Name: Technika squasha kanalików nasiennych do cytologicznej analizy spermatogenezy z wykorzystaniem modelu mysiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj technikę squasha kanalików nasiennych do analizy cytologicznej spermatogenezy u myszy. Ta metoda zachowuje integralność komórkową i umożliwia badanie mejozy oraz przyczyn męskiej niepłodności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIGMS (R01GM11755) dla P.W.J. oraz przez stypendium szkoleniowe od National Cancer Institute (NIH) (CA009110) dla S.R.W. i J.H.

Użycie myszy zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa. Eksperymenty przeprowadzono na młodocianych (20 - 26 dni po porodzie, dpp) myszach C57BL/6J, wykorzystując półsynchroniczną pierwszą falę spermatogenezy. Jednak tę technikę można również wykonać na dorosłych myszach.
1. Sekcja i izolacja kanalików nasiennych myszy
<ol>
	<li>Przygotować roztwór utrwalający/do lizy i bufor do rozcieńczania przeciwciał (ADB) opisane w Tabeli 1 i Tabeli 2.</li>
	<li>Przygotuj jedną 35-milimetrową szalkę Petriego z 3 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS, pH 7,4) i drugą 35-milimetrową szalkę z 2 ml roztworu do utrwalania/lizy na mysz.</li>
	<li>Poświęć mysz poprzez zwichnięcie szyjki macicy lub uduszenie CO2 i spryskaj brzuszną część brzucha 70% etanolem. Otwórz jamę brzuszno-miedniczną za pomocą sterylnych nożyczek, tworząc otwór w kształcie litery V. Następnie usuń jądra, ciągnąc za poduszeczkę tłuszczową najądrza za pomocą kleszczy i unikaj naruszania osłonki białawej. Umieścić jądra na 35-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 1x PBS. 
	nuta: Wykorzystaj pierwszą falę spermatogenezy, aby zaobserwować wzbogaconą populację komórek będących przedmiotem zainteresowania14. Poszczególne etapy spermatogenezy są wzbogacone w różnym wieku myszy (Tabela 3).</li>
	<li>Usuń osłonkę białawą jąder, nakłuwając tkankę kleszczami z ostrymi końcówkami i zbierz luźne kanaliki nasienne. Przenieść kanaliki na nową szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą 2 ml roztworu do utrwalania/lizy.</li>
	<li>Inkubować kanaliki w roztworze do utrwalania/lizy przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kanalików nasiennych
<ol>
	<li>Przygotować szkiełko podstawowe pokryte poli-L-lizyną, obrysowując krawędzie szkiełka pisakiem blokującym płyny.</li>
	<li>Nanieść 100 μl roztworu utrwalającego/do lizy na środek szkiełka</li> podstawowego.
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek delikatnie rozsuń kanaliki nasienne. Wycinanie długich, pojedynczych segmentów kanalików o długości około 20 mm. 
	nuta: Aby uwidocznić struktury, które są wrażliwe na długotrwałą ekspozycję utrwalającą, takie jak centrosomy, najpierw oddziel kanaliki w 1x PBS, a następnie bezpośrednio zmiel kanaliki na powierzchni szkiełek polilizynowych pokrytych 100 μl roztworu do utrwalania.</li>
	<li>Przenieść pięć segmentów kanalików nasiennych o długości 20 mm do przygotowanego szkiełka szklanego pokrytego poli-L-lizyną zawierającego roztwór utrwalający/lizyzowy.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych nożyczek rozdrobnij kanaliki nasienne na segmenty o średnicy od 1,5 do 3,0 mm.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczyków ułóż segmenty kanalików na szkiełku tak, aby żadna tkanka nie zachodziła na siebie, a kanaliki były równomiernie rozłożone. 
	nuta: Optymalna liczba segmentów kanalików na szkiełku podstawowym wynosi od 20 do 40.</li>
</ol>
3. Zgniatanie kanalików nasiennych
<ol>
	<li>Przenieść szkiełko zawierające rozproszone segmenty kanalików nasiennych na blat stołu. Usuń nadmiar płynu za pomocą chusteczki laboratoryjnej, aby uniknąć utraty tkanki podczas etapu squasha.</li>
	<li>Nałóż szkiełko nakrywkowe (22 x 60 - 1,5 mm) na szkiełko podstawowe i dociskaj piętą dłoni przez 10 - 20 sekund. Ważne jest, aby przyłożyć wystarczającą siłę, aby rozproszyć spermatocyty z kanalików nasiennych. 
	nuta: Obserwuj kanaliki za pomocą mikroskopu preparacyjnego, aby zoptymalizować etap zgniatania, tak aby wszystkie segmenty kanalików zostały przerwane.</li>
	<li>Za pomocą kleszczyków do szkiełków natychmiast błyskawicznie zamroź szklane szkiełko w małym dewarze cieczy N2 na 15 sekund lub do momentu, gdy płyn przestanie bulgotać. W przypadku natychmiastowego znakowania immunologicznego usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą żyletki o prostej krawędzi, kleszczyków z cienką końcówką lub igły o rozmiarze 21. 
