Test inwazji przy użyciu macierzy 3D

Naukowcy opracowali modele 3D, aby dokładniej badać procesy inwazji i migracji komórek. Podczas gdy większość tradycyjnych systemów hodowli komórkowych jest 2D, komórki w naszych tkankach istnieją w sieci cząsteczek 3D znanej jako macierz zewnątrzkomórkowa lub ECM. Podczas gdy wiele procesów mechanistycznych wymaganych do ruchliwości komórek w 2D i 3D jest podobnych, czynniki takie jak zmniejszona sztywność ECM w porównaniu z powierzchniami z tworzywa sztucznego, dodanie trzeciego wymiaru migracji oraz fizyczna przeszkoda w poruszaniu się przez siatkę długich polimerów w ECM, wszystkie stanowią inne wyzwania dla komórki w porównaniu z migracją dwuwymiarową.

W tym filmie pokrótce przedstawimy podstawową funkcję i strukturę ECM, a także mechanizmy, za pomocą których komórki modulują i migrują przez niego. Następnie omówimy ogólny protokół używany do badania inwazji komórek śródbłonka. Na koniec przedstawimy kilka zastosowań matryc 3D do badania różnych zagadnień biologicznych.

Zacznijmy od zbadania składu ECM i tego, jak komórki wchodzą z nim w interakcje.

ECM pełni wiele funkcji, takich jak zapewnianie wsparcia komórkom, ułatwianie komunikacji międzykomórkowej i oddzielanie tkanek. Skład ECM różni się w różnych tkankach i ma różne właściwości biologiczne, ale można go podzielić na dwa szerokie typy. Błona podstawna służy do zakotwiczania i oddzielania tkanek, podczas gdy macierz śródmiąższowa otacza i podtrzymuje komórki w tkance. Macierz śródmiąższowa składa się głównie z włóknistego białka kolagenu, ale obejmuje również elastynę i fibronektynę.

Aby komórki mogły migrować przez ECM, musi zachodzić kilka procesów biologicznych. Pierwszym z nich jest adhezja macierzy komórkowej, która obejmuje białka transbłonowe zwane integrynami. Łączą one ECM z wewnętrznym rusztowaniem komórki, znanym jako cytoszkielet.

Innym procesem jest strukturalne przegrupowanie cytoszkieletu komórki. Prowadzi to do powstawania wyspecjalizowanych struktur zwanych inwadopodiami, które są wypukłościami komórki w otaczającą ją macierz. Ostatnim krokiem jest modulacja ECM. Zazwyczaj obejmuje to cząsteczki degradacyjne znane jako metaloproteazy macierzy lub MMP, które gromadzą się w inwadopodiach i degradują otaczający ECM, ułatwiając inwazję komórek. Testy inwazji matryc 3D pozwalają naukowcom wizualizować i badać ten złożony proces.

Teraz, gdy jesteś już zaznajomiony z ECM i jego interakcją z komórkami, przejdźmy przez protokół badania inwazji ECM przez komórki śródbłonka w celu utworzenia kanalików. Hodując komórki śródbłonka w środowisku 3D, można symulować biologiczny proces wzrostu naczyń krwionośnych, znany również jako angiogeneza, który jest ważny zarówno podczas normalnego rozwoju, jak i raka.

Najpierw hoduje się komórki śródbłonka, a zawiesinę pojedynczej komórki przygotowuje się poprzez traktowanie komórek proteazami, takimi jak trypsyna, i przepuszczanie ich przez filtr siatkowy w celu rozbicia grudek komórek. Matryca 3D, zwykle składająca się z kolagenu, fibryny, lamininy lub bardziej złożonych kombinacji tych składników - które można przygotować w laboratorium lub zamówić u komercyjnych dostawców - jest następnie rozmrażana na lodzie. Ponieważ większość preparatów ECM polimeryzuje w wyższych temperaturach, pomocne jest również utrzymywanie innych urządzeń i odczynników w niskiej temperaturze. Zawiesinę komórkową miesza się z rozmrożonym roztworem matrycy w celu osadzenia komórek, a mieszaninę tę umieszcza się w inkubatorze hodowli komórkowych, gdzie wyższa temperatura spowoduje polimeryzację matrycy.

