Name: Ilościowa analiza immunofluorescencyjna całego mocowania populacji progenitorów serca w zarodkach myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy immunofluorescencyjnej całego mocowania do badania populacji progenitorów serca w zarodkach myszy. Technika ta umożliwia automatyzację analizy objętościowej tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez NIH/NHLBI R56 HL128646 oraz Mindich Child Health and Development Institute (MCHDI) przy ISMMS (do N.D.). E.B. jest wspierany przez NIH/NIDCR Traineeship T32 HD075735. Mikroskopia i analiza obrazu zostały przeprowadzone w Microscopy Core w Icahn School of Medicine w Mount Sinai, który jest częściowo wspierany przez Tisch Cancer Institute w Mount Sinai P30 CA196521 – Cancer Center Support Grant.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Icahn School of Medicine na Górze Synaj.
1. Zbieranie i przetwarzanie zarodków w stadium półksiężyca serca
<ol>
	<li>Skryj płodną samicę myszy z płodnym samcem reproduktora.</li>
	<li>Sprawdź, czy nie ma korka do kopulacji dopochwowej za pomocą sondy lub kleszczy. Południe w dniu wykrycia czopa jest uważane za dzień embrionalny (E) 0,5 (Zobacz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A dla pełnej osi czasu). 
	UWAGA: Wtyczki należy sprawdzać rano, ponieważ gubią się one w ciągu dnia.</li>
	<li>Rankiem 8 dnia (E8.25) należy złożyć ciężarną matkę w ofierze przez wdychanie CO2 lub zgodnie z lokalnymi i instytucjonalnymi przepisami. 
	UWAGA: Dokładny czas może być zależny od odkształcenia i powinien być określony empirycznie na podstawie morfologii.</li>
	<li>Spryskaj brzuch myszy 70% etanolem, aby oczyścić obszar i zminimalizować linienie. Odsłoń wnętrzności, wykonując nacięcie brzucha zarówno przez skórę, jak i ścianę ciała.</li>
	<li>Zlokalizuj macicę i ostrożnie usuń cały róg macicy ze zwierzęcia. Zacznij od wycięcia powyżej jednego jajowodu, odcinając tłuszcz z macicy, przechodząc do końca szyjki macicy. Przeciąć szyjkę macicy i kontynuować do górnego końca drugiego jajowodu, przecinając, aby uwolnić całą macicę.</li>
	<li>Umieść macicę w 10 cm naczyniu z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, pH 7,4), aby zmyć nadmiar krwi. Wykonaj subpreparację macicy, przecinając mezometrium między każdym decyduum, które zawiera zarodki. Przenieś zarodki do 6 cm naczynia ze świeżym PBS.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym użyj cienkich kleszczy (#7), aby usunąć tkankę macicy z tkanki dziesiętnej.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie przetnij czubek embrionalnej połowy deciduum, aby odsłonić zarodek. Ściśnij deciduum, aby wypchnąć zarodek i ostrożnie wyciągnij zarodek.</li>
	<li>Wypreparuj tkanki pozaembrionalne tak bardzo, jak to możliwe, nie uszkadzając morfologii zarodka (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B).</li>
	<li>Za pomocą pipety transferowej umieść zarodki w probówce o pojemności 1,5 ml ze świeżym PBS i umieść je na lodzie. Powtórz 1,7-1,9 dla pozostałych zarodków przed kontynuacją.</li>
	<li>Odessać PBS i spłukać raz PBS. Zasysać PBS. 
	UWAGA: Spróbuj usunąć jak najwięcej PBS bez uszkadzania lub wysuszania zarodków. Na wszystkich etapach zaleca się ręczne usuwanie roztworów, aby uniknąć utraty zarodków.</li>
	<li>Utrwalić zarodki za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS przez 1 godzinę w RT. 
	UWAGA: Zarodki można utrwalać przez noc (O/N) w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Spłucz trzy razy PBS. Przechowywać zarodki w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą gotowe do przeprowadzenia immunofluorescencji. 
	UWAGA: Punkt pauzy. Zarodki mogą być bezpiecznie przechowywane w PBS w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.</li>
</ol>
2. Barwienie immunofluorescencyjne
UWAGA: Poniższe warunki inkubacji mogą być dostosowane do różnych harmonogramów. Zaleca się stosowanie delikatnego potrząsania lub kołysania we wszystkich długich etapach inkubacji.
<ol>
	<li>Usunąć PBS i dodać 1 ml buforu blokującego (0,5% saponiny, 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS).</li>
	<li>Inkubować co najmniej 4 godziny w temperaturze pokojowej. Można to również zrobić O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć bufor blokujący i dodać mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczoną w buforze blokującym. Inkubować O/N w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Patrz sekcja Materiały, aby zapoznać się z opisem zastosowanych przeciwciał i sugerowanymi rozcieńczeniami. Rozcieńczenia przeciwciał należy oznaczyć empirycznie. Zaleca się stosowanie Nkx2-5 jako barwnika referencyjnego dla półksiężyca serca, co ma kluczowe znaczenie dla dalszej segmentacji i analizy obrazu.</li>
	<li>Usuń przeciwciała pierwszorzędowe przez aspirację.</li>
	<li>Umyć 3 razy po 1 godzinę z 0,1% Tritonem w PBS.</li>
	<li>Usunąć roztwór do płukania i dodać drugorzędową mieszaninę przeciwciał rozcieńczoną w buforze blokującym. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Można to również zrobić O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyć 3 razy po 1 godzinę z 0,1% Tritonem w PBS. Można to również zrobić O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Barwienie przeciwstawne 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) w PBS przez 10 min. 
	UWAGA: To barwienie przeciwstawne może być wykonywane jednocześnie z przeciwciałem drugorzędowym.</li>
	<li>Umyć 2 razy po 5 minut z 0,1% Tritonem w PBS.</li>
	<li>Powoli zawieszaj zarodki w pożywce montażowej zapobiegającej blaknięciu (2% w/v galusanu n-propylu (nPG), 90% glicerolu, 1x PBS; Zobacz sekcję Materiały, aby uzyskać więcej informacji). Pozostawić do zrównoważenia przez co najmniej 1 godzinę przed montażem. Od czasu do czasu delikatnie przesuwaj rurkę, aby zarodki wpadły do roztworu zapobiegającego blaknięciu. 
	UWAGA: Punkt pauzy. Zarodki można przechowywać przez kilka dni w roztworze zapobiegającym blaknięciu, aż będą gotowe do zamontowania i zobrazowania.</li>
</ol>
3. Montaż zarodków do mikroskopii
<ol>
	<li>Przygotuj szkiełka mikroskopowe do montażu za pomocą taśmy dwusztyftowej lub silikonowych przekładek. Jeśli używasz taśmy dwuklejowej, ułóż dwa równoległe stosy po 5-6 warstw w odległości około 15-20 mm od siebie. Pozostawi to wystarczająco dużo miejsca, aby umieścić zarodki i zabezpieczyć szkiełko nakrywkowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Umieść 15 μl kropli środka zapobiegającego blaknięciu na szkiełku, między taśmą z podwójnym klejem. Ostrożnie przenieś jeden zarodek na szkiełko. 
