Alternatywne metody in vitro do oznaczania integralności strukturalnej kapsydu wirusa

Ogólnym celem tych metod jest pogłębienie wiedzy na temat wpływu zastosowanej kuracji na zakaźność lub integralność kapsydu ludzkiego norowirusa. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie inaktywacji wirusów bezotoczkowych, takie jak to, co dzieje się ze zdolnością kapsydu wirusowego do zakażania komórki po określonej kuracji.

Główną zaletą tych metod jest to, że mogą one dostarczyć dodatkowych informacji mechanistycznych na temat działania danej terapii na wirusa. Chociaż metoda ta pozwala na poznanie strategii inaktywacji ludzkiego norowirusa, może ona zostać zastosowana również w przypadku innych wirusów bezotoczkowych, takich jak rhinowirus czy wirus zapalenia wątroby A.

W pierwszej kolejności należy rozcieńczyć oczyszczone główne białko kapsydu ludzkiego norowirusa, zmontowane w kapsydy, do stężenia 50 µg/mL w 1X roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym. W poszczególnych zatykanych probówkach do PCR należy użyć maksymalnej objętości 15 µL.

Należy upewnić się, że probówka zawiera co najmniej 600 nanogramów kapsydu i że na każdą kombinację ligandu traktującego przypada 600 nanogramów kapsydu. Następnie należy rozgrzać termocykler do pożądanej temperatury obróbki termicznej. Potem należy rozgrzać dodatkowy termocykler do czterech stopni Celsius dla natychmiastowego schłodzenia.

Umieść probówki z roztworem kapsydu w termocyklerze na wymagany czas. Po podgrzaniu niezwłocznie przenieś probówki do schłodzonego do 4 °C cyklera na pięć minut. Krótko wiruj probówki w wirówce, aby wszystkie kropelki osadziły się na dnie probówki.

Rozcieńcz roztwory traktowanych kapsydów oraz PBS do stężenia 3 µg/mL. Upewnij się, że dysponujesz co najmniej 200 µL rozcieńczonego traktowanego kapsydu. Następnie nanieś 100 µL roztworu kapsydu do każdego dołka, dbając o to, aby dla każdej próby przygotować co najmniej dwa dołki. Dodatkowo, dla każdego liganda uwzględnij dwa dołki kontrolne z 100 µL PBS. Pozwoli to na wyznaczenie absorbancji tła testu. Przykryj płytkę pokrywą i uszczelnij krawędzie folią parafinową, aby ograniczyć parowanie. Pozostaw płytkę na noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 4 °C lub na dwie godziny w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji należy usunąć z płytki roztwory kapsydów poddanych działaniu preparatów. Następnie do każdego dołka należy dodać 200 µL buforu blokującego. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub w szczelnie zamkniętym pojemniku w temperaturze 4 °C przez noc.

W międzyczasie rozcieńczyć biotynilowany aptamer do stężenia 1 µM w wodzie wolnej od nukleaz. Należy upewnić się, że przygotowano wystarczającą ilość roztworu, aby uzyskać łącznie 200 µL dla każdej serii badawczej.

Należy również rozcieńczyć wybrany biotynylatowy HPGA do stężenia 30 µL/mL w buforze blokującym. Ponownie należy upewnić się, że przygotowano wystarczającą ilość roztworu, aby uzyskać całkowitą objętość 200 µL dla każdej serii badawczej.

Po inkubacji należy usunąć bufor blokujący i trzykrotnie przemyć płytkę, używając 200 µL PBST na dołek. Osuszyć płytkę, odkładając ją do góry dnem na sterylnym ręczniku papierowym w celu usunięcia pozostałej wilgoci. Następnie, aplikując 100 µL roztworów wiążących ligand na dołek i zapewniając dwa dołki dla każdej kombinacji obróbki termicznej i ligandu, inkubować przykrytą płytkę na wytrząsarce orbitalnej przy prędkości około 60 RPM przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Po wypłukaniu dołków zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy dodać do każdego dołka 100 µL streptawidyny znakowanej peroksydazą chrzanową w stężeniu 0,2 µg/mL w PBS.

Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej przy łagodnym wstrząsaniu na wytrząsarce orbitalnej przed ponownym przemyciem dołków. Następnie, po kolejnym przemyciu, dodać 100 µL substratu TMB do każdego dołka i pozostawić do rozwoju barwy przez okres od 5 do 15 minut. Obserwować pojawienie się barwy w dołkach.

