Name: Wykorzystanie testu punktowego do analizy migracji arkuszy komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Poznaj test punktowy do analizy migracji spójnych arkuszy komórkowych w odpowiedzi na sygnały mikrośrodowiskowe. Ta metoda pozwala badać motoryczność komórek nowotworowych i czynniki ją regulujące.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor pragnie podziękować Bhagawatowi Subramaninowi, Yi (Jasonowi) Changowi, Paulowi Randazzo i Carole Parent za przeczytanie i skomentowanie manuskryptu. Praca ta była wspierana przez Intramural Research Program National Cancer Institute, National Institutes of Health.

1. Powlekanie naczyń (Dzień 1)
UWAGA: Upewnij się, że nie pozostawiasz odcisków palców ani brudu na spodzie płytki podczas jej obsługi.
<ol>
	<li>Rozmrozić kolagen myszy IV na lodzie i rozcieńczyć go 50 mM HCl (pH 1,3), aby przygotować 3 ml 10 μg/ml roztworu kolagenu dożylnie. 
	UWAGA: Kolagen wytrąca się w temperaturze 37 °C. Dlatego ważne jest, aby utrzymywać roztwór kolagenu w niskiej temperaturze podczas rozmrażania i pracy z nim. Należy unikać powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania, przygotowując porcje o odpowiedniej wielkości i przechowując je w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Dodaj 250 μl kolagenowego roztworu dożylnego do każdego dołka 12-dołkowych szklanych płytek dolnych i umieść je w szczelnie zamykanym plastikowym pudełku o odpowiedniej wielkości. Umieść mokry ręcznik papierowy na talerzach i wokół nich, aby uzyskać wilgotną komorę i zamknij pudełko. Inkubować płytki przez noc w temperaturze pokojowej. 
	Uwaga: Ponieważ tylko obszar wzrostu musi być pokryty, wystarczy pokryć tylko szkiełko nakrywkowe, które jest przymocowane do dolnej części płytki, roztworem kolagenu (patrz <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A, B dla schematu płytki).</li>
	<li>Następnego ranka dwukrotnie przepłucz płytki dejonizowanymH2O, aby usunąć niewchłonięty kolagen i bufor. Wodę należy skierować do krawędzi płytki, a nie do krawędzi utworzonej przez dno płytki i szkiełko nakrywkowe (jeśli woda zostanie odpipetowana do tego obszaru, rozpryskuje się). Wysuszyć płyty na powietrzu w okapie z przepływem laminarnym. Płytki należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze 4°C do 5 dni. 
	Uwaga: Różne linie komórkowe mogą wymagać różnych powłok, takich jak fibronektyna lub kolagen I.</li>
</ol>
2. Posiewanie testu kropkowego (Dzień 2)
<ol>
	<li>Przygotowanie zawiesiny komórek
	<ol>
		<li>Do przygotowania zawiesiny komórkowej należy użyć komórek, które zostały wyhodowane w 60-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej w pożywce DMEM/F12 uzupełnionej 5% surowicą końską do 80% konfluencji</li>
		<li>Przepłukać komórki solą fizjologiczną (DPBS) Dulbecco bez wapnia i magnezu, dodać 500 μl trypsyny-EDTA (temperatura pokojowa) i inkubować komórki przez 3 - 5 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w wilgotnej atmosferze.</li>
		<li>Zawiesić oderwane komórki w pożywce hodowlanej o pojemności 4,5 ml, aby zatrzymać aktywność trypsyny i odliczyć 20 μl podwielokrotności zawiesiny komórek w hemocytometrze.</li>
		<li>Pozostałe komórki umieścić w stożkowej probówce o pojemności 15 ml przez odwirowanie przy 200 x g przez 3 minuty, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej do 3 x 106 komórek/ml. 
		UWAGA: W przypadku innych podłoży powlekających i/lub linii komórkowych należy ustalić optymalną gęstość komórek w serii rozcieńczeń. Jako punkt wyjścia zaleca się 3 x 106 komórek/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ogniwa galwaniczne
	<ol>
		<li>Umieść 10 μl kropli zawiesiny komórkowej na środku każdego szkiełka nakrywkowego 12-dołkowej szklanej płytki dolnej pokrytej kolagenem IV, nie dotykając ani nie rysując powłoki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A, B). Inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C, w wilgotnej atmosferze, aby umożliwić połączenie komórek. Sprawdź w odwróconym mikroskopie, czy komórki są połączone. 
