Name: Biotynylowane peptydy penetrujące komórki do badania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Poznaj metodę badania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko z wykorzystaniem biotynylowanych peptydów penetrujących komórki w ludzkich komórkach macierzystych glejaka G166. Technika ta umożliwia analizę dynamicznych szlaków sygnałowych w żywych komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy M. Moralesowi i J. Bravo za pomoc w projektowaniu CPP oraz J.C. Arévalo za pomoc przy protokole pull-down. Jesteśmy wdzięczni za pomoc techniczną firmy T. del Rey. Prace te były wspierane przez Ministerio de Economía y Competitividad, Hiszpania; FEDER BFU2015-70040-R, Junta de Castilla y León, Hiszpania; FEDER SA026U16 oraz Fundación Ramón Areces. M. Jaraíz-Rodríguez i A. González-Sánchez są stypendystami Junta de Castilla y León i Europejskiego Funduszu Społecznego.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone na Uniwersytecie w Salamance.
1. Komórki
<ol>
	<li>Dwa dni przed rozpoczęciem procedury należy pokryć komórki płytką o wymaganej gęstości, aby zlały się w dniu eksperymentu. Umieść komórki w kolbach lub płytkach. Jednak ekstrakcja białka będzie łatwiejsza z płytek. Wygodnie jest przygotować co najmniej 4 płytki po 78 cm2 lub 2 kolby po 150 cm2 na warunek na eksperyment, aby mieć pewność, że wyniki są spójne.</li>
	<li>W tym badaniu ludzkie G166 GSC umieszczono na płytce w 4 kolbach o długości 150 cm2, hodowanych w pożywce z komórek macierzystych RHB-A uzupełnionej 2% B27, 1% N2, 20 ng / ml EGF i b-FGF, jak opisano przez Pollarda i wsp.22. Proces, gdy osiągnięto zbieg. Na przykład, gdy 5 x 106 komórek G166 zostało posianych w kolbie o średnicy 150cm2, zostały one przetworzone 2 dni po posiewaniu.</li>
</ol>
2. Biotynylowane CPP
<ol>
	<li>Obracać fiolki zawierające liofilizowane biotynylowane CPP (BCPPs) w temperaturze 8200 x g przez 30 s, aby uniknąć pozostawienia części proszku na pokrywce. Dołącz kontrolny BCPP, aby upewnić się, że znalezione interakcje są specyficzne dla sekwencji docelowej. W tym badaniu kontrolnym BCPP była TAT-biotyna (TAT-B), a leczonym BCPP był TAT-Cx43266-283-B. Można zastosować inne kontrole, takie jak TAT połączony z zaszyfrowanymi lub zmutowanymi fragmentami wiążącymi się z biotyną.</li>
	<li>Rozpuścić BCPP w odpowiednim roztworze podstawowym do roztworu podstawowego wskazanego przez producenta; na przykład, aby otrzymać roztwór podstawowy 2 mg/ml BCPP do traktowania GSC, dodać 0,5 ml pożywki hodowlanej GSC do jednej fiolki zawierającej 1 mg BCPP. Wiruj i upewnij się, że peptyd jest dobrze rozpuszczony.</li>
</ol>
3. Rury
UWAGA: Przygotuj co najmniej dwanaście probówek 1,5 ml na każdy warunek wymagany w Sekcji 7.
<ol>
	<li>Zaznacz pierwsze 3 probówki na warunek. Będą one miały całkowitą objętość lizatów komórkowych uzyskaną w kroku 6.4.</li>
	<li>Zaznacz A w 3 probówkach na warunek. Probówki te będą zawierały pierwsze supernatanty uzyskane po lizie i przędzeniu lizatów komórkowych, krok 7.2.</li>
	<li>Zaznacz B w 3 probówkach na warunek. Probówki te będą miały małą porcję pierwszych supernatantów. Lizaty te posłużą jako próbki Western blot w kroku 7.3.</li>
	<li>Zaznacz C w 3 probówkach na warunek. Probówki te będą zawierały supernatanty otrzymane po ściągnięciu za pomocą NeutrAvidin, krok 7.7. 
