Wykorzystanie testu punktowego do analizy migracji arkuszy komórek

Ogólnym celem testu kropkowego jest ocena fenotypu migracyjnego przyczepionych spójnych arkuszy komórkowych w odpowiedzi na sygnały mikrośrodowiskowe. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie raka, takie jak to, w jaki sposób cytokiny lub czynniki wzrostu zmieniają ruchliwość komórek nowotworowych. Główną zaletą testu punktowego jest to, że można go łatwo wykonać i wykorzystać do uzyskania powtarzalnych wyników.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w ruchliwość komórek, nadaje się również do szeregu późniejszych testów, takich jak barwienie komórek w celu oceny morfologii kolonii wzrostu i rozpraszania komórek, barwienie immunologiczne, analiza białek i DNA lub RNA lub wstrzykiwanie komórek zwierzętom. Na początek rozmrozić kolagen myszy cztery na lodzie i rozcieńczyć go 50 mikromolowymi HCL, aby przygotować trzy mililitry roztworu kolagenu o stężeniu 10 mikrogramów na mililitr. Dodaj 250 mikrolitrów czteroskładnikowego roztworu kolagenu do studzienek 12-dołkowych płytek ze szklanym dnem i umieść je w odpowiednio dużym, szczelnie zamykającym się plastikowym pudełku.

Umieść mokry ręcznik papierowy na talerzach i wokół nich, aby uzyskać wilgotną komorę, i zamknij pudełko. Następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego ranka, aby przesunąć niewchłonięty kolagen i bufor, użyj wody dejonizowanej, aby dwukrotnie przepłukać płytki, kierując wodę do krawędzi płytki, a nie do krawędzi utworzonej przez krawędź dna i szkiełko nakrywkowe.

Wysuszyć płytki na powietrzu w okapie z przepływem laminarnym i zużyć je natychmiast lub przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do pięciu dni. Aby przygotować zawiesinę komórkową, użyj komórek, które zostały wyhodowane w 60-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej w DMEMF12 pożywce, uzupełnionej 5% surowicą końską do 80% konfluencji. Użyj DPBS bez wapnia i magnezu, aby raz przepłukać komórki, a następnie dodaj 500 mikrolitrów trypsyny EDTA o temperaturze pokojowej i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2 w wilgotnej atmosferze przez trzy do pięciu minut.

Zawieś oderwane komórki w 4,5 mililitra pożywki hodowlanej, aby zatrzymać aktywność trypsyny, i użyj hemocytometru, aby policzyć 20-mikrolitrową podwielokrotność zawiesiny komórek. Wyciągnij pozostałe komórki z 50-mililitrowej stożkowej probówki, wirując przy 200-krotności grawitacji przez trzy minuty. Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej trzy razy od 10 do sześciu komórek na mililitr.

Aby ułożyć komórki w środku każdego szkiełka nakrywkowego 12-dołkowej płytki ze szklanym dnem pokrytym czterema kryształami kolagenowymi, umieść 10 mikrolitrów kropli zawiesiny komórkowej, uważając, aby nie dotknąć ani nie zarysować powłoki. Poszycie nieokrągłej kropli nie da okrągłego arkusza komórek, a jeśli powłoka zostanie dotknięta lub porysowana, uniemożliwi to dobre przyleganie komórek. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze przez 30 minut, aby umożliwić połączenie komórek.

Następnie sprawdź, czy nie ma mocowania pod odwróconym mikroskopem. Za pomocą jednego mililitra pożywki hodowlanej delikatnie umyj studzienki dwukrotnie, aby usunąć nieprzyłączone komórki, a następnie dodaj jeden mililitr pożywki hodowlanej do każdej studzienki. Sprawdź pod odwróconym mikroskopem, czy nie pozostały żadne pływające komórki, w przeciwnym razie ponownie umyj studzienki.

Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2 w wilgotnej atmosferze, aby uzyskać dobrze zdefiniowane arkusze komórek. Za pomocą odwróconego mikroskopu sprawdź wszystkie studzienki, aby upewnić się, że kolonie komórek rosną prawidłowo. W razie potrzeby zaznacz nieodpowiednie studzienki i nie używaj ich.