	UWAGA: Na szkiełku można umieścić więcej niż jeden zarodek. Jednak kolejne etapy orientacji są trudniejsze w przypadku wielu zarodków, a długi czas obrazowania może prowadzić do fotowybielania.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą cienkich kleszczy ustaw zarodek tak, aby przednia strona była skierowana od szkiełka z osią ciała w jednej linii z długą osią szkiełka. Zobacz Rysunek 1C dla schematu montażu.</li>
	<li>Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na próbce, opierając jedną stronę na jednym stosie podwójnej taśmy klejącej i używając kleszczyków, delikatnie opuść szkiełko nakrywkowe, aż zetknie się z drugą taśmą. 
	UWAGA: Kroki 3.3 i 3.4 mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia prawidłowej orientacji zarodka do obrazowania. Opuszczając szkiełko nakrywkowe wzdłuż kierunku tylnego do przedniego, zarodek nie powinien się toczyć, a obszar półksiężyca serca pozostanie zorientowany z dala od szkiełka, co jest idealne do obrazowania pod mikroskopem odwróconym.</li>
	<li>Użyj pipety, aby dodać dodatkowy środek zapobiegający blaknięciu między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym, aby zapobiec wygaśnięciu próbki podczas przechowywania/obrazowania.</li>
</ol>
4. Obrazowanie konfokalne
<ol>
	<li>Uzyskuj obrazy przy użyciu obiektywu o największym powiększeniu, który pozwala na uchwycenie całego obszaru półksiężyca serca w jednym polu widzenia. Użyj częstotliwości próbkowania Nyquist, aby określić wymiary wokseli x-y-z. Większość producentów mikroskopów ma przycisk "optymalizuj", aby zapewnić pobieranie próbek Nyquist. 
	UWAGA: Barwienie dla Nkx2-5 jest tutaj korzystne, ponieważ wyznaczy cały obszar półksiężyca serca. Mniejsze rozmiary kroku Z (nadpróbkowanie) zapewnią lepsze wyniki modelowania 3D, ale mogą prowadzić do wydłużenia czasu akwizycji i/lub wybielania niektórych próbek.</li>
	<li>Skonfiguruj parametry obrazowania, korzystając ze standardowych najlepszych praktyk obrazowania. Mianowicie, użyj najniższej możliwej intensywności lasera, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu dla każdego fluoroforu i wybierz poziomy wzmocnienia i przesunięcia, które dają szeroki zakres dynamiki bez nasycania sygnału. 
	UWAGA: Zachowaj spójność z parametrami obrazowania między próbkami, które będą bezpośrednio porównywane. Jest to szczególnie ważne w przypadku dalszej analizy 3D i kwantyfikacji.</li>
</ol>
5. Analiza obrazu i ilościowe modelowanie 3D
UWAGA: Dla tego protokołu, obrazy były analizowane za pomocą pakietu oprogramowania Imaris. Podobna analiza może być możliwa przy użyciu alternatywnych pakietów. Poniższy opis obejmuje potok analizy dla kanału referencyjnego (tj. Nkx2-5) i jednego kanału eksperymentalnego (tj. YFP). Dodatkowe kanały mogą być analizowane poprzez powtarzanie tych kroków. Podano przykładowy zestaw danych, którego można użyć do odtworzenia poniższej analizy.
<ol>
	<li>Załaduj zestawy danych surowego obrazu do widoku Imaris Arena i otwórz plik dla żądanego zarodka w widoku Surpass. Dane powinny być ładowane w widoku 3D w trybie MIP (maks.). Otwórz okno Regulacja wyświetlania i wybierz tylko kanał odniesienia.</li>
	<li>W razie potrzeby dostosuj próg obrazu, aby uzyskać lepszą wizualizację. Na potrzeby tej analizy dostosuj współczynnik gamma, jeśli stosunek sygnału do szumu jest zbyt niski do segmentacji. 
	UWAGA: W przypadku wykonywania korekcji gamma, które są korektami nieliniowymi, skorygowane obrazy nie mogą być używane do pomiarów lub porównań intensywności. Na tym etapie można przeprowadzić dalszą wstępną obróbkę obrazu (tj. korekcję oświetlenia, rozmycie gaussowskie lub inne filtrowanie), jeśli stosunek sygnału do szumu nie jest zadowalający. Jeśli zdecydujesz się na przetwarzanie wstępne, musisz wykonać te same kroki przetwarzania wstępnego dla wszystkich obrazów w zestawie danych.</li>
	<li>Utwórz nową powierzchnię dla kanału odniesienia, korzystając z okna dialogowego Algorytm powierzchni.
	<ol>
		<li>Zaznacz pole wyboru "Podziel na segmenty tylko obszar zainteresowania".</li>
		<li>Dopasuj obszar obwiedni tak, aby zawierał obszar zainteresowania (ROI, tj. obszar półksiężyca serca) wyznaczony przez plamę odniesienia.</li>
		<li>Wybierz kanał referencyjny z menu rozwijanego Kanał źródłowy. Domyślne ustawienie wygładzania (równe rozmiarowi woksela z) jest zazwyczaj wystarczające, ale może wymagać optymalizacji empirycznej. Do tej analizy należy użyć wygładzania równego połowie rozmiaru woksela z.</li>
		<li>Wykonaj progowanie według intensywności bezwzględnej. Aby upewnić się, że powierzchnia nie wykracza poza sygnał kanału, wyreguluj dolną granicę za pomocą suwaków. 
		UWAGA: W przypadku niektórych obrazów, na których komórki można łatwo nakreślić, możesz dołączyć algorytm "podzielonych dotykających się obiektów", aby jeszcze bardziej oddzielić sygnał od tła.</li>
		<li>Filtruj obiekty według liczby wokseli lub głośności i odrzucaj obiekty tła (małe lub znajdujące się w obszarach poza obszarem Nkx2-5), które mogły zostać wygenerowane przez algorytm. Zakończ algorytm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Korzystając z nowo utworzonej powierzchni, utwórz zamaskowany kanał dla kanału eksperymentalnego.
	<ol>
		<li>Po wybraniu powierzchni wybierz opcję "Maska Sel ... ͟" w oknie Edycja.</li>
		<li>Wybierz interesujący Cię kanał eksperymentalny (np. YFP). Upewnij się, że pole wyboru "Duplikuj kanał przed zastosowaniem maski" jest zaznaczone.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W oknie Display Adjustment (Dopasowanie wyświetlania) wybierz tylko zamaskowany kanał. Utwórz nową powierzchnię dla maskowanego kanału, wykonując kroki 5.3-5.3.5. 
	UWAGA: W tym momencie pomocne może być dostosowanie wyglądu każdej maski, aby ułatwić wizualizację modelu 3D: Zaznacz każdą powierzchnię i wybierz kartę kolorów. W razie potrzeby dostosuj kolor podstawowy i przezroczystość. Kolory powierzchni nie są scalane, gdy się nakładają.</li>
	<li>Aby uzyskać dane objętościowe, przy każdej wybranej powierzchni należy wybrać kartę Statystyka. W podzakładce "Szczegółowe" wybierz "Wartości średnie" z menu rozwijanego. Całkowitą objętość powierzchni można znaleźć w kolumnie Suma wygenerowanej tabeli. 
	UWAGA: Jeśli wygenerowana powierzchnia zawiera błędne fragmenty (tj. fragmenty, które nie są wyłączone z sygnału tła podczas segmentacji lub obszary nieciągłe od powierzchni głównej), może być konieczne ręczne obliczenie całkowitej objętości lub przefiltrowanie powierzchni według objętości lub liczby wokseli i upewnienie się, że w obliczeniach uwzględnione są tylko segmenty sygnału. Objętość dla każdej części powierzchni można znaleźć, wybierając opcję "Wszystkie wartości" z menu rozwijanego. Wybranie każdej wartości spowoduje, że odpowiadający jej region będzie wyglądał na żółty, co pomoże w określeniu wartości do wykluczenia.</li>
</ol>

