr><td>SDS, roztwór</td><td></td><td></td> podstawowy <td>10 % (w/v) dodecylosiarczan sodu. Rozpuścić 10 g dodecylosiarczanu sodu w 80 ml wody dejonizowanej i uzupełnić do 100 ml wodą dejonizowaną.</td></tr><tr>Roztwór <td></td><td></td><td>podstawowy NaOH</td><td>2 N roztwór NaOH: rozpuścić 4 g NaOH w 40 ml wody dejonizowanej i uzupełnić do 100 ml wodą dejonizowaną</td></tr> <tr><td>Połączone roztwory czyszczące i barwiące</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Herr's IKI-4&frac12;</td><td></td><td></td><td>Do standardu 4&frac12; (łącznie 9 g) dodaj: 100 mg jodu, 500 mg jodku potasu. To rozwiązanie oczyszczające może być stosowane na wszystkich etapach rozwoju kwiatów oraz do rozwoju krzemionki, zarówno w celu zwiększenia kontrastu, jak i scharakteryzowania dynamiki skrobi. Użyj FPA50 do analizy strukturalnej i utrwalacza Carnoya do ilościowej analizy skrobi.</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy barwienia Alexandra</td> 95% 10ml, zieleń malachitowa <td></td><td></td><td>(1% w 95% EtOH) 1 ml, kwas fuksynowy (1% w ddH2O) 5ml, pomarańczowy G (1% w ddH2O) 0,5ml, fenol 5g, hydrat chloralu 5g, lodowaty kwas octowy 2ml, glicerol 25ml . To oczyszczanie/barwienie samodzielnie lub w połączeniu z Herr's 4&frac12; Roztwór może być stosowany do oceny poronienia pyłku w kwiatach z dojrzałymi i trójkomórkowymi ziarnami pyłku. Stosuje się go na świeżo zmielonym materiale nieutrwalonym.</td></tr><tr><td>Roztwory barwiące</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor roztwór</td><td></td><td></td><td>Calcofluor 0,007% w wodzie (g:ml). Pierwotnie używany jako rozjaśniacz optyczny. Może być stosowany do barwienia celulozy, karboksylowanych polisacharydów i kalozy w ścianach komórkowych. Często używany do barwienia wnętrza ziarna pyłku. Z tym roztworem można stosować wszystkie trzy utrwalacze.</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td><td>Auraminy Auramina 0,01% w wodzie (g:ml). Ten lipofilowy barwnik fluorescencyjny może być stosowany między innymi do barwienia skórek, cutyny i egzyny. Wszystkie trzy utrwalacze mogą być używane z tym roztworem Mieszanina</td></tr><tr><td></td><td></td><td>kalkofluoru i auryny</td><td>Roztwór auryny : roztwór Calcofluor, 3:1. Może być stosowany do łączonego barwienia za pomocą obu roztworów. Inne proporcje można określić przy zachowaniu mniejszej proporcji kalkofluoru w stosunku do auraminy.</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td><td>DAPI DAPI 0,4 ug/ml, 0,1 M bufor fosforanu sodu (pH 7), 0,1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. Roztwór ten może być stosowany do barwienia rozprzestrzeniania się chromosomów podczas mejozy męskiej i żeńskiej oraz jąder komórkowych dowolnej tkanki. Często używany do badania rozwoju ziarna pyłku. Carnoy's i metanol/kwas octowy są najlepszymi utrwalaczami dla tego roztworu. Utrwalacze na bazie formaldehydu, takie jak FPA50, mogą zakłócać barwienie. Wzbudzenie w promieniowaniu UV i maksymalna emisja około 461 nm.</td></tr><tr><td>Bufor fosforanu sodu (0,1 M)</td><td></td><td></td><td>Receptor protonowy: 0,2 M Na2HPO4, donor protonów: 0,2 M NaH2PO4, stosunek donora protonów / receptora protonowego: 1,364 (dla pH 7)</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> błękitu anilinowego <td>0,1% (w/v) błękit anilinowy, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glicerol. Roztwór ten może być stosowany do barwienia kalozy i celulozy w wielu stadiach rozwoju (np. osadzanie się kalozy u samców i samic teradów, czopy kalozy w łagiewkach pyłkowych). Wzbudzenie w promieniowaniu UV i maksymalna emisja około 455. Może być również wzbudzony przy długości fali 514 nm z emisją na czerwono w celu barwienia zawartości komórek.</td></tr></tbody></table>

