Test inwazji przy użyciu macierzy 3D
Naukowcy opracowali modele 3D, aby dokładniej badać procesy inwazji i migracji komórek. Podczas gdy większość tradycyjnych systemów hodowli komórkowych jest 2D, komórki w naszych tkankach istnieją w sieci cząsteczek 3D znanej jako macierz zewnątrzkomórkowa lub ECM. Podczas gdy wiele procesów mechanistycznych wymaganych do ruchliwości komórek w 2D i 3D jest podobnych, czynniki takie jak zmniejszona sztywność ECM w porównaniu z powierzchniami z tworzywa sztucznego, dodanie trzeciego wymiaru migracji oraz fizyczna przeszkoda w poruszaniu się przez siatkę długich polimerów w ECM, wszystkie stanowią inne wyzwania dla komórki w porównaniu z migracją dwuwymiarową.
W tym filmie pokrótce przedstawimy podstawową funkcję i strukturę ECM, a także mechanizmy, za pomocą których komórki modulują i migrują przez niego. Następnie omówimy ogólny protokół używany do badania inwazji komórek śródbłonka. Na koniec przedstawimy kilka zastosowań matryc 3D do badania różnych zagadnień biologicznych.
Zacznijmy od zbadania składu ECM i tego, jak komórki wchodzą z nim w interakcje.
ECM pełni wiele funkcji, takich jak zapewnianie wsparcia komórkom, ułatwianie komunikacji międzykomórkowej i oddzielanie tkanek. Skład ECM różni się w różnych tkankach i ma różne właściwości biologiczne, ale można go podzielić na dwa szerokie typy. Błona podstawna służy do zakotwiczania i oddzielania tkanek, podczas gdy macierz śródmiąższowa otacza i podtrzymuje komórki w tkance. Macierz śródmiąższowa składa się głównie z włóknistego białka kolagenu, ale obejmuje również elastynę i fibronektynę.
Aby komórki mogły migrować przez ECM, musi zachodzić kilka procesów biologicznych. Pierwszym z nich jest adhezja macierzy komórkowej, która obejmuje białka transbłonowe zwane integrynami. Łączą one ECM z wewnętrznym rusztowaniem komórki, znanym jako cytoszkielet.
Innym procesem jest strukturalne przegrupowanie cytoszkieletu komórki. Prowadzi to do powstawania wyspecjalizowanych struktur zwanych inwadopodiami, które są wypukłościami komórki w otaczającą ją macierz. Ostatnim krokiem jest modulacja ECM. Zazwyczaj obejmuje to cząsteczki degradacyjne znane jako metaloproteazy macierzy lub MMP, które gromadzą się w inwadopodiach i degradują otaczający ECM, ułatwiając inwazję komórek. Testy inwazji matryc 3D pozwalają naukowcom wizualizować i badać ten złożony proces.
Teraz, gdy jesteś już zaznajomiony z ECM i jego interakcją z komórkami, przejdźmy przez protokół badania inwazji ECM przez komórki śródbłonka w celu utworzenia kanalików. Hodując komórki śródbłonka w środowisku 3D, można symulować biologiczny proces wzrostu naczyń krwionośnych, znany również jako angiogeneza, który jest ważny zarówno podczas normalnego rozwoju, jak i raka.
Najpierw hoduje się komórki śródbłonka, a zawiesinę pojedynczej komórki przygotowuje się poprzez traktowanie komórek proteazami, takimi jak trypsyna, i przepuszczanie ich przez filtr siatkowy w celu rozbicia grudek komórek. Matryca 3D, zwykle składająca się z kolagenu, fibryny, lamininy lub bardziej złożonych kombinacji tych składników - które można przygotować w laboratorium lub zamówić u komercyjnych dostawców - jest następnie rozmrażana na lodzie. Ponieważ większość preparatów ECM polimeryzuje w wyższych temperaturach, pomocne jest również utrzymywanie innych urządzeń i odczynników w niskiej temperaturze. Zawiesinę komórkową miesza się z rozmrożonym roztworem matrycy w celu osadzenia komórek, a mieszaninę tę umieszcza się w inkubatorze hodowli komórkowych, gdzie wyższa temperatura spowoduje polimeryzację matrycy.