<ol><li>Kretzschmar, K., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/abstract/S0092-8674(12)00003-7">Lineage tracing.</a> Cell. 148, 33-45 (2012).</li>
<li>Tam, P., Parameswaran, M., Kinder, S., Weinberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+allocation+of+epiblast+cells+to+the+embryonic+heart+and+other+mesodermal+lineages%3A+the+role+of+ingression+and+tissue+movement+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation.</a> Dev Camb Engl. 124, 1631-1642 (1997).</li>
<li>Lawson, K., Meneses, J., Pedersen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+epiblast+fate+during+germ+layer+formation+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo.</a> Dev Camb Engl. , 891-911 (1991).</li>
<li>Kinder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orderly+allocation+of+mesodermal+cells+to+the+extraembryonic+structures+and+the+anteroposterior+axis+during+gastrulation+of+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">The orderly allocation of mesodermal cells to the extraembryonic structures and the anteroposterior axis during gastrulation of the mouse embryo.</a> Dev Camb Engl. 126, 4691-4701 (1999).</li>
<li>Keegan, B. R., Meyer, D., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+cardiac+chamber+progenitors+in+the+zebrafish+blastula%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Organization of cardiac chamber progenitors in the zebrafish blastula.</a> Development. 131, 3081-3091 (2004).</li>
<li>Saiz, N., Williams, K., Seshan, V., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asynchronous+fate+decisions+by+single+cells+collectively+ensure+consistent+lineage+composition+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Asynchronous fate decisions by single cells collectively ensure consistent lineage composition in the mouse blastocyst.</a> Nat Commun. 7, 13463(2016).</li>
<li>Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+Protein+Expression+to+Study+Lineage+Specification+in+Mouse+Preimplantation+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos.</a> J. Vis. Exp. , e53654(2016).</li>
<li>Cullen-McEwen, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tools+for+analysis+of+the+ureteric+tree+in+the+developing+mouse+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging tools for analysis of the ureteric tree in the developing mouse kidney.</a> Methods Mol. Biol. 1075, 305-320 (2014).</li>
<li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Mount+Dissection+and+Immunofluorescence+of+the+Adult+Mouse+Cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea.</a> J Vis Exp. , (2016).</li>
<li>Calderon, D., Bardot, E., Dubois, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Early+Heart+Development+to+Instruct+Stem+Cell+Differentiation+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Probing Early Heart Development to Instruct Stem Cell Differentiation Strategies.</a> Dev. Dyn. , (2016).</li>
<li>Meilhac, S., Lescroart, F., Blanpain, C., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Cell+Lineages+that+Form+the+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect.+Med%22%5BJournal%5D)">Cardiac Cell Lineages that Form the Heart.</a> Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a013888-a013888 (2014).</li>
<li>Kelly, R., Buckingham, M., Moorman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Fields+and+Cardiac+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect.+Med%22%5BJournal%5D)">Heart Fields and Cardiac Morphogenesis.</a> Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a015750-a015750 (2014).</li>
<li>Cai, C. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isl1+Identifies+a+Cardiac+Progenitor+Population+that+Proliferates+Prior+to+Differentiation+and+Contributes+a+Majority+of+Cells+to+the+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Isl1 Identifies a Cardiac Progenitor Population that Proliferates Prior to Differentiation and Contributes a Majority of Cells to the Heart.</a> Dev Cell. 5, 877-889 (2003).</li>
<li>Sbalzarini, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3A+Quantifying+is+convincing%3A+Computational+image+analysis+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Anat.+Embryol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing: Quantifying is convincing: Computational image analysis in biology.</a> Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 219, 1-39 (2016).</li>
<li>Myers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+bioimage+informatics+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Why bioimage informatics matters.</a> Nat. Methods. 9, 659-660 (2012).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J. Cell Biol. 172, 9-18 (2006).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+software+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological imaging software tools.</a> Nat. Methods. 9, 697-710 (2012).</li>
<li>Horn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mind+bomb+1+is+required+for+pancreatic+%CE%B2-cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Mind bomb 1 is required for pancreatic β-cell formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 7356-7361 (2012).</li>
<li>Bardot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxa2+identifies+a+cardiac+progenitor+population+with+ventricular+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Foxa2 identifies a cardiac progenitor population with ventricular differentiation potential.</a> Nat Commun. 8, 14428(2017).</li>
<li>Adams, M. W., Loftus, A. F., Dunn, S. E., Joens, M. S., Fitzpatrick, J. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy+%28LSFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy (LSFM).</a> Curr. Protoc. Cytom. 2015, (2015).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li>
<li>Johnson, S., Rabinovitch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+imaging+of+excised+tissue+using+vital+dyes+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy.</a> Curr. Protoc. Cytom. , (2012).</li>
<li>Burtscher, I., Lickert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxa2+regulates+polarity+and+epithelialization+in+the+endoderm+germ+layer+of+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Foxa2 regulates polarity and epithelialization in the endoderm germ layer of the mouse embryo.</a> Development. 136, 1029-1038 (2009).</li>
<li>Baron, M. H., Mohn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryonic+explant+culture+system+for+analysis+of+hematopoietic+and+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Mouse embryonic explant culture system for analysis of hematopoietic and vascular development.</a> Methods Mol. Med. 105, 231-256 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Powyższy protokół opisuje strategię uzyskiwania danych ilościowych z wysokiej jakości obrazów immunofluorescencyjnych całej góry zarodków myszy po implantacji. Przy prawidłowym wykonaniu, dane wolumetryczne 3D wygenerowane na tych etapach mogą być wykorzystane do analizy porównawczej i intersekcjonalnej wielu domen w zarodku. Opisane podejście do maskowania sygnałów powierzchniowych jest szczególnie przydatne podczas badania nowych populacji komórek w porównaniu z dobrze ugruntowanymi strukturami odniesienia.
<p clas...

