Name: Pomiar odpowiedzi przeciwciał neutralizujących grypę na wirusy A(H3N2) w surowicach ludzkich za pomocą testów mikroneutralizacji z wykorzystaniem komórek MDCK-SIAT1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Poznaj test mikroneutralizacji z komórkami MDCK-SIAT1 do pomiaru przeciwciał neutralizujących wirusy grypy A(H3N2) w surowicach ludzkich. Ta metoda pozwala ocenić skuteczność szczepień przeciw grypie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Xiuhua Lu, dr Feng Liu i pani Ashley Burroughs z Wydziału ds. Grypy CDC za ich krytyczną recenzję i pomoc w przygotowaniu tego manuskryptu. Dziękujemy dr Adrianowi Reberowi z Wydziału ds. Grypy CDC za pomoc w przygotowaniu grafiki do rysunku 3. Na koniec dziękujemy dr M. Matrosovichowi z Marburga w Niemczech za dostarczenie komórek MDCK-SIAT1.

<ol><li>Reber, A., Katz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+assessment+of+influenza+vaccines+and+immune+correlates+of+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+of+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection.</a> Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).</li>
<li>Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlates+of+protection+against+influenza+infection+in+humans--on+the+path+to+a+universal+vaccine%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+in+Immunol%22%5BJournal%5D)">Correlates of protection against influenza infection in humans--on the path to a universal vaccine?</a> Curr Opin in Immunol. 25, 470-476 (2013).</li>
<li>WHO Global Influenza Surveillance Network. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Manual+for+the+labratory+diagnosis+and+virological+surveillence+of+influenza%22">Manual for the labratory diagnosis and virological surveillence of influenza</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548090_eng.pdf">http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548090_eng.pdf</a> (2011).</li>
<li>Govorkova, E. A., Kodihalli, S., Alymova, I. V., Fanget, B., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+immunogenicity+of+influenza+viruses+cultivated+in+Vero+or+MDCK+cells+and+in+embryonated+chicken+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biological+Stand%22%5BJournal%5D)">Growth and immunogenicity of influenza viruses cultivated in Vero or MDCK cells and in embryonated chicken eggs.</a> Dev Biological Stand. 98, discussion 73-34 39-51 (1999).</li>
<li>WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the northern hemisphere influenza season. , 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/201703_recommendation.pdf?ua=1">http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/201703_recommendation.pdf?ua=1</a> 2017-2018 (2017).</li>
<li>Levine, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+Antibody+Responses+to+Antigenically+Drifted+Influenza+A%28H3N2%29+Viruses+among+Children+and+Adolescents+following+2014-2015+Inactivated+and+Live+Attenuated+Influenza+Vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol+%3A+CVI%22%5BJournal%5D)">Neutralizing Antibody Responses to Antigenically Drifted Influenza A(H3N2) Viruses among Children and Adolescents following 2014-2015 Inactivated and Live Attenuated Influenza Vaccination.</a> Clin Vaccine Immunol : CVI. 23, 831-839 (2016).</li>
<li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+characteristics+and+antigenic+properties+of+recently+emerged+subclade+3C.3a+and+3C.2a+human+influenza+A%28H3N2%29+viruses+passaged+in+MDCK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+Other+Respir+Viruses%22%5BJournal%5D)">The characteristics and antigenic properties of recently emerged subclade 3C.3a and 3C.2a human influenza A(H3N2) viruses passaged in MDCK cells.</a> Influenza Other Respir Viruses. , (2017).</li>
<li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuraminidase+receptor+binding+variants+of+human+influenza+A%28H3N2%29+viruses+resulting+from+substitution+of+aspartic+acid+151+in+the+catalytic+site%3A+a+role+in+virus+attachment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Virol%22%5BJournal%5D)">Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment?</a> J of Virol. 84, 6769-6781 (2010).</li>
<li>Skowronski, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+acquired+during+cell+culture+isolation+may+affect+antigenic+characterisation+of+influenza+A%28H3N2%29+clade+3C.2a+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveillance%22%5BJournal%5D)">Mutations acquired during cell culture isolation may affect antigenic characterisation of influenza A(H3N2) clade 3C.2a viruses.</a> Euro Surveillance. 21, 30112(2016).</li>
<li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+alpha-2%2C6-sialyltransferase+in+MDCK+cells+increases+influenza+virus+sensitivity+to+neuraminidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Virol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the alpha-2,6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors.</a> J of Virol. 77, 8418-8425 (2003).</li>
<li>Oh, D. Y., Barr, I. G., Mosse, J. A., Laurie, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDCK-SIAT1+cells+show+improved+isolation+rates+for+recent+human+influenza+viruses+compared+to+conventional+MDCK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">MDCK-SIAT1 cells show improved isolation rates for recent human influenza viruses compared to conventional MDCK cells.</a> J Clin Microbiol. 46, 2189-2194 (2008).</li>
<li>US Department of Health and Human Services. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biosafety+in+Microbiological+and+Biomedical+Laboratories%22">Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories</a>. , (2009).</li>
<li>Reed, H. M. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/aje/article-abstract/27/3/493/99616/A-SIMPLE-METHOD-OF-ESTIMATING-FIFTY-PER-CENT?redirectedFrom=PDF">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> The American Journal of Hygiene. 27, (1938).</li>
<li>Laurie, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Laboratory+Comparison+of+Influenza+Microneutralization+Assays+for+A%28H1N1%29pdm09%2C+A%28H3N2%29%2C+and+A%28H5N1%29+Influenza+Viruses+by+CONSISE%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Vaccine+Immunol+%3A+CVI%22%5BJournal%5D)">International Laboratory Comparison of Influenza Microneutralization Assays for A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and A(H5N1) Influenza Viruses by CONSISE.</a> Clinical Vaccine Immunol : CVI. 22, 957-964 (2015).</li>
<li>Lin, Y., Gu, Y., McCauley, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+Quantitative+Micro-neutralization+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay.</a> J Vis Exp : JoVE. , (2016).</li>
<li>van Baalen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ViroSpot+microneutralization+assay+for+antigenic+characterization+of+human+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">ViroSpot microneutralization assay for antigenic characterization of human influenza viruses.</a> Vaccine. 35, 46-52 (2017).</li>
<li>WHO. Recommended composition of infleunza virus vaccines for use in the 2015-2016 northern heamisphere infleunza season. , 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/2015_16_north/en">http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/2015_16_north/en</a> 2015-2016 (2015).</li>
<li>WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2016-2017 northern hemisphere influenza season. , 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/201602_recommendation.pdf?ua=1">http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/201602_recommendation.pdf?ua=1</a> 2016-2017 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów. Ustalenia i wnioski zawarte w tej publikacji są ustaleniami i wnioskami autorów i niekoniecznie reprezentują poglądy Centrów Kontroli i Prewencji Chorób oraz agencji finansującej.