Należy zadbać o zachowanie jednakowego czasu wywoływania dla wszystkich płyt powtórzeń oraz uwzględnić zakres absorbancji używanego czytnika płytek. Reakcję wywoływania należy zatrzymać, dodając 100 µL 1 M kwasu fosforowego do każdej studzienki. Następnie należy niezwłocznie odczytać płytkę przy 450 nm.

Utwórz nową standardową procedurę operacyjną dla rozmiaru w oprogramowaniu instrumentu DLS, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie wybierz zieloną strzałkę uruchamiania w oprogramowaniu i nadaj nazwę próbce.

Rozcieńcz poddane obróbce termicznej cząstki wirusopodobne (VLP) w stosunku 1:10 w 1X PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 5 µg/mL. Następnie przefiltruj próbkę przez filtr o rozmiarze porów 1 µm w celu usunięcia cząsteczek kurzu. Metoda DLS jest bardzo czuła na obecność kurzu, ponieważ duże cząstki rozpraszają znacznie więcej światła niż cząstki małe. Przenieś 50 µL rozcieńczonych VLP do jednorazowej kuwety o małej objętości. Włóż kuwetę do komory pomiarowej urządzenia. Rozpocznij pomiar i skorzystaj z zakładek dopasowania kumulantów korelogramu oraz porad eksperckich w celu oceny jakości danych. Podczas pomiaru sprawdź, czy wskaźnik polidyspersyjności wynosi mniej niż 0,3, co świadczy o wysokiej jakości pomiaru.

W zakładce Multiview należy upewnić się, że współczynnik korelacji jest stały i bliski jedności (ale nie przekracza jej) w krótkim czasie, a następnie gwałtownie spada do zera w późniejszym czasie, co jest charakterystyczne dla wielkości cząstek. W celu uzyskania informacji zwrotnej na temat jakości danych podczas pomiarów należy korzystać z zakładki expert advice. Po zakończeniu pomiaru należy ponownie sprawdzić, czy wskaźnik polidyspersyjności jest mniejszy niż 0,3.

Upewnij się, że linia dopasowania kumulantów ściśle pokrywa się z punktami danych w zakładce dopasowania kumulantów. Utwórz nową standardową procedurę operacyjną rozmiaru w oprogramowaniu instrumentu DLS, zgodnie ze szczegółowym opisem w protokole tekstowym. Wybierz strzałkę uruchamiania w oprogramowaniu, aby otworzyć i nazwać nową próbkę, a następnie poczekaj, aż instrument osiągnie równowagę temperaturową.

Przenieś zawiesinę VLP do kwarcowej kuwety o małej objętości, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza i pipetując powoli wzdłuż ścianki kuwety. Po osiągnięciu równowagi termicznej przez instrument, włóż kuwetę do komory pomiarowej. Po odczekaniu 10 sekund w celu wyrównania temperatury próbki, rozpocznij pomiar i jednocześnie uruchom stoper.

Zatrzymaj stoper po zakończeniu pierwszego pomiaru. Przyjmij tę wartość jako pierwszy punkt czasowy. Kolejne punkty czasowe uzyskaj z czasów pomiarów zarejestrowanych przez oprogramowanie.

Przeprowadzić obróbkę termiczną w sposób opisany wcześniej, z wyjątkiem zastąpienia PBS 10 millimolar HEPES, pH 7,4 oraz z pominięciem dalszego rozcieńczania kapsydów po obróbce. Następnie pipetą nanieść całą 15 mikrolitr kroplę roztworu obrobionych kapsydów na folię parafinową. Chwycić krawędź siatki pęsetą, zamykając ją na brzegu w celu utrzymania siatki, a następnie umieścić siatkę stroną węglową do dołu na kropli obrobionego roztworu.

Inkubować siatkę przez 10 minut, aby kapsyd mógł przytwierdzić się do jej powierzchni. W zależności od czystości preparatu kapsydu, przeprowadzić płukanie roztworem HEPES, nakładając od 10 do 15 µL w formie kropli umieszczonych w linii za kroplą z kapsydem. Po 10 minutach pobrać siatkę wraz z kroplą.