Badanie organogenezy od dawna opiera się na obserwacji zdarzeń morfogenetycznych w rozwijającym się zarodku. Badania te często opierają się na użyciu barwników fluorescencyjnych lub reporterów śledzących linię w połączeniu z znakowaniem zdefiniowanych populacji referencyjnych. 1 Porównując względne pozycje tych etykiet, można uzyskać informacje na temat pochodzenia, ruchu lub ostatecznego wkładu interesującej nas populacji. Eksperymenty z przeszczepami i mapowaniem losu wykorzystują morfologiczne punkty orientacyjne lub wstrzyknięcie barwników do linii nieruchliwych w celu zdefiniowania punktu początkowego komórek będących przedmiotem zainteresowania, które są następnie badane pod kątem wkładu w rozwinięty zarodek. 2,3,4,5 Eksperymenty genetyczne śledzące pochodzenie wykorzystują tę samą koncepcję z dobrze zdefiniowanymi allelami reporterowymi, które są używane do oznaczania populacji komórek bez eksperymentalnej manipulacji. Kluczem do tych podejść jest możliwość określenia, z wysoką rozdzielczością przestrzenną, lokalizacji etykiet eksperymentalnych i referencyjnych. Podejścia te przyniosły znaczący postęp w rozwoju przedimplantacyjnym i badaniach organogenezy eksplantatów. 6,7,8,9
Wydarzenia rozwojowe, które leżą u podstaw morfogenezy serca, są coraz lepiej opisane w ostatnich latach. 10 Jednym z głównych odkryć w tej dziedzinie badań jest opis wielu populacji przodków, które można rozróżnić na podstawie ekspresji unikalnych markerów. 11 Te populacje obejmują Pierwsze i Drugie Pole Serca (FHF i SHF), które są obecne w obrębie półksiężyca serca po przedniej stronie zarodka w 8,25 dniu rozwoju embrionalnego (E). 12 Populacje te są często badane za pomocą kombinacji mikroskopii szerokokątnej, która dostarcza informacji na poziomie tkanki, oraz seryjnego cięcia z testami immunofluorescencyjnymi, które oferują wysoką rozdzielczość komórkową, ale tylko dwuwymiarową informację przestrzenną. 13 Tak więc, chociaż te badania znacznie poszerzyły nasze zrozumienie rozwoju serca, dostępne metody ograniczyły dogłębną analizę ilościową morfogenezy na tych etapach, tworząc potrzebę podejścia do zbadania organizacji tych populacji na poziomie całego organizmu.
Ostatnie osiągnięcia zarówno w mikroskopii konfokalnej, jak i analizie obrazów 3D pozwalają na algorytmiczne rekonstrukcje komórek i struktur in situ o wysokiej rozdzielczości i przepustowości ze względną łatwością, torując w ten sposób drogę do szczegółowych badań złożonych struktur komórkowych. 14 Wraz ze wzrostem mocy obliczeniowej i rozwojem algorytmów zarządzania dużymi zbiorami danych, które są niezbędne do radzenia sobie z wykładniczym wzrostem rozmiaru zbiorów danych obrazowania, analizy mogą być teraz w pełni zautomatyzowane. 15 Automatyczna analiza zbiorów danych obrazowych ma tę zaletę, że jest bezstronna, ale jest tylko tak wiarygodna, jak jakość wejściowego zestawu danych; Dlatego konieczne jest stosowanie najlepszych praktyk podczas pozyskiwania i wstępnego przetwarzania obrazu, aby zapewnić najwyższą jakość, bezstronną analizę. 16 Protokoły mogą być całkowicie zautomatyzowane i współdzielone w celu zapewnienia odtwarzalności, a algorytmy używane przez oprogramowanie własnościowe są łatwo dostępne za pośrednictwem bibliotek do użytku przez naukowców, którzy są zaznajomieni z nowoczesnymi zastrzeżonymi lub otwartymi narzędziami programistycznymi. 17
Poniższy protokół wyjaśnia niezbędne kroki do przeprowadzenia takiej analizy na jednym dobrze zdefiniowanym modelu organogenezy, tworzenia się półksiężyca serca podczas rozwoju serca. W szczególności protokół ten opisuje, jak (1) zbierać i preparować zarodki w stadium półksiężyca serca, (2) wykonywać immunofluorescencję całego wierzchowca w celach referencyjnych (Nkx2-5) i eksperymentalnych (Foxa2Cre:YFP18,19), (3) przygotowywać i obrazować zarodki za pomocą mikroskopii konfokalnej, a na koniec (4) analizować i określać ilościowo wynikowe obrazy przy użyciu zaawansowanych podejść trójwymiarowych. Chociaż półksiężyc serca jest tutaj używany jako przykład, przy odpowiedniej modyfikacji, protokół ten może być używany do analizy wielu linii od zarodków gastrula do wczesnego stadium somitu.

