Name: Wygodna metoda ekstrakcji i analizy za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej neuroprzekaźników katecholaminy i ich metabolitów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: Poznaj wygodną metodę ekstrakcji na fazie stałej i chromatografii cieczowej do oznaczania neuroprzekaźników katecholaminowych w moczu niemowląt. Ta technika umożliwia wczesne wykrywanie uszkodzeń mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Narodową Fundację Nauki Chin (nr 81172720, nr 81673230), Program Badań nad Rozwojem Społecznym Departamentu Nauki i Technologii Prowincji Jiangsu (No. BE2016741), Projekt Naukowo-Technologiczny Chińskiej Generalnej Administracji Nadzoru Jakości, Inspekcji i Kwarantanny (2015QK055), Program Projektu Otwartego Kluczowego Laboratorium Rozwoju Dziecka i Nauki o Uczeniu się Ministerstwa Edukacji, Uniwersytet Południowo-Wschodni (CDLS-2016-04). Serdecznie dziękujemy Yuan Song i Ping Liu, którzy pomogli nam w pobraniu próbek.

Uzyskano świadomą zgodę rodziców i uzyskano zgodę instytucjonalnej komisji rewizyjnej na badanie. Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z kodeksem etycznym Światowego Stowarzyszenia Lekarzy (Deklaracja Helsińska) dla eksperymentów z udziałem ludzi. Opiekunowie wszystkich uczestników wyrazili pisemną zgodę na włączenie do badania. Uzyskano również zgodę komisji etycznej od szpitala Zhongda, powiązanego z Uniwersytetem Południowo-Wschodnim.
1. Przygotowanie kolumn i roztworów potrzebnych do ekstrakcji i oznaczania katecholamin
<ol>
	<li>Przygotuj kolumnę PFSPE. Podzielić 1-2 mg nanowłókien PCE-PS na 5-6 podwielokrotności i za pomocą cienkiego stalowego pręta o średnicy 0,5 mm wcisnąć je w uporządkowany sposób na końcu końcówki pipety o objętości 200 μl.</li>
	<li>Przygotować sztuczny mocz, ważąc 2,427 g mocznika, 0,034 g kwasu moczowego, 0,09 g kreatyniny, 0,297 g cytrynianu trisodowego, 0,634 g chlorku sodu, 0,45 g chlorku potasu, 0,161 g chlorku amonu, 0,089 g dwuwodnego chlorku wapnia, 0,1 g siedmiowodnego siarczanu magnezu, 0,034 g wodorowęglanu sodu, 0,003 g szczawianu sodu, 0,258 g siarczanu sodu, 0,1 g diwodorofosforanu sodu, i 0,011 g wodorofosforanu disodowego i rozpuść powyższe chemikalia w 200 ml wody dejonizowanej.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy boranu difenylu (DPBA) o stężeniu 2 mg/ml, rozpuszczając 2 mg tego związku w 1 ml wody destylowanej. Przechowywać roztwór w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Analit standardowy 
	UWAGA: Struktura chemiczna i właściwości katecholamin są niestabilne i łatwo ulegają rozkładowi. Proces przygotowania norm musi być bardzo szybki i musi zapobiegać ekspozycji na bezpośrednie działanie promieni słonecznych.
	<ol>
		<li>Odważyć 1,0 mg bromowodorku NE, E, DA, MHPG, DOPAC i wzorca wewnętrznego bromowodorku 3,4-dihydroksybenzyloaminy DHBA w oddzielnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Przed użyciem rozcieńczyć roztwór DHBA w wodzie do 100 ng/ml.</li>
		<li>Przygotowane wzorce należy oscylować w ciemności z dużą prędkością, aż anality całkowicie się rozpuszczą. Jest to stado podstawowe; przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do kilku tygodni.</li>
		<li>Przygotuj wtórne zapasy analitu 1,000 ng / ml. Dla NE, E, DA, DOPAC i MHPG przenieść 5 μl każdego pierwotnego analitu do 4,975 μl wody destylowanej w probówce wirówkowej o pojemności 5 ml i przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Codziennie przygotowuj te roztwory na świeżo. W przypadku DHBA przenieść 5 μl wywaru pierwotnego do 4,995 μl wody destylowanej w probówce wirówkowej o pojemności 5 ml i przechowywać w ciemności oddzielnie w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dokonać dalszych rozcieńczeń z wtórnym analitem w celu utworzenia krzywej wzorcowej (np. Tabela uzupełniająca 2). Roztwory przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C i codziennie przygotowywać świeże.</li>
		<li>Przetestuj optymalne napięcie detektora ECD przy użyciu standardowej kolby o odpowiednim stężeniu. Zmieniaj napięcie, aby znaleźć wartość, w której anality mają najlepszy wygląd piku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować eluant zawierający 30% kwasu fosforowego, 15% acetonitrylu i 55% wody destylowanej. Na 10 ml rozpuszczalnika eluantu użyj 5,5 ml wody destylowanej i dodaj kropla po kropli do wody 1,5 ml acetonitrylu i 3 ml kwasu fosforowego.</li>
</ol>
2. Przygotowanie prawdziwych próbek moczu i faza ruchoma
<ol>
