Alternatywne metody in vitro do oznaczania integralności strukturalnej kapsydu wirusa

Ogólnym celem tych metod jest uzyskanie dalszych informacji na temat wpływu leczenia na zakaźność lub integralność ludzkiego kapsydu norowirusa. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie bezotoczkowej inaktywacji wirusa. Na przykład to, co dzieje się ze zdolnością kapsydu wirusa do infekowania komórki po danym leczeniu.

Główną zaletą tych metod jest to, że mogą one dostarczyć dodatkowego mechanistycznego wglądu w działanie danego leczenia na wirusa. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w strategie inaktywacji ludzkiego norowirusa, ma również potencjał do zastosowania do innych wirusów bezotoczkowych, takich jak rinowirus lub zapalenie wątroby, A.To rozpocząć, rozcieńczyć oczyszczone ludzkie białko kapsydu norowirusa, złożone w kapsydy do 50 mikrogramów na mililitr w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1X. Użyj maksymalnej objętości 15 mikrolitrów w pojedynczych zaślepionych probówkach PCR.

Upewnij się, że probówka zawiera co najmniej 600 nanogramów kapsydu i że w każdej kombinacji ligandów do leczenia znajduje się 600 nanogramów kapsydu. Następnie podgrzej termocykler do żądanej obróbki cieplnej. Następnie podgrzej dodatkowy termocykler do czterech stopni Celsjusza w celu natychmiastowego schłodzenia.

Dodaj probówki z roztworem kapsydu do termocyklera na żądany czas. Po podgrzaniu natychmiast przenieś rurki do wstępnie schłodzonego cyklera o czterech stopniach Celsjusza na pięć minut. Krótko odwiruj probówki w wirówce, aby wszystkie kropelki opadły na dno probówki.

Rozcieńczyć poddane działaniu roztworu kapsydu i PBS do trzech mikrogramów na mililitr. Upewnij się, że jest co najmniej 200 mikrolitrów rozcieńczonego kapsydu poddanego działaniu środka. Następnie nałóż 100 mikrolitrów roztworu kapsydu do każdej studzienki, upewniając się, że na zabieg przypadają co najmniej dwie studzienki.

Dodatkowo dołącz dwie studzienki kontrolne ze 100 mikrolitrami PBS na każdy ligand. Zapewnia to absorbancję tła testu. Przykryj płytkę pokrywką i uszczelnij krawędzie folią parafinową, aby zmniejszyć parowanie.

Pozostaw płytkę na noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub na dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji usunąć z płytki poddane działaniu roztwory kapsydu poddane działaniu kapsydu. Następnie dodaj 200 mikrolitrów na studzienkę bufora blokującego.

Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub szczelnie zamkniętej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. W międzyczasie rozcieńczyć biotynylowany aptamer do jednego mikromola w wodzie wolnej od nukleaz. Upewnij się, że roztwór jest wystarczający na 200 mikrolitrów na każdy zabieg.

Należy również rozcieńczyć wybrany biotynylowany HPGA do 30 mikrolitrów na mililitr w buforze blokującym. Ponownie upewnij się, że roztwór jest wystarczający na 200 mikrolitrów całkowitej objętości na każdy zabieg. Po inkubacji usunąć bufor blokujący i przemyć płytkę trzykrotnie 200 mikrolitrami na studzienkę PBST.

Poklep talerz do góry nogami na sterylnych ręcznikach papierowych, aby wysuszyć resztki wilgoci. Następnie, przy 100 mikrolitrach na studzienkę roztworów wiążących ligandy, upewniając się, że na kombinację ligandów do obróbki cieplnej przypadają dwie studzienki, inkubować pokrytą płytkę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością około 60 obr./min przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po umyciu studzienek, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, dodać 100 mikrolitrów na studzienkę 0,2 mikrograma na mililitr streptawidyny, peroksydazy chrzanowej i PBS.

Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając na wytrząsarce orbitalnej przed ponownym umyciem studzienek. Następnie, po kolejnym umyciu, dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę podłoża TMB i pozwól kolorowi rozwinąć się przez pięć do 15 minut. Obserwuj studzienki pod kątem koloru.