<table><tbody><tr><td>sonda</td><td>Roboz</td><td>RS-9580</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td></td></tr><tr><td>Drobne kleszcze</td><td>Roboz</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8022</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>RPI</td><td>A4490</td><td></td></tr><tr><td>Goat anty-NKX2-5</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-8697</td><td>Używany w 1:100-1:500</td></tr><tr><td>Kurczak anty-GFP</td><td>abcam</td><td>ab13970</td><td>Używany w 1:500</td></tr><tr><td>Królik anty-Islet1</td><td>abcam</td><td>ab109517</td><td>Używany w 1:100</td></tr><tr><td>Królik anty-HCN4</td><td>Millipore</td><td>AB5808</td><td>Używany w 1:100</td></tr><tr><td>488 anty-kurczak</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-546-155</td><td>Rozpuszczony w wodzie i przechowywany w temperaturze -20 &deg; C w końcowym stężeniu 50% glicerolu. Używany w 1:500.</td></tr><tr><td>555 anty-kozioł</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21432</td><td>Używany w 1:500</td></tr><tr><td>647 anty-królik</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-606-152</td><td>Rozpuszczony w wodzie i przechowywany w temperaturze -20 &deg; C w końcowym stężeniu 50% glicerolu. Używany w 1:500.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>galusan n-propylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2370</td><td>Roztwór podstawowy to 20% w/v w DMSO. Roztwór roboczy przygotowany przez zmieszanie 1 części 10x PBS z 9 częściami 100% glicerolu i powolne dodawanie 0,1 części roztworu podstawowego.</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus VWR</td><td>Scientific</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 22x22 mm</td><td>VWR Scientific</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 8.4.1</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowa analiza immunofluorescencyjna całego mocowania populacji progenitorów serca w zarodkach myszy