		UWAGA: Najlepiej widać to na krawędzi kropli, gdzie można zaobserwować tworzenie się monowarstwy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). W razie potrzeby inkubować płytkę do 3 godzin. Upewnij się, że wilgotność w inkubatorze jest wystarczająco wysoka, ponieważ krople mogą szybko wyschnąć. Jeśli na tym etapie zaobserwuje się zmniejszenie objętości kropli, dodaj PBS do przestrzeni między studzienkami, aby zwiększyć wilgotność.</li>
		<li>Delikatnie umyj studzienki dwukrotnie 1 ml pożywki hodowlanej, aby usunąć nieprzyłączone komórki. Dodaj 1 ml pożywki hodowlanej do każdego dołka. Sprawdź w odwróconym mikroskopie, czy nie pozostały żadne pływające komórki, w przeciwnym razie ponownie umyj studzienki. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w wilgotnej atmosferze, aby uzyskać dobrze zdefiniowane arkusze komórek. 
		Uwaga: Pływające komórki prawdopodobnie ponownie przyczepią się do płytki i utworzą niepożądane kolonie komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Stymulowanie komórek (Dzień 3)
<ol>
	<li>Sprawdź wszystkie studzienki za pomocą mikroskopu odwrotnego, aby upewnić się, że kolonie komórek rosną prawidłowo. W razie potrzeby zaznacz nieodpowiednie studzienki i nie używaj ich.</li>
	<li>Oznacz każdą studzienkę płytki odpowiednio dla każdego badanego stanu. Uruchom każdy warunek w dwóch lub trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Zmień pożywkę, aby zagłodzić komórki w DMEM/F12 zawierającym 0,1% surowicy końskiej (pożywka głodowa) na 3 godziny przed stymulacją komórek.</li>
	<li>Stymulować komórki przez dodanie EGF (stężenie końcowe 5 ng/ml) lub innych pożądanych mediatorów i delikatnie wymieszać pożywkę za pomocą mikropipetora o pojemności 1 ml lub obracając płytkę.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 1 - 4 dni, aby obserwować przemieszczenie krawędzi i kontur krawędzi, jak opisano w sekcji 4.1 lub wykonać obrazowanie poklatkowe zgodnie z opisem w sekcji 4.2.</li>
</ol>
4. Wizualizacja kolonii komórkowych i migracji komórek
<ol>
	<li>Barwienie hematoksyliną-eozyną (HE) w celu pomiaru wzrostu kolonii (dzień 4 - 7)
	<ol>
		<li>Utrwal komórki w 70% etanolu (1 ml / studzienkę) przez ~ 2 min.</li>
		<li>Zabarwić jądra hematoksyną (1 ml/studzienkę), ~2 min.</li>
		<li>Umyj komórki wodą z kranu (1 ml/studzienkę), aż jądra staną się niebieskie, 5 - 10 minut.</li>
		<li>Zabarwić cytoplazmę eozyną (1 ml / dołek), ~ 2 min.</li>
		<li>Spłucz wodą dejonizowaną (1 ml / studzienkę). 
		Uwaga: Roztwory hematoksyliny i eozyny można zbierać i używać wielokrotnie, aż barwienie stanie się słabe.</li>
		<li>Płyta sucha na powietrzu.</li>
		<li>Odwróć talerz i zmierz średnicę kropki za pomocą linijki. Alternatywnie, zrób zdjęcia płytki za pomocą aparatu fotograficznego i przeanalizuj średnicę kropki w ImageJ.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikroskopia poklatkowa (dzień 3)
	<ol>
		<li>Włączyć mikroskop inkubatora i ustawić temperaturę na 37 °C. Napełnić nawilżacz dH2O. Dostosować CO2 do 5%. Upewnij się, że komora inkubatora jest nawilżona i że zmotoryzowany stage może się swobodnie poruszać. Zamknąć komorę inkubatora i pozwolić, aby mikroskop ustawił się na 37 °C. 
		UWAGA: Używany tutaj mikroskop (patrz Tabela materiałów) powinien być podgrzewany do 37 °C przez co najmniej 3 godziny przed obrazowaniem komórek, aby uniknąć dryfowania ostrości.</li>
		<li>Umieść płytkę na stoliku mikroskopu inkubatora i ustaw listę etapów. Wyobraź sobie dwie przeciwległe krawędzie i środek każdej kropki komórki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A).</li>
		<li>Rób zdjęcia co 3 minuty, przez 15 - 24 godziny przy użyciu obiektywu 10X. Pobierz dane i przystąp do analizy obrazu w wybranym programie, np. ImageJ lub Matlab.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li>
<li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).</li>
<li>Weiger, M. C., Vedham, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+motion+analysis+reveals+cell+directionality+as+an+indicator+of+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Real-time motion analysis reveals cell directionality as an indicator of breast cancer progression.</a> PLOS ONE. 8 (3), 58859(2013).</li>