	UWAGA: Jest to ważne w przypadku, gdy Western blot nie wykazywał sygnału dla białek, co oznacza, że białka nie zostały ściągnięte w dół lub zostały utracone na pewnym etapie procedury. W takiej sytuacji powtórz proces, aby ściągnąć białka w dół.</li>
</ol>
4. Leczenie komórkowe za pomocą BCPPs
<ol>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną.</li>
	<li>Odpowiednią objętość świeżej pożywki wymaganą do inkubacji BCPP należy zastąpić w najmniejszej możliwej objętości pożywki, zgodnie z czasem inkubacji. Bardzo ważne jest, aby w każdym przypadku pożywka pokrywała całkowicie całą powierzchnię płytki/kolby, tak aby komórki nie wysychały, na przykład 6 ml na 150cm2 przez 30 minut inkubacji.</li>
	<li>Dodać objętość roztworu podstawowego BCPP do kultur komórkowych, aby osiągnąć stężenie, które okazało się skuteczne. W tym badaniu udowodniono, że 50 μM TAT-Cx43266-283-B zmniejsza proliferację GSC.
	<ol>
		<li>Dlatego dodać 92,8 μl 2 mg/ml TAT-Cx43266-283-B (MW = 3723,34 g/mol) na ml pożywki hodowlanej, aby uzyskać końcowe stężenie 50 μM TAT-Cx43266-283-B. Jeżeli objętość, która ma być dodana, jest inna dla peptydów kontrolnych, należy uzupełnić pożywką hodowlaną do tej samej objętości końcowej. Na przykład 49,1 μL TAT-B (MW = 1914,31 g/mol) plus 43,7 μL pożywki GSC dodano na ml pożywki hodowlanej, aby uzyskać końcowe stężenie 50 μM TAT-B.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 30 minut, aby upewnić się, że zachodzą interakcje między BCPP a jego wewnątrzkomórkowymi partnerami. Jeśli interakcja trwa dłużej, inkubuj przez dłuższy czas lub dostosuj czasy, jeśli eksperyment składał się z przebiegu czasowego. Ponadto interesująca interakcja może być promowana lub zapobiegana poprzez stymulację różnych wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych.</li>
</ol>
5. i roztwory.
<ol>
	<li>Przygotować PBS pH 7,4: 136 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 7,8 mM Na2HPO4·2H2O; 1,7 mM KH2PO4.</li>
	<li>Przygotuj bufor do lizy białek: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 137 mM NaCl, 1% IGEPAL, Przed użyciem dodaj: 1/100 (v/v) koktajl inhibitorów proteazy, 1 mM fluorek sodu, 1 mM fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF) i 0,1 mM ortowanadan sodu.</li>
	<li>Przygotować bufor Laemmli: (4x: 0,18 M Tris-HCl pH 6,8; 5 M glicerol; 3,7 % SDS (p/v); 0,6 M β-merkaptoetanol lub 9 mM DTT; 0,04 % (v/v) błękit bromofenolowy (BB)).</li>
</ol>
6. Ekstrakcja białka
UWAGA: Ekstrakcja białka została przeprowadzona zgodnie z wcześniejszym opisem20,23. Przeprowadzić całą tę sekcję procedury w temperaturze 4 °C.
