Name: Proste podejście do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu u myszy C57BL/6 w celu oceny funkcjonalnej i neuropatologicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Poznaj metodę indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu u myszy C57BL/6 przy użyciu peptydu P0 180-199. Protokół umożliwia ocenę funkcjonalną i neuropatologiczną neuropatii obwodowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DGG jest stypendystą NHMRC Petera Doherty'ego i Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA) Early Career Fellow. JLF jest wspierany przez stypendium podoktoranckie MSRA. Prace te były wspierane przez grant projektowy Australijskiej Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC) #APP1058647 dla JX.

Wszystkie opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Florey Institute for Neuroscience and Mental Health (Melbourne Brain Centre) i są zgodne z Australijskim Kodeksem Postępowania w Wykorzystywaniu Zwierząt do Celów Naukowych.
1. Indukcja EAN
UWAGA: EAN może być skutecznie indukowany u samców myszy C57BL/6 w wieku od 6 do 8 tygodni. Protokół indukcji trwa łącznie 9 dni. Dzień 0 odnosi się do dnia pierwszego szczepienia. W przypadku tego protokołu zastrzyki przeprowadzano w znieczuleniu (patrz krok 1.1.2 poniżej).
<ol>
	<li>W dniu -1:
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór toksyny krztuścowej (patrz tabela materiałów) o stężeniu 1,6 μg/ml, używając sterylnego 0,1 M roztworu soli fizjologicznej buforowanej izotonicznym fosforanem myszy (MT-PBS).</li>
		<li>Znieczulenie izofluranem:
		<ol>
			<li>Umieść mysz (C57BL/6, samiec, 6-8 tygodni) w komorze anestezjologicznej i dostosuj przepływ tlenu do 1 l/min.</li>
			<li>Włącz parownik izofluranowy, ustaw go na 2,5% w celu znieczulenia, monitoruj oddech i poczekaj 2 minuty lub do momentu, gdy odruchy pierwotne (rogówka i kończyna tylna) przestaną reagować </li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyjmij mysz z komory anestezjologicznej i podaj 250 μl powyższego roztworu toksyny krztuścowej we wstrzyknięciu dootrzewnowym (i.p.) za pomocą strzykawki 0,5 ml z igłą 301/2 G.</li>
		<li>Przygotować inokulum do wstrzykiwań do immunizacji:
		<ol>
			<li>Przygotować roztwór A, używając 2 mg/ml roztworu peptydu P0180-199 (o czystości > 98%, sekwencja S-S-K-R-G-R- Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) w 0,9% soli fizjologicznej.</li>
			<li>Przygotować roztwór B, używając 20 mg/ml roztworu Mycobacterium tuberculosis (patrz tabela materiałów) w kompletnym adiuwantzie Freunda (FCA, zawierającym: 15% monoolanu mannidu + 85% oleju parafinowego i 0,5 mg/ml wysuszonego zabitego i wysuszonego M Mycobacterium butyricum).</li>
			<li>Aby przygotować końcowe inokulum do wstrzykiwań, należy połączyć równe objętościowo części roztworów A i B w ubijaku do kulek i mieszać je z maksymalną prędkością przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. 
			UWAGA: Roztwory A i B mogą być przechowywane w stanie wywaru i w temperaturze 4 °C przez maksymalnie jeden miesiąc, ale połączone inokulum końcowe musi być świeżo przygotowane w dniu wstrzyknięcia myszy.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu 0 należy podać 50 μl inokulum (preparat opisany w kroku 1.1.4) myszowi poprzez wstrzyknięcie podskórne za pomocą igły 23 G. 
	UWAGA: Wstrzyknięcie można umieścić między łopatkami lub między kończyną tylną a ogonem nad grzbietem ogonowym.</li>
	<li>W dniu 1 przygotuj roztwór toksyny krztuścowej o stężeniu 1,2 μg/ml (w MT-PBS) i podaj 250 μl myszy za pomocą iniekcji dożylnej za pomocą strzykawki 0,5 ml z igłą 301/2 G.</li>
	<li>W dniu 3 powtórz krok 1.3 powyżej. 
	UWAGA: Roztwory podstawowe A i B mogą być sporządzane i przechowywane w temperaturze 4 °C maksymalnie przez jeden miesiąc. Jednakże końcowe inokulum do wstrzykiwań, wytworzone przez połączenie roztworów podstawowych A i B, musi być wykonane w dniu wstrzyknięcia.</li>
	<li>W dniu 8 należy podać 50 μl inokulum (preparat opisany w kroku 1.1.4) myszowi poprzez wstrzyknięcie podskórne (patrz krok 1.2 powyżej), w to samo miejsce wstrzyknięcia, co w kroku 1.2 (dla każdego zwierzęcia)</li>
</ol>
2. Punktacja kliniczna
<ol>
	<li>Wykonuj ocenę kliniczną codziennie, począwszy od dnia 0.</li>
	<li>Przyznaj każdej myszy wynik 0, 1, 2, 3 lub 4 zgodnie z opublikowanymi kryteriami4. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z oceną kliniczną EAN. 
	UWAGA: Aby zachować spójność, należy dołożyć starań, aby ten sam badacz codziennie oceniał myszy o tej samej porze.</li>
</ol>
3. Ocena funkcji motorycznych
UWAGA: Sprawność motoryczna jest oceniana równolegle z punktacją kliniczną dla tej samej kohorty zwierząt. Aparatura do oceny funkcji motorycznych musi być podłączona do komputera, który ma zainstalowany system obrazowania funkcji chodu (patrz tabela materiałów). Zaleca się również, aby wszystkie myszy, które mają być oceniane, były przyzwyczajone do zadania biegowego przed indukcją EAN. W tym celu przeprowadza się ćwiczenia (2 testy na mysz) na trzy dni przed indukcją choroby (dzień -3).
<ol>
	<li>Włączyć aparaturę do oceny funkcji motorycznych i włączyć przycisk światła.</li>
	<li>Mocno chrap mysz i posmaruj jej stopy, opuszczając ją na pojemnik wypełniony czerwonym atramentem, trzymając ją za ogon. 
	UWAGA: Ten krok jest wymagany w przypadku szczepu C57BL/6, ale można go pominąć, jeśli używana jest odmiana myszy o białym kolorze sierści.</li>
	<li>Umieść mysz w komorze do chodzenia i ustaw prędkość bieżni na 15 cm/s.</li>
	<li>Włącz bieżnię i kliknij przycisk "nagraj", aby uchwycić ruch biegowy myszy za pomocą systemu obrazowania funkcji chodu (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Użyj timera i mierz każdy bieg przez 36 sekund. Po 36 s przerwij nagrywanie i zatrzymaj bieżnię. 
	UWAGA: Myszy, które nie mogą pomyślnie ukończyć uruchomionego zadania w tym 36-sekundowym interwale, są uważane za nieudane.</li>
	<li>Zapisz plik wideo w wyznaczonym folderze.</li>
	<li>Powtórz powyższe kroki dla każdej myszy, która ma zostać oceniona. Testuj myszy z tym samym uruchomionym zadaniem co 3 dni.</li>
	<li>Przeanalizuj edytowane pliki wideo za pomocą oprogramowania do pomiaru parametrów funkcji chodu (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Szczegóły dotyczące analizy różnych parametrów silnika różnią się w zależności od oprogramowania, dlatego przed analizą należy zapoznać się z instrukcją producenta. Aby uzyskać histologiczne dowody uszkodzenia aksonów i mieliny za pomocą immunohistochemii lub mikroskopii elektronowej, tkanki zwierzęce mogą być pobierane na dowolnym etapie oceny funkcji pomotorycznej, w zależności od konkretnych celów badań.</li>
</ol>