<li>Poujade, M., Grasland-Mongrain, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+migration+of+an+epithelial+monolayer+in+response+to+a+model+wound%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 15988-15993 (2007).</li>
<li>Sunyer, R., Conte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+durotaxis+emerges+from+long-range+intercellular+force+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission.</a> Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).</li>
<li>Bazellières, E., Conte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nat Cell Biol. 17 (4), 409-420 (2015).</li>
<li>Stuelten, C. H., Busch, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+tumor-fibroblast+interactions+increase+tumor+cell+malignancy+by+a+TGF-Beta+mediated+mechanism+in+a+mouse+xenograft+model+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transient tumor-fibroblast interactions increase tumor cell malignancy by a TGF-Beta mediated mechanism in a mouse xenograft model of breast cancer.</a> PLOS ONE. 5 (3), 9832(2010).</li>
<li>Normanno, N., De Luca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+%28EGFR%29+signaling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer.</a> Gene. 366 (1), 2-16 (2006).</li>
<li>Harrison, S. M. W., Knifley, T., Chen, M., O'Connor, K. L., HGF, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPA%2C+HGF%2C+and+EGF+utilize+distinct+combinations+of+signaling+pathways+to+promote+migration+and+invasion+of+MDA-MB-231+breast+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">LPA, HGF, and EGF utilize distinct combinations of signaling pathways to promote migration and invasion of MDA-MB-231 breast carcinoma cells.</a> BMC Cancer. 13, 501(2013).</li>
<li>Santner, S. J., Dawson, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+MCF10CA1+cell+lines+derived+from+premalignant+human+breast+epithelial+MCF10AT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 65 (2), 101-110 (2001).</li>
<li>Tang, B., Vu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+switches+from+tumor+suppressor+to+prometastatic+factor+in+a+model+of+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">TGF-beta switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression.</a> J Clin Invest. 112 (7), 1116-1124 (2003).</li>
<li>Lee, R. M., Stuelten, C. H., Parent, C. A., Losert, W. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/2057-1739/2/2/025001/meta">Collective cell migration over long time scales reveals distinct phenotypes.</a> Convergent science physical oncology. 2 (2), 025001(2016).</li>
<li>Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+stretching+and+rearrangement+in+epithelial+sheet+migration%5BTitle%5D)+AND+%22New+J+Phys%22%5BJournal%5D)">Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration.</a> New J Phys. 15 (2), (2013).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Grada, A., Otero-Vinas, M., Prieto-Castrillo, F., Obagi, Z., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+techniques+made+simple%3A+analysis+of+collective+cell+migration+using+the+wound+healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay.</a> J Invest Dermatol. 137 (2), 11-16 (2017).</li>
<li>Rosen, P., Misfeldt, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+density+determines+epithelial+migration+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell density determines epithelial migration in culture.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4760-4763 (1980).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Podczas progresji nowotworu komórki migrują z tkanki pochodzenia, aby zaatakować otaczającą tkankę i dać przerzuty do odległych miejsc15. Migrację komórek z dala od kolonii komórkowej można zaobserwować w teście kropkowym. W tym miejscu test punktowy jest zilustrowany analizą fenotypu migracyjnego ludzkich komórek raka piersi w odpowiedzi na EGF.
Aby uzyskać dokładne i powtarzalne wyniki, kluczowe znaczenie ma kilka etapów konfiguracji testów kropkowych. Po pierwsze, po...