<ol>
	<li>Całkowicie odessać pożywkę hodowlaną.</li>
	<li>Przemyj 3 x 10 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) na 150 cm2 bardzo ostrożnie, aby uniknąć oderwania komórek.</li>
	<li>Aby uzyskać lizat komórkowy, dodaj 3 ml buforu do lizy na 150cm2 i dokładnie zeskrob powierzchnię za pomocą skrobaka do komórek. Przechylenie płytki/kolby pod kątem około 45 stopni ułatwi zebranie lizatów komórkowych do odpowiednich probówek.</li>
	<li>Wlej 1 ml lizatu komórkowego na probówkę do trzech probówek o pojemności 1,5 ml. Probówki te zostaną oznaczone warunkiem i powtórzeniem, jak wskazano w kroku 3.1.</li>
</ol>
7. Ściąganie
<ol>
	<li>Odwirować probówki o pojemności 1,5 ml o stężeniu 11 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatanty do nowych probówek (A).</li>
	<li>Pobrać podwielokrotność tego supernatantu na każdy warunek do różnych probówek (B), tj. 50 μl na probówkę. Dodać 4x bufor Laemmli (16,6 μl na 50 μl lizatu) i zamrozić w temperaturze -20 °C. Lizaty te będą służyć jak zwykłe próbki Western blot.</li>
	<li>Bardzo dobrze homogenizować agarozę NeutrAwidyny przez delikatne potrząsanie. Odetnij końcówki końcówek pipet, aby zwiększyć ich średnicę i poprawić pipetowanie kulek. Dodać 50 μl agarozy neutrowidyny na ml lizatu komórkowego w probówkach (A).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc, bardzo delikatnie wstrząsając, aby umożliwić NeutrAvidin interakcję z BCPP związanymi ze swoimi partnerami wewnątrzkomórkowymi.</li>
	<li>Wirować przy 3 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C w celu zebrania kompleksu NeutrAwidyny z białkami.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatanty i przenieść je do czystych probówek (C). Zachowaj je, aby z nich skorzystać na wypadek, gdyby ściąganie się nie powiodło.</li>
	<li>Etapy mycia: dodać świeży bufor do lizy do granulek (probówki A), ponownie zawiesić przez odwrócenie i powtórzyć kroki 7.6) i 7.7) jeszcze 5 razy. Wszystkie te supernatanty można odrzucić.</li>
	<li>Usunąć supernatanty i dodać 2x bufor Laemmli do żądanej objętości końcowej (40 μL na probówkę 1,5 ml dla osadów otrzymanych ze 150 cm2 kolb zlewających się komórek).</li>
	<li>Eluować w temperaturze 100 °C przez 5 minut w celu dysocjacji oddziaływań między białkami i wirować przez 30 s przy 8 200 x g w celu osadzania kulek NeutrAwidyny.</li>
	<li>Pobrać supernatanty, zawierające zdysocjowane białka, z końcówkami kapilarnymi do nowych probówek (D). Koraliki można przechowywać na wypadek, gdyby wymagane było powtarzanie etapów elucji. 
	UWAGA: Supernatanty (probówki D) są teraz gotowe do załadowania w Western blot lub do zamrożenia w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
8. Western Blot
UWAGA: Western blot został przeprowadzony zgodnie z wcześniejszym opisem24.
<ol>
	<li>Załaduj równoważną objętość każdej próbki na linię na midigelach Bis-Tris (4-12%) w systemie elektroforezy Midi-Cell.</li>
	<li>Transblot białek za pomocą systemu suchego blottingu do regularnego stosu nitrocelulozy.</li>
	<li>Membranę należy zabarwić 10% Pąsem przez 10 min.</li>
	<li>Przemyć membrany 3 x 5 min 5 ml TTBS.</li>
	<li>Zablokuj membrany 7% mlekiem w TTBS przez 1 godzinę, delikatnie wstrząsając w tubkach lub małych pudełkach. Upewnij się, że użyta objętość jest wystarczająca do pokrycia membran i że nie wysychają, tj. 40 ml na całą membranę midi.</li>
	<li>Umyć 3 x 5 min 5 ml TTBS.</li>
	<li>Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania, delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Umyć 3 x 5 min 5 ml TTBS.</li>
	<li>Inkubować błonę w temperaturze pokojowej z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą w TTBS przez 1 godzinę.</li>
	<li>Umyć 3 x 5 min 5 ml TTBS.</li>
	<li>Wywoływać z podłożem chemiluminescencyjnym w systemie chemiluminescencyjnym.</li>
</ol>
9. Rozwiązywanie problemów
<ol>
	<li>Jeśli po rozwinięciu Western blot którakolwiek z próbek nie wykazała żadnego sygnału dla białek, sprawdź Ponceau. 
