Technika squasha kanalików nasiennych do cytologicznej analizy spermatogenezy z wykorzystaniem modelu mysiego

Ogólnym celem tej techniki zgniatania kanalików nasiennych jest wizualizacja cech cytologicznych spermatogonii, spermatocytów i spermatydów myszy przy jednoczesnym zachowaniu ich integralności komórkowej. W tej demonstracji skupiamy się na analizie spermatocytów poddawanych mejjozie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii rozrodu mężczyzn, takie jak różnicowanie spermatogonialnych komórek macierzystych, mejotyczna segregacja chromosomów i postmejotyczne różnicowanie okrągłych spermatydów.

Główną zaletą tej techniki jest to, że zachowana jest integralność komórkowa męskich komórek rozrodczych, co pozwala na badanie struktur komórkowych, które nie są łatwe do zobrazowania za pomocą innych technik. Metoda ta może być wykorzystana do lepszego zrozumienia ojcowskich przyczyn niepłodności w każdej placyce. I może być stosowany do układów ssaków, takich jak jądra pochodzące od myszy lub dawców narządów.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności z zrobieniem dobrego squasha. Przyłożenie wystarczającej siły i prawidłowe ułożenie kanalików jest ważnym czynnikiem do wytworzenia równej monowarstwy komórek. Dla każdej myszy, która ma być poddana sekcji, załaduj dwie 35-milimetrowe szalki Petriego, jedną z trzema mililitrami PBS, a drugą z dwoma mililitrami świeżo przygotowanego roztworu do lizy utrwalającej.

Wybierz myszy przechodzące pierwszą falę spermatogenezy, aby obserwować wzbogaconą populację będącą przedmiotem zainteresowania. Po poświęceniu myszy należy oczyścić brzuch 70% alkoholem, a następnie przystąpić do zabiegu. Wykonaj otwór w kształcie litery V w jamie brzusznej miednicy i usuń jądra, ciągnąc za poduszeczkę tłuszczową najądrza za pomocą kleszczy, ale bez naruszania osłonki białawej.

Przenieś jądra do naczynia zawierającego PBS. Tam usuń osłonkę białawą jąder, nakłuwając tkankę ostrymi kleszczami i zbierz luźne kanaliki nasienne. Następnie przenieś kanaliki do naczynia z roztworem do lizy utrwalającej i pozwól reakcji postępować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Podczas inkubacji należy przygotować szkiełko pokryte poli-L-lizyną, obrysowując krawędzie szkiełka pisakiem blokującym płyn, a następnie wypełniając szkiełko 100 mikrolitrami roztworu do lizy utrwalającej w obrębie granic. Po pięciominutowej inkubacji za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek delikatnie rozerwać i przeciąć kanaliki nasienne, aby uzyskać 20 milimetrowych pojedynczych segmentów. Następnie przenieś pięć 20-milimetrowych segmentów kanalików na przygotowany szkiełko.

Następnie kontynuuj dzielenie segmentów na długości od 1,5 do trzech milimetrów za pomocą nożyczek. Teraz za pomocą kleszczy ułóż segmenty tak, aby nie zachodziły na siebie. Rozłóż je równomiernie na slajdzie.

Idealnie, 20 do 40 krótkich odcinków zajmie jedną prowadnicę. Rozpocząć od usunięcia nadmiaru płynu z preparatu szkiełkowego za pomocą chusteczki chłonnej. Teraz nałóż szkiełko nakrywkowe i zgnieć kanaliki, naciskając piętę dłoni przez 10 do 20 sekund.

Celem jest zastosowanie wystarczającej siły, aby rozproszyć spermatocyty z kanalików nasiennych. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego sprawdź, czy segmenty zostały naruszone przez kabaczek. Następnie wlej trochę ciekłego azotu do małego Dewara i błyskawicznie zamroź szkiełko na 15 sekund lub do momentu, gdy płyn przestanie bulgotać.

Aby kontynuować oczyszczanie amino, należy natychmiast usunąć szkiełko nakrywkowe za pomocą ostrego punktu lub krawędzi. Chociaż nie jest to idealne rozwiązanie, zamrożone szkiełka można natychmiast zakonserwować w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i przechowywać do dwóch tygodni. Aby później zdjąć szkiełko nakrywkowe, zanurz szkiełka w ciekłym azocie na 15 sekund i podważ szkiełko nakrywkowe.

Aby kontynuować znakowanie aminokwasów, umyj szkiełka trzy razy w PBS przez pięć minut na mycie za pomocą 50-mililitrowego słoika Coplin. Po przepłukaniu nałóż jeden mililitr buforu do rozcieńczania przeciwciał na każde szkiełko, aby służyło jako blok. Pozwól, aby reakcja blokowa trwała od jednej do dwóch godzin w wilgotnej komorze.