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Wykorzystanie coraz bardziej zaawansowanych technik obrazowania przyczyniło się znacznie do naszego lepszego zrozumienia rozwoju embrionalnego. Rozwój preimplantacyjny i organogeneza to dwa obszary badań, które w znacznym stopniu skorzystały na tych postępach ze względu na wysoką jakość danych, które można uzyskać bezpośrednio z obrazowania zarodków przedimplantacyjnych lub narządów ex vivo. Podczas gdy zarodki przed implantacją dostarczyły danych o szczególnie wysokiej rozdzielczości przestrzennej, późniejsze etapy były mniej podatne na rekonstrukcję trójwymiarową. Uzyskanie wysokiej jakości danych 3D lub wolumetrycznych dla znanych struktur embrionalnych w połączeniu z mapowaniem losów lub śledzeniem linii genetycznych pozwoli na bardziej kompleksową analizę zdarzeń morfogenetycznych zachodzących podczas embriogenezy.
Ten protokół opisuje całościowe podejście immunofluorescencyjne, które pozwala na etykietowanie, wizualizację i kwantyfikację populacji komórek progenitorowych w obrębie rozwijającego się półksiężyca sercowego, kluczowej struktury powstałej podczas rozwoju serca. Podejście to zostało zaprojektowane w taki sposób, aby można było uzyskać informacje zarówno na poziomie komórki, jak i tkanki. Wykorzystując mikroskopię konfokalną i przetwarzanie obrazu, protokół ten pozwala na trójwymiarową przestrzenną rekonstrukcję półksiężyca serca, zapewniając tym samym możliwość analizy lokalizacji i organizacji określonych populacji progenitorów podczas tej krytycznej fazy rozwoju serca. Co ważne, zastosowanie przeciwciał referencyjnych pozwala na sukcesywne maskowanie półksiężyca serca i późniejsze pomiary ilościowe obszarów w obrębie półksiężyca. Protokół ten nie tylko umożliwi szczegółowe badanie wczesnego rozwoju serca, ale wraz z adaptacjami powinien mieć zastosowanie do większości układów narządów w gastruli do wczesnego stadium somitowego zarodka myszy.