	UWAGA: Membrana w Ponceau powinna pokazywać niezdefiniowane i liczne pasma wzdłuż załadowanych pasów. Jeśli prążki nie są bardzo zauważalne, ilość załadowanych białek może być niewystarczająca lub przenoszenie mogło przebiegać nieprawidłowo. Rozważ powtórzenie Western blot.</li>
	<li>Jeśli w membranie Ponceau na żadnym pasie nie ma żadnej plamy, powtórz całą procedurę od kroku 7.4 w probówkach (C).</li>
	<li>Jeśli po rozwinięciu się Western blot sygnał białkowy jest bardzo słaby, ale Ponceau wykazał białka, należy ponownie inkubować błonę z pierwotnym przeciwciałem przez dłuższy czas. Jeśli sygnał jest nadal dość słaby, ponownie inkubuj w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
10. Inne techniki użyte w tym artykule
<ol>
	<li>Immunocytochemia BCPP
	<ol>
		<li>Utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie (0,2 ml nacm2) przez 20 min.</li>
		<li>Myć 3x 5 min PBS (0,2 ml nacm2).</li>
		<li>Odpowiednie przeciwciało (co najmniej 0,15 ml nacm2) rozcieńczone w roztworze przeciwciał o stężeniu wskazanym przez producenta nanieść na białko będące przedmiotem zainteresowania przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem (0,15 ml nacm2) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Powtórz kroki 10.1.2-10.1.4 z innymi przeciwciałami przeciwko interesującym Cię białkom. Należy uważać, aby nie używać tego samego gatunku dla różnych przeciwciał pierwszorzędowych lub fluoroforów o tej samej długości fali dla przeciwciał drugorzędowych.</li>
		<li>Zamontuj ogniwa za pomocą odczynnika zapobiegającego blaknięciu (0,005 ml nacm2).</li>
		<li>Analiza na mikroskopie fluorescencyjnym podłączonym do kamery cyfrowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test MTT
	<ol>
		<li>Hodować komórki w temperaturze 37 °C na płytkach 24-dołkowych.</li>
		<li>Inkubować komórki w ciemności przez 75 minut z 0,15 ml pożywki hodowlanej nacm2 zawierającej 0,5 mg/ml MTT.</li>
		<li>Odessać pożywkę i inkubować komórki przez 10 minut w ciemności z dimetylosulfotlenkiem (0,25 ml nacm2) z łagodnym wstrząsaniem.</li>
		<li>Zmierzyć absorbancję przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin.+3.+The+nature+of+the+biotin-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site.</a> Biochem J. 89, 599-609 (1963).</li>
<li>Wilchek, M., Bayer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+avidin-biotin+technology%3A+literature+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Applications of avidin-biotin technology: literature survey.</a> Methods Enzymol. 184, 14-45 (1990).</li>
<li>Herce, H. D., Garcia, A. E., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+molecular+mechanism+for+the+cellular+uptake+of+guanidinium-rich+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Fundamental molecular mechanism for the cellular uptake of guanidinium-rich molecules.</a> J Am Chem Soc. 136 (50), 17459-17467 (2014).</li>
<li>Ramsey, J. D., Flynn, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides+transport+therapeutics+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides transport therapeutics into cells.</a> Pharmacol Ther. 154, 78-86 (2015).</li>
<li>Fominaya, J., Bravo, J., Rebollo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+stabilize+cell+penetrating+peptides+for+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Deliv%22%5BJournal%5D)">Strategies to stabilize cell penetrating peptides for in vivo applications.</a> Ther Deliv. 6 (10), 1171-1194 (2015).</li>
<li>Vives, E., Brodin, P., Lebleu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+truncated+HIV-1+Tat+protein+basic+domain+rapidly+translocates+through+the+plasma+membrane+and+accumulates+in+the+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus.</a> J Biol Chem. 272 (25), 16010-16017 (1997).</li>
<li>Gump, J. M., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAT+transduction%3A+the+molecular+mechanism+and+therapeutic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects.</a> Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).</li>
<li>Brooks, H., Lebleu, B., Vives, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tat+peptide-mediated+cellular+delivery%3A+back+to+basics%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Tat peptide-mediated cellular delivery: back to basics.</a> Adv Drug Deliv Rev. 57 (4), 559-577 (2005).</li>