całościowe oczyszczanie i barwienie organów kwiatowych arabidopsis i krzemianek

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Ze względu na swoje potężne narzędzia do molekularnych badań genetycznych, Arabidopsis thaliana jest jednym z najbardziej znanych gatunków modelowych w biologii roślin, a zwłaszcza w biologii rozrodu roślin. Jednak analizy morfologiczne, anatomiczne i ultrastrukturalne roślin tradycyjnie obejmują czasochłonne procedury osadzania i cięcia w przypadku jasnego pola, skanowania i mikroskopii elektronowej. Niedawny postęp w konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej, najnowocześniejsze komputerowe analizy mikroskopowe 3D oraz ciągłe doskonalenie technik molekularnych, które mają być stosowane na minimalnie przetworzonych próbkach montowanych w całości, doprowadziły do zwiększonego zapotrzebowania na opracowywanie wydajnych i minimalnych technik przetwarzania próbek. W tym protokole opisujemy techniki prawidłowego preparowania kwiatów i krzemionek Arabidopsis, podstawowe techniki oczyszczania oraz niektóre procedury barwienia do obserwacji struktur rozrodczych w całości.

Arabidopsis należy do rodziny kapustowatych (Brassicaceae), wytwarzając kwiatostany z obupłciowych kwiatów ułożonych w baldach (Rycina 1). Każdy kwiat posiada cztery działki kielicha, cztery płatki korony, sześć pręcików (cztery długie i dwa krótkie) oraz zrośnięty zalążek składający się z dwóch wrodzenie zrośniętych słupków (Rycina 1F-H) ułożonych w czterech koncentrycznych kręgach25</...

W tym protokole opisujemy techniki prawidłowego preparowania kwiatów i krzemionek Arabidopsis, niektóre podstawowe techniki oczyszczania oraz wybrane procedury barwienia dla obserwacji struktur rozrodczych na całej powierzchni.