Oznacz każdą studzienkę płytki odpowiednio dla każdego badanego stanu. Uruchom każdy warunek w dwóch lub trzech egzemplarzach. Zmień pożywkę, aby zagłodzić komórki w DMEMF12 zawierającej 0,1% końskiej surowicy, trzy godziny przed stymulacją komórek.

Następnie stymuluj komórki, dodając EGF lub inne pożądane mediatory. Użyj pipetara o pojemności jednego mikrolitra lub delikatnie zakręć płytką, aby wymieszać medium. Inkubuj płytkę przez jeden do czterech dni, aby obserwować przemieszczenie krawędzi i kontur krawędzi.

Aby przeprowadzić barwienie H i E, należy dwukrotnie przemyć komórki PBS i utrwalić je na około dwie minuty. Dodaj hematoksylinę przez około dwie minuty, aby zabarwić jądra. Myj komórki wodą z kranu przez pięć do 10 minut, aż jądra staną się niebieskie.

Następnie barwić cytoplazmę eozyną przez dwie minuty przed spłukaniem komórek wodą dejonizowaną. Wysuszyć płytkę na powietrzu, a następnie odwrócić ją i za pomocą linijki zmierzyć średnicę kropki. Alternatywnie, zrób zdjęcia płytki za pomocą aparatu i użyj ImageJ do analizy średnicy kropki.

Aby przeprowadzić mikroskopię poklatkową, włącz mikroskop inkubatora i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza. Napełnij nawilżacz DH2O, a następnie dostosuj CO2 do 5%Upewnij się, że komora inkubatora jest nawilżona i że zmotoryzowany stage może się swobodnie poruszać. Następnie zamknij komorę inkubatora i pozwól, aby mikroskop ustawił się na 37 stopni Celsjusza.

Umieść płytkę na stoliku mikroskopu inkubatora i ustaw listę etapów, a następnie zobrazuj dwie przeciwległe krawędzie i środek każdej kropki komórki. Korzystając z obiektywu 10X, rób zdjęcia co trzy minuty przez 15 do 24 godzin. Pobierz dane i kontynuuj analizę obrazu w wybranym programie, takim jak Matlab.

Początkowo obrazowanie kropek komórkowych z kontrastem fazowym wykazało, że inwazyjne komórki raka piersi tworzące kolonie płuc utrzymują fenotyp mezenchymalny po stymulacji EGF. Jednak pojedyncze komórki opuszczające arkusz są częściej obserwowane w kropkach komórkowych stymulowanych przez EGF. Odpowiedź komórek raka piersi tworzących kolonie płuc na EGF była dalej oceniana przez barwienie H i E kultur, które były stymulowane EGF przez cztery dni.

Rzeczywiście, stymulacja EGF spowodowała zwiększenie średnicy kolonii, co wskazuje, że migracja komórek stymulowanych przez EGF może być zmieniona. W tym teście punktowym komórki na krawędziach arkusza obrazowano przez dziewięć godzin po stymulacji komórek raka piersi tworzących kolonie za pomocą EGF. PIV ujawnił, że EGF zwiększył prędkość komórek do 0,63 mikrometra na minutę z 0,45 mikrometra na minutę w komórkach kontrolnych.

Ponadto EGF zmniejszył zmienność kierunkowości komórek lub kątowego rozprzestrzeniania się z 0,95 w kulturach kontrolnych do 0,79 w kulturach stymulowanych przez EGF. Ponadto, jak zaobserwowano w barwieniu H i E po czterech dniach, EGF zwiększył promieniowe przemieszczenie krawędzi nabłonka w ciągu dziewięciu godzin, z 257 mikrometrów do 356 mikrometrów. Po opanowaniu praktyczny czas na tę technikę wynosi kilka godzin.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie poklatkowe, barwienie immunologiczne oraz analiza DNA i RNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania. Na przykład można go użyć do analizy, czy białka ulegają zróżnicowanej ekspresji w szybko lub wolno migrujących komórkach lub kiedy komórki migrują do otaczającego środowiska. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować test punktowy i używać go do oceny fenotypu migracyjnego dołączonych spójnych arkuszy komórkowych w odpowiedzi na sygnały mikrośrodowiskowe.