	<li>Poproś matki, aby zebrały pierwszy poranny mocz swoich niemowląt za pomocą aseptycznych kubków na mocz. Przenieść próbki do probówek polipropylenowych i natychmiast oznaczyć etykietą. Następnie należy przechowywać próbki w zamrażarce o temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Wirować i odwirowywać próbki moczu o masie 1 510 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT), aby pozbyć się większości zakłóceń spowodowanych cząstkami stałymi. Odrzuć osad i zbierz supernatanty do dalszych eksperymentów. W celu skutecznej ekstrakcji analitów należy przystąpić do obróbki wstępnej PFSPE (krok 3) natychmiast po odwirowaniu.</li>
	<li>Przygotowanie fazy mobilnej
	<ol>
		<li>Przygotuj czystą butelkę, co najmniej 1 l. Skład fazy ruchomej jest wymieniony w tabeli uzupełniającej 1; dla 1 l fazy ruchomej odmierzyć do butelki 6,7242 g kwasu cytrynowego, 93,06 mg soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 7,02 g monometalicznego ortofosforanu sodu, 404,5 mg soli sodowej kwasu 1-heptanosulfonowego i 3,5 g hydratu sodu. Dodaj 40 ml acetonitrylu i wody destylowanej do 1,000 ml. Mieszać i wibrować ultradźwiękowo przez 15 minut, aż cała materia w roztworze się rozpuści.</li>
		<li>Za pomocą pH-metru ze szklaną elektrodą dostosować wartość pH fazy ruchomej do 4,21 za pomocą nasyconego roztworu wodorotlenku sodu.</li>
		<li>Przefiltruj fazę ruchomą za pomocą mikroporowatej membrany z polifluorku winylidenu 0,45 μm i próżniowego urządzenia ssącego, aby pozbyć się zanieczyszczeń.</li>
		<li>Użyj wibracji ultradźwiękowych przez 15 minut, aby odgazować fazę ruchomą za każdym razem przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ekstrakcja PFSPE i analiza HPLC
<ol>
	<li>Aktywuj nanowłókna. Przeciśnij kolejno 100 μl metanolu i 100 μl wody przez kolumnę PFSPE za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml w powolny, kroplowy sposób.</li>
	<li>Zmieszać 100 μl próbki moczu ze 100 μl roztworu DPBA 2 mg/ml i 30 μl 100 ng/ml roztworu DHBA (IS, wzorzec wewnętrzny) w probówce EP o pojemności 0,5 ml, a następnie przenieść zmieszany roztwór do kolumny PFSPE. Przecisnąć zmieszany roztwór próbki przez kolumnę PFSPE za pomocą gazoszczelnej plastikowej strzykawki o pojemności 5 ml, wykorzystując siłę ciśnienia powietrza.</li>
	<li>Wypłukać kolumnę trzykrotnie, ładując 100 μl roztworu DPBA (2 mg/ml) do kolumny SPE i powoli przepychać roztwór przez wkład pod ciśnieniem powietrza za pomocą gazoszczelnej plastikowej strzykawki o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Załadować 50 μl eluantu na kolumnę PFSPE i przepchnąć go przez kolumnę, zbierając eluat za pomocą probówki EP o pojemności 0,5 ml.</li>
	<li>Włącz odgazowywacz HLPC, aby odgazować powietrze w systemie. Przed przystąpieniem do analizy próbek system powinien pracować przez ponad 0,5 godziny z fazą ruchomą w celu zrównoważenia i zmniejszenia hałasu linii podstawowej. Patrz Tabela Uzupełniająca 1 przedstawiająca parametry ustawień systemu HPLC.</li>
	<li>Pobrać próbkę 20 μl eluatu za pomocą automatycznego próbnika, a następnie wstrzyknąć ją do systemu HPLC-ECD.</li>
	<li>Po zakończeniu przebiegów wyłącz komórkę detektora za pomocą interfejsu detektora. NIE wyłączaj ogniwa za pomocą przełącznika z tyłu detektora, ponieważ może to spowodować uszkodzenie instrumentu.</li>
	<li>Ręcznie zmień skład fazy ruchomej na 10% metanolu i 90% wody. Biegnij przez co najmniej 30 minut. Następnie ręcznie zmień fazę ruchomą na metanol klasy HPLC. Uruchom przez około 15 minut, aby chronić system w metanolu. Niewykonanie tego kroku zgodnie z zalecanym czasem pracy może spowodować uszkodzenie kolumny i detektora. Wyłącz przepływ, a następnie wyłącz odgazowywacz.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja wkładów z kwasem fenyloboronowym (PBA)
Procedury ekstrakcji kartridży PBA były podobne do schematu w Kumar et al. (2011)25. Wszystkie roztwory są przepychane przez kartridże PBA (100 mg, 1 mL) za pomocą powietrza wtłaczanego przez strzykawkę.
<ol>
	<li>Kondycjonować wkład kolejno 1 ml wody acetonitrylowej (v/v) o proporcji 80:20 zawierającej 1% kwas mrówkowy i 1 ml 50 mM buforu fosforanowego (pH 10).</li>
	<li>Przecisnąć zbuforowaną próbkę moczu (1 ml moczu i 2 ml buforu fosforanowego, pH 8,5) przez wkład PBA.</li>
	<li>Przemyć wkład 1 ml buforu acetonitrylowo-fosforanowego o stężeniu 50:50 v/v (10 mM, pH 8,5).</li>
	<li>Eluować wkład za pomocą 1 ml wody acetonitrylowej (80:20 v/v) zawierającej 1% kwas mrówkowy.</li>
</ol>
5. Identyfikacja i kwantyfikacja katecholamin
<ol>
	<li>Liniowości
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć drugorzędowe anality sztucznym moczem do sześciu stężeń (1,5, 3, 12, 25, 50 i 100 ng/ml); objętość rozcieńczenia sztucznego moczu jest zgodna z tabelą uzupełniającą 2. Wykonaj trzy równoległe próbki o każdym stężeniu, aby uzyskać 18 roztworów eksperymentalnych analitu do skonstruowania krzywych kalibracyjnych.</li>