<ol><li>Newswanger, D. L., Warren, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guillain-Barre+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Fam+Physician%22%5BJournal%5D)">Guillain-Barre syndrome.</a> Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).</li>
<li>Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+Guillain-Barre+syndrome+mortality+in+Spain+from+1999+to+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013.</a> Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).</li>
<li>Walling, A. D., Dickson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guillain-Barre+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Fam+Physician%22%5BJournal%5D)">Guillain-Barre syndrome.</a> Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).</li>
<li>Gonsalvez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+and+Neuropathological+Testing+Paradigm+Reveals+New+Disability-Based+Parameters+and+Histological+Features+for+P0180-199-Induced+Experimental+Autoimmune+Neuritis+in+C57BL%2F6+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).</li>
<li>Berg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guillain-Barre+syndrome%3A+pathogenesis%2C+diagnosis%2C+treatment+and+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis.</a> Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).</li>
<li>Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+inflammatory+demyelinating+polyneuropathy--update+on+pathogenesis%2C+diagnostic+criteria+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy--update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy.</a> Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).</li>
<li>Griffin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+the+motor-sensory+axonal+Guillain-Barre+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome.</a> Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).</li>
<li>Taylor, W. A., Hughes, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+allergic+neuritis+induced+in+SJL+mice+by+bovine+P2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2.</a> J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).</li>
<li>Zou, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P0+protein+peptide+180-199+together+with+pertussis+toxin+induces+experimental+autoimmune+neuritis+in+resistant+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice.</a> J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).</li>
<li>Miletic, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P0%28106-125%29+is+a+neuritogenic+epitope+of+the+peripheral+myelin+protein+P0+and+induces+autoimmune+neuritis+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).</li>
<li>Hafer-Macko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+motor+axonal+neuropathy%3A+an+antibody-mediated+attack+on+axolemma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma.</a> Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).</li>
<li>Griffin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+nodal+changes+in+the+acute+motor+axonal+neuropathy+pattern+of+the+Guillain-Barre+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome.</a> J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów w związku z tą pracą.