Testy migracji są powszechnie stosowane do oceny potencjału inwazyjnego i przerzutowego komórek nowotworowych in vitro. Najczęściej test ran lub zadrapań jest używany do oceny migracji arkuszy nabłonka do obszaru oczyszczonego z komórek1,2,3. Aby przeprowadzić test zarysowania, komórki są platerowane w monowarstwę i za pomocą końcówki pipety tworzony jest obszar "zadrapania" lub wolny od komórek. Test zarysowania jest łatwy do skonfigurowania za pomocą powszechnie dostępnych materiałów do hodowli tkankowych i może być wykonywany na płytkach wielodołkowych, co pozwala na przetwarzanie wielu próbek. Jednak w miarę tworzenia zadrapania komórki są fizycznie usuwane z monowarstwy i często ulegają śmierci komórkowej. Co więcej, macierz zewnątrzkomórkowa przymocowana do płytki często ulega uszkodzeniu podczas procesu drapania. Podobnie, użycie wkładek silikonowych (takich jak Ibidi chambers4) lub szablonów5,6,7 może prowadzić do mechanicznego rozerwania komórek i częściowego usunięcia białek macierzy używanych do powlekania płytek. Kolejną wadą testów monitorujących zamknięcie ran czy zadrapań jest ich ograniczony przebieg w czasie, ponieważ migracja komórek może być analizowana tylko do momentu zamknięcia rysy.
Podczas wykonywania testu punktowego, komórki są umieszczane jako okrągła kolonia na powlekanej lub niepowlekanej płytce8. Uzasadnieniem dla tej strategii posiewu jest uzyskanie arkuszy komórek o zdefiniowanych krawędziach, które mogą migrować lub atakować otaczające obszary wolne od komórek bez zakłócania hodowli poprzez usuwanie komórek lub wkładek. Ogólnym celem testu punktowego jest obserwacja migracji arkuszy komórkowych mierzonej przemieszczeniem krawędzi lub średnicą kolonii, a także wykonanie obrazowania poklatkowego w celu analizy fenotypu migracyjnego komórek w wyższej rozdzielczości czasowo-przestrzennej.
Na migrację komórek mogą wpływać różne sygnały mikrośrodowiskowe, takie jak chemokiny, cytokiny i czynniki wzrostu, takie jak EGF. EGF jest czynnikiem wzrostu, który wywiera swoje efekty biologiczne poprzez wiązanie się ze swoim receptorem, receptorem EGF9, i zwiększa inwazyjne i przerzutowe zachowanie komórek nowotworowych4,9,10. W tym przypadku test kropkowy jest używany do badania stymulowanej przez EGF migracji komórek w ludzkiej inwazyjnej linii komórkowej raka piersi tworzącej kolonię płuc (MCF10CA1a)8,11,12.