		<li>Rozcieńczyć zapas wtórny DHBA sztucznym moczem 10-krotnie, aby uzyskać 100 ng / ml eksperymentalnego roztworu.</li>
		<li>Poddać wstępnej obróbce wszystkie roztwory analitu z ppkt 5.1.1, zgodnie z krokiem 3 (procedury ekstrakcji PFSPE). Podobnie jak w kroku 3, wstrzyknąć 20 μl każdego odpowiedniego eluatu do systemu HPLC-ECD, aby uzyskać chromatogram HPLC.</li>
		<li>Skonstruuj krzywe kalibracyjne pięciu analitów, wykreślając stosunek powierzchni piku (cele/IS) jako oś Y do stosunku stężeń (cele/IS) jako oś X, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wartości LOD i LOQ dla czułości
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć 20 μl ślepej próby sztucznego moczu do systemu HPLC-ECD (jak w kroku 3), aby uzyskać chromatogram HPLC próbki.</li>
		<li>Na chromatogramie z ppkt 5.2.1 zebrać 11 wartości sygnału ślepej próby i obliczyć wartość średnią Xb oraz odchylenie standardowe Sb. Obliczyć minimalny sygnał substancji, który można wykryć przy pewnym poziomie ufności, XL, jako XL = Xb+K*Sb (K jest współczynnikiem określonym przez poziom ufności, Sb odzwierciedla poziom hałasu metody pomiarowej i poziom hałasu maszyny). Zatem LOD = (XL-X b)/S = (K*Sb)/S (S oznacza wartość nachylenia krzywej roboczej).</li>
		<li>Zdefiniuj S/N 3:1 (K=3) jako granicę wykrywalności (LOD) i S/N 10:1 (K=10) jako granicę oznaczalności (LOQ).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń odzysk
	<ol>
		<li>Przygotuj prawdziwe i wzbogacone próbki moczu. Rozcieńczyć drugorzędowe anality prawdziwym moczem do trzech stężeń (5, 50, 100 ng/ml), aby uzyskać wzbogacone próbki moczu. Przygotować trzy równoległe próbki dla każdego roztworu analitu. Policz zwiększone stężenie jako ilość docelowych związków wzbogaconych w próbce moczu. Zdefiniuj tę wartość jako As.</li>
		<li>Rozcieńczyć materiał DHBA do 100 ng/ml, jak w kroku 5.1.2.</li>
		<li>Przetwarzać każdy roztwór próbki z ppkt 5.3.1 zgodnie z etapem 3 (procedury ekstrakcji PFSPE) i wstrzykiwać 20 μl każdego odpowiedniego eluantu do systemu HPLC-ECD w celu uzyskania wyniku chromatogramu. Wartość analitów będzie liczona jako ilość związków docelowych określona ilościowo w próbce moczu wzbogaconej. Zdefiniuj tę wartość jako At.</li>
		<li>Wstrzyknąć 20 μl próbki moczu do systemu HPLC-ECD (jak w kroku 3), aby uzyskać wynik chromatogramu. Wartość analitów będzie liczona jako początkowa ilość związków docelowych określona ilościowo w próbce moczu. Zdefiniuj tę wartość jako Ai.</li>
		<li>Obliczyć ilość związków docelowych w próbkach na podstawie równania krzywej standardowej. Procentowy odzysk szacuje się jako metodologiczny odzysk % = (At - Ai) × 100/(As). Wartości średnie przedstawiono w tabeli 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń niedokładność
	<ol>
		<li>Przygotować wzbogacone próbki sztucznego moczu o stężeniach 5, 50 i 100 ng/ml, jak w kroku 5.3.1. Przygotować sześć równoległych próbek dla każdego roztworu analitu. Codziennie przygotowuj świeże próbki eksperymentalne.</li>
		<li>Rozcieńczyć zapas DHBA do 100 ng/ml, jak w kroku 5.1.2.</li>
		<li>Oceń precyzję śróddzienną (n=6). Poddać każdy roztwór próbki w ppkt. 5.4.1 zgodnie z krokiem 3 i wstrzyknąć 20 μl każdego odpowiedniego eluantu do układu HPLC-ECD w celu uzyskania chromatogramu. Wykonaj tę samą operację sześć razy tego samego dnia.</li>
		<li>Obliczyć ilość związków docelowych w próbkach na podstawie równania krzywej standardowej. Przy tym samym stężeniu tego samego związku względne odchylenie standardowe (RSD) sześciu testów w ciągu jednego dnia określa się jako precyzję śróddobową. Wartości średnie przedstawiono w tabeli 1.</li>
		<li>Oceń precyzję międzydzienną (n=6). O tej samej porze każdego dnia w ciągu sześciu kolejnych dni przygotować wzbogacone próbki sztucznego moczu o trzech stężeniach 5, 50, 100 ng/ml, jak w ppkt 5.4.1 i 5.4.2, i przetworzyć każdy roztwór próbki analitu zgodnie z krokiem 3.</li>
		<li>Wstrzyknąć 20 μl każdej odpowiedniej eluatu z ppkt 5.4.5 do systemu HPLC-ECD w celu uzyskania wyników chromatogramu każdego dnia. Obliczyć ilość związków docelowych w próbkach na podstawie równania krzywej standardowej. Precyzja międzydzienna jest wyrażona przez RSD ilości testów z wzbogaconych próbek sztucznego moczu w trzech stężeniach w ciągu sześciu kolejnych dni. Wartości średnie przedstawiono w tabeli 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy zaświadczają, że nie ma konfliktu interesów z żadną organizacją finansową w odniesieniu do materiału omawianego w tym artykule.