Całościowe oczyszczanie i barwienie organów kwiatowych Arabidopsis i krzemianek

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Protokół ten opisuje, jak prawidłowo rozciąć pąki kwiatowe, kwiaty i młode krzemionki. A następnie całościowe oczyszczanie dla różnych technik barwienia i obserwacji. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie seksualnej produkcji roślin.Takich jak analiza stale mutantów lub jakakolwiek środowiskowo i eksperymentalnie wywołana awaria w rozwoju i funkcjonowaniu kwiatów. Główną zaletą tej techniki jest umożliwienie łatwego i szybkiego badania przesiewowego wielu etapów rozwojowych jednocześnie. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy sekcji narządów kwiatowych są trudne do nauczenia, ponieważ wymagają wcześniejszej znajomości anatomii kwiatów i umiejętności preparowania.Na początek użyj małych nożyczek, aby usunąć kwiaty z zsynchronizowanych roślin. I natychmiast umieść je w pojedynczych probówkach do mikrowirówek, zawierających odpowiedni utrwalacz. Następnie usuń utrwalacz i dodaj tyle 70% etanolu, aby całkowicie pokryć próbki.Przywrócić próbki do temperatury czterech stopni Celsjusza na co najmniej 24 godziny. Następnie napełnij szklankę zegarmistrza świeżo przygotowanym 70% etanolem i umieść ją na małej szalce Petriego, aby uzyskać wsparcie. Następnie umieść kwiatostan w szkle zegarmistrza i upewnij się, że jest całkowicie pokryty etanolem.Za pomocą kleszczy i strzykawki wyposażonej w igłę rozetnij kwiat pod mikroskopem stereoskopowym, rozrywając działki, płatki i pręcik. Następnie odłóż szkiełko zegarmistrza na bok i użyj szklanego szkiełka do ostatecznego rozbioru. Przenieś próbkę na szkiełko i dodaj 10 mikrolitrów świeżo przygotowanego 70% etanolu.Wykonuj nacięcia po każdej stronie nadgarstka, obracając go w razie potrzeby. Następnie delikatnie wyjmij zastawki, aby odsłonić zalążki. Wykonaj ostre małe nacięcie, aby oderwać połowę tkanki przenoszącej od pojemnika i użyj kleszczy i igły, aby rozerwać dwie połowy.Usuń styl piętna i szypułkę za pomocą ostrych nacięć. Za pomocą kleszczy i igły delikatnie odwróć i ułóż wciąż przyczepione zalążki, aby uzyskać dwa równoległe rzędy. Użyj małego kawałka bibuły, aby usunąć etanol z próbki na szkiełku podstawowym.Następnie dodaj 20 mikrolitrów roztworu klarującego do szkiełka. Za pomocą pary strzykawek z igłami podskórnymi ustawić próbki i usunąć wszelkie pozostałe pęcherzyki powietrza. Następnie delikatnie umieścić szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym i poczekać, aż roztwór czyszczący wypełni przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a próbką.Umieść suwak w uchwycie na suwak i pozostaw go pod wyciągiem. Postawmy więc na świeżo zebrane pąki kwiatowe, które mają się otworzyć z nierozwarstwiającymi się pylnikami. Następnie przygotuj 96-dołkową płytkę z wystarczającą ilością roztworu Alexandra, aby całkowicie zanurzyć pąki kwiatowe.Usuń działki i płatki, aby odsłonić pylniki i zanurz je w roztworze Alexandra. Pozostaw płytę pod wyciągiem na jedną do trzech godzin. Następnie zastąp roztwór Alexandra roztworem Herra na cztery i pół roztworu i inkubuj płytkę pod wyciągiem przez noc.Następnego dnia użyj kleszczy, aby ostrożnie przenieść oczyszczone pąki na nowy szkiełko. Następnie wypreparuj pręciki i usuń wszystkie inne tkanki z próbek. Następnie przystąp do oczyszczania na bazie wodzianu chloralu i połączonego barwienia oczyszczającego przy użyciu czterech i pół roztworu Herra.Najpierw przenieś kwiat ze szkła zegarmistrza na szkiełko i za pomocą bibuły usuń nadmiar etanolu. Dodaj pięć do 10 mikrolitrów roztworu DAPI. Za pomocą dwóch strzykawek z igłami podskórnymi wyciąć pręciki i usunąć wszystkie inne organy kwiatowe.Następnie uwolnij ziarna pyłku do roztworu DAPI. Usuń wszystkie zanieczyszczenia z pręcika ze szkiełka, upewniając się, że na szkiełku pozostały tylko ziarna pyłku. Usunięcie wszystkich resztek pręcika ze szkiełka jest najważniejszym krokiem do usunięcia egzyny.Między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym należy pozostawić tylko ziarna pyłku. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku z łożyskiem próbki i dodaj minimalną ilość roztworu DAPI potrzebną do wypełnienia przestrzeni między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym. Delikatnie połóż palec wskazujący na szkiełku nakrywkowym i wykonaj szybki, krótki ruch ślizgowy.Umieść szkiełko w pudełku dla ludzi w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza na co najmniej 15 minut. Następnie w ciągu 24 godzin obserwuj szkiełko pod mikroskopią florescencyjną lub konfokalną. Przenieś wypreparowaną próbkę ze szkła zegarmistrza na szklaną płytkę z wgłębieniami wypełnionymi 1% SDS i 0,2 roztworem wodorotlenku sodu.Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej. Roztwór wodorotlenku sodu SDS szybko usunie próbki, sprawiając, że w ciągu kilku minut staną się przezroczyste. Ostrożnie spłukać próbkę wodą i umieścić ją na czystym szkiełku.Następnie dodaj 20 do 40 mikrolitrów roztworu barwiącego do szkiełka. W zależności od analizowanego narządu kwiatowego i umiejętności badacza, ten zabieg DS może być przeprowadzony przed, w przypadku doświadczonych badaczy lub po etapie sekcji w przypadku mniej doświadczonych badaczy. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku, uważając, aby nie zgnieść preparatu.Następnie umieść wszystkie przygotowane szkiełka w ludzkim pudełku pokrytym folią aluminiową i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę. Na koniec obserwuj próbkę pod mikroskopią florescencyjną szerokopolową lub konfokalną. Po zabiegu preparacji, opisanym w protokole, usuwane są zbędne tkanki, które mogłyby utrudniać obserwacje, a uzyskuje się bardziej szczegółowe obrazy.W zależności od celu, barwienie wodzianem chloralu może być stosowane do scharakteryzowania wczesnego rozwoju kwiatów na poziomie całego pąka kwiatowego, mejozy i genezy mikrogomedalu w pylniku, wczesnego rozwoju zalążka i specyfikacji komórki macierzystej megaspory, rozwoju żeńskiej go-med-ify, a nawet inwazji łagiewki pyłkowej na siatkę środkową. Połączone barwienie Alexandra i czteroipółkrotne oczyszczanie Herra umożliwia ocenę poronienia pyłku w obrębie danego lokuli lub pylnika jako całości. Podczas gdy żywotne ziarna pyłku wykazują czerwoną cytoplazmę, abortowane wykazują pustą cytoplazmę i ostatecznie mają nieregularny kształt i są całkowicie zmiażdżone.Usunięcie egzyny powoduje zwiększenie intensywności barwienia jąder i wyższe szczegóły organizacji chromatyny. Użycie i usunięcie wodorotlenku sodu SDS przed barwieniem sprawiło, że kwiatostan stał się przezroczysty. Spowodowało to większe zabarwienie kalozy w tkankach kwiatowych.Ujawniło to zwykle trudne do dostrzeżenia nagromadzenie kalozy. Takich jak warstwa kalozy, która oddziela komórkę generatywną od komórki wegetatywnej. Nawet wtedy, gdy ziarna pyłku były nadal zawarte w pylniku.Po opanowaniu techniki te można wykonać w mniej niż 48 godzin, jeśli są wykonywane prawidłowo. Podejmując tę procedurę, należy pamiętać, że wyniki w dużej mierze zależą od dobrego przygotowania próbki, takiego jak użycie odpowiedniego utrwalacza, prawidłowe wykonanie sekcji i wyizolowanie interesującej tkanki na szkiełku.