Test MN jest jednym z głównych testów stosowanych w serologii grypy w celu wykrycia odpowiedzi przeciwciał po zakażeniu grypą lub szczepieniu. Miana uzyskane z testów MN są często wykorzystywane jako główny wynik wielu badań serologicznych dotyczących grypy. Testy MN są również szeroko stosowane w diagnostyce serologicznej i ocenie immunogenności szczepionki. Przeprowadzono międzynarodowe badania międzylaboratoryjne w celu porównania testów MN przeprowadzonych w wielu laboratoriach14.
<p class...

Wirusy grypy nadal powodują zachorowalność i śmiertelność w populacji ludzkiej każdego roku. Kwas hialuronowy jest główną glikoproteiną powierzchniową wirusów grypy. Przeciwciała neutralizujące skierowane przeciwko HA są głównym mechanizmem immunologicznym, który koreluje z ochroną przed zakażeniem grypą1,2. Testy hamowania hemaglutynacji (HI) i testy MN to dwie metody szeroko stosowane do pomiaru odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich po zakażeniu grypą lub szczepieniu3. Test HI mierzy hamowanie przeciwciał hemaglutynacji wirusa czerwonych krwinek i jest uważany za test zastępczy. W przeciwieństwie do HI, test MN może bezpośrednio mierzyć poziom przeciwciał w surowicach ludzkich, które neutralizują zakażenie grypą w hodowlach komórkowych. Komórki MDCK są często używane do izolacji wirusa grypy i testów MN4.
Wirusy grypy nieustannie przechodzą antygenowy dryf i przesunięcia, nabywając mutacje na białkach HA, które mogą zmienić specyficzność wiązania receptorów wirusów. Od 2014 r. pojawiły się nowe skupiska wirusów A(H3N2), które krążyły aż do obecnego sezonu. Większość tych wirusów należy do grupy genetycznej 3C.2a i 3C.3a opartej na analizie filogenetycznej białek HA. Wiele krążących wirusów 3C.2a miało zmniejszoną zdolność do hemaglutynacji czerwonych krwinek i dlatego nie można ich scharakteryzować za pomocą testów HI5. Testy neutralizacji muszą być stosowane do pomiaru odpowiedzi przeciwciał na te wirusy, które nie hemaglutynują 6. Co więcej, badania wykazały, że te współczesne wirusy A(H3N2) mają zmienione właściwości wiązania receptora w porównaniu z wcześniejszymi wirusami A(H3N2) i mają tendencję do akumulacji mutacji i polimorfizmu dostosowanych do hodowli kultur komórkowych in vitro7,8,9. W porównaniu z konwencjonalnymi komórkami MDCK, MDCK-SIAT1 jest linią komórkową opracowaną przez Matrosovicha i wsp. poprzez stabilną transfekcję komórek MDCK z cDNA ludzkiej α2,6-sialtransferazy (SIAT1). Ta linia komórkowa wykazuje ekspresję zwiększonych ilości ugrupowań α2,6-sjalowej galaktozy i zmniejszone ilości ugrupowań kwasu α2,3-sjalowego niż macierzyste komórki MDCK10. Wykazano, że komórki MDCK-SIAT1 poprawiają wskaźniki izolacji wirusów A(H3N2) w porównaniu z komórkami MDCK11. Ostatnio Lin i wsp. stwierdzono, że w przypadku nowo powstałych wirusów grypy ludzkiej A(H3N2) 3C.2a i 3C.3a wierniejsze replikacje wirusa i lepsza zakaźność wirusa zostały osiągnięte, gdy wirusy były hodowane w liniach komórkowych MDCK-SIAT1 w porównaniu z komórkami MDCK7. W związku z tym komórki MDCK-SIAT1 lepiej nadają się w testach MN do charakteryzowania odpowiedzi przeciwciał na niedawne klastry wirusów A(H3N2).