Zaproponowana w tym artykule metoda PFSPE może być znacząca i znacząca ze względu na jej szybkość, prostotę i wygodę. Adsorbenty użyte w protokole to elektroprzędzone nanowłókna, które mają wysoki stosunek powierzchni do objętości i adsorbują anality z wysoką wydajnością. Procedura wymaga tylko kilku miligramów nanowłókien i niewielkiej objętości rozpuszczalnika eluantu i nie wymaga etapu odparowywania w celu zagęszczenia analitów. W tym miejscu przedstawiliśmy szczegółowy przegląd protokołu opartego na HPLC-ECD, który p...

Neuroprzekaźniki katecholaminy i zawartość ich metabolitów w płynach ustrojowych mogą wpływać na funkcje neuronalne i w dużym stopniu wpływać na równowagę stanów reakcji na bodziec1. Nieprawidłowości mogą powodować różne choroby, takie jak pheochromacytoma, ganglioneuroma, neuroblastoma i zaburzenia neurologiczne1,2. Ekstrakcja i oznaczanie katecholamin w płynach ustrojowych ma znaczenie dla diagnozowania odpowiednich chorób. Jednak katecholaminy w próbkach biologicznych występują w niskich stężeniach i łatwo się utleniają. Co więcej, są one bardzo trudne do elucji ze względu na dużą ilość zakłóceń w medium3. W związku z tym jednoczesne wykrywanie katecholamin w płynach biologicznych nadal stanowi wyzwanie.
Pojawiły się opinie pokazujące, że katecholaminy w moczu mogą być miarą stresu, a ich poziomy są ważnymi markerami biologicznymi reagującymi na stymulację dotykową u noworodków5. Według badań, wszystkie niemowlęta, które ucierpiały z powodu wcześniaków, są narażone na ryzyko uszkodzenia mózgu4,5,6, a uraz może powodować nieprawidłowe uwalnianie katecholamin i powiązanych substancji do płynów. Istnieją zaawansowane techniki rezonansu magnetycznego, które mogą wykryć uszkodzenie mózgu we wcześniejszych fazach7,8. Jednak w ciągu pierwszych 48 godzin nieprawidłowy proces neurorozwojowy spowoduje trwałe uszkodzenie mózgu, które nie będzie widoczne na obrazach medycznych11. Poza tym wysokie koszty i ograniczone zasoby instrumentów, wraz z innymi czynnikami, uniemożliwiają wszystkim oddziałom neonatologicznym dostęp do tych specjalistycznych technik neuroobrazowania. Jednak zastosowanie łatwo dostępnych i praktycznych biomarkerów (takich jak katecholaminy i ich metabolity) może przezwyciężyć te niedociągnięcia, a badania przesiewowe biomarkera w płynach ludzkich mogą pomóc we wczesnej diagnozie uszkodzenia mózgu i doprowadzić do szybkiej identyfikacji noworodków wymagających neuroprotekcji9. Katolaminy w moczu mogą być łatwym i oczywistym wskaźnikiem, ze względu na bezpośrednią korelację między ilością ich uwalnianych do płynów a funkcją neuroaktywności.
Wśród płynów biologicznych, próbki płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) i osocza nie są łatwe do zdobycia za pomocą istniejących procedur traumatycznych, a także bardzo trudno jest pozbyć się zakłóceń spowodowanych białkiem adhezyjnym i innymi zanieczyszczeniami, co prowadzi do kłopotliwego i czasochłonnego procesu pobierania próbek, który nie nadaje się do wielokrotnego wykrywania. Również w przypadku dzieci prawie niemożliwe jest pobranie próbek w traumatyczny sposób. Dlatego pobieranie próbek moczu jest lepsze niż inne formy pobierania próbek, ponieważ jest nieinwazyjne, łatwe w obsłudze i może być wykonywane wielokrotnie. Próbki moczu są obfite i łatwe do przechowywania oraz wykazują ogromne zalety w porównaniu z innymi formami próbek biologicznych.