Jakość końcowych danych i analizy zależy w dużej mierze od (1) integralności i morfologii wypreparowanych zarodków, (2) zastosowania przeciwciał o wysokiej swoistości oraz (3) prawidłowego ustawienia parametrów obrazowania. Uszkodzone zarodki będą zaburzać proces generowania powierzchni i utrudnią analizę ilościową. Przykłady prawidłowo wypreparowanych i określonych pod względem stadium rozwoju zarodków przedstawiono na Rysunku 2B. Zarodki można dodatkowo pre...

Tutaj opisujemy protokół immunofluorescencji całego wierzchowca i ilościowej analizy objętościowej zarodków myszy we wczesnym stadium rozwoju. Przedstawiamy tę technikę jako potężne podejście do jakościowej i ilościowej oceny struktur serca podczas rozwoju i sugerujemy, że może być ona szeroko adaptowalna do innych układów narządów.

Ilościowa analiza immunofluorescencyjna całego mocowania populacji progenitorów serca w zarodkach myszy

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Ogólnym celem tej metody jest ilościowa ocena lokalizacji i dystrybucji komórek progenitorowych serca podczas organogenezy serca. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju serca, pozwalając nam obserwować lokalizację populacji przodków serca podczas normalnego rozwoju embrionalnego. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że obrazowanie wolumetryczne może dostarczyć ilościowych informacji o dynamice poziomu tkanki oraz że proces analizy można zautomatyzować w celu poprawy odtwarzalności.Chociaż metoda ta dostarcza informacji na temat wczesnej organogenezy serca, może być również zastosowana do ogólnych badań nad wczesną embriogenezą lub do morfogenezy innych interesujących narządów. Rankiem w ósmym dniu embrionalnym zdezynfekuj brzuch ciężarnej myszy 70% etanolem i wykonaj nacięcie brzucha zarówno przez skórę, jak i ścianę ciała. Zaczynając powyżej jednego jajowodu, ostrożnie rozetnij tłuszcz wzdłuż boku macicy aż do szyjki macicy.Wykonaj nacięcie przez szyjkę macicy i kontynuuj do górnego końca drugiego przecięcia jajowodu, aby uwolnić całą macicę. Umyj nadmiar krwi z macicy w 10-centymetrowym naczyniu zawierającym świeży PBS i przetnij mezometrium

quantitative-whole-mount-immunofluorescence-analysis-cardiac

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy zastosowanie testu opartego na komórkach ES myszy w celu zidentyfikowania krytycznych okien czasowych aktywacji sygnałów Wnt/β-catenin i BMP podczas indukcji kardiogennej. Metoda ta stanowi standaryzowaną platformę, która pozwala na wiarygodne ilościowe określenie wydajności kardiogennej i może być stosowana do badania innych linii komórkowych.