W niniejszym raporcie przedstawiono prostą metodę indukcji EAN przy użyciu peptydu P0180-199 u myszy C57BL/6, umożliwiając ilościowe określenie kluczowych deficytów neuropatologicznych i funkcjonalnych u myszy indukowanych EAN. Odmienną cechą opisanego tutaj protokołu indukcji EAN jest stosowanie znieczulenia podczas wykonywania zastrzyków uodparniających. Zastosowanie znieczulenia izofluranem znacznie zwiększa zdolność do zapewnienia, że całkowita objętość inokulum zostanie wstrzyknięta podskórnie w pożądane ...

Neuropatie obwodowe mogą być albo pochodzenia genetycznego, albo nabyte, przy czym neuropatie nabyte mają albo metaboliczne, niedokrwienne, zapalne albo toksyczne substancje. Choroby te są również z pożytkiem klasyfikowane jako pochodzenia aksonalnego lub demielinicznego. Najczęstszymi nabytymi demielinizacyjnymi neuropatiami obwodowymi są ostra zapalna polineuropatia demielinizacyjna (AIDP, znana również jako zespół Guillaina-Barrégo, GBS) i przewlekła zapalna polineuropatia demielinizacyjna (CIDP)1,2,3,4; Oba charakteryzują się patogenetycznie reakcją autoimmunologiczną skierowaną przeciwko osłonce mielinowej, powodującą demielinizację nerwów obwodowych. W tych chorobach aktywowane limfocyty T przenikają przez barierę nerwową krwi i generują reakcję immunologiczną w PNS. Aktywacja makrofagów w nerwie powoduje następnie demielinizację albo bezpośrednio poprzez atak fagocytarny, albo pośrednio przez wydzielane mediatory stanu zapalnego, co skutkuje niepełnosprawnością kliniczną, taką jak paraliż i dysfunkcja czuciowa5. Podczas gdy demielinizowane aksony zachowują zdolność do remielinizacji po demielinizacji, remielinizacja jest często opóźniona lub niepełna, co powoduje podatność nagich aksonów na nieodwracalne uszkodzenia, co jest główną przyczyną trwałej niepełnosprawności klinicznej. Obecnie najskuteczniejsze terapie są immunomodulujące, ale pomimo ich skuteczności, w wielu przypadkach powrót do zdrowia jest często powolny i ~25% pacjentów doświadczy resztkowych deficytów funkcjonalnych, które znacznie obniżą jakość ich życia6,7.
EAN jest powszechnie używanym zwierzęcym modelem demielinizacyjnej neuropatii obwodowej, który dostarczył cennych informacji na temat patogenezy i umożliwił ocenę nowych środków terapeutycznych4. Model ten może być indukowany u różnych gatunków, takich jak króliki, szczury, myszy i świnki morskie, i jest indukowany przez immunizację antygenami neurogennymi. Jednak ostatecznie udana indukcja EAN zależy od odpowiedniej odpowiedzi immunologicznej, aby choroba mogła wystąpić. Biorąc pod uwagę różnice gatunkowe (i międzygatunkowe/szczepowe) w funkcjonowaniu układu odpornościowego, opracowano wiele kombinacji antygenów i adiuwantów, aby skutecznie indukować EAN. Jeśli chodzi o mysie narzędzia genetyczne, C57BL/6 jest najczęściej stosowany; jednak tradycyjny peptyd białka P2 57-81 (P257-81), który powoduje chorobę u podatnego szczepu myszy SJL 8, nie jest w stanie zalegalizować patogenezy prowadzącej do deficytów funkcjonalnych w szczepie C57BL/6. Na szczęście paradygmaty uwrażliwiające wykorzystujące peptydy P0106-125 lub P0180-199, dostarczane w adiuwantach w połączeniu z wstrzyknięciem toksyny krztuścowej, mogą pokonać tę barierę, umożliwiając wykorzystanie wyrafinowanych narzędzi genetycznych w mysim modelu EAN.
Tutaj prezentowana jest prosta metoda indukcji EAN u myszy C57BL/6. Ponadto zapewniono kompleksowe szczegółowe podejście, za pomocą którego można ocenić deficyty funkcjonalne i neuropatologiczne związane z chorobą. Peptide9 peptide180-199 został wybrany zamiast alternatywy P057-8110. Model P0180-199 został opisany jako powodujący łagodniejsze objawy kliniczne w porównaniu z alternatywą P057-8110, a zatem prawdopodobnie wytrzyma wprowadzenie potencjalnie szkodliwych zaburzeń genetycznych, wyzdrowieje po zabiegach chirurgicznych (takich jak implantacja pompy osmotycznej) i jest podatny na testy funkcji chodu na bieżni4. Jednak opisane tutaj testy funkcjonalne chodu na bieżni i protokoły histologiczne można łatwo zastosować podczas badania choroby w wariancie indukowanym przez P057-81.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6, samiec, 6-8 tygodni</td><td>Australian Bioresources Cenre, WA, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lista toksyn krztuścowych</td><td>Biological Laboratories, Inc., CA, USA</td><td>#181</td><td></td></tr><tr><td>0,1 M mysia izotoniczna fosforanowana buforowana sól fizjologiczna (MT-PBS)</td><td></td><td></td><td>Laboratoria będą miały swój własny protokół.