Wygodna metoda ekstrakcji i analizy za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej neuroprzekaźników katecholaminy i ich metabolitów

Ogólnym celem tej procedury jest jednoczesne określenie trzech neuroprzekaźników monoaminowych i dwóch ich metabolitów w moczu niemowlęcia poprzez wygodną ekstrakcję do fazy stałej sprzężoną z wysokociśnieniową chromatografią cieczową z detekcją elektrochemiczną. Ta metoda może przewidywać i określać niestabilne związki docelowe w kompletnej próbce z łatwą obsługą w krótkim czasie. Twoje próbki mogą być łatwo wstępnie oczyszczone przez wąskie kworum z ciałem stałym wypełnionym włóknami, a anality w próbce można łatwo wzbogacić, rozpuścić i wykryć w systemie detekcji elektrochemicznej.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że ekstrakcja i analiza neuroprzekaźników katecholaminowych w płynach biologicznych ma kluczowe znaczenie w ocenie funkcji oporności i związanych z nią chorób. Osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, będą miały trudności, ponieważ należy unikać ekspozycji na światło, a czas wstępnego leczenia powinien być jak najkrótszy. Procedurę demonstrują Lanlan Wei i Qing Han, dwaj doktoranci z naszego laboratorium.

Na początek przygotuj dwa miligramy na mililitr roztworu podstawowego roztworu DPBA, rozpuszczając dwa miligramy związku w jednym mililitrze wody destylowanej. Roztwór należy przechowywać w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotowując przedłużacze analitu, należy pamiętać, że struktura chemiczna i właściwości katecholamin są niestabilne, a ponieważ łatwo się rozkładają, proces przygotowania wypełniaczy musi być bardzo szybki i należy unikać ekspozycji na cienkie światło słoneczne.

Zważ 1,0 miligrama noradrenaliny, epinefryny, dopaminy, MHPG, DOPAC i wewnętrznego standardu DHBA w oddzielnych 1,5-mililitrowych probówkach do mikrowirówek. Dodaj 1,0 mililitra wody destylowanej, aby rozpuścić każdy ze związków, z wyjątkiem epinefryny, którą należy rozpuścić w roztworze kwasu solnego o stężeniu 0,01 mola na litr. Oscylować przygotowanymi wzorcami w ciemności z dużą prędkością, aż anality całkowicie się rozpuszczą.

Są to podstawowe zapasy i mogą być przechowywane w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres do kilku tygodni. Aby przygotować zapasy wtórnego analitu noradrenaliny, epinefryny, dopaminy, DOPAC i MHPG, przenieś pięć mikrolitrów każdego pierwotnego analitu do 4 975 mikrolitrów wody destylowanej w oddzielnych pięciomililitrowych probówkach wirówkowych. Codziennie przygotowuj świeże roztwory i przechowuj je w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia.

W przypadku DHBA przenieś pięć mikrolitrów surowca pierwotnego do 4 995 mikrolitrów wody destylowanej w pięciomililitrowej probówce wirówkowej i przechowuj ją oddzielnie w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wykonaj dalsze rozcieńczenia z wtórnym analitem, aby utworzyć krzywą standardową. Przechowuj roztwory w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza i codziennie przygotowuj świeże.

Następnie należy przetestować optymalne napięcie detektora ECD, używając standardowego kolby o odpowiednim stężeniu. Zmieniaj napięcie, aby znaleźć wartość, w której anality mają najlepszy wygląd piku. Aby przygotować 10 mililitrów rozpuszczalnika eluentu, użyj 5,5 mililitra wody destylowanej, a następnie dodaj 1,5 mililitra acetonitrylu i trzy mililitry kwasu fosforowego, kropla po kropli, do wody.

Aby przygotować fazę mobilną, odmierz składniki wymienione w protokole tekstowym do czystej litrowej butelki. Dodaj 40 mililitrów acetonitrylu i wody destylowanej do 1 000 mililitrów. Mieszać i wibrować ultradźwiękowo przez 15 minut, aż cała materia w roztworze się rozpuści.

Za pomocą pH-metru ze szklaną elektrodą dostosować wartość pH fazy ruchomej do 4,21 za pomocą nasyconego roztworu wodorotlenku sodu. Przefiltruj fazę ruchomą za pomocą mikroporowatej membrany z polifluorku winylidenu o grubości 0,45 mikrona i próżniowego urządzenia ssącego w celu usunięcia zanieczyszczeń. Użyj wibracji ultradźwiękowych przez 15 minut, aby odgazować fazę ruchomą za każdym razem przed użyciem.

Następnie należy wirować i odwirowywać próbki moczu w temperaturze 1 510 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć większość zakłóceń cząstek stałych. Zbierz supernatanty i odrzuć osad do dalszych eksperymentów. Aby skutecznie ekstrahować anality, natychmiast po odwirowaniu należy przystąpić do ekstrakcji w fazie stałej z wypełnionymi włóknami lub obróbki wstępnej PFSPE.

Aby aktywować nanowłókna, należy kolejno przecisnąć 100 mikrolitrów metanolu i 100 mikrolitrów wody przez kolumnę PFSPE za pomocą pięciomililitrowej strzykawki w powolny sposób kroplami. Próbka moczu musi być zmieszana z roztworem DPPA, aby poprawić jej hydrofobowość i pomóc katecholaminom i metabolitom wchłonąć się we włókna. Roztwór DHBA musi być również dodany jako wzorzec wewnętrzny.