Po ustawieniu matrycy zawierającej komórkę, do szalki z matrycą dodaje się pożywkę hodowlaną zawierającą czynniki angiogenne. Za pomocą oprogramowania do mikroskopii poklatkowej można następnie śledzić poszczególne komórki, aby obserwować ich migrację przez matrycę. Uzyskane obrazy są analizowane, a pozycje komórek są wykorzystywane do obliczania kierunku ruchu i odległości w mikronach. Wartości te można następnie wykreślić w celu określenia aktywności lokomotorycznej - średniego tempa migracji komórek. Na koniec tworzenie się sieci rur jest obserwowane i analizowane za pomocą oprogramowania do wizualizacji w celu identyfikacji cech, takich jak węzły, rury i pętle.
Przyjrzyjmy się teraz kilku zastosowaniom macierzy 3D w konkretnych eksperymentach.
W migracji komórek pośredniczy aktywna modulacja cytoszkieletu komórkowego. W tym eksperymencie przygotowano matryce kolagenowe i zmieszano je z barwnikiem zawierającym czerwone białko fluorescencyjne, aby umożliwić wizualizację. Poszczególne sferoidy komórkowe, które są swobodnie unoszącymi się skupiskami komórek, zostały wyizolowane i osadzone w macierzy kolagenowej. Po inkubacji osadzone komórki wybarwiono pod kątem określonych składników cytoszkieletu i zobrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Naukowcy obserwowali składniki cytoszkieletu i ich zmiany podczas migracji komórek przez ECM.
Naukowcy mogą również badać, w jaki sposób właściwości ECM wpływają na migrację. Korzystając z koncentrycznego systemu żelowego, w którym komórki są osadzone w wewnętrznej matrycy żelowej otoczonej zewnętrznymi matrycami o różnych stężeniach, naukowcy mogą śledzić komórki za pomocą mikroskopii poklatkowej, aby zbadać ich migrację z wewnętrznego żelu do początkowo bezkomórkowego żelu zewnętrznego. Naukowcy zaobserwowali, że większa sztywność żeli o wyższym stężeniu skutkowała wzrostem zarówno przemieszczenia komórek, jak i ogólnej odległości migracji komórek.
Wreszcie, testy inwazji matrycowej można przeprowadzić na żywym zwierzęciu w celu zbadania angiogenezy w kontekście specyficznym dla narządu. W tym przypadku wyprodukowano żele fibrynowe – powszechnie stosowane w inżynierii tkankowej ze względu na ich biodegradowalny charakter – a następnie wszczepiono je do płuc myszy, gdzie żele były utrzymywane na miejscu przez "klej" wykonany z białka fibrynogenu. Migrację komórek i tworzenie nowych naczyń krwionośnych pozostawiono na miejsce przez kolejne 7 do 30 dni, po czym płuca i żele fibrynowe zostały pobrane, utrwalone i pocięte. Obrazowanie tych odcinków ujawniło tworzenie się naczyń krwionośnych i pęcherzyków płucnych w implantowanych żelach, dając naukowcom wgląd w ten kluczowy aspekt rozwoju płuc w in vivo{ otoczeniu.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat testów inwazji macierzy zewnątrzkomórkowej. W tym filmie omówiono skład ECM i sposób, w jaki komórki migrują przez niego, przedstawiono prosty protokół badania migracji komórek śródbłonka przez matrycę 3D oraz podkreślono kilka procesów komórkowych badanych obecnie w kontekście interakcji komórka-ECM. Ponieważ endogenna migracja komórek zachodzi w przestrzeni 3D, te warunki biologiczne najlepiej symulować za pomocą technik hodowli 3D. Ulepszenia w składzie matrycy będą nadal umożliwiać naukowcom dokładniejsze replikowanie i badanie migracji komórkowej w laboratorium. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) to sieć cząsteczek, które zapewniają strukturę strukturalną dla komórek i tkanek oraz ułatwiają komunikację międzykomó…