Tutaj opisujemy test MN wykorzystujący komórki MDCK-SIAT1 do pomiaru odpowiedzi przeciwciał na współczesne wirusy 3C.2a i 3C.3a A(H3N2) w surowicy ludzkiej. W tym teście można wykorzystać wirusy wyhodowane w jajach lub komórkach. Surowice inaktywowane termicznie zawierające przeciwciała neutralizujące są najpierw seryjnie rozcieńczane, a następnie inkubowane ze 100 TCID50 / studzienkę wirusa grypy A (H3N2), aby umożliwić przeciwciała w surowicy związanie się z wirusem. Komórki MDCK-SIAT1 są następnie dodawane do mieszaniny wirus-przeciwciało i inkubowane przez 18 - 20 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , aby umożliwić wirusowi A(H3N2) zakażenie komórek MDCK-SIAT1 i replikację. Po całonocnej inkubacji płytki są utrwalane, a ilość wirusa w każdym studzience jest oznaczana ilościowo za pomocą testu ELISA przy użyciu przeciwciał monoklonalnych NP przeciwko grypie A. Wykrycie NP wskazuje na obecność infekcji wirusowej i brak przeciwciał neutralizujących. Miano przeciwciał neutralizujących definiuje się jako odwrotność najwyższego rozcieńczenia surowicy, która zapewnia ≥ 50% zahamowanie zakaźności wirusa.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy Nauki</td><td>przyrodnicze</td><td>11965</td><td>Krytyczny składnik sterylnej hodowli komórek, namnażania wirusów i pożywki rozcieńczalnika wirusów</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Hyklon</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA) frakcja V, wolna od protazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3117332001</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Nauki przyrodnicze</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Life Science</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Sól dwusiarczanowa Geneticin G-418&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1720-5G&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Science</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Nauki przyrodnicze</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>VWR</td><td>67-64-1</td><td>Stosowany w stężeniu 80%</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowo-cytrynianowy z nadboranem sodu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBF2806V</td><td></td></tr><tr><td>tabletka dichlorowodorku O-fenylenodiaminy</td><td>Sigma-Aldrich SLBQ1086V</td><td></td><td>1 tabletka na 100 ml wody klasy hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A510-P500</td><td>Używany 0,5 M stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Etanol, denaturowany, 4L</td><td>VWR</td><td>EM-AX0422-3</td><td>Stosowany w stężeniu 70%</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Nauki przyrodnicze</td><td></td><td></td>1748048</tr><tr><td>RDE II "Seiken"</td><td>Denka Seiken</td><td>370013</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Mysz monoklonalna Ab</td><td>Millipore pool</td><td>anty-NP MAB 8257 MAB 8258</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mysie IgG HRP&nbsp;</td><td>KPL</td><td>074-1802</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki płaskodenne</td><td>Thermo Scientific</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>Urządzenie molekularne</td><td>Spectromax 384 plus</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych 162 cm2/Nasadka odpowietrzająca</td><td>Corning/VWR</td><td>3151</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar odpowiedzi przeciwciał neutralizujących grypę na wirusy a(h3n2) w surowicach ludzkich za pomocą testów mikroneutralizacji z wykorzystaniem komórek mdck-siat1