Nigdy nie pozwól, aby szkiełka wyschły podczas tej procedury. Następnie postukaj szkiełkami o ręcznik papierowy, aby delikatnie wyjąć bufor i włóż je z powrotem do nawilżonej komory. Następnie nałóż 100 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego na każde szkiełko i przenieś je do 40 stopni Celsjusza, gdzie reakcja wiązania może przebiegać przez noc.

Jeśli roztwór przeciwciała jest na wagę złota, można użyć połowy objętości, jeśli jest pokryty szkiełkiem nakrywkowym lub parafilmem. Następnego dnia użyj trzech płukań w PBS, aby usunąć przeciwciało pierwszorzędowe. Następnie nałóż 100 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego i pozwól tej reakcji trwać od jednej do półtorej godziny w temperaturze pokojowej.

Aby uniknąć fotowybielania, podczas tej inkubacji przechowuj szkiełka w ciemnej, wilgotnej komorze. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie za pomocą PBS. Teraz nałóż kropki na slajdy za pomocą nośnika montażowego zawierającego DAPI.

Następnie przyklej szkiełka nakrywkowe za pomocą lakieru do paznokci i przystąp do obrazowania. Do wykonywania zdjęć należy użyć mikroskopu epifluorescencyjnego ze zautomatyzowanym stolikiem, który umożliwia precyzyjny ruch w osi z. Do robienia zdjęć używaj także aparatu o wysokiej rozdzielczości.

Teraz oceń slajdy za pomocą obiektywu 20x. Określ jakość przygotowania dyni. Dobrej jakości dynia będzie miała monowarstwę jąder, które są równomiernie rozłożone.

Niektóre regiony squasha mogą być lepsze od innych. Zanotuj współrzędne najlepszych regionów, aby łatwo je znaleźć w większym powiększeniu. Teraz zwiększ powiększenie do 100x.

Następnie uchwyć obrazy z odnotowanych obszarów, które mają spójną monowarstwę jąder. Ustaw górne i dolne stosy z, aby upewnić się, że całe ostre światło jest przechwytywane. Optymalna liczba stosów Z jest zazwyczaj określana przez oprogramowanie do akwizycji obrazu i jest różna dla każdego obiektywu.

Na podstawie obrazów skompiluj obraz o rozszerzonej głębi za pomocą oprogramowania do przetwarzania. Oprogramowanie połączy ostre światło z każdego stosu z, co jest niezbędne do optymalnego obrazowania preparatów do squasha w kanalikach. Za pomocą opisanej metody kanalikowego zobrazowano przejściowe populacje komórek przechodzące przejście od profazy do metafazy pierwszej.

Wzbogacone populacje spermatocytów metafazy pierwszej wizualizowano przy użyciu przeciwciał przeciwko tubulinie alfa. Aby uwidocznić komórki w profazie pierwszej, preparaty kabaczków kanalikowych zostały znakowane immunologicznie przeciwciałem przeciwko białku kompleksu synaptonemalnego 3. Zidentyfikowano spermatocyty w stadium leptotenu, zygotenu i diplotenu pachytenu.

Przeciwciała przeciwko kinazie cyklu komórkowego Aurora B wykorzystano do wizualizacji późniejszych zdarzeń pierwszej mejozy. Kinaza ta lokalizuje się w wewnętrznym centromerze podczas metafazy, następnie przemieszcza się do strefy środkowej wrzeciona podczas anafazy, a na końcu do bruzdy rozszczepienia podczas cytokinezy. Zachowując integralność komórkową, technika zgniatania kanalików pozwala na wizualizację organizacji subkomórkowej w strukturach związanych z profazą pierwszą.

Dynamikę bukietu chromosomów można śledzić poprzez profazę pierwszą. Można również uwidocznić duplikację centrioli w dysjunkcji centrosomów. We wczesnym stadium diplotenu spermatocyty ulegające dysjunkcjom centrosomów po duplikacji centrioli uwidoczniono z przeciwciałami przeciwko perycentrynie, białkowym składnikom macierzy pericentriolarnej i przeciwciałami przeciwko Centrin-3 w celu oznaczenia centrioli.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak szybko ocenić cechy cytologiczne rozwijających się spermatocytów myszy przy jednoczesnym zachowaniu integralności komórkowej. Po opanowaniu, rozbiór poprzez zgniatanie można wykonać w mniej niż godzinę na mysz. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o przyłożeniu wystarczającej siły, aby rozproszyć spermatocyty z kanalików nasiennych.

Ponadto stężenie utrwalacza i czas inkubacji można zoptymalizować w zależności od badanej struktury komórkowej. Za pomocą tej techniki można łatwo wdrożyć alternatywne strategie wizualizacji, takie jak podejścia ryb DNA i RNA. Uzupełniając zgniatarki kanalikowe dalszymi testami biochemicznymi, możliwa jest ocena mechanistycznych determinantów udanej progresji mejotycznej.