Należy pamiętać o konsekwentnym rozwijaniu w tym samym czasie między powtórzonymi płytkami i pamiętać o zakresie absorbancji używanego czytnika płytek. Zatrzymaj rozwój reakcji za pomocą 100 mikrolitrów na studzienkę jednego molowego kwasu fosforowego. Natychmiast odczytaj płytkę przy 450 nanometrach.

Utwórz nową procedurę operacyjną standardu rozmiaru w oprogramowaniu przyrządu DLS, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie wybierz zieloną strzałkę uruchamiania w oprogramowaniu i nazwij przykład. Rozcieńczyć poddane obróbce cieplnej cząstki wirusopodobne lub VLP od 1 do 10 w 1X PBS, aby uzyskać końcowe stężenie pięciu mikrogramów na mililitr.

Następnie przefiltruj próbkę z porami o wielkości jednego mikrona, aby usunąć cząsteczki kurzu. DLS jest bardzo wrażliwy na pył, ponieważ duże cząstki rozpraszają znacznie więcej światła niż małe cząstki. Przenieś 50 mikrolitrów rozcieńczonych VLP do jednorazowej kuwety o małej objętości.

Włóż kuwetę do sample komory przyrządu. Rozpocznij przebieg i skorzystaj z zakładek dopasowania kumulantu korrelogramu i porad ekspertów, aby ocenić jakość danych. Podczas cyklu sprawdź, czy rozproszenie poli wartości indeksu jest mniejsze niż 0,3, co stanowi pomiar jakości.

W zakładce multiview upewnij się, że współczynnik korelacji jest stały i bliski, ale nie większy niż jeden w krótkim czasie, a następnie gwałtownie spada przy zerze, co jest charakterystyczne dla wielkości cząstek. Skorzystaj z zakładki porad ekspertów, aby uzyskać informacje zwrotne na temat jakości danych podczas pomiarów. Po zakończeniu pomiaru sprawdź ponownie rozproszenie poli wartości indeksu jest mniejsze niż 0,3.

Upewnij się, że linia dopasowania kumulantu ściśle przylega do punktów danych na karcie dopasowania kumulantów. Utwórz nową procedurę operacyjną standardu rozmiaru w oprogramowaniu przyrządu DLS, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wybierz strzałkę uruchamiania w oprogramowaniu, aby otworzyć i nazwać nową próbkę i pozwolić instrumentowi osiągnąć równowagę temperatury.

Przenieś zawiesinę VLP do kuwety kwarcowej o małej objętości, unikaj pęcherzyków i powoli pipetuj o ściankę kuwety. Gdy przyrząd osiągnie równowagę temperaturową, włóż kuwetę do komory na próbkę. Po odczekaniu 10 sekund na wyrównanie temperatury próbki, rozpocznij bieg i jednocześnie uruchom stoper.

Zatrzymaj minutnik na końcu pierwszego pomiaru. Potraktuj ten czas jako pierwszy punkt czasowy. Uzyskiwanie kolejnych punktów czasowych z czasów pomiarów zarejestrowanych przez oprogramowanie.

Przeprowadzić obróbkę cieplną jak poprzednio, z wyjątkiem zastąpienia PBS dla 10-milimolowych hałd o pH 7,4 i nie rozcieńczać kapsydów po zabiegu. Następnie odpipetuj całą 15 mikrolitrową kroplę poddanego działaniu kapsydu na folię parafinową. Chwyć krawędź siatki pęsetą, pozwalając im zamknąć się na krawędzi, aby przytrzymać siatkę i umieść siatkę węglową stroną do dołu na kropli traktowanego roztworu.

Pozostaw siatkę do inkubacji przez 10 minut, aby kapsyd mógł przyczepić się do siatki. W zależności od czystości preparatu kapsydu dodać popłuczyny roztworu w pryzmie w postaci kropelek o objętości od 10 do 15 mikrolitrów umieszczonych w linii za leczoną kroplą kapsydu. Po 10 minutach podnieś siatkę z kroplą.

Umieść siatkę prawie prostopadle do kawałka bibuły filtracyjnej, aby odprowadzić kroplę. Następnie użyj siatki, aby podnieść kroplę bufora o pojemności od 10 do 15 mikrolitrów i przytrzymaj ją przez 30 sekund. Po 30 sekundach czasu mycia odsuń się kolejnym kawałkiem bibuły filtracyjnej.