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Przeciwciała neutralizujące przeciwko hemaglutyninie (HA) wirusów grypy są uważane za główny mechanizm immunologiczny, który koreluje z ochroną przed infekcjami grypy. Testy mikroneutralizacji (MN) są często stosowane do pomiaru odpowiedzi przeciwciał neutralizujących w surowicach ludzkich po szczepieniu lub zakażeniu grypą. Komórki Madine Darby Canine Kidney (MDCK) są powszechnie stosowanym substratem komórkowym do testów MN. Jednak obecnie krążące wirusy grypy 3C.2a i 3C.3a A(H3N2) uzyskały zmienioną specyficzność wiązania receptorów. Udowodniono, że linia komórkowa MDCK-SIAT1 ze zwiększonymi α-2,6 sjalowymi ugrupowaniami galaktozy na powierzchni zapewnia lepszą zakaźność i wierniejsze replikacje niż konwencjonalne komórki MDCK dla tych współczesnych wirusów A(H3N2). W tym miejscu opisujemy test MN przy użyciu komórek MDCK-SIAT1, który został zoptymalizowany pod kątem ilościowego określania miana przeciwciał neutralizujących przeciwko tym współczesnym wirusom A (H3N2). W tym protokole inaktywowane termicznie surowice zawierające przeciwciała neutralizujące są najpierw seryjnie rozcieńczane, a następnie inkubowane ze 100 TCID50 / studzienka wirusów grypy A (H3N2), aby umożliwić przeciwciałom w surowicy związanie się z wirusami. Komórki MDCK-SIAT1 są następnie dodawane do mieszaniny wirus-przeciwciało i inkubowane przez 18 - 20 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , aby umożliwić wirusom A (H3N2) zakażenie komórek MDCK-SIAT1. Po całonocnej inkubacji płytki są ustalane, a ilość wirusa w każdym dołku jest oznaczana ilościowo za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) przy użyciu przeciwciał monoklonalnych nukleoproteiny A (NP) przeciwko grypie. Miano przeciwciał neutralizujących definiuje się jako odwrotność najwyższego rozcieńczenia surowicy, która zapewnia ≥50% zahamowanie zakaźności wirusa.

Oznaczenie zakaźności zapasów wirusa jest pierwszym krokiem w teście MN. Rysunek 2 przedstawia układ płytki służący do wyznaczenia TCID50 zapasów wirusa. W przypadku zapasów wirusa o nieznanej zakaźności, można przeprowadzić miareczkowanie z wielu wstępnych rozcieńczeń, na przykład zarówno 10-2, jak i 10-3, aby uzyskać optymalną krzywą miareczkowania do obliczenia zakaźności wirusa. Ilość wirusa użyta w teście MN powinna zosta...