Główne metody ilościowego oznaczania katecholamin w płynach biologicznych obejmują testy radioenzymatyczne10, testy immunoenzymatyczne i sorbentowe11, woltamperometria12 i spektrometria termiczna soczewek13. Istnieją jednak niedociągnięcia, takie jak skomplikowane operacje i trudne do wykrycia wiele celów. Obecnie dominującą techniką analizy jest wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)14, w połączeniu z czułą elektrochemią15 lub detekcją fluorymetryczną16, ze względu na jej wysoką czułość i dobrą selektywność. Dzięki technologii tandemowej spektrometrii mas, takiej jak chromatografia cieczowa / spektrometria mas (LC / MS) i chromatografia cieczowa / spektrometria mas / spektrometria mas (LC / MS / MS), analiza i kwantyfikacja neuroprzekaźników może osiągnąć wysoką dokładność i swoistość17,18. Jednak technika MS wymaga drogiego oprzyrządowania, a także znacznie wykwalifikowanej siły roboczej, co sprawia, że metoda ta jest trudna do uniwersalnego zastosowania w większości konwencjonalnych laboratoriów. Systemy HPLC-ECD są powszechnie wyposażone w większość konwencjonalnych i klinicznych laboratoriów, a zatem stały się powszechnym i dobrym wyborem dla grup badawczych do oznaczania chemicznego, ale wymagają, aby próbka wprowadzana do systemu była czysta i miała objętość w mikroskali19. Dlatego bardzo ważne jest oczyszczenie i zagęszczenie próbki przed analizą. Klasyczną metodą etapu oczyszczania jest ekstrakcja ciecz-ciecz14,15,20 i ekstrakcja w fazie stałej off-line, w tym aktywowana kolumna tlenku glinu21,22 i kompleksowanie difenylboranu (DPBA)23,24,25,26.
Myeongho Lee et al. od 2007 roku używają żywicy polimerowej modyfikowanej chemicznie eterem koronowym jako adsorbentu do selektywnej ekstrakcji katecholamin z ludzkiego moczu27. Również w 2006 roku Haibo He i wsp. Zademonstrowano łatwe podejście do syntezy sorbentu do ekstrakcji powinowactwa do boronianu poprzez wykorzystanie funkcjonalizowanego nanomagnetycznego wielościennego oligomerycznego silseskwioksanu (POSS) kompozytu nanomagnetycznego i zastosowanie go do wzbogacania katecholamin w ludzkim moczu (noradrenaliny, epinefryny i izoprenaliny)<klasa SUP = "xref">28. Wykorzystali również nanomateriały do wykonania prac, wykorzystując technologię zwaną nano-elektroprzędzeniem i formując polimerowy materiał włóknisty w nanoskali. Proces elektroprzędzenia może dostosować średnicę, morfologię i wyrównanie przestrzenne produktu poprzez kontrolowanie napięcia roboczego i zmianę zawartości roztworu przędzalniczego wraz z innymi parametrami29. W porównaniu z konwencjonalnym wkładem SPE, elektroprzędzone nanowłókna doskonale nadają się do ekstrakcji i wzbogacania docelowych analitów ze złożonej matrycy, ponieważ są wyposażone w wysokie proporcje powierzchni do objętości, aby adsorbować anality z wysoką wydajnością i wykazują łatwiejsze do kontrolowania właściwości chemiczne powierzchni, co pozwala na wygodne przyłączanie związków docelowych. Te właściwości sprawiają, że są dobrym wyborem dla adsorbentów SPE, znacznie zmniejszając ilość rozpuszczalnika w fazie stałej i desorpcji30,31,32,33. W przypadku katecholamin w próbkach moczu, elektroprzędzone nanowłókna złożone z apolimerowego eteru koronowego z polistyrenem (PCE-PS) użyto do selektywnej ekstrakcji trzech katecholamin (NE, E i DA)34. W pracy wskazano, że selektywny eter koronowy adsorbuje cele NE, E i DA, co opiera się na jego prawidłowej geometrii wiązania katecholamin poprzez tworzenie wiązań wodorowych. Wyniki skutecznie pokazały, że materiał jest eterem koronowym, usuwając inne związki zakłócające zawarte w próbkach biologicznych. Zainspirowani tym raportem, opracowano nowatorską metodę selektywnej ekstrakcji katecholamin przy użyciu elektroprzędzonych kompozytowych nanowłókien składających się z PCE-PS.
W tym artykule metoda opisana wcześniej34 została ulepszona i wykorzystana nie tylko do skutecznej analizy E, NE i DA, ale także ich metabolitów, MHPG i DOPAC, w moczu. Badamy również nowe możliwości dla mechanizmu procesu adsorpcji. Metoda wykazuje zadowalającą skuteczność ekstrakcji i selektywność dla pięciu analitów, a metoda została zweryfikowana w analizie moczu niemowląt wysokiego ryzyka z okołoporodowym uszkodzeniem mózgu i zdrowych osób z grupy kontrolnej.