Naukowcy opracowali modele 3D, aby dokładniej badać procesy inwazji i migracji komórek. Podczas gdy większość tradycyjnych systemów hodowli komórkowych jest 2D, komórki w naszych tkankach istnieją w sieci cząsteczek 3D znanej jako macierz zewnątrzkomórkowa lub ECM. Podczas gdy wiele procesów mechanistycznych wymaganych do ruchliwości komórek w 2D i 3D jest podobnych, czynniki takie jak zmniejszona sztywność ECM w porównaniu z powierzchniami z tworzywa sztucznego, dodanie trzeciego wymiaru migracji oraz fizyczna przeszkoda w poruszaniu się przez siatkę długich polimerów w ECM, wszystkie stanowią inne wyzwania dla komórki w porównaniu z migracją dwuwymiarową.
W tym filmie pokrótce przedstawimy podstawową funkcję i strukturę ECM, a także mechanizmy, za pomocą których komórki modulują i migrują przez niego. Następnie omówimy ogólny protokół używany do badania inwazji komórek śródbłonka. Na koniec przedstawimy kilka zastosowań matryc 3D do badania różnych zagadnień biologicznych.
Zacznijmy od zbadania składu ECM i tego, jak komórki wchodzą z nim w interakcje.
ECM pełni wiele funkcji, takich jak zapewnianie wsparcia komórkom, ułatwianie komunikacji międzykomórkowej i oddzielanie tkanek. Skład ECM różni się w różnych tkankach i ma różne właściwości biologiczne, ale można go podzielić na dwa szerokie typy. Błona podstawna służy do zakotwiczania i oddzielania tkanek, podczas gdy macierz śródmiąższowa otacza i podtrzymuje komórki w tkance. Macierz śródmiąższowa składa się głównie z włóknistego białka kolagenu, ale obejmuje również elastynę i fibronektynę.
Aby komórki mogły migrować przez ECM, musi zachodzić kilka procesów biologicznych. Pierwszym z nich jest adhezja macierzy komórkowej, która obejmuje białka transbłonowe zwane integrynami. Łączą one ECM z wewnętrznym rusztowaniem komórki, znanym jako cytoszkielet.
Innym procesem jest strukturalne przegrupowanie cytoszkieletu komórki. Prowadzi to do powstawania wyspecjalizowanych struktur zwanych inwadopodiami, które są wypukłościami komórki w otaczającą ją macierz. Ostatnim krokiem jest modulacja ECM. Zazwyczaj obejmuje to cząsteczki degradacyjne znane jako metaloproteazy macierzy lub MMP, które gromadzą się w inwadopodiach i degradują otaczający ECM, ułatwiając inwazję komórek. Testy inwazji matryc 3D pozwalają naukowcom wizualizować i badać ten złożony proces.
Teraz, gdy jesteś już zaznajomiony z ECM i jego interakcją z komórkami, przejdźmy przez protokół badania inwazji ECM przez komórki śródbłonka w celu utworzenia kanalików. Hodując komórki śródbłonka w środowisku 3D, można symulować biologiczny proces wzrostu naczyń krwionośnych, znany również jako angiogeneza, który jest ważny zarówno podczas normalnego rozwoju, jak i raka.