Umieść siatkę niemal prostopadle do kawałka papieru filtracyjnego, aby odprowadzić kropelkę. Następnie użyj siatki, aby pobrać kropelkę 10 do 15 µL buforu HEPES i przytrzymaj ją przez 30 sekund. Po 30 sekundach płukania odprowadź ciecz za pomocą kolejnego kawałka papieru filtracyjnego.

Następnie nanieś 15 µL kropli dwóch procentowego roztworu octanu uranylu na wolny obszar folii parafinowej. Dotknij kropli octanu uranylu siatką i przytrzymaj ją przez 45 sekund. Następnie odciągnij nadmiar octanu uranylu, upewniając się, że usunięto większość roztworu.

Umieść siatkę stroną węglową do góry na fragmencie papieru filtrującego, uważając, aby siatka nie przykleiła się do wilgoci na pincecie. Następnie umieść papier filtrujący z siatką w otwartej szklanej płytce Petriego. Po powtórzeniu tego procesu dla wszystkich prób, umieść połówki płytek Petriego z siatkami w eksykatorze na noc w celu wysuszenia przed obserwacją za pomocą TEM.

Poniższy wykres przedstawia spadek zdolności wiązania kapsydów ludzkiego norowirusa w czasie podczas obróbki w temperaturze 68°C. Jak widać, wiązanie HPGA jest pierwszym sygnałem, który całkowicie zanika. W tym punkcie przyjmuje się, że zdecydowana większość kapsydów w roztworze utraciła zdolność wiązania HPGAs komórek gospodarza, a w konsekwencji nie mogą one zostać zinternalizowane do wnętrza komórki.

Wiązanie aptameru odzwierciedla wiązanie HBGA, choć do usunięcia sygnału wymagana jest nieco intensywniejsza obróbka termiczna. Przedstawiono tutaj krzywą współczynnika korelacji DLS reprezentatywną dla danych dobrej jakości. W czasie bliskim zeru korelogram jest stały, a jego wartość jest bliska jedności, lecz pozostaje poniżej niej.

Następnie gwałtownie spada do zera w czasie charakterystycznym dla rozmiaru cząstek. Wynikom wielkości otrzymanym w tym eksperymencie można prawdopodobnie zaufać. Przeciwnie, ta krzywa współczynnika korelacji jest reprezentatywna dla danych słabej jakości.

Korelogram rozpoczyna się od wartości powyżej jeden i stopniowo spada do zera. Wyników z tego eksperymentu nie należy wykorzystywać. W tym przypadku dane dotyczące wielkości cząsteczek wykazują wyraźny profil agregacji dla kapsydów traktowanych w temperaturze 68 °C, przy czym superagregaty tworzą się po około 20 minutach.

Czas, w którym dochodzi do superagregacji, jest charakterystyczny dla podatności VLP na dane działanie. Rysunek ten przedstawia wyniki TEM dla obróbki termicznej kapsydów ludzkiego norowirusa. W tym przypadku kapsydy poddawano działaniu temperatur od 60 do 80 °C, patrząc od lewej do prawej.

Jak widać, morfologia kapsydu wyraźnie zmienia się pod wpływem obróbki, gdyż kapsydy ulegają agregacji i denaturacji. Podobne zjawisko odnotowano w przypadku kapsydów poddanych działaniu temperatury 68 °C przez czas od 0 do 25 minut.

Po opanowaniu, techniki te można przeprowadzić w czasie od 1 do 24 godzin, pod warunkiem ich prawidłowego wykonania.

Po opracowaniu technika ta zapewniła badaczom w dziedzinie wirulogii żywności dodatkową możliwość zbadania mechanizmów i efektów inaktywacji kapsydu ludzkich norowirusów. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak RT-PCR w czasie rzeczywistym z obróbką wstępną RNazą lub bez niej, SDS-PAGE kapsydów wirusowych oraz testy płytek z hodowalnymi wirusami zastępczymi, aby uzyskać pełniejszy obraz redukcji wirusów po danym traktowaniu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania wiązania ligandów, dynamicznego rozpraszania światła oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej w celu uzyskania dalszych informacji mechanistycznych na temat wpływu procesu inaktywacji na kapsyd ludzkiego norowirusa.

Należy pamiętać, że praca z niektórymi z użytych odczynników może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie środków ochrony indywidualnej oraz przestrzeganie najlepszych praktyk bezpieczeństwa laboratoryjnego.