<table><tbody><tr><td>200 i mikro; L kolumna z końcówką</td><td></td><td></td> pipety <td>zawierająca nanowłókna</td></tr><tr><td>Materiał nanowłókien</td><td></td><td></td> PCE-PS <td>do ekstrakcji PFSPE</td></tr><tr><td>pręt stalowy (o średnicy około 0,5 mm)</td><td></td><td></td> <td>wsyp nanowłókna do kolumny</td></tr><tr><td>gazoszczelna plastikowa strzykawka (5 ml)</td><td></td><td></td> <td>skompresuj roztwór na końcu końcówki</td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>ester 2-aminoetylowy kwasu difenyloborynowego (DPBA)</td> <td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>A-106408</td><td>odczynnik kompleksu</td></tr><tr><td>noradrenaliny (NE)</td> <td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>A-9512</td><td>analit</td></tr><tr><td>3-metoksy-4-hydroksyfenyloglikol (MHPG)</td> <td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>H1377</td><td>analit</td></tr><tr><td>epinefryna (E)</td> <td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>100154-200503</td><td>analit</td></tr><tr><td>3, 4- Kwas dihydroksyfenylooctowy (DOPAC)</td> <td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>D-9128</td><td>analit</td></tr><tr><td>dopamina (DA)</td> <td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>H-8502</td><td>analit</td></tr><tr><td>3, bromowodorek 4-dihydroksybenzyloaminy (DHBA)</td> <td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>858781</td><td>etykieta wewnętrzna</td></tr><tr><td>acetonitryl</td><td>Sigma-Aldrich.Inc</td><td>75-05-8</td><td>elurynat i kwas</td></tr> <tr><td></td><td>fosforowy w fazie ruchomejSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>7664-38-2</td><td>eluriant</td></tr><tr><td>kwas moczowy</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>69-93-2</td><td>sztuczny mocz</td></tr><tr><td>kreatynina</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>60-27-5</td> sztuczny <td>mocz</td></tr><tr><td>cytrynian trisodowy</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>6132-04-3</td><td>sztuczny mocz</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo. , Ltd</td><td>7447-40-7</td><td>sztuczny mocz</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>12125-02-9</td><td>sztuczny mocz</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>SWC0140326</td><td>sztuczny mocz</td></tr><tr><td>C2Na2O4</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>62-76-0</td><td>sztuczny mocz</td></tr><tr><td>NaSO4</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>7757-82-6</td><td>sztuczny mocz</td></tr><tr><td>wodorofosforan disodowy</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10039-32-4</td><td>sztuczny</td></tr><tr><td>mocznik</td><td>moczu Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>57-13-6</td><td>sztuczny mocz</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>7647-14-5</td><td>sztuczny mocz</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10034-99-8</td><td>sztuczny mocz</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10035-04-8</td><td>sztuczny mocz</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>7647-01-0</td> sztuczny <td>mocz</td></tr><tr><td>kwas cytrynowy</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>77-92-9</td><td>sztuczny mocz i faza ruchoma</td></tr><tr><td>Sól disodowa EDTA</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>34124-14-6</td><td>faza ruchoma</td></tr><tr><td>monometaliczny ortofosforan sodu</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>7558-80-7</td> sztuczny <td>mocz i faza ruchoma</td></tr><tr><td>sól sodowa kwasu 1-heptanosulfonowego</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>22767-50-6</td><td></td></tr><tr><td>wodorotlenek sodu</td> w fazie ruchomej <td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>1310-73-2</td><td>kolumna</td></tr><tr><td>kwasu fenyloboronowego w fazie ruchomej (kolumna PBA)</td><td>Aglilent</td><td>12102018</td><td>ekstrakcji PBA</td></tr><tr><td>Inertsil&reg; ODS-3 5 i mikro; m 4,6 razy; Kolumna 150 mm</td><td>Dikma</td><td>5020-06731</td><td>Kolumna HPLC do separacji</td></tr><tr><td>SHIMADZU SIL-20AC protuberancja AUTOMATYCZNY PRÓBNIK</td><td>Shimadzu Corporation, Japonia</td> Automatyczny wtrysk <td>SIL-20AC</td><td>do eluriantu</td></tr><tr><td>SHIMADZU LC-20AD Wysokowydajna chromatografia cieczowa</td><td>Shimadzu Corporation, Japonia</td><td>Pompa HPLC</td><td>LC-20AD</td></tr><tr><td>Detektor elektrochemiczny SHIMADZU L-ECD-60A</td><td>Shimadzu Corporation, Japonia</td><td>Detektor L-ECD-60A</td><td>do analitów</td></tr><tr><td>ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System</td><td>Micromeritics, USA</td><td></td><td>analizator powierzchni i porowatości&nbsp;</td></tr></tbody></table>