Najpierw hoduje się komórki śródbłonka, a zawiesinę pojedynczej komórki przygotowuje się poprzez traktowanie komórek proteazami, takimi jak trypsyna, i przepuszczanie ich przez filtr siatkowy w celu rozbicia grudek komórek. Matryca 3D, zwykle składająca się z kolagenu, fibryny, lamininy lub bardziej złożonych kombinacji tych składników - które można przygotować w laboratorium lub zamówić u komercyjnych dostawców - jest następnie rozmrażana na lodzie. Ponieważ większość preparatów ECM polimeryzuje w wyższych temperaturach, pomocne jest również utrzymywanie innych urządzeń i odczynników w niskiej temperaturze. Zawiesinę komórkową miesza się z rozmrożonym roztworem matrycy w celu osadzenia komórek, a mieszaninę tę umieszcza się w inkubatorze hodowli komórkowych, gdzie wyższa temperatura spowoduje polimeryzację matrycy.
Po ustawieniu matrycy zawierającej komórkę, do szalki z matrycą dodaje się pożywkę hodowlaną zawierającą czynniki angiogenne. Za pomocą oprogramowania do mikroskopii poklatkowej można następnie śledzić poszczególne komórki, aby obserwować ich migrację przez matrycę. Uzyskane obrazy są analizowane, a pozycje komórek są wykorzystywane do obliczania kierunku ruchu i odległości w mikronach. Wartości te można następnie wykreślić w celu określenia aktywności lokomotorycznej - średniego tempa migracji komórek. Na koniec tworzenie się sieci rur jest obserwowane i analizowane za pomocą oprogramowania do wizualizacji w celu identyfikacji cech, takich jak węzły, rury i pętle.
Przyjrzyjmy się teraz kilku zastosowaniom macierzy 3D w konkretnych eksperymentach.
W migracji komórek pośredniczy aktywna modulacja cytoszkieletu komórkowego. W tym eksperymencie przygotowano matryce kolagenowe i zmieszano je z barwnikiem zawierającym czerwone białko fluorescencyjne, aby umożliwić wizualizację. Poszczególne sferoidy komórkowe, które są swobodnie unoszącymi się skupiskami komórek, zostały wyizolowane i osadzone w macierzy kolagenowej. Po inkubacji osadzone komórki wybarwiono pod kątem określonych składników cytoszkieletu i zobrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Naukowcy obserwowali składniki cytoszkieletu i ich zmiany podczas migracji komórek przez ECM.
Naukowcy mogą również badać, w jaki sposób właściwości ECM wpływają na migrację. Korzystając z koncentrycznego systemu żelowego, w którym komórki są osadzone w wewnętrznej matrycy żelowej otoczonej zewnętrznymi matrycami o różnych stężeniach, naukowcy mogą śledzić komórki za pomocą mikroskopii poklatkowej, aby zbadać ich migrację z wewnętrznego żelu do początkowo bezkomórkowego żelu zewnętrznego. Naukowcy zaobserwowali, że większa sztywność żeli o wyższym stężeniu skutkowała wzrostem zarówno przemieszczenia komórek, jak i ogólnej odległości migracji komórek.