</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pharmachem, QLD, Australia</td><td></td><td>Laboratories będzie miało swój własny protokół podawania.</td></tr><tr><td>P0180&ndash; 199 peptyd</td><td>Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN</td><td></td><td>P0180&ndash; 199, sekwencja S&ndash; S&ndash; K&ndash; R&ndash; G&ndash; R&ndash; Pytanie&ndash; T&ndash; P&ndash; V&ndash; L&ndash; T&ndash; A&ndash; M&ndash; L&ndash; D&ndash; H&ndash; S&ndash; R&ndash; S</td></tr><tr><td>Ciepło zabiło Mycobacterium tuberculosis (szczep H37RA)</td><td>Difco, MI, USA</td><td>#231141</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny adiuwant Freunda (FCA)</td><td>Difco, MI, USA</td><td>#263910</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyd (PFA)</td><td>Usługi mikroskopii elektronowej</td><td>#15710</td><td>Rozcieńczyć do 4% PFA w dniu pobrania tkanki.</td></tr><tr><td>25% glutaraldheyde</td><td>ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia#</td><td>11-30-8</td><td>Rozcieńczyć do 2,5% aldehydu glutarowego w dniu utrwalenia.</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia</td><td>SL189</td><td>Utwórz 10% (w/v) zapasów w 0,1 mln MT-PBS. Stosować w stężeniu 0,03% (v/v).</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia</td><td>SA030</td><td>Stosować w stężeniu 30% (w/v).</td></tr><tr><td>Optymalna temperatura skrawania (OCT) medium</td><td>Sakura Finetek, CA, USA</td><td>#4583</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Merck Millipore, MA, USA</td><td>#S30-100</td><td>Stosować jako rozcieńczalnik przeciwciał o stężeniu 10% (v/v) lub innym określonym przez własne laboratorium.</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma Aldrich, MI, USA</td><td>#90o2-31-1</td><td>Stosować w rozcieńczalniku przeciwciał o stężeniu 0,3% (v/v) lub innym ustalonym przez własne laboratorium.</td></tr><tr><td>królicze białko prekursorowe anty-amyloidu (APP)</td><td>Invitrogen (Life Technologies), CA, USA</td><td>S12700</td><td>Używany w 1:400 lub miareczkowany we własnym laboratorium.</td></tr><tr><td>Białko związane z antykontaktyną królika-1 (Caspr)</td><td>Prezent od prof. Eliora Pelesa, Wiezmann Institute of Science, Izrael</td><td></td><td>Używany w 1:500 lub miareczkować we własnym laboratorium.</td></tr><tr><td>Odpowiednie sprzężone przeciwciała drugorzędowe Alexa Fluor</td><td>Sondy molekularne (Life Technologies), OR, USA</td><td>Różne</td><td>zastosowania w stosunku 1:200 lub miareczkowanie we własnym laboratorium. Wybór gatunku, w którym wyhodowano przeciwciało, i wybór Alexa Fluor zależy od uznania każdego laboratorium.</td></tr><tr><td>Wodne rozwiązanie montażowe</td><td>Dako (Agilent), CA, USA</td><td></td>#S3023 <td>Każde laboratorium będzie miało swoje własne preferencje.</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL strzykawka z igłami 301/2 g</td><td>BD</td><td>#326105</td><td></td></tr><tr><td>Igły 23 g</td><td>BD</td><td>#305143</td><td></td></tr><tr><td>Czerwona poduszka</td><td></td><td></td> z atramentem <td>Do znakowania stóp zwierząt można użyć dowolnej czerwonej poduszki z atramentem lub czerwonego barwnika spożywczego.</td></tr><tr><td>Aparatura DigiGate (w tym bieżnia)</td><td>eMouse Specifics Inc. Framingham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DigiGate Imaging System</td><td>eMouse Specifics Inc. Framingham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stoper</td><td></td><td></td><td>Można użyć dowolnego timera.</td></tr><tr><td>DigiGait 8 Software</td><td>eMouse Specifics Inc. Framingham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Można użyć dowolnego odpowiedniego mikroskopu preparacyjnego.</td></tr><tr><td>Ładowane prowadnice</td><td>Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd</td><td>SF41296SP</td><td></td></tr><tr><td>Cyrostat</td><td>Leica</td><td></td><td>Można użyć dowolnego odpowiedniego cyrostatu.</td></tr><tr><td>Sprzęt perfuzyjny i instrumenty</td><td></td><td></td> prosektoryjne <td>Laboratoria będą miały własne protoktole perfuzyjne.</td></tr><tr><td>Nieprzezroczyste humifikaty komorowe</td><td></td><td></td><td>Labs mogą produkować własne przy użyciu nieprzezroczystego plastikowego pojemnika.</td></tr><tr><td>PAP pene</td><td>GeneTex (USA)</td><td></td><td>Ołówek woskowy lub napięcie powierzchniowe mogą być również użyte do stworzenia dołka wokół sekcji tkanki.</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeis LSM780</td><td></td><td>Można użyć dowolnego mikroskopu konfokalnego z odpowiednimi liniami laserowymi.</td></tr><tr><td>FIDŻI/Image J</td><td>Narodowe Instytuty Zdrowia</td><td></td><td>Dostępne od www.fiji.sc</td></tr></tbody></table>