	nuta: W celu uzyskania optymalnych wyników należy natychmiast oznaczyć immunologicznie preparaty (patrz krok 4). Jednak w tym momencie szkiełka mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez okres do dwóch tygodni. Aby zmaksymalizować żywotność białek i struktur komórkowych, należy natychmiast przechowywać szkiełka na suchym lodzie lub przenieść do zamrażarki o temperaturze -80 °C, a szkiełko nakrywkowe trzymać na szkiełku. W przypadku znakowania immunologicznego przechowywanych szkiełek należy usunąć szkiełko nakrywkowe, zanurzając szkiełka w płynieN2 na 15 sekund, jak opisano w kroku 3.3.</li>
</ol>
4. Znakowanie immunologiczne zamontowanych kanalików nasiennych
<ol>
	<li>Zanurz szkiełko w 1x PBS i umyj trzy razy przez 5 minut w 50-mililitrowym słoiku Coplin zawierającym 1x PBS. 
	nuta: Nigdy nie dopuścić do całkowitego wyschnięcia szkiełek podczas znakowania immunologicznego.</li>
	<li>Nanieść 1 ml buforu do rozcieńczania przeciwciał na szkiełko podstawowe i blokować przez 1-2 godziny w wilgotnej komorze.</li>
	<li>Wyjąć bufor do rozcieńczania przeciwciał i nanieść 100 μl pierwszorzędowego przeciwciała rozcieńczonego w buforze do rozcieńczania przeciwciał w wilgotnej komorze. 
	nuta: W celu uzyskania najlepszych wyników należy inkubować przeciwciała pierwszorzędowe przez noc w temperaturze 4 °C. Stosować mniejsze objętości przeciwciał (np. 50 μl), przykrywając szkiełko szkiełkiem nakrywkowym lub parafilmem. Walidacja i optymalizacja przeciwciał pierwszorzędowych15.</li>
	<li>Płucz szkiełka trzy razy przez 5 minut w słoiku Coplin o pojemności 50 ml zawierającym 1x PBS. 
	nuta: Aby usprawnić mycie, zamieszaj słoiki Coplin za pomocą małego magnetycznego pręta mieszającego i umieść na magnetycznej płycie mieszającej z niską prędkością lub umieść słoik Coplin na mikserze stołowym z niską prędkością.</li>
	<li>Stosować 100 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w buforze rozcieńczającym przeciwciała przez 1 do 1,5 godziny w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej. Inkubować szkiełka w ciemnym pudełku, aby uniknąć fotowybielania przeciwciał sprzężonych z fluoroforem. 
	nuta: Należy stosować mniejsze objętości przeciwciał (np. 50 μl), przykrywając szkiełko szkiełkiem nakrywkowym lub parafilmem.</li>
	<li>Płucz szkiełka dwa razy przez 5 minut w 50-mililitrowym słoiku Coplin zawierającym 1x PBS.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka w podłożu montażowym zawierającym 4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI, 1,5 μg/ml) i nałóż szkiełka nakrywkowe (22 x 60 - 1,5 mm).</li>
	<li>Uszczelnij szkiełka nakrywkowe do szkiełek przezroczystym lakierem do paznokci, aby zachować szkiełka i zapobiec przesuwaniu się szkiełek nakrywkowych.</li>
</ol>
5. Analiza i obrazowanie preparatów do squasha w kanalikach
<ol>
	<li>Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego ze zautomatyzowanym stolikiem, który umożliwia precyzyjny ruch w osi Z, oraz kamery o wysokiej rozdzielczości do przechwytywania obrazu. Alternatywnie można użyć laserowego mikroskopu konfokalnego. 
	nuta: Na tym etapie użyj dowolnego dostępnego sprzętu i oprogramowania. Na przykład obrazy wyświetlane w formatach Rysunek 1 i <silna klasa="xfig">Rysunek 2 zostały zarejestrowane za pomocą skanera Zeiss Cell Observer Z1 połączonego z kamerą CMOS ORCA-Flash 4.0 i przeanalizowane za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów Zeiss ZEN 2012 blue edition.</li>
	<li>Oceń slajdy za pomocą obiektywu 20X, aby określić jakość przygotowania do squasha. Szkiełka dobrej jakości mają monowarstwę jąder, które są równomiernie rozłożone. 
	nuta: Niektóre sekcje slajdu mogą być lepsze od innych, warto zanotować współrzędne, w których można znaleźć najlepsze obszary slajdu do dalszej analizy przy użyciu większego powiększenia.</li>
	<li>Używając obiektywu o większym powiększeniu (np. 63X lub 100X), uchwyć obszary szkiełka, które mają spójną monowarstwę jąder. Po wybraniu regionu ustaw górny i dolny stos Z, aby upewnić się, że całe ostre światło jest przechwytywane. 
	nuta: Optymalna liczba stosów Z uchwyconych między górną a dolną granicą jest zazwyczaj określana przez oprogramowanie do akwizycji obrazu i jest różna dla każdego obiektywu.</li>
	<li>Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby skompilować obraz o rozszerzonej głębi ostrości. Oprogramowanie łączy w sobie ostre światło z każdego stosu Z i jest niezbędne do optymalnego obrazowania preparatów do squasha w kanałach.</li>
</ol>