<li>Cuesto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide-3-kinase+activation+controls+synaptogenesis+and+spinogenesis+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide-3-kinase activation controls synaptogenesis and spinogenesis in hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 31 (8), 2721-2733 (2011).</li>
<li>Schmidt, N., Mishra, A., Lai, G. H., Wong, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine-rich+cell-penetrating+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Arginine-rich cell-penetrating peptides.</a> FEBS Lett. 584 (9), 1806-1813 (2010).</li>
<li>Sorgen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+in+the+carboxyl+terminus+of+the+gap+junction+protein+connexin43+indicates+signaling+between+binding+domains+for+c-Src+and+zonula+occludens-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural changes in the carboxyl terminus of the gap junction protein connexin43 indicates signaling between binding domains for c-Src and zonula occludens-1.</a> J Biol Chem. 279 (52), 54695-54701 (2004).</li>
<li>Giepmans, B. N., Hengeveld, T., Postma, F. R., Moolenaar, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+c-Src+with+gap+junction+protein+connexin-43.+Role+in+the+regulation+of+cell-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interaction of c-Src with gap junction protein connexin-43. Role in the regulation of cell-cell communication.</a> J Biol Chem. 276 (11), 8544-8549 (2001).</li>
<li>Tabernero, A., Gangoso, E., Jaraíz-Rodríguez, M., Medina, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+connexin43-Src+interaction+in+astrocytomas%3A+A+molecular+puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of connexin43-Src interaction in astrocytomas: A molecular puzzle.</a> Neuroscience. 323, 183-194 (2016).</li>
<li>Giaume, C., Koulakoff, A., Roux, L., Holcman, D., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglial+networks%3A+a+step+further+in+neuroglial+and+gliovascular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astroglial networks: a step further in neuroglial and gliovascular interactions.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (2), 87-99 (2010).</li>
<li>Shinoura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+and+messenger+RNA+expression+of+connexin43+in+astrocytomas%3A+implications+in+brain+tumor+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Protein and messenger RNA expression of connexin43 in astrocytomas: implications in brain tumor gene therapy.</a> J Neurosurg. 84, 839-845 (1996).</li>
<li>Soroceanu, L., Manning, T., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+expression+of+connexin-43+and+functional+gap+junction+coupling+in+human+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Reduced expression of connexin-43 and functional gap junction coupling in human gliomas.</a> Glia. 33, 107-117 (2001).</li>
<li>Pu, P., Xia, Z., Yu, S., Huang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+expression+of+Cx43+in+astrocytic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neurol+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Altered expression of Cx43 in astrocytic tumors.</a> Clin Neurol Neurosurg. 107 (1), 49-54 (2004).</li>
<li>Crespin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+gap+junction+protein%2C+connexin43%2C+in+a+large+panel+of+human+gliomas%3A+new+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Med%22%5BJournal%5D)">Expression of a gap junction protein, connexin43, in a large panel of human gliomas: new insights.</a> Cancer Med. 5 (8), 1742-1752 (2016).</li>
<li>Gangoso, E., Thirant, C., Chneiweiss, H., Medina, J. M., Tabernero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-penetrating+peptide+based+on+the+interaction+between+c-Src+and+connexin43+reverses+glioma+stem+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">A cell-penetrating peptide based on the interaction between c-Src and connexin43 reverses glioma stem cell phenotype.</a> Cell Death & Disease. 5, (2014).</li>
<li>Gonzalez-Sanchez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+recruits+PTEN+and+Csk+to+inhibit+c-Src+activity+in+glioma+cells+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Connexin43 recruits PTEN and Csk to inhibit c-Src activity in glioma cells and astrocytes.</a> Oncotarget. 7 (31), 49819-49833 (2016).</li>
