Całościowe oczyszczanie i barwienie organów kwiatowych Arabidopsis i krzemianek

W tym protokole opisujemy techniki prawidłowego preparowania kwiatów i krzemionek Arabidopsis, niektóre podstawowe techniki oczyszczania oraz wybrane procedury barwienia dla obserwacji struktur rozrodczych na całej powierzchni.

Protokół ten opisuje, jak prawidłowo rozciąć pąki kwiatowe, kwiaty i młode krzemionki. A następnie całościowe oczyszczanie dla różnych technik barwienia i obserwacji. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie seksualnej produkcji roślin.

Takich jak analiza stale mutantów lub jakakolwiek środowiskowo i eksperymentalnie wywołana awaria w rozwoju i funkcjonowaniu kwiatów. Główną zaletą tej techniki jest umożliwienie łatwego i szybkiego badania przesiewowego wielu etapów rozwojowych jednocześnie. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy sekcji narządów kwiatowych są trudne do nauczenia, ponieważ wymagają wcześniejszej znajomości anatomii kwiatów i umiejętności preparowania.

Na początek użyj małych nożyczek, aby usunąć kwiaty z zsynchronizowanych roślin. I natychmiast umieść je w pojedynczych probówkach do mikrowirówek, zawierających odpowiedni utrwalacz. Następnie usuń utrwalacz i dodaj tyle 70% etanolu, aby całkowicie pokryć próbki.

Przywrócić próbki do temperatury czterech stopni Celsjusza na co najmniej 24 godziny. Następnie napełnij szklankę zegarmistrza świeżo przygotowanym 70% etanolem i umieść ją na małej szalce Petriego, aby uzyskać wsparcie. Następnie umieść kwiatostan w szkle zegarmistrza i upewnij się, że jest całkowicie pokryty etanolem.

Za pomocą kleszczy i strzykawki wyposażonej w igłę rozetnij kwiat pod mikroskopem stereoskopowym, rozrywając działki, płatki i pręcik. Następnie odłóż szkiełko zegarmistrza na bok i użyj szklanego szkiełka do ostatecznego rozbioru. Przenieś próbkę na szkiełko i dodaj 10 mikrolitrów świeżo przygotowanego 70% etanolu.

Wykonuj nacięcia po każdej stronie nadgarstka, obracając go w razie potrzeby. Następnie delikatnie wyjmij zastawki, aby odsłonić zalążki. Wykonaj ostre małe nacięcie, aby oderwać połowę tkanki przenoszącej od pojemnika i użyj kleszczy i igły, aby rozerwać dwie połowy.

Usuń styl piętna i szypułkę za pomocą ostrych nacięć. Za pomocą kleszczy i igły delikatnie odwróć i ułóż wciąż przyczepione zalążki, aby uzyskać dwa równoległe rzędy. Użyj małego kawałka bibuły, aby usunąć etanol z próbki na szkiełku podstawowym.

Następnie dodaj 20 mikrolitrów roztworu klarującego do szkiełka. Za pomocą pary strzykawek z igłami podskórnymi ustawić próbki i usunąć wszelkie pozostałe pęcherzyki powietrza. Następnie delikatnie umieścić szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym i poczekać, aż roztwór czyszczący wypełni przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a próbką.

Umieść suwak w uchwycie na suwak i pozostaw go pod wyciągiem. Postawmy więc na świeżo zebrane pąki kwiatowe, które mają się otworzyć z nierozwarstwiającymi się pylnikami. Następnie przygotuj 96-dołkową płytkę z wystarczającą ilością roztworu Alexandra, aby całkowicie zanurzyć pąki kwiatowe.

Usuń działki i płatki, aby odsłonić pylniki i zanurz je w roztworze Alexandra. Pozostaw płytę pod wyciągiem na jedną do trzech godzin. Następnie zastąp roztwór Alexandra roztworem Herra na cztery i pół roztworu i inkubuj płytkę pod wyciągiem przez noc.

Następnego dnia użyj kleszczy, aby ostrożnie przenieść oczyszczone pąki na nowy szkiełko. Następnie wypreparuj pręciki i usuń wszystkie inne tkanki z próbek. Następnie przystąp do oczyszczania na bazie wodzianu chloralu i połączonego barwienia oczyszczającego przy użyciu czterech i pół roztworu Herra.