<ol><li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aneuploidy%3A+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li>
<li>Morelli, M. A., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+all+germ+cells+are+created+equal%3A+Aspects+of+sexual+dimorphism+in+mammalian+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis.</a> Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).</li>
<li>Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+meiotic+prophase+I+to+metaphase+I+transition+in+mouse+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes.</a> Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).</li>
<li>Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slide+preparation+method+to+preserve+three-dimensional+chromatin+architecture+of+testicular+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells.</a> J Vis Exp. (83), e50819(2014).</li>
<li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li>
<li>Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+spermatogenesis%3A+how+far+from+clinical+application%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Urol+Rep%22%5BJournal%5D)">In vitro spermatogenesis: how far from clinical application?</a> Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).</li>
<li>Staub, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+research+on+mammalian+male+germ+cell+meiotic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro.</a> J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).</li>
<li>Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Squash+procedure+for+protein+immunolocalization+in+meiotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells.</a> Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).</li>
<li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li>
<li>Xu, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+cryosection+method+for+mouse+testis+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">A modified cryosection method for mouse testis tissue.</a> Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).</li>
<li>Hess, R., Moore, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+methods+for+evaluation+of+the+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Histological methods for evaluation of the testis.</a> Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).</li>
<li>Bellvé, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+culture%2C+and+fractionation+of+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li>
<li>Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+organelle+traffic+through+cytoplasmic+bridges+in+early+spermatids+of+the+rat%3A+mechanisms+of+haploid+gene+product+sharing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing.</a> Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).</li>
<li>Bellvé, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+the+mouse+testis+and+characterization+of+isolated+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells.</a> J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).</li>
<li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+for+immunocytochemistry%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).</li>
<li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination%2C+pairing%2C+and+synapsis+of+homologs+during+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).</li>
<li>Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+recombination%3A+the+essence+of+heredity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Meiotic recombination: the essence of heredity.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).</li>
<li>Scherthan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere+and+telomere+movements+during+early+meiotic+prophase+of+mouse+and+man+are+associated+with+the+onset+of+pairing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing.</a> J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).</li>
<li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+leptotene-zygotene+transition+of+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The leptotene-zygotene transition of meiosis.</a> Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).</li>
<li>Scherthan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bouquet+makes+ends+meet%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A bouquet makes ends meet.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).</li>
<li>Turner, J. <a target="_blank" href="http://dev.biologists.org/content/134/10/1823">Meiotic sex chromosome inactivation.</a> Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).</li>
<li>Royo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATR+acts+stage+specifically+to+regulate+multiple+aspects+of+mammalian+meiotic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing.</a> Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).</li>
<li>Turner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+unsynapsed+meiotic+chromosomes+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse.</a> Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).</li>
<li>Marjanović, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEP63+deficiency+promotes+p53-dependent+microcephaly+and+reveals+a+role+for+the+centrosome+in+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination.</a> Nat Commun. 6, 7676(2016).</li>
<li>Inanç, B., Dodson, H., Morrison, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Centrosome-autonomous+signal+that+involves+centriole+disengagement+permits+centrosome+duplication+in+G2+phase+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage.</a> Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).</li>
<li>Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+mammalian+sperm+cells+identifies+new+components+of+the+centrosome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).</li>
<li>Fukuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transacting+factor+CBF-A%2FHnrnpab+binds+to+the+A2RE%2FRTS+element+of+protamine+2+mRNA+and+contributes+to+its+translational+regulation+during+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis.</a> PLoS Genet. 9 (10), e1003858(2013).</li>
<li>Lahn, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Previously+uncharacterized+histone+acetyltransferases+implicated+in+mammalian+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).</li>
<li>Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosomal+association+of+histone+macroH2A1.2+in+embryonic+stem+cells+and+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells.</a> Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).</li>
<li>Shanmugam, M., Hernandez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+functions+for+SNAP45%2C+a+subunit+of+the+small+nuclear+RNA-activating+protein+complex+SNAPc%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc.</a> J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).</li>
<li>Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+linking+extra+centrosomes+to+chromosomal+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability.</a> Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).</li>
<li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li>
<li>Amory, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+spermatogenesis+by+bisdichloroacetyldiamines+is+mediated+by+inhibition+of+testicular+retinoic+acid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis.</a> J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).</li>
<li>Hogarth, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+a+spermatogenic+wave+into+a+tsunami%3A+synchronizing+murine+spermatogenesis+using+WIN+18%2C446%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446.</a> Biol Reprod. 88 (2), 40(2013).</li>
<li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).</li>
<li>Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis+in+the+immature+mouse+proceeds+faster+than+in+the+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult.</a> Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).</li>
<li>Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+early+and+massive+wave+of+germinal+cell+apoptosis+is+required+for+the+development+of+functional+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis.</a> EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).</li>
<li>Kangasniemi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+basal+and+FSH+dependent+cyclic+AMP+production+in+rat+seminiferous+tubules+staged+by+an+improved+transillumination+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique.</a> Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).</li>
<li>Martianov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+arrest+of+spermiogenesis+and+germ+cell+apoptosis+in+mice+lacking+the+TBP-like+TLF%2FTRF2+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene.</a> Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).</li>
<li>Henriksén, K., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+apoptosis+of+male+germ+cells+in+the+rat%3A+Mechanisms+of+cell+death+studied+by+supravital+squash+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations.</a> Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Myszy okazały się użytecznym organizmem modelowym do badania zdarzeń komórkowych, które rządzą progresją mejotyczną podczas spermatogenezy. Ponadto konieczne jest opracowanie narzędzi przeznaczonych do badania spermatogenezy, ponieważ wiele zdarzeń, takich jak wyjście z mejotycznej profazy I, jest dymorficznych płciowo. Protokół ten opisuje metodę squasha kanalików nasiennych do wizualizacji i badania różnych etapów spermatogenezy myszy. Metoda ta zachowuje integralność komórkową, a tym samym umożliwia szczegółowe analiz...