Wreszcie, testy inwazji matrycowej można przeprowadzić na żywym zwierzęciu w celu zbadania angiogenezy w kontekście specyficznym dla narządu. W tym przypadku wyprodukowano żele fibrynowe – powszechnie stosowane w inżynierii tkankowej ze względu na ich biodegradowalny charakter – a następnie wszczepiono je do płuc myszy, gdzie żele były utrzymywane na miejscu przez "klej" wykonany z białka fibrynogenu. Migrację komórek i tworzenie nowych naczyń krwionośnych pozostawiono na miejsce przez kolejne 7 do 30 dni, po czym płuca i żele fibrynowe zostały pobrane, utrwalone i pocięte. Obrazowanie tych odcinków ujawniło tworzenie się naczyń krwionośnych i pęcherzyków płucnych w implantowanych żelach, dając naukowcom wgląd w ten kluczowy aspekt rozwoju płuc w in vivo{ otoczeniu.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat testów inwazji macierzy zewnątrzkomórkowej. W tym filmie omówiono skład ECM i sposób, w jaki komórki migrują przez niego, przedstawiono prosty protokół badania migracji komórek śródbłonka przez matrycę 3D oraz podkreślono kilka procesów komórkowych badanych obecnie w kontekście interakcji komórka-ECM. Ponieważ endogenna migracja komórek zachodzi w przestrzeni 3D, te warunki biologiczne najlepiej symulować za pomocą technik hodowli 3D. Ulepszenia w składzie matrycy będą nadal umożliwiać naukowcom dokładniejsze replikowanie i badanie migracji komórkowej w laboratorium. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Naukowcy opracowali modele 3D, aby dokładniej badać procesy inwazji i migracji komórek. Podczas gdy większość tradycyjnych systemów hodowli komórkowych jest 2D, komórki w naszych tkankach istnieją w sieci cząsteczek 3D znanej jako macierz zewnątrzkomórkowa lub ECM. Podczas gdy wiele procesów mechanistycznych wymaganych do ruchliwości komórek w 2D i 3D jest podobnych, czynniki takie jak zmniejszona sztywność ECM w porównaniu z powierzchniami z tworzywa sztucznego, dodanie trzeciego wymiaru migracji oraz fizyczna przeszkoda w poruszaniu się przez siatkę długich polimerów w ECM, wszystkie stanowią inne wyzwania dla komórki w porównaniu z migracją dwuwymiarową.
W tym filmie pokrótce przedstawimy podstawową funkcję i strukturę ECM, a także mechanizmy, za pomocą których komórki modulują i migrują przez niego. Następnie omówimy ogólny protokół używany do badania inwazji komórek śródbłonka. Na koniec przedstawimy kilka zastosowań matryc 3D do badania różnych zagadnień biologicznych.
Zacznijmy od zbadania składu ECM i tego, jak komórki wchodzą z nim w interakcje.
ECM pełni wiele funkcji, takich jak zapewnianie wsparcia komórkom, ułatwianie komunikacji międzykomórkowej i oddzielanie tkanek. Skład ECM różni się w różnych tkankach i ma różne właściwości biologiczne, ale można go podzielić na dwa szerokie typy. Błona podstawna służy do zakotwiczania i oddzielania tkanek, podczas gdy macierz śródmiąższowa otacza i podtrzymuje komórki w tkance. Macierz śródmiąższowa składa się głównie z włóknistego białka kolagenu, ale obejmuje również elastynę i fibronektynę.
Aby komórki mogły migrować przez ECM, musi zachodzić kilka procesów biologicznych. Pierwszym z nich jest adhezja macierzy komórkowej, która obejmuje białka transbłonowe zwane integrynami. Łączą one ECM z wewnętrznym rusztowaniem komórki, znanym jako cytoszkielet.
Innym procesem jest strukturalne przegrupowanie cytoszkieletu komórki. Prowadzi to do powstawania wyspecjalizowanych struktur zwanych inwadopodiami, które są wypukłościami komórki w otaczającą ją macierz. Ostatnim krokiem jest modulacja ECM. Zazwyczaj obejmuje to cząsteczki degradacyjne znane jako metaloproteazy macierzy lub MMP, które gromadzą się w inwadopodiach i degradują otaczający ECM, ułatwiając inwazję komórek. Testy inwazji matryc 3D pozwalają naukowcom wizualizować i badać ten złożony proces.
Teraz, gdy jesteś już zaznajomiony z ECM i jego interakcją z komórkami, przejdźmy przez protokół badania inwazji ECM przez komórki śródbłonka w celu utworzenia kanalików. Hodując komórki śródbłonka w środowisku 3D, można symulować biologiczny proces wzrostu naczyń krwionośnych, znany również jako angiogeneza, który jest ważny zarówno podczas normalnego rozwoju, jak i raka.