proste podejście do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu u myszy c57bl/6 w celu oceny funkcjonalnej i neuropatologicznej

A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie nerwów (EAN) jest dobrze cenionym eksperymentalnym modelem autoimmunologicznych obwodowych chorób demielinizacyjnych. Choroba EAN jest wywoływana przez uodparnienie myszy peptydami neurogennymi w celu skierowania ataku zapalnego w kierunku składników obwodowego układu nerwowego (PNS). Ostatnie postępy umożliwiły indukcję EAN w stosunkowo opornej linii myszy C57BL/6 przy użyciu peptydów białka mieliny zero (P0)106-125 lub P0180-199 podawanych w adiuwantach w połączeniu z wstrzyknięciem toksyny krztuścowej. Zdolność do indukcji EAN w szczepie C57BL/6 pozwala na wykorzystanie licznych narzędzi genetycznych, które istnieją na tym myszym tle, a tym samym umożliwia zaawansowane badanie patogenezy choroby i badanie mechanistycznego działania nowych terapii w połączeniu z podejściami transgenicznymi. W tym badaniu pokazujemy proste podejście do skutecznej indukcji EAN za pomocą peptydu P0180-199 u myszy C57BL / 6. Przedstawiono również protokół oceny deficytów funkcjonalnych występujących w tym modelu, którym towarzyszy szereg cech neuropatologicznych. W związku z tym model ten jest potężnym modelem eksperymentalnym do badania patogenezy ludzkich obwodowych neuropatii demielinizacyjnych oraz do określenia skuteczności potencjalnych terapii, które mają na celu promowanie naprawy mieliny i ochronę przed uszkodzeniem nerwów w autoimmunologicznym zapaleniu nerwów.