<table><tbody><tr><td>Komórki MCF10CA1a</td><td>Karmanos Research Institute</td><td>N/A</td><td>komórki używane do oznaczania</td></tr><tr><td>kolagenu myszy IV</td><td>BD Biosciences</td><td>354233</td><td>używane do powlekania płytek</td></tr><tr><td>trypsyna / EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300054</td><td>służy do usuwania komórek z płytek do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>DPBS&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>21-031-CV</td><td>stosowany do mycia komórek</td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Thermo Fisher</td><td>stosowany 11320082</td><td>jako pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>surowica końska</td><td>Thermo Fisher</td><td>26050088</td><td>stosowany do uzupełnienia pożywki hodowlanej</td></tr><tr><td>12-dołkowa szklana płyta dolna</td><td>MatTek</td><td>P12G-1.5-14-F</td><td>służy do hodowli komórek do obrazowania</td></tr><tr><td>EGF (naskórkowy czynnik wzrostu, ludzki rekombinant)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>stosowany do stymulacji komórek</td></tr><tr><td>bez kwasów tłuszczowych BSA</td><td>Sigma</td><td>A8806-1G</td><td>używany do wytwarzania buforu dla</td></tr><tr><td>EGF hematoksyliny</td><td>Sigma</td><td>HHS32</td><td>używany do barwienia kolonii</td></tr><tr><td>eozyny</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>26051-10</td><td>używany do barwienia kolonii</td></tr><tr><td>37 i #176; C, 5% CO2 inkubator</td><td>Sanyo</td><td>model MCO-18AIC (UV)</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioObserver z komorą inkubatora i zmotoryzowanym stopniem Zeiss</td><td>model Axio Observer.Z1</td><td>używany do obrazowania poklatkowego</td><td>Kamera</td></tr><tr><td>sCMOS ORCA Flash LT</td><td>BioVision</td><td>C11440-42U-KIT</td><td>służy do obrazowania poklatkowego w połączeniu z Zeiss AxioObserver</td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>BioVision</td><td>MMACQMIC</td><td>oprogramowanie do obrazowania poklatkowego</td></tr><tr><td>mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td>model IX70</td><td>służy do liczenia komórek i sprawdzania kolonii w plastikowym pudełku do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td></td><td>Lock& Zamek</td><td>N/A</td><td>używany jako wilgotna komora (można użyć dowolnego szczelnie zamykanego plastikowego pudełka, które pasuje do płyt)</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie testu punktowego do analizy migracji arkuszy komórek