Mejoza to złożone zdarzenie komórkowe, w którym po pojedynczej rundzie replikacji DNA następują dwie kolejne rundy podziału komórki. Kilka zdarzeń specyficznych dla mejozy musi być skoordynowanych podczas początkowych etapów mejozy, aby zapewnić dokładną segregację chromosomów. Zdarzenia te obejmują zakończenie rekombinacji homologicznej, koorientację kinetochorów siostrzanych podczas pierwszego podziału mejotycznego oraz stopniową utratę kompleksów kohezyny w celu rozwiązania chiazmatów między homologami. Precyzyjna regulacja tych procesów jest niezbędna do utrzymania płodności i zapobiegania zdarzeniom nieprawidłowej segregacji chromosomów, które mogą prowadzić do genetycznych zaburzeń rozwojowych i spontanicznych poronień1.
Podczas gdy kluczowe zdarzenia mejozy mają miejsce zarówno u mężczyzn, jak i kobiet, istnieją znaczące czasowe i mechanistyczne różnice między spermatogenezą a oogenezą2. Na przykład podczas mejozy żeńskiej profaza I występuje podczas rozwoju embrionalnego i zatrzymuje się na etapie dyktowania aż do dojrzewania. Natomiast spermatogeneza rozpoczyna się w okresie dojrzewania i postępuje falami przez całe dorosłe życie bez zatrzymania. Różnice między mejozą męską i żeńską podkreślają potrzebę opracowania metod, które są specjalnie ukierunkowane na ocenę tych procesów zarówno w spermatocytach, jak i oocytach. Obecnie ocena progresji mejotycznej w dużej mierze opiera się na wykorzystaniu spreadów chromatyny3,4,5. Chociaż rozprzestrzenianie się chromatyny jest przydatne do badania chromosomów mejotycznych, nie udaje im się zachować integralności komórkowej, uniemożliwiając ocenę struktur komórkowych, takich jak mikrotubule wrzecionowate, centrosomy, otoczka jądrowa i przyłączenia telomerów. Obrazowanie na żywo i techniki długoterminowego hodowli znacznie poszerzyły naszą wiedzę na temat mejozy kobiet; Podobne podejścia do wizualizacji całej nienaruszonej komórki są jednak rzadziej stosowane w badaniu spermatogenezy6,7. Aby zobrazować dynamiczne zdarzenia podczas mejozy męskiej, dostosowaliśmy sprawdzone techniki zgniatania kanalików, aby szybko ocenić cechy cytologiczne rozwijających się spermatocytów myszy8,9. Opisana tutaj metoda utrzymuje integralność komórki, umożliwiając badanie wielu struktur komórkowych na różnych etapach spermatogenezy.
Ta technika zgniatania kanalików to podejście całościowe, które pozwala na ocenę struktur komórkowych za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Powszechne podejścia histologiczne do wizualizacji progresji mejotycznej u samców myszy, takie jak barwienie hematoksyliną i eozyną jąder zanurzonych w parafinie oraz immunofluorescencyjne znakowanie kriosekcji, pozwalają na szeroki przegląd progresji mejotycznej. Jednak techniki te nie są w stanie rozpoznać pojedynczych komórek w stopniu niezbędnym do szczegółowej analizy zdarzeń zachodzących podczas mejozy10,11. Alternatywne techniki wizualizacji procesów mejotycznych polegają na znacznym zaburzeniu chemiosmotycznym spermatocytów w celu wyizolowania i utrwalenia materiałów jądrowych3,4,5. Te zabiegi chemiczne utrudniają obserwację typów komórek innych niż pierwotne spermatocyty. Niedawno opisana metoda przez Namekawę umożliwiła społeczności badawczej zachowanie architektury jądrowej izolowanych spermatocytów, ale wymaga użycia cytospinu i akcesoriów, które mogą nie być łatwo dostępne dla niektórych laboratoriów4. W przeciwieństwie do tego, technika squasha kanalików wymaga jedynie sprzętu, który jest ogólnie standardem w większości laboratoriów biologii komórki.
Opisana tutaj metoda zgniatania kanalików może być użyta do wizualizacji różnych typów komórek znajdujących się w kanaliku nasiennym, w tym komórek Sertoliego, spermatogonii, pierwotnych i wtórnych spermatocytów oraz spermatyd. Łącząc tę technikę z niemal synchroniczną pierwszą falą spermatogenezy u młodych myszy, możliwe jest uzyskanie wzbogaconych populacji komórek spermatogennych w miarę ich postępu przez mejozę12. Proces ten pozwala na szczegółową analizę procesów zachodzących w spermatogenezie, takich jak wczesne zdarzenia profazy, przejścia G2/MI i metafazy do anafazy oraz spermiogeneza. Ponadto preparaty do squasha kanalików mogą być wykorzystywane do wizualizacji cech cytologicznych chromosomów (np. domen międzychromatydowych (ICD) i kinetochorów) oraz centrosomów (centrioli i materiału/matryc pericentrioralnych). Metoda squasha może być z łatwością stosowana równolegle z innymi podejściami eksperymentalnymi, takimi jak rozprzestrzenianie chromatyny i ekstrakcja białek. Ponadto technika ta została z powodzeniem zmodyfikowana w celu osadzania żywych komórek plemnikotwórczych na szkiełkach w celu bezpośredniej wizualizacji13.
Opisana tutaj metoda obejmuje technikę zgniatania kanalików nasiennych całokomórkowych do analizy przejścia G2/MI u myszy C57BL/6J typu dzikiego. Cechy cytologiczne pierwotnych spermatocytów wchodzących do pierwszego podziału mejotycznego uwidoczniono za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej w celu obserwacji wrzeciona mejotycznego. Tę wszechstronną technikę można łatwo zmodyfikować, aby uwidocznić inne etapy mejotyczne i różne typy komórek. Technika ta jest również podatna na alternatywne strategie wizualizacji, takie jak podejścia DNA i RNA FISH.

<table><tbody><tr><td>16% Paraformaldehydowa wodna</td><td>mikroskopia elektronowa Nauki (EMS)</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>119-069-161</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla konia</td><td>Sigma</td><td>H-1270</td><td></td></tr><tr><td>35mm x 10mm szalka Petriego, sterylna, niepoddana obróbce</td><td>CellTreat</td><td>P886-229638</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane powlekane poli-L-lizyną</td><td>Sigma</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Blocker Pen</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences (EMS)</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Wilgotne pudełko</td><td>Evergreen</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do barwienia ze szkła Wheaton Coplin na 5 lub 10 szkiełek</td><td>Fisher</td><td>08-813E</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Montaż zapobiegający blaknięciu Średni z szkiełkami podstawowymi mikroskopu DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>(22mmx60mm)</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Bezbarwny lakier do paznokci</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td><silny>Microsopes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy </td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Obserwator Z1</td><td>Zeiss</td><td>4109431007994000</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss ZEN 2012 blue edition oprogramowanie do obrazowania</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 CMOS Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primary Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Mysz anty-SYCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-74569</td><td>1 na 50</td></tr><tr><td>Królik anty-SYCP3</td><td>Fisher (Novus)</td><td>NB300-231</td><td>1 na 1000</td></tr><tr><td>Koza anty-SCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20845</td><td>1 na 50</td></tr><tr><td>Ludzkie przeciwciała</td><td>anty-centromerowe</td><td>15-235</td><td>1 na 100</td></tr><tr><td>Mysia anty-alfa tubulina</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1 na 1000</td></tr><tr><td>Mysz anty-AIM1</td><td>BD Biosciences</td><td>611082</td><td>1 na 200</td></tr><tr><td>Mysz anty-&gamma; H2AX</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA1-2022</td><td>1 na 500</td></tr><tr><td>Mysz anty-CENT3</td><td>Abnova</td><td>H00001070-M01</td><td>1 na 200</td></tr><tr><td>Królik anty-perycentryna</td><td>Abcam</td><td>ab4448</td><td>1 na 200</td></tr><tr><td>Królik anty-REC8</td><td>Dzięki uprzejmości&nbsp; Dr. Karen Schindler</td><td>N/A</td><td>1 na 1000</td></tr></tbody></table>

technika squasha kanalików nasiennych do cytologicznej analizy spermatogenezy z wykorzystaniem modelu mysiego

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Progresja mejotyczna u mężczyzn to proces, który wymaga skoordynowanego działania wielu wysoce regulowanych zdarzeń komórkowych. Błędy występujące podczas mejozy mogą prowadzić do niepłodności, utraty ciąży lub wad genetycznych. Rozpoczynając się na początku okresu dojrzewania i kontynuując przez całe dorosłe życie, ciągłe półsynchroniczne fale spermatocytów ulegają spermatogenezie i ostatecznie tworzą haploidalne plemniki. Pierwsza fala mysich spermatocytów poddawanych inicjacji mejotycznej pojawia się w 10 dniu po porodzie (10 dpp) i jest uwalniana do światła kanalików nasiennych jako dojrzałe plemniki po 35 dpp. Dlatego korzystne jest wykorzystanie myszy w tym oknie rozwojowym w celu uzyskania wysoce wzbogaconych populacji będących przedmiotem zainteresowania. Analiza rzadkich stadiów komórkowych jest trudniejsza u starszych myszy ze względu na udział kolejnych fal spermatogennych, które zwiększają różnorodność populacji komórkowych w kanalikach. Opisana tutaj metoda jest łatwą do wdrożenia techniką oceny cytologicznej komórek znajdujących się w kanalikach nasiennych myszy, w tym spermatogonii, spermatocytów i spermatydów. Technika kanalikowego squasha utrzymuje integralność izolowanych męskich komórek rozrodczych i umożliwia badanie struktur komórkowych, które nie są łatwe do wizualizacji za pomocą innych technik. Aby zademonstrować możliwe zastosowania tej techniki zgniatania kanalików, monitorowano montaż wrzeciona w spermatocytach przechodzących przez przejście od profazy do metafazy I (przejście G2/MI). Ponadto oceniono duplikację centrosomów, mejotyczną inaktywację chromosomów płciowych (MSCI) i tworzenie bukietów chromosomów jako przykłady struktur cytologicznych, które można zaobserwować za pomocą tej metody kanalików. Technika ta może być wykorzystana do wskazania określonych defektów podczas spermatogenezy, które są spowodowane mutacją lub zaburzeniami egzogennymi, a tym samym przyczynia się do naszego molekularnego zrozumienia spermatogenezy.

W niniejszym badaniu zastosowano metodę rozgniatania kanalików (tubule squash method) w celu wizualizacji przejściowych populacji komórek przechodzących z profazy do metafazy I (G2/MI), których zagęszczenie uzyskano poprzez pobranie jąder od młodzieńczych myszy typu dzikiego znajdujących się w pierwszej fali spermatogenezy (24. dzień po urodzeniu, dpp). Rycina 1 przedstawia reprezentatywne obrazy różnych stadiów komórek, które można zwizualizować za pomocą me...

Celem tej techniki zgniatania kanalików jest szybka ocena cech cytologicznych rozwijających się mysich spermatocytów przy jednoczesnym zachowaniu integralności komórkowej. Metoda ta pozwala na badanie wszystkich etapów spermatogenezy i może być łatwo stosowana wraz z innymi biochemicznymi i molekularnymi podejściami biologicznymi do badania mejozy myszy.

Technika squasha kanalików nasiennych do cytologicznej analizy spermatogenezy z wykorzystaniem modelu mysiego

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Ogólnym celem tej techniki zgniatania kanalików nasiennych jest wizualizacja cech cytologicznych spermatogonii, spermatocytów i spermatydów myszy przy jednoczesnym zachowaniu ich integralności komórkowej. W tej demonstracji skupiamy się na analizie spermatocytów poddawanych mejjozie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii rozrodu mężczyzn, takie jak różnicowanie spermatogonialnych komórek macierzystych, mejotyczna segregacja chromosomów i postmejotyczne różnicowanie okrągłych spermatydów.Główną zaletą tej techniki jest to, że zachowana jest integralność komórkowa męskich komórek rozrodczych, co pozwala na badanie struktur komórkowych, które nie są łatwe do zobrazowania za pomocą innych technik. Metoda ta może być wykorzystana do lepszego zrozumienia ojcowskich przyczyn niepłodności w każdej placyce. I może być stosowany do układów ssaków, takich jak jądra pochodzące od myszy lub dawców narządów.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności z zrobieniem dobrego squasha. Przyłożenie wystarczającej siły i prawidłowe ułożenie kanalików jest ważnym czynnikiem do wytworzenia równej monowarstwy komórek. Dla każdej myszy, która ma być poddana sekcji, załaduj dwie 35-milimetrowe szalki Petriego, jedną z trzema mililitrami PBS, a drugą z dwoma mililitrami świeżo przygotowanego roztworu do lizy utrwalającej.Wybierz myszy przechodzące pierwszą falę spermatogenezy, aby obserwować wzbogaconą populację będącą przedmiotem zainteresowania. Po poświęceniu myszy należy oczyścić brzuch 70% alkoholem, a następnie przystąpić do zabiegu. Wykonaj otwór w kształcie litery V w jamie brzusznej miednicy i usuń jądra, ciągnąc za poduszeczkę tłuszczową najądrza za pomocą kleszczy, ale bez naruszania osłonki białawej.Przenieś jądra do naczynia zawierającego PBS. Tam usuń osłonkę białawą jąder, nakłuwając tkankę ostrymi kleszczami i zbierz luźne kanaliki nasienne. Następnie przenieś kanaliki do naczynia z roztworem do lizy utrwalającej i pozwól reakcji postępować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Podczas inkubacji należy przygotować szkiełko pokryte poli-L-lizyną, obrysowując krawędzie szkiełka pisakiem blokującym płyn, a następnie wypełniając szkiełko 100 mikrolitrami roztworu do lizy utrwalającej w obrębie granic. Po pięciominutowej inkubacji za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek delikatnie rozerwać i przeciąć kanaliki nasienne, aby uzyskać 20 milimetrowych pojedynczych segmentów. Następnie przenieś pięć 20-milimetrowych segmentów kanalików na przygotowany szkiełko.Następnie kontynuuj dzielenie segmentów na długości od 1,5 do trzech milimetrów za pomocą nożyczek. Teraz za pomocą kleszczy ułóż segmenty tak, aby nie zachodziły na siebie. Rozłóż je równomiernie na slajdzie.Idealnie, 20 do 40 krótkich odcinków zajmie jedną prowadnicę. Rozpocząć od usunięcia nadmiaru płynu z preparatu szkiełkowego za pomocą chusteczki chłonnej. Teraz nałóż szkiełko nakrywkowe i zgnieć kanaliki, naciskając piętę dłoni przez 10 do 20 sekund.Celem jest zastosowanie wystarczającej siły, aby rozproszyć spermatocyty z kanalików nasiennych. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego sprawdź, czy segmenty zostały naruszone przez kabaczek. Następnie wlej trochę ciekłego azotu do małego Dewara i błyskawicznie zamroź szkiełko na 15 sekund lub do momentu, gdy płyn przestanie bulgotać.Aby kontynuować oczyszczanie amino, należy natychmiast usunąć szkiełko nakrywkowe za pomocą ostrego punktu lub krawędzi. Chociaż nie jest to idealne rozwiązanie, zamrożone szkiełka można natychmiast zakonserwować w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i przechowywać do dwóch tygodni. Aby później zdjąć szkiełko nakrywkowe, zanurz szkiełka w ciekłym azocie na 15 sekund i podważ szkiełko nakrywkowe.Aby kontynuować znakowanie aminokwasów, umyj szkiełka trzy razy w PBS przez pięć minut na mycie za pomocą 50-mililitrowego słoika Coplin. Po przepłukaniu nałóż jeden mililitr buforu do rozcieńczania przeciwciał na każde szkiełko, aby służyło jako blok. Pozwól, aby reakcja blokowa trwała od jednej do dwóch godzin w wilgotnej komorze.Nigdy nie pozwól, aby szkiełka wyschły podczas tej procedury. Następnie postukaj szkiełkami o ręcznik papierowy, aby delikatnie wyjąć bufor i włóż je z powrotem do nawilżonej komory. Następnie nałóż 100 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego na każde szkiełko i przenieś je do 40 stopni Celsjusza, gdzie reakcja wiązania może przebiegać przez noc.Jeśli roztwór przeciwciała jest na wagę złota, można użyć połowy objętości, jeśli jest pokryty szkiełkiem nakrywkowym lub parafilmem. Następnego dnia użyj trzech płukań w PBS, aby usunąć przeciwciało pierwszorzędowe. Następnie nałóż 100 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego i pozwól tej reakcji trwać od jednej do półtorej godziny w temperaturze pokojowej.Aby uniknąć fotowybielania, podczas tej inkubacji przechowuj szkiełka w ciemnej, wilgotnej komorze. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie za pomocą PBS. Teraz nałóż kropki na slajdy za pomocą nośnika montażowego zawierającego DAPI.Następnie przyklej szkiełka nakrywkowe za pomocą lakieru do paznokci i przystąp do obrazowania. Do wykonywania zdjęć należy użyć mikroskopu epifluorescencyjnego ze zautomatyzowanym stolikiem, który umożliwia precyzyjny ruch w osi z. Do robienia zdjęć używaj także aparatu o wysokiej rozdzielczości.Teraz oceń slajdy za pomocą obiektywu 20x. Określ jakość przygotowania dyni. Dobrej jakości dynia będzie miała monowarstwę jąder, które są równomiernie rozłożone.Niektóre regiony squasha mogą być lepsze od innych. Zanotuj współrzędne najlepszych regionów, aby łatwo je znaleźć w większym powiększeniu. Teraz zwiększ powiększenie do 100x.Następnie uchwyć obrazy z odnotowanych obszarów, które mają spójną monowarstwę jąder. Ustaw górne i dolne stosy z, aby upewnić się, że całe ostre światło jest przechwytywane. Optymalna liczba stosów Z jest zazwyczaj określana przez oprogramowanie do akwizycji obrazu i jest różna dla każdego obiektywu.Na podstawie obrazów skompiluj obraz o rozszerzonej głębi za pomocą oprogramowania do przetwarzania. Oprogramowanie połączy ostre światło z każdego stosu z, co jest niezbędne do optymalnego obrazowania preparatów do squasha w kanalikach. Za pomocą opisanej metody kanalikowego zobrazowano przejściowe populacje komórek przechodzące przejście od profazy do metafazy pierwszej.Wzbogacone populacje spermatocytów metafazy pierwszej wizualizowano przy użyciu przeciwciał przeciwko tubulinie alfa. Aby uwidocznić komórki w profazie pierwszej, preparaty kabaczków kanalikowych zostały znakowane immunologicznie przeciwciałem przeciwko białku kompleksu synaptonemalnego 3. Zidentyfikowano spermatocyty w stadium leptotenu, zygotenu i diplotenu pachytenu.Przeciwciała przeciwko kinazie cyklu komórkowego Aurora B wykorzystano do wizualizacji późniejszych zdarzeń pierwszej mejozy. Kinaza ta lokalizuje się w wewnętrznym centromerze podczas metafazy, następnie przemieszcza się do strefy środkowej wrzeciona podczas anafazy, a na końcu do bruzdy rozszczepienia podczas cytokinezy. Zachowując integralność komórkową, technika zgniatania kanalików pozwala na wizualizację organizacji subkomórkowej w strukturach związanych z profazą pierwszą.Dynamikę bukietu chromosomów można śledzić poprzez profazę pierwszą. Można również uwidocznić duplikację centrioli w dysjunkcji centrosomów. We wczesnym stadium diplotenu spermatocyty ulegające dysjunkcjom centrosomów po duplikacji centrioli uwidoczniono z przeciwciałami przeciwko perycentrynie, białkowym składnikom macierzy pericentriolarnej i przeciwciałami przeciwko Centrin-3 w celu oznaczenia centrioli.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak szybko ocenić cechy cytologiczne rozwijających się spermatocytów myszy przy jednoczesnym zachowaniu integralności komórkowej. Po opanowaniu, rozbiór poprzez zgniatanie można wykonać w mniej niż godzinę na mysz. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o przyłożeniu wystarczającej siły, aby rozproszyć spermatocyty z kanalików nasiennych.Ponadto stężenie utrwalacza i czas inkubacji można zoptymalizować w zależności od badanej struktury komórkowej. Za pomocą tej techniki można łatwo wdrożyć alternatywne strategie wizualizacji, takie jak podejścia ryb DNA i RNA. Uzupełniając zgniatarki kanalikowe dalszymi testami biochemicznymi, możliwa jest ocena mechanistycznych determinantów udanej progresji mejotycznej.

a-seminiferous-tubule-squash-technique-for-cytological-analysis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano protokoły transplantacji komórek linii płciowej oraz ksenoprzeszczepów tkanki jądra. Transplantacja komórek linii płciowej prowadzi do spermatogenezy pochodzącej od dawcy w jądrach biorcy i stanowi funkcjonalny test rekonstytucji służący do identyfikacji komórek macierzystych spermatogoniów (SSCs). Ksenoprzeszczepy tkanki jądra odtwarzają rozwój jądra oraz spermatogenezę różnych gatunków dawców u myszy biorców.

