Proste podejście do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu u myszy C57BL/6 w celu oceny funkcjonalnej i neuropatologicznej

Ten raport przedstawia proste podejście do skutecznego wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu (EAN) przy użyciu peptydu białka mieliny zero (P0)_180-199 w połączeniu z kompletnym adiuwantem Freunda i toksyną krztuścową. Przedstawiamy wyrafinowany paradygmat zdolny do dokładnej oceny zakresu deficytów funkcjonalnych i neuropatologii, które występują w tym EAN.

Ogólnym celem tej procedury jest skuteczne wywołanie eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu lub EAN w modelu mysim w celu funkcjonalnej i patologicznej analizy procesu chorobowego. Model EAN może być wykorzystany do odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące neuropatii obwodowej. Jest to również wspaniały model do potencjalnego badania skuteczności nowych środków terapeutycznych.

Główną zaletą tego podejścia jest to, że zapewnia prosty i obiektywny paradygmat testowania funkcjonalnego, który można zastosować podczas korzystania z modelu EAN w myszy. Procedurę demonstruje mi dzisiaj Sang Won Yoo, który jest studentem studiów licencjackich w laboratorium biologii neurotrofin i mieliny na Uniwersytecie w Melbourne. Na trzy dni przed indukcją choroby włącz aparat do oceny funkcji motorycznych i włącz przycisk światła.

Podnieś mysz i opuść ją na pojemnik z czerwonym barwnikiem spożywczym. Umieść mysz w komorze do chodzenia i ustaw prędkość bieżni na 15 centymetrów na sekundę. Włącz bieżnię i kliknij przycisk nagrywania, aby użyć systemu obrazowania funkcji chodu w celu uchwycenia ruchu myszy podczas biegu przez 36 sekund.

Po 36 sekundach zatrzymaj nagrywanie i bieżnię i zapisz plik wideo z biegiem treningowym z biegiem treningowym w wyznaczonym folderze. Dzień przed pierwszym szczepieniem użyj strzykawki o pojemności 0,5 mililitra wyposażonej w igłę o rozmiarze 30-1/2, aby podać 1,6 mikrograma na mililitr toksyny krztuścowej w 250 mikrolitrach mysiego izotonicznego PBS IP znieczulonym sześcio- lub ośmiotygodniowym samcom myszy C57BL/6. Następnie oceń myszy pod kątem klinicznych objawów EAN w skali od zera do czterech zgodnie z tabelą i przeprowadź ocenę funkcji motorycznych, jak właśnie pokazano.

Następnego dnia połączyć równe objętości świeżo przygotowanych roztworów peptydu w 0,9% soli fizjologicznej i 20 miligramów na mililitr Mycobacterium tuberculosis w kompletnym adiuwancie Freunda w zlewce perełkowej i mieszać roztwory z maksymalną prędkością przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Załadować inokulum do strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 23, a następnie odwrócić i wstrząsnąć strzykawką przed usunięciem powietrza z trzonu strzykawki. Przed podaniem inokulum usuń włosy tuż obok linii środkowej między łopatkami i zdezynfekuj odsłoniętą skórę 70% etanolem.

Następnie użyj pary kleszczy Adson, aby chwycić skórę i dostarczyć 50 mikrolitrów roztworu do myszy, której wstrzyknięto toksynę krztuśca za pomocą wstrzyknięcia podskórnego. Następnego ranka podaj 1,2 mikrograma na mililitr toksyny krztuścowej w 250 mikrolitrach PBS IP, jak właśnie wykazano, a następnie kolejne 1,2 mikrograma na mililitr toksyny krztuścowej IP 48 godzin później. Trzy dni później po trzecim wstrzyknięciu krztuśca należy podać kolejne 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego inokulum w to samo miejsce wstrzyknięcia, co poprzednio i monitorować wynik kliniczny i funkcje motoryczne zwierząt dwa razy w tygodniu, aż do końca eksperymentu.

EAN indukowany peptydem P0 180-199 u myszy C57BL / 6 prowadzi do choroby jednofazowej z początkiem wyniku klinicznego po sześciu dniach od pierwszej immunizacji i maksymalnym nasileniem wyniku po 25 dniach od pierwszej immunizacji, a następnie pewną poprawą wyniku klinicznego po 40 dniach po pierwszym szczepieniu. Myszy zaczynają zawodzić w prostym zadaniu biegowym już sześć dni po pierwszym szczepieniu, z niewielką zdolnością do wykonania prostego zadania biegania na bieżni przez 35 dni po szczepieniu, co nie poprawia zdolności biegowych po 55 dniach od pierwszej immunizacji. Badanie półcienkich odcinków nerwów kulszowych myszy EAN indukowanych peptydami ujawnia obszary demielinizacji w porównaniu z nerwami kulszowymi z dopasowanych wiekiem zdrowych osób kontrolnych.

Obrazy z mikroskopii elektronowej o dużej mocy umożliwiają identyfikację określonych cech neuropatologicznych, takich jak demienizacja, uszkodzenie blaszki mielinowej oraz oznaki stresu aksonowego, takie jak obrzęk mitochondriów. Zwierzęta te wykazują również ostre uszkodzenie aksonów, o czym świadczy traumatycznie podwyższona ekspresja białka prekursorowego beta-amyloidu w nerwach kulszowych, której nie obserwuje się w zdrowych tkankach kontrolnych o dopasowanym wieku. Obserwuje się również poszerzenie węzłów i zakłócenie parawęzłów.

Po opanowaniu, wstrzyknięcia podskórne można wykonać w ciągu około pięciu do 10 minut na mysz przy minimalnym ryzyku błędu wstrzyknięcia. Podczas wykonywania tej procedury bardzo ważne jest, aby obserwować miejsce wstrzyknięcia, aby upewnić się, że całe inokulum pozostaje w miejscu wstrzyknięcia i że żadna jego część nie wycieka. Przechwytywanie wideo chodu na bieżni jest świetne, ponieważ umożliwia obliczenie innych parametrów, takich jak faza wymachu lub długość kroku, a pomiary te mogą stać się ważne podczas testowania skuteczności nowych terapii.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć naprawdę dobre zrozumienie, jak indukować EAN u samców myszy C57BL / 6. Ponadto, powinieneś mieć naprawdę dobre zrozumienie tego, jak bezpiecznie i naprawdę dokładnie umieszczać zastrzyki podskórne, upewniając się, że nie ma błędu wstrzykiwania. Nie zapominaj, że podczas pracy z igłami i inokulum istnieje ryzyko zranienia, zwłaszcza podczas używania ostrych narzędzi.

Tak więc, aby uniknąć ryzyka obrażeń, naprawdę dobrym pomysłem jest zawsze używanie kleszczy i nigdy nie chwytanie skóry lub tkanki ręcznie, a także używanie jednorazowych strzykawek, nigdy nie przypominając przy tym pokrywy.