Najpierw hoduje się komórki śródbłonka, a zawiesinę pojedynczej komórki przygotowuje się poprzez traktowanie komórek proteazami, takimi jak trypsyna, i przepuszczanie ich przez filtr siatkowy w celu rozbicia grudek komórek. Matryca 3D, zwykle składająca się z kolagenu, fibryny, lamininy lub bardziej złożonych kombinacji tych składników - które można przygotować w laboratorium lub zamówić u komercyjnych dostawców - jest następnie rozmrażana na lodzie. Ponieważ większość preparatów ECM polimeryzuje w wyższych temperaturach, pomocne jest również utrzymywanie innych urządzeń i odczynników w niskiej temperaturze. Zawiesinę komórkową miesza się z rozmrożonym roztworem matrycy w celu osadzenia komórek, a mieszaninę tę umieszcza się w inkubatorze hodowli komórkowych, gdzie wyższa temperatura spowoduje polimeryzację matrycy.
Po ustawieniu matrycy zawierającej komórkę, do szalki z matrycą dodaje się pożywkę hodowlaną zawierającą czynniki angiogenne. Za pomocą oprogramowania do mikroskopii poklatkowej można następnie śledzić poszczególne komórki, aby obserwować ich migrację przez matrycę. Uzyskane obrazy są analizowane, a pozycje komórek są wykorzystywane do obliczania kierunku ruchu i odległości w mikronach. Wartości te można następnie wykreślić w celu określenia aktywności lokomotorycznej - średniego tempa migracji komórek. Na koniec tworzenie się sieci rur jest obserwowane i analizowane za pomocą oprogramowania do wizualizacji w celu identyfikacji cech, takich jak węzły, rury i pętle.
Przyjrzyjmy się teraz kilku zastosowaniom macierzy 3D w konkretnych eksperymentach.
W migracji komórek pośredniczy aktywna modulacja cytoszkieletu komórkowego. W tym eksperymencie przygotowano matryce kolagenowe i zmieszano je z barwnikiem zawierającym czerwone białko fluorescencyjne, aby umożliwić wizualizację. Poszczególne sferoidy komórkowe, które są swobodnie unoszącymi się skupiskami komórek, zostały wyizolowane i osadzone w macierzy kolagenowej. Po inkubacji osadzone komórki wybarwiono pod kątem określonych składników cytoszkieletu i zobrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Naukowcy obserwowali składniki cytoszkieletu i ich zmiany podczas migracji komórek przez ECM.
Naukowcy mogą również badać, w jaki sposób właściwości ECM wpływają na migrację. Korzystając z koncentrycznego systemu żelowego, w którym komórki są osadzone w wewnętrznej matrycy żelowej otoczonej zewnętrznymi matrycami o różnych stężeniach, naukowcy mogą śledzić komórki za pomocą mikroskopii poklatkowej, aby zbadać ich migrację z wewnętrznego żelu do początkowo bezkomórkowego żelu zewnętrznego. Naukowcy zaobserwowali, że większa sztywność żeli o wyższym stężeniu skutkowała wzrostem zarówno przemieszczenia komórek, jak i ogólnej odległości migracji komórek.