whole-mount-clearing-staining-arabidopsis-flower-organs

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Skład ściany komórkowej rośliny różni się w zależności od typu tkanki i może zawierać ligninę, celulozę, hemicelulozy i pektyny. Opracowano różne techniki barwienia w celu wizualizacji różnic na poziomie typu komórki. Niniejszy artykuł jest kompilacją powszechnie stosowanych technik barwienia ścian komórkowych.

Barwienie histochemiczne drugorzędowych elementów ściany komórkowej Arabidopsis thaliana

Zapewniamy tutaj skuteczny i niezawodny protokół barwienia immunologicznego, fluorescencji hybrydyzacji in situ, barwienia DNA, a następnie ilościowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości w zalążkach Arabidopsis thaliana. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej.

Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis

Krystaliczna celuloza jest ważnym składnikiem ściany komórkowej roślin. Jednak jego kwantyfikacja w rozdzielczości komórkowej jest technicznie trudna.  W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie technologii światła spolaryzowanego i przekrojów korzeniowych w celu uzyskania informacji o składzie ściany komórkowej w rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Kwantyfikacja w wysokiej rozdzielczości akumulacji krystalicznej celulozy w korzeniach rzodkiewnika w celu monitorowania specyficznych tkankowo modyfikacji ściany komórkowej

Obrazowanie konfokalne na żywo dostarcza biologom potężnego narzędzia do badania rozwoju. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół obrazowania konfokalnego na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika.