P0180-199 indukowana peptydowo EAN u myszy C57BL/6 prowadzi do monofazowego przebiegu choroby, w której wystąpienie objawów klinicznych następuje od 6. dnia po pierwszej immunizacji (dpi), a maksymalne nasilenie wyniku klinicznego obserwuje się od 25. dpi, po czym od 40. dpi następuje pewna poprawa w ocenie klinicznej (Rysunek 1)4,9Pod względem funkcji chodu myszy zaczynają wykazywać deficy...

Ten raport przedstawia proste podejście do skutecznego wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu (EAN) przy użyciu peptydu białka mieliny zero (P0)180-199 w połączeniu z kompletnym adiuwantem Freunda i toksyną krztuścową. Przedstawiamy wyrafinowany paradygmat zdolny do dokładnej oceny zakresu deficytów funkcjonalnych i neuropatologii, które występują w tym EAN.

Proste podejście do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu u myszy C57BL/6 w celu oceny funkcjonalnej i neuropatologicznej

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by ...

Ogólnym celem tej procedury jest skuteczne wywołanie eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu lub EAN w modelu mysim w celu funkcjonalnej i patologicznej analizy procesu chorobowego. Model EAN może być wykorzystany do odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące neuropatii obwodowej. Jest to również wspaniały model do potencjalnego badania skuteczności nowych środków terapeutycznych.Główną zaletą tego podejścia jest to, że zapewnia prosty i obiektywny paradygmat testowania funkcjonalnego, który można zastosować podczas korzystania z modelu EAN w myszy. Procedurę demonstruje mi dzisiaj Sang Won Yoo, który jest studentem studiów licencjackich w laboratorium biologii neurotrofin i mieliny na Uniwersytecie w Melbourne. Na trzy dni przed indukcją choroby włącz aparat do oceny funkcji motorycznych i włącz przycisk światła.Podnieś mysz i opuść ją na pojemnik z czerwonym barwnikiem spożywczym. Umieść mysz w komorze do chodzenia i ustaw prędkość bieżni na 15 centymetrów na sekundę. Włącz bieżnię i kliknij przycisk nagrywania, aby użyć systemu obrazowania funkcji chodu w celu uchwycenia ruchu myszy podczas biegu przez 36 sekund.Po 36 sekundach zatrzymaj nagrywanie i bieżnię i zapisz plik wideo z biegiem treningowym z biegiem treningowym w wyznaczonym folderze. Dzień przed pierwszym szczepieniem użyj strzykawki o pojemności 0,5 mililitra wyposażonej w igłę o rozmiarze 30-1/2, aby podać 1,6 mikrograma na mililitr toksyny krztuścowej w 250 mikrolitrach mysiego izotonicznego PBS IP znieczulonym sześcio- lub ośmiotygodniowym samcom myszy C57BL/6. Następnie oceń myszy pod kątem klinicznych objawów EAN w skali od zera do czterech zgodnie z tabelą i przeprowadź ocenę funkcji motorycznych, jak właśnie pokazano.Następnego dnia połączyć równe objętości świeżo przygotowanych roztworów peptydu w 0,9% soli fizjologicznej i 20 miligramów na mililitr Mycobacterium tuberculosis w kompletnym adiuwancie Freunda w zlewce perełkowej i mieszać roztwory z maksymalną prędkością przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Załadować inokulum do strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 23, a następnie odwrócić i wstrząsnąć strzykawką przed usunięciem powietrza z trzonu strzykawki. Przed podaniem inokulum usuń włosy tuż obok linii środkowej między łopatkami i zdezynfekuj odsłoniętą skórę 70% etanolem.Następnie użyj pary kleszczy Adson, aby chwycić skórę i dostarczyć 50 mikrolitrów roztworu do myszy, której wstrzyknięto toksynę krztuśca za pomocą wstrzyknięcia podskórnego. Następnego ranka podaj 1,2 mikrograma na mililitr toksyny krztuścowej w 250 mikrolitrach PBS IP, jak właśnie wykazano, a następnie kolejne 1,2 mikrograma na mililitr toksyny krztuścowej IP 48 godzin później. Trzy dni później