Przeciwciała neutralizujące grypę korelują z ochroną przed infekcjami grypowymi. Testy mikroneutralizacji mierzą przeciwciała neutralizujące w surowicach ludzkich i są często stosowane w serologii grypy u ludzi. Opisujemy test mikroneutralizacji z wykorzystaniem komórek MDCK-SIAT1 do pomiaru miana przeciwciał neutralizujących wobec współczesnych wirusów 3C.2a i 3C.3a A(H3N2) po szczepieniu lub zakażeniu grypą.

Pomiar odpowiedzi przeciwciał neutralizujących grypę na wirusy A(H3N2) w surowicach ludzkich za pomocą testów mikroneutralizacji z wykorzystaniem komórek MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Ogólnym celem tego testu mikroneutralizacji jest pomiar odpowiedzi przeciwciał neutralizujących na współczesne wirusy grypy H3N2 w surowicach ludzkich przy użyciu komórek MDCK-SIAT1. Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w celu oceny odporności na grypę. Na przykład może określić, czy szczepienie przeciwko grypie wywołuje wystarczającą odpowiedź przeciwciał neutralizujących na krążące wirusy H3N2, aby zapobiec infekcji.Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona komórki MDCK-SIAT1 i testy mikroneutralizacji do wykrywania odpowiedzi przeciwciał na zresetowanie klastrów antygenowych wirusów grypy H3N2. Stada wirusa powinny być rozmnażane do wysokich mian zakaźnych przed użyciem w testach mikroneutralizacji. Rozpocznij tę procedurę od namnażania wirusów AH3N2 w komórkach MDCK-SIAT1, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Pierwszego dnia należy rozmrozić fiolkę z wirusem w temperaturze pokojowej i natychmiast umieścić wirusa na lodzie. Aby przetestować wirusa w dwóch różnych początkowych rozcieńczeniach, najpierw dodaj 100 mikrolitrów wirusa do 99 mililitrów rozcieńczalnika wirusa w celu wstępnego rozcieńczenia 10:2. Następnie dodaj 1 mililitr wstępnego rozcieńczenia 10:2 do 9 mililitrów rozcieńczalnika wirusowego do wstępnego rozcieńczenia 10:3.Używając dwóch płytek do mikromiareczkowania, dodaj 100 mikrolitrów mikrorozcieńczalnika do wszystkich studzienek, z wyjątkiem pierwszej kolumny 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. Następnie wykonaj rozcieńczenia pół log 10. Dodać 146 mikrolitrów wirusa, zaczynając od rozcieńczenia, do wszystkich studzienek w kolumnie pierwszej, i szeregowo przenieść 46 mikrolitrów z kolumny pierwszej do kolumny jedenastej.Zmieniaj końcówki pipet między kolumnami. Po wymieszaniu kolumny jedenastej wyrzuć końcówki w rozcieńczeniu 46 mikrolitrów. Użyć kolumny dwunastej jako kontrolnej komórki, która zawiera tylko rozcieńczalnik wirusa.Następnie inkubuj płytkę przez godzinę, w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla. Przygotuj komórki MDCK-SIAT1 zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonych komórek do każdego dołka na płytkach do mikromiareczkowania.I przykryj talerze. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, przez 18 do 20 godzin. W drugim dniu należy przeprowadzić test ELISA, najpierw usuwając pożywkę z płytek do mikromiareczkowania.Po umyciu każdej studzienki 200 mikrolitrami PBS, dodaj 300 mikrolitrów zimnego 80% acetonu do każdej studzienki. I inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie usuń utrwalacz.I pozostaw talerze do wyschnięcia na powietrzu. Następnie rozcieńczyć przeciwciało monoklonalne nukleoproteiny przeciw grypie A do stężenia docelowego w rozcieńczalniku przeciwciała. Umyj płytki trzykrotnie 300 mikrolitrami buforu do mycia.Następnie dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego do każdej studzienki. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez godzinę. W celu dodania przeciwciała wtórnego rozcieńczyć kozią anty-mysią IgG sprzężoną z przeciwciałem HRP do docelowego stężenia w rozcieńczalniku przeciwciała.Umyj płytki trzykrotnie 300 mikrolitrami buforu do mycia. Dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała wtórnego do każdej studzienki przed inkubacją płytki w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie umyj płytki pięciokrotnie 300 mikrolitrami buforu do mycia.I dotknij niestrzępiącej się chusteczki. Dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego podłoża do każdej studzienki. I inkubować w temperaturze pokojowej, aż rozwój koloru się nasyci, a gęstość optyczna lub OD studzienek kontrolnych komórek będzie mniejsza niż 0,2.Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do wszystkich studzienek. Odczytać średnicę zewnętrzną studzienek przy 490 nanometrach za pomocą spektrofotometru mikropłytkowego. Oblicz TCID50 wirusa za pomocą metody Reeda-Muencha, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.W pierwszym dniu testu MN rozmrozić surowice w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i usunąć natychmiast po rozmrożeniu. Podgrzej i aktywuj surowice ludzkie przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 56 stopni Celsjusza, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie umieścić surowice na lodzie i dodać rozcieńczalnik wirusa do surowicy, aby uzyskać wstępne rozcieńczenie w stosunku 1:10.Aby przeprowadzić test z jednym wirusem, dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczalnika wirusa do rzędów od B do H, z wyjątkiem kolumn 11 i 12. Następnie dodać 100 mikrolitrów surowicy rozcieńczonej w stosunku 1:10 do kolumn od A1 do A10. Wykonać dwukrotne seryjne rozcieńczenie od rzędów A do H. I wyrzucić ostatnie 50 mikrolitrów w rzędzie H. W celu kontroli wirusa dodać 50 mikrolitrów rozcieńczalnika wirusa do studzienek A12, B12, C12 i D12.W celu kontroli komórki dodać 100 mikrolitrów rozcieńczalnika wirusa do studzienek E12, F12, G12 i H12. Do surowic kontrolnych dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonych surowic kontrolnych do studzienki A, kolumna 11. I dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczalnika wirusa do studzienek od B11 do H11.Przejdź do szeregowego rozcieńczania w dół. Przykryj płytki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, aż będą gotowe do dodania wirusa. W celu dodania wirusa należy rozcieńczyć wirusa do 100 TCID50 w 50 mikrolitrach z rozcieńczalnikiem do wirusa.Dodać 50 mikrolitrów rozcieńczonego wirusa do wszystkich studzienek, z wyjątkiem kolumny 11 na tylnych płytkach miareczkowania i studzienek kontrolnych komórek, E12, F12, G12 i H12 na wszystkich płytkach. Dodać 50 mikrolitrów rozcieńczalnika do wirusów do wszystkich studzienek w kolumnie 11. Następnie dodaj 50 mikrolitrów wirusa w 100 TCID50 w 50 mikrolitrach do pierwszego dołka.Następnie wymieszaj i przenieś 50 mikrolitrów do kolejnych studzienek, aby wykonać dwukrotne seryjne rozcieńczenia. Wymieniaj końcówki pipet między studzienkami, aby uniknąć przenoszenia wirusa. Wyrzuć 50 mikrolitrów z dołka H11.Następnie dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczalnika wirusa do kolumny 11, aby doprowadzić końcową objętość do 100 mikrolitrów. Stuknij w talerze, aby wymieszać. Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, przez godzinę, przed wykonaniem dodawania komórek MDCK pierwszego dnia i ELISA drugiego dnia, tak jak poprzednio.Po dodaniu przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przeprowadzić dodawanie substratu i odczyt płytki. Umyj płytki pięć razy 300 mikrolitrami buforu do mycia i postukaj w niestrzępiącą się chusteczkę. Dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego substratu OPD do każdej studzienki.Następnie inkubuj płytki w temperaturze pokojowej, aż studzienki kontrolne wirusa osiągną gęstość optyczną 490 nanometrów między 0,8 a 3 z kontrolą komórki przy niskim poziomie tła OD mniejszym niż 0,2. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do wszystkich studzienek. Odczytać średnicę zewnętrzną studzienek przy 490 nanometrach za pomocą spektrofotometru mikropłytkowego.Na koniec należy określić miano przeciwciał neutralizujących w każdej próbce surowicy, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Reprezentatywne wyniki testów mikroneutralizacji przedstawiono tutaj. OD w każdym dołku reprezentuje ilość infekcji wirusowej i replikacji w komórkach MDCK-SIAT1, w obecności seryjnie rozcieńczonych surowic zawierających przeciwciała neutralizujące.Granicę 50% neutralizacji definiuje się jako medianę OD studzienek kontrolnych wirusa plus medianę OD studzienek kontrolnych komórek, podzieloną przez dwa, odwrotność najwyższego rozcieńczenia surowicy, która osiąga równą lub większą niż 50% neutralizacja, jest uważana za miano przeciwciał dla próbki surowicy. W tym przykładzie sparowane surowice pobrane przed i po szczepieniu przeciwko grypie od dwóch pacjentów zostały przetestowane pod kątem wirusa H3N2 stosowanego w szczepionce w sezonie grypowym 2016-2017. W przypadku surowic przedszczepieniowych pacjenta 1 żadna z rozcieńczeń surowicy nie hamowała infekcji wirusowej, dlatego uważa się, że jest ona ujemna.Po szczepieniu surowice od tego pacjenta wykazały neutralizację. Trzecie rozcieńczenie z tej surowicy jest najwyższym rozcieńczeniem poniżej granicy 50%, dlatego ten pacjent ma miano poszczepienne wynoszące 40. Dla porównania, surowica od drugiego pacjenta przed szczepieniem zawiera wcześniej istniejące przeciwciała neutralizujące o mianie 320.Po szczepieniu miano wzrosło do ponad 1280. W tym przypadku, przy wstępnym rozcieńczeniu surowicy w stosunku 1:10, nie uzyskano końcowego miana przeciwciał. Surowicę można ponownie przebadać przy wyższym rozcieńczeniu wstępnym w celu uzyskania miana końcowego.Testy mikroneutralizacji z wykorzystaniem komórek MDCK-SIAT1 są bardzo czułe, specyficzne i wytrzymałe w wykrywaniu odpowiedzi przeciwciał neutralizujących dla najnowszych klastrów antygenowych wirusów grypy H3N2. Dzięki zastosowaniu zwykłych komórek MDCK, procedura ta może być również stosowana do wykrywania odpowiedzi przeciwciał na inne szczepy wirusów H3N2 i inne podtypy wirusów grypy, w celu oceny odporności ochronnej na grypę.