Obrazowanie konfokalne na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika

Ten protokół przedstawia metodę obserwacji embriogenezy u Arabidopsis poprzez usuwanie zalążków, a następnie kontrolę tworzenia się wzorów zarodków pod mikroskopem.

Metoda charakteryzowania embriogenezy u Arabidopsis

Przedstawiamy prostą i wszechstronną metodę wykonywania fluorescencyjnego obrazowania na żywo liści Arabidopsis thaliana przez dłuższy okres czasu. Używamy transgenicznej rośliny Arabidopsis wykazującej ekspresję fluorescencyjnego genu reporterowego pod kontrolą promotora związanego z odpornością jako przykładu uzyskania czasoprzestrzennego zrozumienia odpowiedzi immunologicznych roślin.

Uniwersalna metoda montażu liści Arabidopsis do przyżyciowego obrazowania poklatkowego

Tutaj opisujemy wytwarzanie i zastosowanie zestawu transgenicznych linii Arabidopsis thaliana umożliwiających indukowalną, specyficzną tkankowo ekspresję w trzech głównych merystemach, merystemie wierzchołkowym pędu, merystemie wierzchołkowym korzenia i kambium.

Indukowalna, specyficzna dla typu komórki ekspresja u Arabidopsis thaliana poprzez transaktywację za pośrednictwem LhGR

Tutaj opisana jest metoda uczynienia tkanek roślinnych przezroczystymi przy jednoczesnym zachowaniu stabilności białek fluorescencyjnych. Technika ta ułatwia głębokie obrazowanie oczyszczonych tkanek roślinnych bez fizycznego cięcia.

Optyczne oczyszczanie tkanek roślinnych do obrazowania fluorescencyjnego

Obecny protokół opisuje zoptymalizowaną metodę obserwacji histologicznej galasów indukowanych przez Plasmodiophora brassicae. Skrawki wibratomu hipokotyli są oczyszczane przed obrazowaniem fluorescencyjnym w celu zbadania udziału czynników transkrypcyjnych i fitohormonów podczas progresji choroby. Protokół ten przezwycięża ograniczenia związane z zatapianiem żywicy, umożliwiając wizualizację białek fluorescencyjnych w plantach.

Połączenie mikroskopii oczyszczającej i fluorescencyjnej w celu wizualizacji zmian w ekspresji genów i reakcjach fizjologicznych na Plasmodiophora brassicae

Tutaj opisujemy ulepszenie metody semi-in vitro (SIV) do obserwacji naprowadzania i odbioru łagiewki pyłkowej u Arabidopsis thaliana, co zwiększa podatność zalążków. Wysokoprzepustowa metoda SIV cum septum może być połączona z liniami markerowymi gametofitów i genetycznie kodowanymi biosensorami w celu monitorowania dynamicznego procesu zapłodnienia.

Obrazowanie na żywo odbioru łagiewki pyłkowej rzodkiewnika i podwójnego zapłodnienia metodą semi-in vitro cum septum

Ulepszona metoda pomiaru profili nawodnienia pyłku u Arabidopsis thaliana jest opisana tutaj. Nowa metoda oferuje wyższą rozdzielczość, jest nieinwazyjna i wysoce odtwarzalna. Protokół stanowi nowe narzędzie do dokładniejszej analizy procesów regulujących wczesne etapy zapylania.

Jednoziarnisty test biologiczny uwodnienia pyłku in vivo o wysokiej rozdzielczości dla Arabidopsis thaliana

Poznaj techniki preparowania kwiatów i krzemianek Arabidopsis oraz całościowe oczyszczanie i barwienie struktur rozrodczych. Ta metoda umożliwia badanie rozwoju kwiatów i analizę mutacji.

Całościowe oczyszczanie i barwienie organów kwiatowych Arabidopsis i krzemianek

Przeglądaj więcej filmów