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Chociaż złożone organizmy wydają się statyczne, ich tkanki podlegają ciągłej rotacji. Gdy komórki starzeją się, umierają i są zastępowane przez nowe komórki, komórki poruszają się w tkankach w ściśle zaplanowany sposób. Podczas rozwoju guza równowaga ta zostaje zaburzona, a komórki nowotworowe opuszczają nabłonek, z którego pochodzą, aby zaatakować lokalne mikrośrodowisko, przemieszczać się do odległych miejsc i ostatecznie utworzyć guzy przerzutowe w odległych miejscach. Test punktowy jest prostym, dwuwymiarowym, nieograniczonym testem migracji, służącym do oceny ruchu netto arkuszy komórek do obszaru wolnego od komórek oraz do analizy parametrów migracji komórek za pomocą obrazowania poklatkowego. W tym przypadku test kropkowy jest demonstrowany przy użyciu ludzkiej inwazyjnej linii komórkowej raka piersi tworzącej kolonię płuc, MCF10CA1a, w celu analizy odpowiedzi migracyjnej komórek na naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), o którym wiadomo, że zwiększa potencjał złośliwy komórek raka piersi i zmienia fenotyp migracyjny komórek.

Przedstawiony tutaj test kropelkowy (Rysunek 1) przeprowadzono z wykorzystaniem inwazyjnych komórek raka piersi tworzących kolonie w płucach (MCF10CA1a) jako systemu modelowego. Test kropelkowy pozwala na uzyskanie wysoce powtarzalnych kropel komórkowych nawet w przypadku osób początkujących, co czyni go wygodnym i łatwym do wykonania badaniem (Rysunek 1D). Test kropelkowy w połączeniu z barwieniem HE lub obrazow...

Migracja komórek jest niezbędna do rozwoju, utrzymania i naprawy tkanek oraz nowotworzenia, a także jest regulowana przez czynniki wzrostu, chemokiny i cytokiny. Protokół ten opisuje test punktowy, dwuwymiarowy, nieograniczony test migracji w celu oceny fenotypu migracyjnego dołączonych, spójnych arkuszy komórkowych w odpowiedzi na sygnały mikrośrodowiskowe.