Po ustawieniu matrycy zawierającej komórkę, do szalki z matrycą dodaje się pożywkę hodowlaną zawierającą czynniki angiogenne. Za pomocą oprogramowania do mikroskopii poklatkowej można następnie śledzić poszczególne komórki, aby obserwować ich migrację przez matrycę. Uzyskane obrazy są analizowane, a pozycje komórek są wykorzystywane do obliczania kierunku ruchu i odległości w mikronach. Wartości te można następnie wykreślić w celu określenia aktywności lokomotorycznej - średniego tempa migracji komórek. Na koniec tworzenie się sieci rur jest obserwowane i analizowane za pomocą oprogramowania do wizualizacji w celu identyfikacji cech, takich jak węzły, rury i pętle.

Przyjrzyjmy się teraz kilku zastosowaniom macierzy 3D w konkretnych eksperymentach.

W migracji komórek pośredniczy aktywna modulacja cytoszkieletu komórkowego. W tym eksperymencie przygotowano matryce kolagenowe i zmieszano je z barwnikiem zawierającym czerwone białko fluorescencyjne, aby umożliwić wizualizację. Poszczególne sferoidy komórkowe, które są swobodnie unoszącymi się skupiskami komórek, zostały wyizolowane i osadzone w macierzy kolagenowej. Po inkubacji osadzone komórki wybarwiono pod kątem określonych składników cytoszkieletu i zobrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Naukowcy obserwowali składniki cytoszkieletu i ich zmiany podczas migracji komórek przez ECM.

Naukowcy mogą również badać, w jaki sposób właściwości ECM wpływają na migrację. Korzystając z koncentrycznego systemu żelowego, w którym komórki są osadzone w wewnętrznej matrycy żelowej otoczonej zewnętrznymi matrycami o różnych stężeniach, naukowcy mogą śledzić komórki za pomocą mikroskopii poklatkowej, aby zbadać ich migrację z wewnętrznego żelu do początkowo bezkomórkowego żelu zewnętrznego. Naukowcy zaobserwowali, że większa sztywność żeli o wyższym stężeniu skutkowała wzrostem zarówno przemieszczenia komórek, jak i ogólnej odległości migracji komórek.

Wreszcie, testy inwazji matrycowej można przeprowadzić na żywym zwierzęciu w celu zbadania angiogenezy w kontekście specyficznym dla narządu. W tym przypadku wyprodukowano żele fibrynowe – powszechnie stosowane w inżynierii tkankowej ze względu na ich biodegradowalny charakter – a następnie wszczepiono je do płuc myszy, gdzie żele były utrzymywane na miejscu przez "klej" wykonany z białka fibrynogenu. Migrację komórek i tworzenie nowych naczyń krwionośnych pozostawiono na miejsce przez kolejne 7 do 30 dni, po czym płuca i żele fibrynowe zostały pobrane, utrwalone i pocięte. Obrazowanie tych odcinków ujawniło tworzenie się naczyń krwionośnych i pęcherzyków płucnych w implantowanych żelach, dając naukowcom wgląd w ten kluczowy aspekt rozwoju płuc w in vivo{ otoczeniu.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat testów inwazji macierzy zewnątrzkomórkowej. W tym filmie omówiono skład ECM i sposób, w jaki komórki migrują przez niego, przedstawiono prosty protokół badania migracji komórek śródbłonka przez matrycę 3D oraz podkreślono kilka procesów komórkowych badanych obecnie w kontekście interakcji komórka-ECM. Ponieważ endogenna migracja komórek zachodzi w przestrzeni 3D, te warunki biologiczne najlepiej symulować za pomocą technik hodowli 3D. Ulepszenia w składzie matrycy będą nadal umożliwiać naukowcom dokładniejsze replikowanie i badanie migracji komórkowej w laboratorium. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!