Ilościowa analiza immunofluorescencyjna całego mocowania populacji progenitorów serca w zarodkach myszy

Ogólnym celem tej metody jest ilościowa ocena lokalizacji i dystrybucji komórek progenitorowych serca podczas organogenezy serca. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju serca, pozwalając nam obserwować lokalizację populacji przodków serca podczas normalnego rozwoju embrionalnego. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że obrazowanie wolumetryczne może dostarczyć ilościowych informacji o dynamice poziomu tkanki oraz że proces analizy można zautomatyzować w celu poprawy odtwarzalności.

Chociaż metoda ta dostarcza informacji na temat wczesnej organogenezy serca, może być również zastosowana do ogólnych badań nad wczesną embriogenezą lub do morfogenezy innych interesujących narządów. Rankiem w ósmym dniu embrionalnym zdezynfekuj brzuch ciężarnej myszy 70% etanolem i wykonaj nacięcie brzucha zarówno przez skórę, jak i ścianę ciała. Zaczynając powyżej jednego jajowodu, ostrożnie rozetnij tłuszcz wzdłuż boku macicy aż do szyjki macicy.

Wykonaj nacięcie przez szyjkę macicy i kontynuuj do górnego końca drugiego przecięcia jajowodu, aby uwolnić całą macicę. Umyj nadmiar krwi z macicy w 10-centymetrowym naczyniu zawierającym świeży PBS i przetnij mezometrium między każdym deciduom. Przenieś zarodki do sześciocentymetrowego naczynia zawierającego świeży PBS pod mikroskopem preparacyjnym i użyj pięciu cienkich kleszczy, aby usunąć tkankę macicy z tkanki liściastego.

Następnie ostrożnie przekrój czubek embrionalnej połowy decydu, aby odsłonić zarodki, ściskając decyduom, aby ostrożnie popchnąć i wyciągnąć pierwszy zarodek. Wyciąć jak najwięcej dodatkowej tkanki embrionalnej bez uszkadzania morfologii zwierzęcia i użyć pipety transferowej, aby umieścić zarodek w 1,5-mililitrowej probówce zawierającej świeży PBS na lodzie. Po pobraniu wszystkich zarodków należy odessać PBS z każdej probówki i przepłukać zarodki świeżym PBS.

Po dokładnym odessaniu PBS z każdej probówki, utrwal zarodki w 4% paraformaldehydzie przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie trzy przepłucz świeżym PBS, a następnie przechowuj zarodki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Rozpocznij od zastąpienia PBS jednym mililitrem buforu blokującego na czterogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji zastąpić bufor blokujący odpowiednią mieszaniną przeciwciał pierwszorzędowych i rozcieńczonym buforem blokującym do inkubacji przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego ranka odessać nadmiar przeciwciał i umyć zarodki trzy razy przez godzinę na przemycie w 0,1% Triton w PBS. Po trzecim przemyciu dodać odpowiednią mieszaninę przeciwciał wtórnych do zarodków na trzygodzinną inkubację w temperaturze pokojowej, a następnie trzy przemycia, jak pokazano. Następnie przeciwbarwić zarodki DAPI w PBS przez 10 minut, a następnie dwa pięciominutowe płukania, a następnie powoli zawiesić zarodki w pożywce zapobiegającej blaknięciu, pozwalając zarodkom na równowagę przez co najmniej godzinę z okresowym delikatnym przesuwaniem, aby pomóc próbkom wpaść do roztworu.

Przed zamontowaniem zarodków wykonaj dwa równoległe stosy po pięć do sześciu warstw podwójnej taśmy klejącej w odległości od 15 do 20 milimetrów od siebie na jednym szkiełku mikroskopowym na zarodek i umieść 15 mikrolitrów kropli pożywki zapobiegającej blaknięciu na każdym szkiełku między stosami taśm. Ostrożnie przenieś jeden zarodek do każdej kropli i użyj mikroskopu rozwarstwiającego i cienkich kleszczy, aby ustawić zarodki tak, aby ich przednie strony były skierowane od szkiełka i osią ciała znajdowały się w jednej linii z długą osią szkiełek. Aby umieścić szkiełka nakrywkowe, najpierw oprzyj jedną stronę szkła na jednym stosie podwójnej taśmy klejącej i użyj kleszczyków, aby delikatnie opuścić szkiełko nakrywkowe, aż zetknie się z drugim stosem taśm

Szczególnie ważne jest staranne ustawienie i zamontowanie zarodków. Zarodki, które nie są prawidłowo umieszczone, będą znacznie trudniejsze do zobrazowania i mogą wymagać dodatkowego przetwarzania w celu uzyskania dobrych danych ilościowych. Za pomocą pipety dodaj dodatkowe medium zapobiegające blaknięciu między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym, aby zapobiec wysychaniu próbki podczas obrazowania, i wybierz obiektyw o największym dostępnym powiększeniu, który pozwala na uchwycenie całego obszaru półksiężyca serca w jednym polu widzenia.