Wykorzystanie testu punktowego do analizy migracji arkuszy komórek

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Ogólnym celem testu kropkowego jest ocena fenotypu migracyjnego przyczepionych spójnych arkuszy komórkowych w odpowiedzi na sygnały mikrośrodowiskowe. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie raka, takie jak to, w jaki sposób cytokiny lub czynniki wzrostu zmieniają ruchliwość komórek nowotworowych. Główną zaletą testu punktowego jest to, że można go łatwo wykonać i wykorzystać do uzyskania powtarzalnych wyników.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w ruchliwość komórek, nadaje się również do szeregu późniejszych testów, takich jak barwienie komórek w celu oceny morfologii kolonii wzrostu i rozpraszania komórek, barwienie immunologiczne, analiza białek i DNA lub RNA lub wstrzykiwanie komórek zwierzętom. Na początek rozmrozić kolagen myszy cztery na lodzie i rozcieńczyć go 50 mikromolowymi HCL, aby przygotować trzy mililitry roztworu kolagenu o stężeniu 10 mikrogramów na mililitr. Dodaj 250 mikrolitrów czteroskładnikowego roztworu kolagenu do studzienek 12-dołkowych płytek ze szklanym dnem i umieść je w odpowiednio dużym, szczelnie zamykającym się plastikowym pudełku.Umieść mokry ręcznik papierowy na talerzach i wokół nich, aby uzyskać wilgotną komorę, i zamknij pudełko. Następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego ranka, aby przesunąć niewchłonięty kolagen i bufor, użyj wody dejonizowanej, aby dwukrotnie przepłukać płytki, kierując wodę do krawędzi płytki, a nie do krawędzi utworzonej przez krawędź dna i szkiełko nakrywkowe.Wysuszyć płytki na powietrzu w okapie z przepływem laminarnym i zużyć je natychmiast lub przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do pięciu dni. Aby przygotować zawiesinę komórkową, użyj komórek, które zostały wyhodowane w 60-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej w DMEMF12 pożywce, uzupełnionej 5% surowicą końską do 80% konfluencji. Użyj DPBS bez wapnia i magnezu, aby raz przepłukać komórki, a następnie dodaj 500 mikrolitrów trypsyny EDTA o temperaturze pokojowej i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2 w wilgotnej atmosferze przez trzy do pięciu minut.Zawieś oderwane komórki w 4,5 mililitra pożywki hodowlanej, aby zatrzymać aktywność trypsyny, i użyj hemocytometru, aby policzyć 20-mikrolitrową podwielokrotność zawiesiny komórek. Wyciągnij pozostałe komórki z 50-mililitrowej stożkowej probówki, wirując przy 200-krotności grawitacji przez trzy minuty. Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej trzy razy od 10 do sześciu komórek na mililitr.Aby ułożyć komórki w środku każdego szkiełka nakrywkowego 12-dołkowej płytki ze szklanym dnem pokrytym czterema kryształami kolagenowymi, umieść 10 mikrolitrów kropli zawiesiny komórkowej, uważając, aby nie dotknąć ani nie zarysować powłoki. Poszycie nieokrągłej kropli nie da okrągłego arkusza komórek, a jeśli powłoka zostanie dotknięta lub porysowana, uniemożliwi to dobre przyleganie komórek. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze przez 30 minut, aby umożliwić połączenie komórek.Następnie sprawdź, czy nie ma mocowania pod odwróconym mikroskopem. Za pomocą jednego mililitra pożywki hodowlanej delikatnie umyj studzienki dwukrotnie, aby usunąć nieprzyłączone komórki, a następnie dodaj jeden mililitr pożywki hodowlanej do każdej studzienki. Sprawdź pod odwróconym mikroskopem, czy nie pozostały żadne pływające komórki, w przeciwnym razie ponownie umyj studzienki.Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2 w wilgotnej atmosferze, aby uzyskać dobrze zdefiniowane arkusze komórek. Za pomocą odwróconego mikroskopu sprawdź wszystkie studzienki, aby upewnić się, że kolonie komórek rosną prawidłowo. W razie potrzeby zaznacz nieodpowiednie studzienki i nie używaj ich.Oznacz każdą studzienkę płytki odpowiednio dla każdego badanego stanu. Uruchom każdy warunek w dwóch lub trzech egzemplarzach. Zmień pożywkę, aby zagłodzić komórki w DMEMF12 zawierającej 0,1% końskiej surowicy, trzy godziny przed stymulacją komórek.Następnie stymuluj komórki, dodając EGF lub inne pożądane mediatory. Użyj pipetara o pojemności jednego mikrolitra lub delikatnie zakręć płytką, aby wymieszać medium. Inkubuj płytkę przez jeden do czterech dni, aby obserwować przemieszczenie krawędzi i kontur krawędzi.Aby przeprowadzić barwienie H i E, należy dwukrotnie przemyć komórki PBS i utrwalić je na około dwie minuty. Dodaj hematoksylinę przez około dwie minuty, aby zabarwić jądra. Myj komórki wodą z kranu przez pięć do 10 minut, aż jądra staną się niebieskie.Następnie barwić cytoplazmę eozyną przez dwie minuty przed spłukaniem komórek wodą dejonizowaną. Wysuszyć płytkę na powietrzu, a następnie odwrócić ją i za pomocą linijki zmierzyć średnicę kropki. Alternatywnie, zrób zdjęcia płytki za pomocą aparatu i użyj ImageJ do analizy średnicy kropki.Aby przeprowadzić mikroskopię poklatkową, włącz mikroskop inkubatora i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza. Napełnij nawilżacz DH2O, a następnie dostosuj CO2 do 5%Upewnij się, że komora inkubatora jest nawilżona i że zmotoryzowany stage może się swobodnie poruszać. Następnie zamknij komorę inkubatora i pozwól, aby mikroskop ustawił się na 37 stopni Celsjusza.Umieść płytkę na stoliku mikroskopu inkubatora i ustaw listę etapów, a następnie zobrazuj dwie przeciwległe krawędzie i środek każdej kropki komórki. Korzystając z obiektywu 10X, rób zdjęcia co trzy minuty przez 15 do 24 godzin. Pobierz dane i kontynuuj analizę obrazu w wybranym programie, takim jak Matlab.Początkowo obrazowanie kropek komórkowych z kontrastem fazowym wykazało, że inwazyjne komórki raka piersi tworzące kolonie płuc utrzymują fenotyp mezenchymalny po stymulacji EGF. Jednak pojedyncze komórki opuszczające arkusz są częściej obserwowane w kropkach komórkowych stymulowanych przez EGF. Odpowiedź komórek raka piersi tworzących kolonie płuc na EGF była dalej oceniana przez barwienie H i E kultur, które były stymulowane EGF przez cztery dni.Rzeczywiście, stymulacja EGF spowodowała zwiększenie średnicy kolonii, co wskazuje, że migracja komórek stymulowanych przez EGF może być zmieniona. W tym teście punktowym komórki na krawędziach arkusza obrazowano przez dziewięć godzin po stymulacji komórek raka piersi tworzących kolonie za pomocą EGF. PIV ujawnił, że EGF zwiększył prędkość komórek do 0,63 mikrometra na minutę z 0,45 mikrometra na minutę w komórkach kontrolnych.Ponadto EGF zmniejszył zmienność kierunkowości komórek lub kątowego rozprzestrzeniania się z 0,95 w kulturach kontrolnych do 0,79 w kulturach stymulowanych przez EGF. Ponadto, jak zaobserwowano w barwieniu H i E po czterech dniach, EGF zwiększył promieniowe przemieszczenie krawędzi nabłonka w ciągu dziewięciu godzin, z 257 mikrometrów do 356 mikrometrów. Po opanowaniu praktyczny czas na tę technikę wynosi kilka godzin.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie poklatkowe, barwienie immunologiczne oraz analiza DNA i RNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania. Na przykład można go użyć do analizy, czy białka ulegają zróżnicowanej ekspresji w szybko lub wolno migrujących komórkach lub kiedy komórki migrują do otaczającego środowiska. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować test punktowy i używać go do oceny fenotypu migracyjnego dołączonych spójnych arkuszy komórkowych w odpowiedzi na sygnały mikrośrodowiskowe.