<li>Jaraíz-Rodríguez, M., et al. A short region of connexin43 reduces human glioma stem cell migration, invasion and survival through Src, PTEN and FAK. Stem Cell Reports. , In press (2017).</li>
<li>Pollard, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cell+lines+expanded+in+adherent+culture+have+tumor-specific+phenotypes+and+are+suitable+for+chemical+and+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 568-580 (2009).</li>
<li>Yu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+regulation+of+NGF-mediated+functions+by+Nedd4-2+ubiquitination+of+TrkA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo regulation of NGF-mediated functions by Nedd4-2 ubiquitination of TrkA.</a> J Neurosci. 34 (17), 6098-6106 (2014).</li>
<li>Herrero-Gonzalez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+inhibits+the+oncogenic+activity+of+c-Src+in+C6+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Connexin43 inhibits the oncogenic activity of c-Src in C6 glioma cells.</a> Oncogene. 29 (42), 5712-5723 (2010).</li>
<li>Cooper, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCooper%2C+GM+%22The+Cell%3A+A+Molecular+Approach%22">The Cell: A Molecular Approach</a>. , 2nd ed, Sinauer Associates. (2000).</li>
<li>Fittipaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+lipid+rafts+mediate+caveolar+endocytosis+of+HIV-1+Tat+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell membrane lipid rafts mediate caveolar endocytosis of HIV-1 Tat fusion proteins.</a> J Biol Chem. 278 (36), 34141-34149 (2003).</li>
<li>Dirks, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+stem+cells%3A+the+cancer+stem+cell+hypothesis+writ+large%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large.</a> Mol Oncol. 4 (5), 420-430 (2010).</li>
<li>Hopp, T. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nbt/journal/v6/n10/abs/nbt1088-1204.html">A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification.</a> Nat Biotech. 6 (10), 1204-1210 (1988).</li>
<li>Benard, V., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+Cdc42%2C+Rac%2C+and+Rho+GTPase+activation+by+affinity+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assay of Cdc42, Rac, and Rho GTPase activation by affinity methods.</a> Methods Enzymol. 345, 349-359 (2002).</li>
<li>Guidotti, G., Brambilla, L., Rossi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Penetrating+Peptides%3A+From+Basic+Research+to+Clinics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell-Penetrating Peptides: From Basic Research to Clinics.</a> Trends Pharmacol Sci. 38 (4), 406-424 (2017).</li>
<li>Hu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+therapy+using+tumor+homing+and+penetrating+peptide-functionalized+PEG-PLA+nanoparticles+loaded+with+paclitaxel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Glioma therapy using tumor homing and penetrating peptide-functionalized PEG-PLA nanoparticles loaded with paclitaxel.</a> Biomaterials. 34 (22), 5640-5650 (2013).</li>
<li>Babu, M. M., van der Lee, R., de Groot, N. S., Gsponer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+disordered+proteins%3A+regulation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Intrinsically disordered proteins: regulation and disease.</a> Curr Opin Struct Biol. 21 (3), 432-440 (2011).</li>
<li>Anthis, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+integrin+tyrosine+phosphorylation+is+a+conserved+mechanism+for+regulating+talin-induced+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Beta integrin tyrosine phosphorylation is a conserved mechanism for regulating talin-induced integrin activation.</a> J Biol Chem. 284 (52), 36700-36710 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieje wiele metod badania oddziaływań białko-białko. Metoda przedstawiona w tym badaniu opiera się na szeroko stosowanym systemie pull-down biotyny-awidyny, w którym biotynylowana przynęta jest inkubowana z lizatami komórkowymi, aby umożliwić nawiązanie interakcji. Modyfikacja przedstawiona w tym badaniu obejmuje połączenie tej techniki z sekwencjami penetrującymi komórki. Proponujemy zaprojektowanie przynęt penetrujących komórki, które mogą być inkubowane z żywymi komórkami zamiast lizatów komórkowych, a zatem znalezione interakcje będą odzwierciedlać te, które wystąpiły w kontekście komórkowym.