Następnie ustaw parametry obrazowania, korzystając ze standardowych najlepszych praktyk obrazowania i użyj częstotliwości próbkowania Nyquista, aby określić wymiary XYZ woksela każdego zarodka. Aby przeanalizować obrazy zarodków, załaduj zestawy surowych danych obrazu do odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu i otwórz pierwszy plik w widoku przewyższającym. Dane zostaną załadowane w widoku 3D w trybie projekcji maksymalnej intensywności.

Otwórz okno regulacji wyświetlacza i wybierz tylko kanał odniesienia. W razie potrzeby dostosuj próg obrazu. Jeśli stosunek sygnału do szumu jest zbyt niski do segmentacji, dostosuj wartość gamma.

Przestrzeganie najlepszych praktyk podczas pozyskiwania obrazów ma kluczowe znaczenie dla uzyskania odpowiednich danych i będzie zależeć od konkretnej użytej konfiguracji mikroskopii. Jeśli potrzebna jest korekta wartości gamma, obrazy te nie powinny być używane do porównywania intensywności fluorescencji. Użyj okna dialogowego algorytmu powierzchni, aby utworzyć nową powierzchnię dla kanału odniesienia i zaznacz pole wyboru Tylko początek segmentu będącego przedmiotem zainteresowania.

Dostosuj obszar obwiedni tak, aby zawierał obszar zainteresowania wyznaczony przez plamę odniesienia, a następnie wybierz kanał referencyjny z menu rozwijanego kanału źródłowego. Ustaw wygładzanie na połowę rozmiaru woksela Z i użyj suwaków progowych, aby dostosować dolną granicę do jej bezwzględnej intensywności, aby upewnić się, że powierzchnia nie wykracza poza sygnał kanału. Przefiltruj obiekty według liczby wokseli lub woluminu, odrzucając wszystkie obiekty tła, które mogły zostać wygenerowane przez algorytm, i zakończ algorytm.

Następnie wybierz nowo utworzoną powierzchnię i wybierz funkcję zestawu maski z okna edycji. Wybierz interesujący Cię kanał eksperymentalny, zwracając uwagę, że zaznaczone jest pole wyboru Duplikuj kanał przed zastosowaniem maski i wybierz tylko kanał maski w oknie regulacji wyświetlania. Następnie utwórz nową powierzchnię, jak pokazano poniżej.

Aby uzyskać dane objętościowe dla każdej wybranej powierzchni, otwórz zakładkę podrzędną szczegółów na karcie statystyk i wybierz wartości średnie z menu rozwijanego. Całkowita objętość powierzchni zostanie znaleziona w kolumnie sumy wygenerowanej tabeli. Tutaj pokazano embrionalny zarodek myszy w dniu 8,25 z komórkami progenitorowymi układu sercowo-naczyniowego GFP z dodatnim wynikiem GFP znakowanymi przeciwciałem półksiężyca antysercowego, jak właśnie pokazano.

Po wybraniu kanału referencyjnego dla barwionej tkanki, intensywność i gamma są dostosowywane przed rozpoczęciem algorytmu tworzenia powierzchni. Wybierany jest obszar zainteresowania i wybierany jest poziom szczegółowości powierzchni. Powierzchnia początkowa jest progowana w celu uwzględnienia wszystkich rzeczywistych sygnałów na powierzchni.

Następnie przeprowadza się filtrowanie w celu usunięcia małych fragmentów tła w celu uzyskania ostatecznej powierzchni odniesienia. Wybierając powierzchnię odniesienia, kanał porównania może zostać zduplikowany i zamaskowany. Intensywność i gamma dla tego kanału są dostosowywane przed wygenerowaniem drugiej powierzchni w tej samej sekwencji kroków.

Całkowita objętość każdej powierzchni jest następnie obliczana automatycznie i może być porównywana zarówno ilościowo, jak i wizualnie. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że jakość wypreparowanych zarodków, skuteczność przeciwciał, orientacja montażu i konfiguracja obrazowania mają wpływ na jakość danych końcowych. Oprócz tego potoku analizy ilościowej można zastosować inne metody, takie jak dekonwolucja, w celu uzyskania dodatkowych danych jakościowych.

Po opracowaniu technologia ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się rozwojem serca do zbadania dynamiki nowych populacji progenitorów serca we wczesnej fazie embriogenezy.