wygodna metoda ekstrakcji i analizy za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej neuroprzekaźników katecholaminy i ich metabolitów

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

Ekstrakcja i analiza neuroprzekaźników katecholaminowych w płynach biologicznych ma ogromne znaczenie w ocenie funkcji układu nerwowego i powiązanych chorób, ale ich precyzyjny pomiar jest nadal wyzwaniem. Opisano wiele protokołów pomiaru neuroprzekaźników za pomocą różnych instrumentów, w tym wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC). Istnieją jednak niedociągnięcia, takie jak skomplikowana operacja lub trudne do wykrycia wiele celów, których nie da się uniknąć, a obecnie dominującą techniką analizy jest nadal HPLC w połączeniu z czułą detekcją elektrochemiczną lub fluorymetryczną, ze względu na jej wysoką czułość i dobrą selektywność. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół wstępnego leczenia i wykrywania katecholamin za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej z detekcją elektrochemiczną (HPLC-ECD) w rzeczywistych próbkach moczu niemowląt, przy użyciu elektroprzędzonych nanowłókien kompozytowych składających się z polimerowego eteru koronowego z polistyrenem jako adsorbentem, znanego również jako metoda ekstrakcji do fazy stałej z włóknami w upakowanych włóknach (PFSPE). Pokazujemy, w jaki sposób próbki moczu można łatwo wstępnie oczyścić za pomocą kolumny fazy stałej wypełnionej nanowłóknami oraz jak anality w próbce mogą być szybko wzbogacane, desorbowane i wykrywane w systemie ECD. PFSPE znacznie upraszcza procedury obróbki wstępnej próbek biologicznych, pozwalając na skrócenie czasu, kosztów i zmniejszenie utraty celów. 
Ogólnie rzecz biorąc, ta praca ilustruje prosty i wygodny protokół ekstrakcji do fazy stałej sprzężony z systemem HPLC-ECD do jednoczesnego oznaczania trzech neuroprzekaźników monoaminowych (noradrenaliny (NE), epinefryny (E), dopaminy (DA)) i dwóch ich metabolitów (3-metoksy-4-hydroksyfenyloglikol (MHPG) i kwas 3,4-dihydroksy-fenylooctowy (DOPAC)) w moczu niemowląt. Ustalony protokół zastosowano do oceny różnic w katecholaminach w moczu i ich metabolitach między niemowlętami wysokiego ryzyka z okołoporodowym uszkodzeniem mózgu a zdrowymi osobami z grupy kontrolnej. Analiza porównawcza wykazała istotną różnicę w MHPG w moczu między obiema grupami, co wskazuje, że metabolity katecholamin mogą być ważnym markerem kandydującym do wczesnej diagnozy przypadków zagrożonych uszkodzeniem mózgu u niemowląt.

Niniejszy protokół opisuje prostą i wygodną metodę PFSPE do wstępnego przygotowania próbek moczu i wzbogacania pięciu katecholamin w celu ich detekcji za pomocą systemu HPLC-ECD; schemat procesu przedstawiono na Rysunku 1. Protokół obejmuje głównie cztery etapy – aktywację, załadunek, płukanie i elucję – z wykorzystaniem niewielkiej ilości nanowłókien PCE-PS oraz prostego urządzenia do ekstrakcji do fazy stałej. Morfologię nanowłókien PCE-PS oceniono za pomoc...

Prezentujemy wygodną ekstrakcję do fazy stałej w połączeniu z wysokociśnieniową chromatografią cieczową (HPLC) z detekcją elektrochemiczną (ECD) do jednoczesnego oznaczania trzech neuroprzekaźników monoaminowych i dwóch ich metabolitów w moczu niemowląt. Identyfikujemy również metabolit MHPG jako potencjalny biomarker do wczesnej diagnostyki uszkodzeń mózgu u niemowląt.

Wygodna metoda ekstrakcji i analizy za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej neuroprzekaźników katecholaminy i ich metabolitów

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

Ogólnym celem tej procedury jest jednoczesne określenie trzech neuroprzekaźników monoaminowych i dwóch ich metabolitów w moczu niemowlęcia poprzez wygodną ekstrakcję do fazy stałej sprzężoną z wysokociśnieniową chromatografią cieczową z detekcją elektrochemiczną. Ta metoda może przewidywać i określać niestabilne związki docelowe w kompletnej próbce z łatwą obsługą w krótkim czasie. Twoje próbki mogą być łatwo wstępnie oczyszczone przez wąskie kworum z ciałem stałym wypełnionym włóknami, a anality w próbce można łatwo wzbogacić, rozpuścić i wykryć w systemie detekcji elektrochemicznej.Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że ekstrakcja i analiza neuroprzekaźników katecholaminowych w płynach biologicznych ma kluczowe znaczenie w ocenie funkcji oporności i związanych z nią chorób. Osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, będą miały trudności, ponieważ należy unikać ekspozycji na światło, a czas wstępnego leczenia powinien być jak najkrótszy. Procedurę demonstrują Lanlan Wei i Qing Han, dwaj doktoranci z naszego laboratorium.Na początek przygotuj dwa miligramy na mililitr roztworu podstawowego roztworu DPBA, rozpuszczając dwa miligramy zwi