Tutaj używamy TAT jako sekwencji penetrującej komórkę, biotyny jako znacznika ściągającego i regionu Cx43 składającego się między aminokwasami 266-283 jako celu do znalezienia interakcji wewnątrzkomórkowych w ludzkich GSC. Strukturalne podstawy interakcji między Cx43 i c-Src są dobrze znane11,12. Jest to ważna interakcja, ponieważ hamuje onkogenną aktywność c-Src w komórkach glejaka24,13. W rzeczywistości CPP zawierające ten region (TAT-Cx43266-283) naśladują właściwości antyonkogenne Cx43 na komórkach glejaka 19,20,21. W komórkach C6 glejaka szczurów mechanizm, za pomocą którego TAT-Cx43266-283 hamuje c-Src, obejmuje rekrutację c-Src wraz z jego endogennymi inhibitorami CSK i PTEN20. Należy wspomnieć, że GSC są bardzo interesujące jako cel w terapii glejaka, ponieważ stanowią subpopulację, która jest oporna na konwencjonalne leczenie, a zatem odpowiedzialna za nawrót tego złośliwego guza mózgu27. Co więcej, są to komórki trudne do transfekcji, dlatego badanie interakcji wewnątrzkomórkowych staje się trudniejsze. CPP są szybko i skutecznie internalizowane w GSC19, co sprzyja ich zastosowaniu do badania interakcji wewnątrzkomórkowych. W tym badaniu, stosując CPP sprzężone z biotyną, potwierdzamy interakcję sekwencji Cx43266-283 z c-Src wraz z jej endogennymi inhibitorami CSK i PTEN w ludzkich GSC.
Ta metoda jest bardzo skuteczna w badaniu wewnątrzkomórkowego mechanizmu związków bioaktywnych. Jednak bardzo ważne jest potwierdzenie, że efekt biologiczny przynęty penetrującej komórki biotynylowane nie różni się od tego uzyskanego w przypadku przynęty niebiotynylowanej. Ten krok jest wymagany, aby skojarzyć stwierdzone interakcje z działaniem związku bioaktywnego. Ponadto stabilność związku, jego ewentualna degradacja przez proteazy, a także jego możliwa toksyczność, powinny być dokładnie zbadane i wzięte pod uwagę przed zaplanowaniem doświadczenia. W przedstawionym przykładzie antyproliferacyjne działanie TAT-Cx43266-283 na ludzkie GSC G166 zostało wcześniej udokumentowane20. W tym badaniu potwierdzamy, że działanie antyproliferacyjne TAT-Cx43266-283-B i TAT-Cx43266-283 jest bardzo podobne. Ponadto analiza morfologii komórkowej wykazała, że dystrybucja α-tubuliny i F-aktyny jest bardzo podobna u G166 GSC traktowanych TAT-Cx43266-283-B lub TAT-Cx43266-283. Podsumowując, wyniki te wskazują, że włączenie biotyny do c-końca TAT-Cx43266-283 nie zmieniło wpływu tego związku na ludzkie GSC. Jeśli jednak biotyna modyfikowałaby działanie cząsteczki bioaktywnej, można przetestować inne znaczniki do oczyszczania białek, takie jak oktapeptyd FLAG (DYKDDDDK)28, znacznik hemaglutyniny pochodzącej z grypy ludzkiej HA (YPYDVPDYA) lub S-transferaza glutationowa (GST)29. Podobnie, jeśli TAT nie jest ukierunkowany na populację komórek będących przedmiotem zainteresowania, można zastosować inne sekwencje penetrujące komórkę, takie jak penetratyna, MPG (w celu przeglądu, patrz30) lub sekwencje specyficzne dla komórki31.