measuring-influenza-neutralizing-antibody-responses-to-h3n2-viruses

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje testy mikroneutralizacji do pomiaru przeciwciał neutralizujących za pomocą komórek nerki Madin-Darby Canine nadekspresji kwasu sjalowego związanego z α2,6 w surowicy ludzkiej. Ten test jest często stosowany w badaniach serologicznych grypy u...

Test mikroneutralizacji do pomiaru miana przeciwciał neutralizujących w surowicy ludzkiej

Ten film demonstruje test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu do analizy relacji antygenowych między wirusami grypy A i B. Zapewnia ilościowy i wizualny sposób oceny skuteczności przeciwciał lub innych metod leczenia w zapobieganiu infekcji wirusowej.

Analiza związku antygenowego między wirusami przy użyciu testu mikroneutralizacji opartego na obrazie

Ten film demonstruje technikę generowania wariantów ucieczki neutralizujących przeciwciał monoklonalnych wirusa grypy. Zawiesina wirusa zneutralizowanego przez przeciwciała jest wstrzykiwana do zarodków jaj kurzych w celu selektywnego rozmnażania wariantów ucieczki. W ten sposób powstaje populacja wirusa składająca się głównie z wariantów ucieczki, potwierdzonych za pomocą testu hemaglutynacji.

Wytwarzanie wariantów ucieczki wirusa grypy przeciwko przeciwciałom neutralizującym

Ten film pokazuje test mierzący miano przeciwciał influenza neuraminidazy (NA) w próbce surowicy. Próbkę surowicy zawierającą przeciwciała przeciwko NA dodaje się do płytki mikrodołkowej pokrytej fetuiną. Po dodaniu wirusa przeciwciała zapobiegają rozszczepianiu przez wirusa NA fetuiny i odsłanianiu jej ugrupowania galaktozy. Następnie dodaje się lektynę sprzężoną z peroksydazą, która wiąże się z odsłoniętą galaktozą. Miano przeciwciał hamujących NA określa się za pomocą testu...