po trzecim wstrzyknięciu krztuśca należy podać kolejne 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego inokulum w to samo miejsce wstrzyknięcia, co poprzednio i monitorować wynik kliniczny i funkcje motoryczne zwierząt dwa razy w tygodniu, aż do końca eksperymentu.EAN indukowany peptydem P0 180-199 u myszy C57BL / 6 prowadzi do choroby jednofazowej z początkiem wyniku klinicznego po sześciu dniach od pierwszej immunizacji i maksymalnym nasileniem wyniku po 25 dniach od pierwszej immunizacji, a następnie pewną poprawą wyniku klinicznego po 40 dniach po pierwszym szczepieniu. Myszy zaczynają zawodzić w prostym zadaniu biegowym już sześć dni po pierwszym szczepieniu, z niewielką zdolnością do wykonania prostego zadania biegania na bieżni przez 35 dni po szczepieniu, co nie poprawia zdolności biegowych po 55 dniach od pierwszej immunizacji. Badanie półcienkich odcinków nerwów kulszowych myszy EAN indukowanych peptydami ujawnia obszary demielinizacji w porównaniu z nerwami kulszowymi z dopasowanych wiekiem zdrowych osób kontrolnych.Obrazy z mikroskopii elektronowej o dużej mocy umożliwiają identyfikację określonych cech neuropatologicznych, takich jak demienizacja, uszkodzenie blaszki mielinowej oraz oznaki stresu aksonowego, takie jak obrzęk mitochondriów. Zwierzęta te wykazują również ostre uszkodzenie aksonów, o czym świadczy traumatycznie podwyższona ekspresja białka prekursorowego beta-amyloidu w nerwach kulszowych, której nie obserwuje się w zdrowych tkankach kontrolnych o dopasowanym wieku. Obserwuje się również poszerzenie węzłów i zakłócenie parawęzłów.Po opanowaniu, wstrzyknięcia podskórne można wykonać w ciągu około pięciu do 10 minut na mysz przy minimalnym ryzyku błędu wstrzyknięcia. Podczas wykonywania tej procedury bardzo ważne jest, aby obserwować miejsce wstrzyknięcia, aby upewnić się, że całe inokulum pozostaje w miejscu wstrzyknięcia i że żadna jego część nie wycieka. Przechwytywanie wideo chodu na bieżni jest świetne, ponieważ umożliwia obliczenie innych parametrów, takich jak faza wymachu lub długość kroku, a pomiary te mogą stać się ważne podczas testowania skuteczności nowych terapii.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć naprawdę dobre zrozumienie, jak indukować EAN u samców myszy C57BL / 6. Ponadto, powinieneś mieć naprawdę dobre zrozumienie tego, jak bezpiecznie i naprawdę dokładnie umieszczać zastrzyki podskórne, upewniając się, że nie ma błędu wstrzykiwania. Nie zapominaj, że podczas pracy z igłami i inokulum istnieje ryzyko zranienia, zwłaszcza podczas używania ostrych narzędzi.Tak więc, aby uniknąć ryzyka obrażeń, naprawdę dobrym pomysłem jest zawsze używanie kleszczy i nigdy nie chwytanie skóry lub tkanki ręcznie, a także używanie jednorazowych strzykawek, nigdy nie przypominając przy tym pokrywy.

a-simple-approach-to-induce-experimental-autoimmune-neuritis-c57bl6

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Film demonstruje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u myszy poprzez wstrzyknięcie kombinacji glikoprotein oligodendrocytów mielinowych i inaktywowanych Mycobacterium tuberculosis. Model umożliwia naukowcom badanie mechanizmów chorobowych i testowanie interwencji terapeutycznych.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

Ten film demonstruje metodę wywoływania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) poprzez wstrzykiwanie peptydów pochodzących z mieliny z adiuwantem w celu aktywacji autoreaktywnych limfocytów T, które migrują do mózgu. Toksyna krztuścowa jest podawana w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając tym limfocytom T i innym komórkom odpornościowym przedostanie się do mózgu. Te komórki odpornościowe powodują demielinizację, co prowadzi do...