Wreszcie, testy inwazji matrycowej można przeprowadzić na żywym zwierzęciu w celu zbadania angiogenezy w kontekście specyficznym dla narządu. W tym przypadku wyprodukowano żele fibrynowe – powszechnie stosowane w inżynierii tkankowej ze względu na ich biodegradowalny charakter – a następnie wszczepiono je do płuc myszy, gdzie żele były utrzymywane na miejscu przez "klej" wykonany z białka fibrynogenu. Migrację komórek i tworzenie nowych naczyń krwionośnych pozostawiono na miejsce przez kolejne 7 do 30 dni, po czym płuca i żele fibrynowe zostały pobrane, utrwalone i pocięte. Obrazowanie tych odcinków ujawniło tworzenie się naczyń krwionośnych i pęcherzyków płucnych w implantowanych żelach, dając naukowcom wgląd w ten kluczowy aspekt rozwoju płuc w in vivo{ otoczeniu.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat testów inwazji macierzy zewnątrzkomórkowej. W tym filmie omówiono skład ECM i sposób, w jaki komórki migrują przez niego, przedstawiono prosty protokół badania migracji komórek śródbłonka przez matrycę 3D oraz podkreślono kilka procesów komórkowych badanych obecnie w kontekście interakcji komórka-ECM. Ponieważ endogenna migracja komórek zachodzi w przestrzeni 3D, te warunki biologiczne najlepiej symulować za pomocą technik hodowli 3D. Ulepszenia w składzie matrycy będą nadal umożliwiać naukowcom dokładniejsze replikowanie i badanie migracji komórkowej w laboratorium. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the extracellular matrix and what are its main functions?
The extracellular matrix (ECM) is a network of molecules that provides structural support for cells and facilitates intercellular communication. It performs several functions including anchoring and separating tissues through the basement membrane, and surrounding and supporting cells via the interstitial matrix. The interstitial matrix is primarily composed of collagen, but also includes elastin and fibronectin.
Q2: How do cells migrate through the extracellular matrix?
Cell migration through the ECM involves three key processes. First, integrins—transmembrane proteins—mediate cell-matrix adhesion by linking the ECM to the cytoskeleton. Second, the cytoskeleton undergoes structural rearrangement, forming invadopodia, which are cellular protrusions into the surrounding matrix. Finally, matrix metalloproteases (MMPs) accumulate in invadopodia and degrade the ECM, facilitating cell invasion.
Q3: Why are 3D matrices better than 2D culture systems for studying cell invasion?
While cells in tissues exist within a 3D ECM network, traditional 2D culture systems use rigid plastic surfaces. Three-dimensional matrices better simulate the biological environment by presenting reduced stiffness compared to plastic, adding a third dimension for migration, and creating physical hindrance from the mesh of long polymers. These factors present different challenges that more accurately reflect how cells migrate in vivo.
Q4: What are the main steps in preparing cells for a 3D invasion assay?
Endothelial cells are first cultured, then treated with proteases such as trypsin and passed through a mesh filter to create a single cell suspension and break up clumps. The 3D matrix—typically composed of collagen, fibrin, laminin, or combinations thereof—is thawed on ice to prevent premature polymerization. The cell suspension is mixed with the thawed matrix and placed in an incubator where higher temperature causes the matrix to polymerize.
Q5: How are cell migration and tube formation measured in 3D matrix assays?
Time-lapse microscopy software tracks individual cells through the matrix to observe migration patterns. Cell positions are analyzed to calculate movement direction and distance in microns, which are plotted to determine locomotory activity—the average migration rate. Tube network formation is visualized and analyzed using software to identify structural features such as nodes, tubes, and loops.
Q6: What do studies on ECM stiffness reveal about cell migration behavior?
Using concentric gel systems with varying matrix concentrations, researchers observed that greater stiffness in higher concentration gels resulted in increased cell displacement and overall migration distance. This demonstrates that ECM mechanical properties directly influence how cells migrate through the matrix, with stiffer environments promoting greater cell movement and invasion.
Q7: How can 3D matrix assays be used to study angiogenesis in living animals?
Fibrin gels, valued for their biodegradable nature, are implanted into mouse lungs and held in place with fibrinogen protein glue. Over 7 to 30 days, cell migration and blood vessel formation occur within the implanted gels. After harvesting and sectioning the lungs, imaging reveals blood vessel and alveoli formation, providing insights into angiogenesis in its in vivo organ-specific context.
Chapters in this video
0:00
Overview
1:16
ECM Composition and Cell-ECM Interaction
3:01
Endothelial Cell Tube Formation Assay
5:01
Applications
7:08
Summary
Videos from this collection: