Proste podejście do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu u myszy C57BL/6 w celu oceny funkcjonalnej i neuropatologicznej
9 listopada 2017
Ten raport przedstawia proste podejście do skutecznego wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu (EAN) przy użyciu peptydu białka mieliny zero (P0)180-199 w połączeniu z kompletnym adiuwantem Freunda i toksyną krztuścową. Przedstawiamy wyrafinowany paradygmat zdolny do dokładnej oceny zakresu deficytów funkcjonalnych i neuropatologii, które występują w tym EAN.
Ogólnym celem tej procedury jest skuteczne wywołanie eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu lub EAN w modelu mysim w celu funkcjonalnej i patologicznej analizy procesu chorobowego. Model EAN może być wykorzystany do odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące neuropatii obwodowej. Jest to również wspaniały model do potencjalnego badania skuteczności nowych środków terapeutycznych.
Główną zaletą tego podejścia jest to, że zapewnia prosty i obiektywny paradygmat testowania funkcjonalnego, który można zastosować podczas korzystania z modelu EAN w myszy. Procedurę demonstruje mi dzisiaj Sang Won Yoo, który jest studentem studiów licencjackich w laboratorium biologii neurotrofin i mieliny na Uniwersytecie w Melbourne. Na trzy dni przed indukcją choroby włącz aparat do oceny funkcji motorycznych i włącz przycisk światła.
Podnieś mysz i opuść ją na pojemnik z czerwonym barwnikiem spożywczym. Umieść mysz w komorze do chodzenia i ustaw prędkość bieżni na 15 centymetrów na sekundę. Włącz bieżnię i kliknij przycisk nagrywania, aby użyć systemu obrazowania funkcji chodu w celu uchwycenia ruchu myszy podczas biegu przez 36 sekund.
Po 36 sekundach zatrzymaj nagrywanie i bieżnię i zapisz plik wideo z biegiem treningowym z biegiem treningowym w wyznaczonym folderze. Dzień przed pierwszym szczepieniem użyj strzykawki o pojemności 0,5 mililitra wyposażonej w igłę o rozmiarze 30-1/2, aby podać 1,6 mikrograma na mililitr toksyny krztuścowej w 250 mikrolitrach mysiego izotonicznego PBS IP znieczulonym sześcio- lub ośmiotygodniowym samcom myszy C57BL/6. Następnie oceń myszy pod kątem klinicznych objawów EAN w skali od zera do czterech zgodnie z tabelą i przeprowadź ocenę funkcji motorycznych, jak właśnie pokazano.
Następnego dnia połączyć równe objętości świeżo przygotowanych roztworów peptydu w 0,9% soli fizjologicznej i 20 miligramów na mililitr Mycobacterium tuberculosis w kompletnym adiuwancie Freunda w zlewce perełkowej i mieszać roztwory z maksymalną prędkością przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Załadować inokulum do strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 23, a następnie odwrócić i wstrząsnąć strzykawką przed usunięciem powietrza z trzonu strzykawki. Przed podaniem inokulum usuń włosy tuż obok linii środkowej między łopatkami i zdezynfekuj odsłoniętą skórę 70% etanolem.
Następnie użyj pary kleszczy Adson, aby chwycić skórę i dostarczyć 50 mikrolitrów roztworu do myszy, której wstrzyknięto toksynę krztuśca za pomocą wstrzyknięcia podskórnego. Następnego ranka podaj 1,2 mikrograma na mililitr toksyny krztuścowej w 250 mikrolitrach PBS IP, jak właśnie wykazano, a następnie kolejne 1,2 mikrograma na mililitr toksyny krztuścowej IP 48 godzin później. Trzy dni później po trzecim wstrzyknięciu krztuśca należy podać kolejne 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego inokulum w to samo miejsce wstrzyknięcia, co poprzednio i monitorować wynik kliniczny i funkcje motoryczne zwierząt dwa razy w tygodniu, aż do końca eksperymentu.
EAN indukowany peptydem P0 180-199 u myszy C57BL / 6 prowadzi do choroby jednofazowej z początkiem wyniku klinicznego po sześciu dniach od pierwszej immunizacji i maksymalnym nasileniem wyniku po 25 dniach od pierwszej immunizacji, a następnie pewną poprawą wyniku klinicznego po 40 dniach po pierwszym szczepieniu. Myszy zaczynają zawodzić w prostym zadaniu biegowym już sześć dni po pierwszym szczepieniu, z niewielką zdolnością do wykonania prostego zadania biegania na bieżni przez 35 dni po szczepieniu, co nie poprawia zdolności biegowych po 55 dniach od pierwszej immunizacji. Badanie półcienkich odcinków nerwów kulszowych myszy EAN indukowanych peptydami ujawnia obszary demielinizacji w porównaniu z nerwami kulszowymi z dopasowanych wiekiem zdrowych osób kontrolnych.
Obrazy z mikroskopii elektronowej o dużej mocy umożliwiają identyfikację określonych cech neuropatologicznych, takich jak demienizacja, uszkodzenie blaszki mielinowej oraz oznaki stresu aksonowego, takie jak obrzęk mitochondriów. Zwierzęta te wykazują również ostre uszkodzenie aksonów, o czym świadczy traumatycznie podwyższona ekspresja białka prekursorowego beta-amyloidu w nerwach kulszowych, której nie obserwuje się w zdrowych tkankach kontrolnych o dopasowanym wieku. Obserwuje się również poszerzenie węzłów i zakłócenie parawęzłów.
Po opanowaniu, wstrzyknięcia podskórne można wykonać w ciągu około pięciu do 10 minut na mysz przy minimalnym ryzyku błędu wstrzyknięcia. Podczas wykonywania tej procedury bardzo ważne jest, aby obserwować miejsce wstrzyknięcia, aby upewnić się, że całe inokulum pozostaje w miejscu wstrzyknięcia i że żadna jego część nie wycieka. Przechwytywanie wideo chodu na bieżni jest świetne, ponieważ umożliwia obliczenie innych parametrów, takich jak faza wymachu lub długość kroku, a pomiary te mogą stać się ważne podczas testowania skuteczności nowych terapii.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć naprawdę dobre zrozumienie, jak indukować EAN u samców myszy C57BL / 6. Ponadto, powinieneś mieć naprawdę dobre zrozumienie tego, jak bezpiecznie i naprawdę dokładnie umieszczać zastrzyki podskórne, upewniając się, że nie ma błędu wstrzykiwania. Nie zapominaj, że podczas pracy z igłami i inokulum istnieje ryzyko zranienia, zwłaszcza podczas używania ostrych narzędzi.
Tak więc, aby uniknąć ryzyka obrażeń, naprawdę dobrym pomysłem jest zawsze używanie kleszczy i nigdy nie chwytanie skóry lub tkanki ręcznie, a także używanie jednorazowych strzykawek, nigdy nie przypominając przy tym pokrywy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodologię indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwów (EAN) w modelu mysim przy użyciu peptydu 180-199 białka mieliny zero (P0) wraz z pełnym adiuwantem Freunda i toksyną krztuśca. Celem jest umożliwienie funkcjonalnej i patologicznej analizy neuropatii obwodowej, co pozwala na uzyskanie wiedzy na temat procesu chorobowego oraz potencjalnych metod leczenia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Choroby autoimmunologiczne
- Neuropatia obwodowa
Wprowadzenie
- Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie nerwów (EAN) jest modelem służącym do badania neuropatii obwodowej.
- Model ten jest praktycznym narzędziem do oceny nowych środków terapeutycznych.
- Przeprowadzanie testów funkcjonalnych w trakcie badania wspomaga obiektywną ewaluację.
- Kluczowe oceny behawioralne obejmują funkcje motoryczne oraz punktację kliniczną.
Cel badania
- W celu efektywnego indukowania EAN u myszy C57BL/6 na potrzeby badawcze.
- W celu analizy zakresu deficytów funkcjonalnych oraz neuropatologii.
- W celu opracowania powtarzalnego protokołu dla przyszłych badań nad neuropatią obwodową.
Stosowane metody
- Platforma wykorzystuje bieżnię oraz system obrazowania funkcji chodu do ocen funkcjonalnych.
- Model koncentruje się na samcach myszy C57BL/6 w procesie indukcji EAN.
- W badaniu nie wspomniano o żadnych przepływach pracy multiomicznych.
- Protokół obejmuje różne iniekcje podskórne w określonych odstępach czasu po immunizacji.
- Oceny funkcji motorycznych są przeprowadzane wielokrotnie w trakcie badania w celu monitorowania progresji choroby.
Główne wyniki
- Badanie potwierdza monofazowy przebieg choroby, w którym objawy kliniczne osiągają szczyt 25 dni po immunizacji.
- Od szóstego do trzydziestego piątego dnia obserwuje się znaczne pogorszenie sprawności w wykonywaniu zadań motorycznych.
- Analiza neuropatologiczna wykazuje demielinizację i uszkodzenia aksonalne u myszy traktowanych w porównaniu z grupą kontrolną.
- Podwyższona ekspresja białka prekursorowego beta-amyloidu wskazuje na ostre uszkodzenie aksonalne.
Wnioski
- Niniejsze badanie dostarcza przejrzystego i wydajnego protokołu indukowania EAN, co ułatwia zrozumienie neuropatologii.
- Wgląd w procesy chorobowe wspiera przyszłe badania nad potencjalnymi metodami leczenia neuropatii obwodowej.