Zmodyfikowany test oparty na mysich embrionalnych komórkach macierzystych do ilościowego określania wydajności indukcji kardiogennej

Opisujemy szereg metod wstrzykiwania barwników, wektorów DNA, wirusów i komórek w celu monitorowania zarówno losu komórek, jak i fenotypu endogennych i szczepionych komórek pochodzących z komórek embrionalnych lub pluripotencjalnych w embrionalnych zarodkach myszy w dniu embrionalnym (E)9.5 i późniejszych etapach rozwoju.

Znakowanie i wstrzykiwanie komórek w rozwijających się embrionalnych sercach myszy

Analiza ekspresji białek w młodych embrionalnych zastawkach myszy została utrudniona przez ograniczoną dostępną tkankę. Manuskrypt ten zawiera protokół przygotowania białka z rozwijających się embrionalnych obszarów zastawki myszy do analizy western blot.

Izolacja białka z rozwijającego się zarodkowego regionu zastawki serca myszy

Mutacje, które prowadzą do wrodzonych wad serca, korzystają z badań in vivo struktury serca podczas rozwoju, ale badania strukturalne w wysokiej rozdzielczości na embrionalnym sercu myszy są technicznie trudne. W tym miejscu przedstawiamy solidną metodę immunofluorescencji i analizy obrazu w celu oceny struktur specyficznych dla kardiomiocytów w rozwijającym się sercu myszy.

Analiza rozwoju kardiomiocytów za pomocą immunofluorescencji w embrionalnym sercu myszy

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Opisujemy protokół do wolumetrycznego obrazowania komórek znakowanych białkiem fluorescencyjnym głęboko w nienaruszonych sercach embrionalnych i pourodzeniowych. Wykorzystując metody oczyszczania tkanek w połączeniu z barwieniem całego wierzchowca, pojedyncze komórki znakowane białkiem fluorescencyjnym wewnątrz serca embrionalnego lub pourodzeniowego mogą być wyraźnie i dokładnie zobrazowane.

Obrazowanie oczyszczonych serc embrionalnych i pourodzeniowych w rozdzielczości pojedynczej komórki

W tej metodzie, embrionalne tkanki serca są chirurgicznie mikropreparowane, dysocjowane, znakowane fluorescencyjnie i wszczepiane do tkanek embrionalnych gospodarza. Stanowi to platformę do badania indywidualnej lub tkankowej organizacji rozwoju w ektopowych warunkach hemodynamicznych i/lub zmienionym środowisku parakrynnym/juktakrynowym.

System mikroiniekcji do implantacji in vivo kardiomiocytów zarodkowych w zarodku ptaków

Prezentujemy protokoły do badania rozwoju serca myszy za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej na pełnych zarodkach myszy wypreparowanych z komorowych specyficznych dla komór MLC-2v-tdPomidorowych myszy reporterowych. Metoda ta pozwala nam bezpośrednio uwidocznić każdy etap powstawania komory podczas rozwoju serca myszy bez pracochłonnych metod histochemicznych.

Analiza rozwoju komory serca podczas embriogenezy myszy z wykorzystaniem epifluorescencji całej góry

Celem tej metody jest generowanie in vitro komórek progenitorowych serca specyficznych dla pola serca w celu zbadania specyfikacji komórek progenitorowych i właściwości funkcjonalnych, a także generowanie komórek serca specyficznych dla komory do modelowania chorób serca.

Wytwarzanie in vitro komórek progenitorowych serca specyficznych dla pola serca

Dostarczanie komórek pod kontrolą ultradźwięków w miejscu zawału mięśnia sercowego u myszy jest bezpiecznym, skutecznym i wygodnym sposobem przeszczepu komórek.

Indukowana ultradźwiękami indukowana pluripotencjalna implantacja kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych u myszy z zawałem mięśnia sercowego

Przedstawiamy szczegółowy protokół hodowli i obrazowania embrionów myszy, który umożliwia obrazowanie 3D + czasowe komórek progenitorowych serca. Ten zestaw narzędzi wideo omawia kluczowe umiejętności wymagane do skutecznego obrazowania na żywo, które w przeciwnym razie byłyby trudne do zdobycia z publikacji tekstowych.

Obrazowanie na żywo wczesnych progenitorów serca w zarodku myszy

Poznaj metodę ilościowej analizy immunofluorescencyjnej całego mocowania do badania populacji progenitorów serca w zarodkach myszy. Technika ta umożliwia automatyzację analizy objętościowej tkanek.

Ilościowa analiza immunofluorescencyjna całego mocowania populacji progenitorów serca w zarodkach myszy

Przeglądaj więcej filmów