Generowanie eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

W tym filmie mysi model stwardnienia rozsianego jest tworzony za pomocą eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Myszowi wstrzykuje się emulsję zawierającą peptyd neuronalny i adiuwant, wywołując odpowiedź immunologiczną, która aktywuje autoreaktywne limfocyty T. Następnie podaje się wstrzyknięcie toksyny krztuścowej (PTX) w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając autoreaktywnym limfocytom T infiltrację mózgu. Ten naciek inicjuje kaskadę...

Ten film pokazuje proces oceny dysfunkcji motorycznej w modelu mysim poprzez podanie toksyny krztuścowej i inokulum zawierającego peptydy naśladujące mielinę i adiuwanty, a następnie testy na bieżni w celu oceny funkcji motorycznych i oceny wynikłego uszkodzenia nerwów w wyniku aktywacji immunologicznej i demielinizacji.

Ocena funkcji motorycznych w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia nerwu

Przeszczep komórek macierzystych/progenitorowych (NPC) jest bardzo obiecujący w neurologii regeneracyjnej. Systemowe dostarczanie NPC przekształciło się w skuteczny, mało inwazyjny i bardzo skuteczny terapeutycznie protokół dostarczania komórek macierzystych do mózgu i rdzenia kręgowego gryzoni i naczelnych dotkniętych eksperymentalnym przewlekłym uszkodzeniem zapalnym ośrodkowego układu nerwowego.

Systemowe wstrzykiwanie nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych u myszy z przewlekłym EAE

Ten manuskrypt opisuje metody indukcji i oceny eksperymentalnego modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), wraz z oceną rozmieszczenia komórek odpornościowych i poziomów cytokin mRNA w węzłach chłonnych, śledzionie, krwi i rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej i ilościowego PCR, odpowiednio, w różnych fazach choroby.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego u myszy i ocena zależnej od choroby dystrybucji komórek odpornościowych w różnych tkankach

Ten protokół opisuje, jak określić, czy farmakologiczne leczenie eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia wykazuje ochronę OUN w wyniku tłumienia infiltracji komórek odpornościowych, czy też są neuroprotekcyjne podczas ataku infiltracji komórek odpornościowych.

Określanie supresji układu odpornościowego w porównaniu z ochroną OUN dla interwencji farmakologicznych w demielinizacji autoimmunologicznej

Pokazujemy technikę obrazowania in vivo na żywo bioluminescencji i bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w eksperymentalnym modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) dla stwardnienia rozsianego u myszy SJL/J.

Bioluminescencja i obrazowanie w bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w modelu EAE stwardnienia rozsianego u myszy

Tutaj prezentujemy protokoły do badania upośledzenia jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia in vivo. W szczególności zajmujemy się tym, jak określić przepuszczalność bariery krew-mózg i aktywność żelatynazy zaangażowaną w migrację leukocytów przez limity gleju.

Wizualizacja upośledzenia barier śródbłonkowych i glejowych jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia mięśniowego in vivo

Niniejszy protokół opisuje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia w modelu mysim przy użyciu glikoproteiny oligodendrocytów mieliny i monitorowanie procesu chorobowego za pomocą systemu punktacji klinicznej. Eksperymentalne objawy związane z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego są analizowane za pomocą analizy mikrotomografii komputerowej kości udowej myszy i testu terenowego w celu kompleksowej oceny procesu chorobowego.

Indukcja i zróżnicowane wskaźniki oceny eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Aby wywołać eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia, zwierzęcy model stwardnienia rozsianego, myszy są immunizowane emulsją typu woda w oleju zawierającą autoantygen i kompletny adiuwant Freunda. Chociaż istnieje kilka protokołów przygotowania tych emulsji, tutaj przedstawiono szybki, prosty i ustandaryzowany protokół homogenizacji do przygotowania emulsji.

Szybka, prosta i standaryzowana metoda homogenizacji do przygotowania emulsji antygenowych/adiuwantowych do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia

Poznaj metodę indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu u myszy C57BL/6 przy użyciu peptydu P0 180-199. Protokół umożliwia ocenę funkcjonalną i neuropatologiczną neuropatii obwodowej.

Proste podejście do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu u myszy C57BL/6 w celu oceny funkcjonalnej i neuropatologicznej (Wideo) | JoVE Journal

Proste podejście do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu u myszy C57BL/6 w celu oceny funkcjonalnej i neuropatologicznej

Przeglądaj więcej filmów