Najpierw przenieś kwiat ze szkła zegarmistrza na szkiełko i za pomocą bibuły usuń nadmiar etanolu. Dodaj pięć do 10 mikrolitrów roztworu DAPI. Za pomocą dwóch strzykawek z igłami podskórnymi wyciąć pręciki i usunąć wszystkie inne organy kwiatowe.

Następnie uwolnij ziarna pyłku do roztworu DAPI. Usuń wszystkie zanieczyszczenia z pręcika ze szkiełka, upewniając się, że na szkiełku pozostały tylko ziarna pyłku. Usunięcie wszystkich resztek pręcika ze szkiełka jest najważniejszym krokiem do usunięcia egzyny.

Między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym należy pozostawić tylko ziarna pyłku. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku z łożyskiem próbki i dodaj minimalną ilość roztworu DAPI potrzebną do wypełnienia przestrzeni między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym. Delikatnie połóż palec wskazujący na szkiełku nakrywkowym i wykonaj szybki, krótki ruch ślizgowy.

Umieść szkiełko w pudełku dla ludzi w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza na co najmniej 15 minut. Następnie w ciągu 24 godzin obserwuj szkiełko pod mikroskopią florescencyjną lub konfokalną. Przenieś wypreparowaną próbkę ze szkła zegarmistrza na szklaną płytkę z wgłębieniami wypełnionymi 1% SDS i 0,2 roztworem wodorotlenku sodu.

Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej. Roztwór wodorotlenku sodu SDS szybko usunie próbki, sprawiając, że w ciągu kilku minut staną się przezroczyste. Ostrożnie spłukać próbkę wodą i umieścić ją na czystym szkiełku.

Następnie dodaj 20 do 40 mikrolitrów roztworu barwiącego do szkiełka. W zależności od analizowanego narządu kwiatowego i umiejętności badacza, ten zabieg DS może być przeprowadzony przed, w przypadku doświadczonych badaczy lub po etapie sekcji w przypadku mniej doświadczonych badaczy. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku, uważając, aby nie zgnieść preparatu.

Następnie umieść wszystkie przygotowane szkiełka w ludzkim pudełku pokrytym folią aluminiową i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę. Na koniec obserwuj próbkę pod mikroskopią florescencyjną szerokopolową lub konfokalną. Po zabiegu preparacji, opisanym w protokole, usuwane są zbędne tkanki, które mogłyby utrudniać obserwacje, a uzyskuje się bardziej szczegółowe obrazy.

W zależności od celu, barwienie wodzianem chloralu może być stosowane do scharakteryzowania wczesnego rozwoju kwiatów na poziomie całego pąka kwiatowego, mejozy i genezy mikrogomedalu w pylniku, wczesnego rozwoju zalążka i specyfikacji komórki macierzystej megaspory, rozwoju żeńskiej go-med-ify, a nawet inwazji łagiewki pyłkowej na siatkę środkową. Połączone barwienie Alexandra i czteroipółkrotne oczyszczanie Herra umożliwia ocenę poronienia pyłku w obrębie danego lokuli lub pylnika jako całości. Podczas gdy żywotne ziarna pyłku wykazują czerwoną cytoplazmę, abortowane wykazują pustą cytoplazmę i ostatecznie mają nieregularny kształt i są całkowicie zmiażdżone.

Usunięcie egzyny powoduje zwiększenie intensywności barwienia jąder i wyższe szczegóły organizacji chromatyny. Użycie i usunięcie wodorotlenku sodu SDS przed barwieniem sprawiło, że kwiatostan stał się przezroczysty. Spowodowało to większe zabarwienie kalozy w tkankach kwiatowych.

Ujawniło to zwykle trudne do dostrzeżenia nagromadzenie kalozy. Takich jak warstwa kalozy, która oddziela komórkę generatywną od komórki wegetatywnej. Nawet wtedy, gdy ziarna pyłku były nadal zawarte w pylniku.

Po opanowaniu techniki te można wykonać w mniej niż 48 godzin, jeśli są wykonywane prawidłowo. Podejmując tę procedurę, należy pamiętać, że wyniki w dużej mierze zależą od dobrego przygotowania próbki, takiego jak użycie odpowiedniego utrwalacza, prawidłowe wykonanie sekcji i wyizolowanie interesującej tkanki na szkiełku.