Test do pomiaru miana przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy

Ten film demonstruje test immunofluorescencyjny przeznaczony do pomiaru neutralizacji ludzkiego wirusa cytomegalii (HCMV). Przeciwciała specyficzne dla wirusa miesza się z wirusem i inkubuje z ludzkimi komórkami fibroblastów. Przeciwciała neutralizują wirusa, uniemożliwiając mu infekowanie komórek gospodarza, podczas gdy niezneutralizowane wirusy infekują komórki. Po inkubacji stopień neutralizacji określa się poprzez ilościowe oznaczanie komórek zakażonych wirusem za pomocą immunofluorescencji.

Metoda immunofluorescencyjna do pomiaru neutralizacji ludzkiego wirusa cytomegalii

Opisujemy test lektyny sprzężony z enzymem (ELLA) do pomiaru miana przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy (NA) w surowicach. Test wykorzystuje aglutyninę z orzeszków ziemnych do ilościowego określenia reszt galaktozy, które stają się dostępne, gdy NA usuwa kwas sjalowy z 96-dołkowych płytek pokrytych fetuiną.

Pomiar mian przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy za pomocą testu lektyny sprzężonej z enzymem

To badanie opisuje test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu, aby przeanalizować relacje antygenowe między wirusami. Protokół wykorzystuje skaner płaski i składa się z czterech etapów, w tym miareczkowania, miareczkowania, neutralizacji i kwantyfikacji neutralizacji. Test działa dobrze z obecnymi krążącymi wirusami grypy A(H1N1)pdm09, A(H3N2) i B.

Optymalizacja ilościowego testu mikroneutralizacji

Przedstawione protokoły opisują, jak przeprowadzić test hamowania hemaglutynacji w celu ilościowego określenia miana przeciwciał specyficznych dla grypy z próbek surowicy biorców szczepionki przeciw grypie. Pierwszy test określa optymalne stężenia antygenu wirusowego za pomocą hemaglutynacji. Drugi test określa ilościowo miana przeciwciał swoistych dla grypy poprzez hamowanie hemaglutynacji.

Zoptymalizowany test hamowania hemaglutynacji (HI) do ilościowego określania mian przeciwciał specyficznych dla grypy

Wirusy grypy typu A (IAV) są ważnymi ludzkimi patogenami układu oddechowego. Aby zrozumieć patogenność wirusów IAV i przeprowadzić badania przedkliniczne nowych metod szczepień, potrzebne są modele zwierzęce naśladujące ludzką fizjologię. W tym miejscu opisujemy techniki oceny patogenezy IAV, odpowiedzi humoralnych i skuteczności szczepionki przy użyciu mysiego modelu infekcji.

Badania wirusa grypy A w mysim modelu infekcji

Opisujemy metodę, za pomocą której identyfikujemy krytyczne pozostałości wymagane do wiązania ludzkich lub mysich przeciwciał monoklonalnych, które celują w wirusową hemaglutyninę wirusów grypy A. Protokół można dostosować do innych glikoprotein powierzchniowych wirusa i odpowiadających im przeciwciał neutralizujących.

Wytwarzanie wariantów ucieczki neutralizujących przeciwciał monoklonalnych wirusa grypy

Tutaj opisujemy protokół pakowania pseudowirusów i pomiaru aktywności neutralizującej przeciwciała.

Otrzymywanie pseudotypowych wirusów ptasiej grypy H5 metodą transfekcji fosforanu wapnia i pomiar aktywności neutralizującej przeciwciała

Poznaj test mikroneutralizacji z komórkami MDCK-SIAT1 do pomiaru przeciwciał neutralizujących wirusy grypy A(H3N2) w surowicach ludzkich. Ta metoda pozwala ocenić skuteczność szczepień przeciw grypie.

Pomiar odpowiedzi przeciwciał neutralizujących grypę na wirusy A(H3N2) w surowicach ludzkich za pomocą testów mikroneutralizacji z wykorzystaniem komórek MDCK-SIAT1 (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar odpowiedzi przeciwciał neutralizujących grypę na wirusy A(H3N2) w surowicach ludzkich za pomocą testów mikroneutralizacji z wykorzystaniem komórek MDCK-SIAT1

Przeglądaj więcej filmów