Transplantacja komórek linii zarodkowej i ksenoprzeszczepy tkanki jądra u myszy

Ten film demonstruje procedurę izolacji komórek Sertoliego z kanalików nasiennych myszy, składnika jąder. Trawienie enzymatyczne i wielokrotne płukanie sprzyjają uwalnianiu komórek Sertoliego do roztworu, który może być dalej hodowany w celu proliferacji i wzrostu.

Izolacja immunologicznych regulatorowych komórek Sertoliego z mysich kanalików nasiennych

Metody izolowania i przygotowywania próbek jąder Drosophila (żywych i stałych) do obrazowania za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego i fluorescencji są opisane tutaj.

Cytologiczna analiza spermatogenezy: żywe i utrwalone preparaty jąder Drosophila

Opisujemy strategię sortowania plemników myszy za pomocą cytometrii przepływowej. Spermatydy są podzielone na cztery wysoce czyste populacje, w tym okrągłe (etapy spermiogenezy 1-9), wczesne wydłużające się (etapy spermiogenezy 10-12), późne wydłużające się (etapy spermiogenezy 13-14) i wydłużone spermioidy (etapy spermiogenezy 15-16). Barwienie DNA, wielkość i ziarnistość są wykorzystywane jako parametry selekcji.

Sortowanie spermatyd myszy według cytometrii przepływowej w zależności od kroku

Mejoza to proces rozwojowy, w którym gamety są formowane przez pojedynczą rundę replikacji DNA i dwie kolejne rundy segregacji chromosomów. Mejozę ssaków można zbadać, wykorzystując technikę przygotowania mejotycznych rozsiewów chromosomów. W tym miejscu przedstawiono metodę przygotowania jąder rozsianych powierzchniowo ze spermatocytów myszy.

Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów myszy

Upłynnienie nasienia jest niezbędne do uwolnienia nasienia z żelu nasiennego. W badaniu przedstawiono procedury pobierania nasienia z żeńskiego układu rozrodczego po stosunku płciowym oraz pomiaru czasu upłynnienia nasienia.

Pobieranie nasienia po kryciu z żeńskiego układu rozrodczego i pomiar upłynnienia nasienia u myszy

Prezentowany tutaj jest protokół wzbogacania spermatocytów pachytenowych, okrągłych spermatyd i wydłużania spermatyd z jąder dorosłych myszy za pomocą nieciągłego gradientu gęstości albuminy surowicy bydlęcej za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Wzbogacanie spermatocytów pachytenowych i spermatydów z jąder myszy przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego

Tutaj prezentujemy prostą i skuteczną metodę izolowania żywych mejotycznych i postmejotycznych komórek rozrodczych od jąder dorosłych myszy. Korzystając z barwnika wiążącego DNA o niskiej cytotoksyczności, wzbudzonego fioletem i sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, można wyizolować wysoce wzbogacone populacje komórek spermatogennych do wielu dalszych zastosowań.

Izolacja mysich komórek spermatogennych za pomocą fioletowo-wzbudzonego, przepuszczalnego dla komórek barwnika wiążącego DNA

Ten protokół opisuje wspomaganą transiluminacją mikrodysekcję segmentów kanalików nasiennych dorosłych myszy reprezentujących określone etapy cyklu nabłonkowego nasienia i typy komórek w nim, a następnie barwienie immunologiczne preparatów dyni i nienaruszonych segmentów kanalików.

Wspomagana transiluminacją dyssekcja określonych etapów cyklu nabłonka nasiennego myszy w celu dalszych analiz immunobarwiących

Ten artykuł opisuje in-vivo hamowanie CENP-E poprzez operację jamy brzusznej i wstrzyknięcie do jąder GSK923295, cenny model męskiego podziału mejotycznego. Korzystając z testów immunofluorescencji, cytometrii przepływowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej, pokazujemy, że hamowanie CENP-E powoduje niewspółosiowość chromosomów i niestabilność genomu w spermatocytach myszy.

Ocena funkcjonalna kinezyny-7 CENP-E w spermatocytach za pomocą inhibicji in vivo, immunofluorescencji i cytometrii przepływowej

Tutaj wprowadzamy metodę wykonywania okrągłych wstrzyknięć spermatyd (ROSI) u myszy, technikę o obiecujących zastosowaniach klinicznych i użyteczność do badania mechanizmów leżących u podstaw rozwoju embrionalnego.

Wstrzyknięcie okrągłego plemnika myszy

Poznaj technikę squasha kanalików nasiennych do analizy cytologicznej spermatogenezy u myszy. Ta metoda zachowuje integralność komórkową i umożliwia badanie mejozy oraz przyczyn męskiej niepłodności.

Technika squasha kanalików nasiennych do cytologicznej analizy spermatogenezy z wykorzystaniem modelu mysiego

Przeglądaj więcej filmów