Wymieszaj 100 mikrolitrów próbki moczu ze 100 mikrolitrami dwóch miligramów na mililitr roztworu DPBA i 30 mikrolitrami 100 nanogramów na mililitr roztworu wzorca wewnętrznego DHBA w 0,5 mililitrowej probówce Eppendorfa. Następnie przeciśnij zmieszany roztwór próbki przez kolumnę PFSPE za pomocą pięciomililitrowej plastikowej strzykawki gazowej, wykorzystując siłę ciśnienia powietrza. Wypłukać kolumnę trzykrotnie za pomocą pięciomililitrowej plastikowej strzykawki typu gazowego, aby załadować 100 mikrolitrów roztworu DPBA do kolumny SPE i powoli przepychać roztwór przez wkład pod ciśnieniem powietrza.

Ten etap płukania jest konieczny, ponieważ roztwór DPBA może usunąć zanieczyszczenia, podczas gdy anality są zatrzymywane, poprawiając w ten sposób czułość i selektywność analitów. Następnie załaduj 50 mikrolitrów eluentu na kolumnę PFSPE i przepchnij go przez kolumnę, zbierając eluat za pomocą 0,5-mililitrowej probówki Eppendorfa. Włącz odgazowywacz HPLC, aby odgazować powietrze w systemie.

Przed przystąpieniem do analiz próbek system powinien pracować dłużej niż 0,5 godziny z fazą ruchomą, aby zrównoważyć i zredukować szum linii podstawowej. Pobrać próbkę 20 mikrolitrów eluatu za pomocą automatycznego próbnika, a następnie wstrzyknąć ją do systemu HPLC ECD. Po zakończeniu przebiegów wyłącz komórkę detektora za pomocą interfejsu detektora.

Nie wyłączaj ogniwa za pomocą przełącznika z tyłu detektora, ponieważ może to spowodować uszkodzenie przyrządu. Ręcznie zmień skład fazy ruchomej na 10% metanolu i 90% wody. Po uruchomieniu przez co najmniej 30 minut ręcznie zmienić fazę ruchomą na metanol klasy HPLC.

Uruchom system na około 15 minut, aby chronić go w metanolu. Niewykonanie tego kroku zgodnie z zalecanym czasem pracy może spowodować uszkodzenie kolumny i detektora. Wyłącz przepływ, a następnie wyłącz odgazowywacz.

Przejdź do analizy katecholamin zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Chromatogram próbki wody wzbogaconej z tarczami i wzorcem wewnętrznym jest pokazany bez ekstrakcji. W warunkach HPLC określonych w protokole, pięć pików docelowych metody PFSPE jest dobrze oddzielonych i znacznie wyższych niż te ekstrahowane za pomocą dostępnego na rynku wkładu z kwasem fenyloboronowym.

Ponadto pik DOPAC nie pojawił się w wyniku ekstrakcji wkładu PBA, co wskazuje, że kolumna PBA nie była w stanie wyekstrahować DOPAC. Po pobraniu próbki moczu metoda PFSPE mogła nie tylko wyodrębnić cele z dobrą identyfikacją pików, ale także pozbyć się większości zakłóceń w moczu. Krzywe kalibracyjne zostały skonstruowane dla każdego związku poprzez wykreślenie stosunku powierzchni piku, wykazując dobrą liniowość przy niskim stężeniu.

W celu walidacji z prawdziwymi próbkami moczu przebadano próbki moczu 28 niemowląt wysokiego ryzyka i 22 zdrowych niemowląt. Podczas gdy niektóre katecholaminy nie różniły się znacząco między grupą wysokiego ryzyka a grupą zdrową, niemowlęta wysokiego ryzyka miały większe ilości metabolitu MHPG niż grupa kontrolna. W związku z tym poziom MHPG w moczu może być potencjalnym markerem wczesnej identyfikacji niemowląt wysokiego ryzyka.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku minut. Podejmując się zabiegu, należy pamiętać o przygotowaniu żużlu na świeżo, szybkiej obsłudze i zapobieganiu ekspozycji na bezpośrednie działanie promieni słonecznych. Kluczowe znaczenie ma również dodatek roztworu kwasu difenyloboranu na etapie absorpcji i płukania.

Po tej procedurze, jako miary braku terminacji katecholamin i metabolitów w osoczu lub płynie mózgowo-rdzeniowym. Alsliver można przeprowadzić w celu określenia uniwersalności tego protokołu w testowaniu innych płynów biologicznych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania związku między deficytami neurorozwojowymi a poziomem katecholamin w moczu w próbkach pobranych od dzieci.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić metodę ekstrakcji do fazy stałej za pomocą figur nair i prostego urządzenia, fibule powietrzne PCE PS korporacyjne odpady DPBA mogą pomóc w oczyszczeniu neuroprzekaźników katecholaminowych w próbkach moczu. Technika ta obejmuje wczesną diagnozę kasy zagrożonej uszkodzeniem mózgu u niemowląt. Ponieważ analiza porównawcza ujawniła nieprawidłowe różnice w jednoargumentowym MHPG u dzieci z autyzmem, co wskazuje, że metabolity katecholamin mogą być ważnym markerem kandydującym.