Następnie umieść 15-mikrolitrową kroplę dwuprocentowego roztworu octanu uranylu na folii parafinowej w pustym miejscu. Podnieś kroplę octanu uranylu za pomocą siatki i przytrzymaj ją przez 45 sekund. Następnie odetnij octan uranylu, upewniając się, że usunąłeś większość roztworu.

Umieść siatkę stroną węglową do góry na kawałku bibuły filtracyjnej, uważając, aby siatka nie przykleiła się do wilgoci na pęsetze. Następnie umieść bibułę filtracyjną z siatką na otwartej szklanej szalce Petriego. Po powtórzeniu tego procesu dla wszystkich zabiegów, umieść połówki szalki Petriego wraz z kratkami w eksykatorze na noc do wyschnięcia przed obserwacją za pomocą TEM.

Poniższy wykres przedstawia zmniejszenie zdolności wiązania kapsydów ludzkiego norowirusa w czasie po leczeniu w temperaturze 68 stopni Celsjusza. Jak widać, wiązanie HPGA jest pierwszym sygnałem, który całkowicie znika. W tym momencie zakłada się, że zdecydowana większość kapsydów w roztworze utraciła zdolność wiązania HPGA komórki gospodarza, a zatem nie może zostać zinternalizowana do komórki.

Wiązanie aptamerowe odzwierciedla wiązanie HBGA, chociaż do usunięcia sygnału wymagana jest nieco większa obróbka cieplna. Pokazana tutaj jest krzywa współczynnika korelacji DLS reprezentatywna dla danych dobrej jakości. W czasie bliskim zeru korrelogram jest stały przy wartości bliskiej, ale mniejszej niż jeden.

Następnie gwałtownie spada do zera w czasie charakterystycznym dla wielkości cząstek. Wyniki tego eksperymentu dotyczące rozmiaru są prawdopodobnie godne zaufania. I odwrotnie, ta krzywa współczynnika korelacji jest reprezentatywna dla danych o niskiej jakości.

Korelogram zaczyna się od wartości powyżej jednego i stopniowo spada do zera. Wyniki tego eksperymentu nie powinny być wykorzystywane. W tym przypadku dane dotyczące wielkości cząstek pokazują wyraźny profil agregacji dla kapsydów poddanych działaniu temperatury 68 stopni Celsjusza z nadkruszywami tworzącymi się po około 20 minutach.

Czas, w którym następuje super agregacja, jest charakterystyczny dla podatności VLP na to traktowanie. Rysunek ten wizualizuje wyniki TEM dla obróbki cieplnej kapsydów ludzkiego norowirusa. W tym przypadku kapsydy były poddawane obróbce w temperaturze od 60 do 80 stopni Celsjusza od lewej do prawej.

Jak widać, morfologia kapsydu wyraźnie zmienia się wraz z leczeniem, ponieważ kapsydy agregują się i denaturują. Podobne zjawisko obserwuje się w przypadku kapsydów traktowanych w temperaturze 68 stopni Celsjusza przez zero do 25 minut. Po opanowaniu techniki te można wykonać w ciągu jednej do 24 godzin, jeśli są wykonywane prawidłowo.

Po opracowaniu technika ta zapewniła naukowcom zajmującym się wirusologią żywności dodatkową możliwość zbadania mechanizmów i skutków inaktywacji na kapsyd ludzkich norowirusów. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak RT-PCR w czasie rzeczywistym ze wstępnym leczeniem RNazą i bez niej, strona STS kapsydów wirusowych oraz testy płytki nazębnej z hodowanymi wirusami zastępczymi, aby uzyskać pełniejszy ogólny obraz redukcji wirusa po danym zabiegu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykorzystać wiązanie ligandów, dynamiczne rozpraszanie światła i transmisyjną mikroskopię elektronową, aby uzyskać dalszy mechanistyczny wgląd w wpływ leczenia inaktywacją na ludzki kapsyd norowirusa.

Nie zapominaj, że praca z niektórymi używanymi odczynnikami może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej i przestrzeganie najlepszych praktyk bezpieczeństwa w laboratorium.