using-the-dot-assay-to-analyze-migration-of-cell-sheets

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano powszechnie stosowane, wysoce dostępne metody badania migracji komórek i inwazji in vitro. Pierwszą metodą jest test zamykania ran komórkowych, który mierzy ruchliwość komórek. Drugą metodą jest test migracji i inwazji transwell, który ocenia zdolność komórek do chemotakcji i inwazyjności.

Metody in vitro Testy migracji i inwazji komórek

Opisano ilościową metodę badania spontanicznej migracji komórek w jednowymiarowym, zamkniętym mikrośrodowisku. Metoda ta wykorzystuje mikrofabrykowane kanały i może być stosowana do badania migracji dużej liczby komórek w różnych warunkach w pojedynczych eksperymentach.

Badanie migracji komórek w kanałach mikroprefabrykowanych

Tutaj opisujemy protokół, który łączy dwie techniki proteomiczne, mianowicie dwuwymiarową elektroforezę (2DE) i spektrometrię mas (MS), w celu identyfikacji różnie wyrażonych/potranslacyjnych zmodyfikowanych białek wśród dwóch lub więcej grup próbek pierwotnych. Takie podejście, wraz z eksperymentami funkcjonalnymi, pozwala na identyfikację i charakterystykę markerów prognostycznych/celów terapeutycznych.

Od plamki 2DE-Gel do funkcji białka: lekcja wyciągnięta z HS1 w przewlekłej białaczce limfocytowej

Badanie wczesnej migracji komórek śródbłonka (EEC) jest ważne dla zrozumienia patofizjologii niektórych chorób i potencjalnego zidentyfikowania nowych strategii interwencji terapeutycznej. Poniższy protokół opisuje techniki oceny migracji komórek, które zostały dostosowane do badania EWG.

Ocena migracji komórek śródbłonka po ekspozycji na toksyczne chemikalia

Ten protokół szczegółowo opisuje konfigurowalną metodę pomiaru migracji komórek w odpowiedzi na chemoatraktanty, które mogą być również użyte do określenia szybkości dyfuzji leku z matrycy polimerowej.

Konfigurowalna komora do pomiaru migracji komórek

To badanie przedstawia dwie różne metody analizy inwazji i migracji komórek: test komory Boydena i test gojenia ran oparty na mikroskopie in vitro. Opisano protokoły tych dwóch eksperymentów oraz porównano ich zalety i wady.

Ocena procesu inwazji i migracji komórek: porównanie testu ran drapanych opartego na mikroskopie wideo i testu z komorą Boydena

Obecny protokół opisuje zintegrowaną metodę badania migracji i inwazji komórek rakowych na jednej platformie w czasie rzeczywistym, zapewniając łatwą do odtworzenia i efektywną czasowo opcję badania mobilności i morfologii komórek.

Prosty przepływ pracy migracji/inwazji przy użyciu zautomatyzowanego imagera Live Cell

Siły mechaniczne są ważne dla kontrolowania migracji komórek. Protokół ten demonstruje użycie elastycznych hydrożeli, które można odkształcić za pomocą szklanej mikropipety i mikromanipulatora w celu stymulacji komórek za pomocą lokalnego gradientu sztywności w celu wywołania zmian w strukturze komórki i migracji.

Test durotaksji pojedynczej komórki do oceny mechanicznej kontroli ruchu komórkowego i powiązanych zdarzeń sygnalizacyjnych

Prezentujemy trzy proste testy in vitro - test migracji na duże odległości, test migracji kokulturowej i test przyciągania chemo-chemicznego - które wspólnie oceniają funkcje komórek śródbłonka okołokomorowego pochodzących z ludzkich komórek macierzystych i ich interakcję z interneuronami GABA-ergicznymi.

Testy migracji, chemoprzyciągania i kohodowli komórek śródbłonka pochodzących z ludzkich komórek macierzystych i neuronów GABA-ergicznych

Protokół do ilościowej oceny migracji komórek 3D w obrębie i do interfejsu granulowanych hydrożeli jest przedstawiony tutaj.

Kwantyfikacja trójwymiarowej migracji komórek w obrębie i do granulowanych biomateriałów hydrożelowych

Poznaj test punktowy do analizy migracji spójnych arkuszy komórkowych w odpowiedzi na sygnały mikrośrodowiskowe. Ta metoda pozwala badać motoryczność komórek nowotworowych i czynniki ją regulujące.

Wykorzystanie testu punktowego do analizy migracji arkuszy komórek

Przeglądaj więcej filmów