a-convenient-method-for-extraction-analysis-with-high-pressure-liquid

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Ten protokół pokaże ekstrakcję i analizę wolnych i estryfikowanych bioaktywnych kwasów tłuszczowych z komórek. Kwasy tłuszczowe są dokładnie oznaczane ilościowo za pomocą rozcieńczania stabilnych izotopów, chiralnej chromatografii cieczowej, wychwytywania elektronów, atmosferycznej jonizacji chemicznej, wielokrotnego monitorowania spektrometrii mas (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Ekstrakcja lipidów komórkowych do ukierunkowanego rozcieńczania stabilnych izotopów Chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Przedstawiono protokół użycia wysokosprawnych kolumn do chromatografii cieczowej z przepływem reakcji dla metod wykorzystujących derywatyzację po kolumnie (PCD).

Derywatyzacja po kolumnie przy użyciu wysokosprawnych kolumn do chromatografii cieczowej z przepływem reakcji

Przedstawiono metodę identyfikacji gatunków materiału botanicznego poprzez bezpośrednią analizę w czasie rzeczywistym - spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości i wielowymiarowa analiza statystyczna.

Szybka, wysokoprzepustowa identyfikacja gatunków materiału botanicznego za pomocą bezpośredniej analizy w czasie rzeczywistym Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości

Selektywna i czuła metoda tandemowej chromatografii mas chromatografii cieczowej (LC-MS/MS) w połączeniu z efektywną ekstrakcją do fazy stałej na 96-dołkowej mikropłytce z wymianą kationową w trybie mieszanym (MCX) została opracowana do pomiaru wolnej 3-nitrotyrozyny (3-NT) w ludzkim moczu o wysokiej przepustowości, która jest odpowiednia do zastosowań klinicznych.

Integracja zminiaturyzowanej ekstrakcji do fazy stałej i wykrywania LC-MS/MS 3-nitrotyrozyny w ludzkim moczu do zastosowań klinicznych

Wychwyt synaptosomalnej dopaminy i wysokosprawna chromatografia cieczowa stanowią eksperymentalne narzędzia do badania homeostazy dopaminy u myszy, oceniając odpowiednio funkcję transportera dopaminy i poziom dopaminy w tkance prążkowia. W tym miejscu przedstawiamy protokoły pomiaru zawartości dopaminy w tkance oraz oceny funkcjonalności transportera dopaminy.

Ocena homeostazy dopaminergicznej u myszy za pomocą analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej i wychwytu synaptosomalnego dopaminy

Tutaj opisujemy wysokoprzepustową metodę kompleksowego nadzoru nad narkotykami, która pozwala na lepszą rozdzielczość i wykrywanie dużych paneli nadużywanych narkotyków i ich metabolitów, z kontrolą jakości opartą na wielosegmentowej elektroforezie kapilarnej i spektrometrii mas.

Wysokowydajny i kompleksowy nadzór nad lekami za pomocą wielosegmentowej elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas

Ta metoda wprowadza prostą technikę wykrywania endogennego uwalniania monoamin za pomocą ostrych wycinków mózgu. Zestaw wykorzystuje 48-dołkową płytkę zawierającą uchwyt na tkankę do uwalniania monoamin. Uwolniona monoamina jest analizowana za pomocą HPLC w połączeniu z detekcją elektrochemiczną. Ponadto technika ta zapewnia metodę przesiewową w celu odkrywania leków.

Test na płytce do pomiaru endogennego uwalniania monoamin w ostrych wycinkach mózgu

Protokoły opisują metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z indeksem załamania światła lub detekcją spektrometryczną mas do badania reakcji metabolicznych w złożonych systemach bezkomórkowych opartych na lizacie.

Chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas w celu profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie

Prezentujemy metodę szybkiej spektrometrii mas (MS)/spektrometrii mas (MS) opartej na adnotacji i klasyfikacji alkaloidów tropanowych, przydatną zarówno do wstępnej dereplikacji próbek zawierających tropan jak i odkrywania nowych alkaloidów do izolacji.

Zastosowania tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej w badaniach nad produktami naturalnymi: alkaloidy tropanowe jako studium przypadku

Poznaj wygodną metodę ekstrakcji na fazie stałej i chromatografii cieczowej do oznaczania neuroprzekaźników katecholaminowych w moczu niemowląt. Ta technika umożliwia wczesne wykrywanie uszkodzeń mózgu.

Wygodna metoda ekstrakcji i analizy za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej neuroprzekaźników katecholaminy i ich metabolitów (Wideo) | JoVE Journal

Wygodna metoda ekstrakcji i analizy za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej neuroprzekaźników katecholaminy i ich metabolitów

Przeglądaj więcej filmów