- Wyniki te pogłębiają zrozumienie mechanizmów autoimmunologicznych oddziałujących na obwodowy układ nerwowy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia indukcję eksperymentalnego zapalenia nerwów autoimmunologicznych u myszy C57BL/6, szczepu o szerokiej dostępności narzędzi genetycznych, co wspieraB mechanistyczne ograniczanie ryzyka w przypadku kandydatów terapeutycznych celujących w obwodową demielinizację. Model ten zapewnia ilościowe odczyty funkcjonalne i neuropatologiczne, które zwiększają pewność prognostyczną w przedklinicznej ocenie strategii naprawy mieliny i neuroprotekcji. Jego powtarzalność oraz kompatybilność z podejściami transgenicznymi pozycjonują go jako narzędzie translacyjne do walidacji celów w badaniach nad autoimmunologiczną neuropatią obwodową.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mechanizmów patogennych w autoimmunologicznej neuropatii obwodowej poprzez indukowaną, peptydowo sterowaną aktywację odpornościową u genetycznie podatnego gospodarza.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje linię C57BL/6, co pozwala na integrację z modelami knockout, knock-in oraz modelami reporterowymi w celu weryfikacji i minimalizacji ryzyka związanego z celami przyczynowymi.
- Wartość prognostyczna: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków immunologicznie zapośredniczonego uszkodzenia nerwów, pomagając w podejmowaniu wczesnych decyzji go/no-go w przypadku kandydatów na leki immunomodulujące lub remyelinizujące.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie mierzalnego spadku funkcji poprzez analizę chodu na bieżni, co umożliwia podłużne monitorowanie deficytów motorycznych jako biomarkera farmakodynamicznego.
- Wartość operacyjna: Standaryzowana ocena kliniczna (skala 0–4) oraz określone w czasie immunizacje wspierają powtarzalną indukcję choroby w kohortach badawczych.
- Gotowość do analizy: Metoda jest kompatybilna z zaślepioną oceną neuropatologiczną, w tym z przygotowaniem półcienkich przekrojów i mikroskopią elektronową, w celu walidacji oddziaływania związków neuroprotekcyjnych na cel molekularny.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Odzwierciedla kluczowe cechy neuropatologiczne ludzkiej demielinizacji obwodowej, w tym uszkodzenia aksonalne potwierdzone podwyższonym poziomem białka prekursorowego beta-amyloidu, co potwierdza istotność mechanistyczną.
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia ocenę kandydatów terapeutycznych w różnych fazach choroby, od początku (dzień 6), przez szczyt (dzień 25), aż po regenerację (dzień 40), co pozwala na optymalizację dawkowania i czasu podania.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Ułatwia ocenę skuteczności naprawy mieliny i neuroprotekcji, zmniejszając niepewność biologiczną przed badaniami umożliwiającymi złożenie wniosku o IND.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po przedkliniczne testy skuteczności, w szczególności w przypadku leków biologicznych lub małych cząsteczek ukierunkowanych na modulowanie odpowiedzi autoimmunologicznych lub promowanie integralności aksonów w neuropatii obwodowej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie kontrolowanej indukcji autoimmunizacji specyficznej dla PNS w celu walidacji celów uczestniczących w interakcjach odpornościowo-nerwowych.
- Przesiewanie: Zapewnia standaryzowaną platformę do oceny wpływu związków na funkcje motoryczne i neuropatologię, z wynikami nadającymi się do obrazowania wysokotreściowego i punktowania.
- Analityka: Generuje podłużne dane funkcjonalne (parametry chodu, długość kroku, fazę przenoszenia) oraz końcowe wskaźniki histopatologiczne do analizy porównawczej między grupami terapeutycznymi.
- Badania translacyjne: Wspiera walidację przedkliniczną poprzez modelowanie cech przewlekłych i rzutowych oraz patologii aksonalnej istotnych dla ludzkich neuropatii obwodowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę immunologiczno-neurobiologiczną do iteracyjnego testowania hipotez terapeutycznych w wielu projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w modelach neuropatii obwodowej, umożliwiając precyzyjną i powtarzalną indukcję demielinizacji zapośredniczonej immunologicznie oraz stresu aksonalnego.
- Wartość operacyjna: Zdefiniowany harmonogram immunizacji i dawek przypominających, w połączeniu ze zstandaryzowanymi testami funkcjonalnymi, zwiększa powtarzalność między laboratoriami i zmniejsza zmienność.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność decyzji go/no-go poprzez dostarczenie wczesnych, mierzalnych dowodów na modulację celu w systemie istotnym dla przebiegu choroby.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów skorygowaną o ryzyko, wykazujących efekty zarówno w zakresie wyników funkcjonalnych, jak i punktów końcowych neuropatologicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu obsługi myszy, technik iniekcji podskórnych oraz perfuzyjnej fiksacji do analiz neuropatologicznych.
- Metoda jest zależna od dostępu do systemów obrazowania chodu na bieżni oraz sprzętu do przygotowywania półcienkich przekrojów i mikroskopii elektronowej.
- Niezbędne jest ustandaryzowane szkolenie w zakresie oceny klinicznej i ślepej analizy w celu zapewnienia spójności danych między operatorami.
- W przypadku ekstrapolacji metody na inne szczepy myszy wymagana jest korekta stężenia peptydów i składu adiuwantów ze względu na zmienną odpowiedź immunologiczną.
- Metoda jest ograniczona do monofazowego przebiegu choroby; bez modyfikacji protokołu może nie modelować postaci rzutowo-remisyjnych lub chronicznie postępujących neuropatii obwodowej.