Oprócz badania białek, które specyficznie oddziałują z sekwencją docelową, najlepiej byłoby, gdyby zajęto się obecnością białek, które oddziałują zarówno z sekwencją kontrolną, jak i docelową oraz białek, które nie oddziałują z nimi, jako kontroli pozytywnych i ujemnych. W tym sensie znaleźliśmy Cav-1 w sytuacji kontrolnej i leczonej, co sugeruje, że kaweole były zaangażowane w mechanizm internalizacji, jak wykazano wcześniej26. Co więcej, FAK, który oddziałuje z c-Src, ale przypuszczalnie nie wchodzi w interakcję z c-terminalem Cx43, był nieobecny zarówno w sytuacji kontrolnej, jak i leczonej. Wyniki te wzmacniają specyficzność interakcji między TAT-Cx43266-283-B, c-Src, CSK i PTEN.To potwierdzić wyniki uzyskane za pomocą tego protokołu, mikroskopia konfokalna może być wykorzystana do wizualizacji rozmieszczenia oddziałujących białek i do badania ich kolokalizacji. W ten sposób stwierdziliśmy, że TAT-Cx43266-283-B i c-Src wykazują podobny rozkład wewnątrzkomórkowy z pewnymi punktami kolokalizacji potwierdzającymi wyniki uzyskane w eksperymentach pull-down. W rzeczywistości TAT-Cx43266-283-B jest rozmieszczony blisko błony plazmatycznej, co sugeruje, że ładunek, w tym badaniu Cx43266-283, kieruje cząsteczkę do swoich wewnątrzkomórkowych partnerów.
Jednym z ograniczeń proponowanej metody jest to, że cząsteczka użyta jako przynęta mogłaby nie złożyć się prawidłowo i nie zostałyby osiągnięte oczekiwane efekty. W tej sytuacji znalezionych interakcji nie można było powiązać z efektem. Jednak ta metoda może być szczególnie interesująca w przypadku interakcji związanych ze szlakami transdukcji sygnału, ponieważ są one zwykle przeprowadzane przez wewnętrznie nieuporządkowane regiony32 i dlatego nie wymagają uporządkowanego fałdowania. Ponadto jedną z zalet proponowanej metody jest to, że można śledzić przebieg interakcji w czasie, co jest szczególnie istotne w przypadku oddziaływań przejściowych. Co więcej, można łatwo zbadać wpływ każdej pozostałości na interakcję. Rzeczywiście, możliwe jest zbadanie wpływu modyfikacji potranslacyjnych na interakcję białko-białko, na przykład poprzez fosfomimetyczne podstawienie glutaminianu na serynę lub treoninę. Podobnie, zastąpienie alaniny lub treoniny lub tyrozyny fenyloalaniną pozwala na przetestowanie działania niefosforylującej seryny, treoniny lub tyrozyny. Aby naśladować fosfo-tyrozynę, najdokładniejszym sposobem jest zastąpienie Tyr p-Tyr33.
Wreszcie, zakres tego protokołu wykracza daleko poza interakcję białko-białko, ponieważ system ten można zastosować do innych bioaktywnych ładunków, takich jak sekwencje RNA, nanocząstki, wirusy lub inne cząsteczki, które można połączyć z biotyną i transdukować za pomocą CPP w celu zbadania ich wewnątrzkomórkowego mechanizmu działania.

Interakcje białko-białko są niezbędne dla wielu różnych procesów komórkowych. Aby w pełni zrozumieć te procesy, potrzebne są metody identyfikacji interakcji białek w złożonym środowisku wewnątrzkomórkowym. Jedną z najczęściej stosowanych metod identyfikacji partnerów interakcji białka jest użycie tego białka lub peptydu mimetycznego części tego białka jako przynęty w eksperymentach typu affinity pull-down, a następnie wykrywanie białek wiążących. System awidyna-biotyna jest często stosowany ze względu na wysokie powinowactwo, specyficzność i stabilną interakcję między awidyną a biotyną1,2. Zwykle biotyna jest kowalencyjnie związana z przynętą (białkiem lub peptydem), a po okresie inkubacji z lizatami komórkowymi, aby umożliwić nawiązanie interakcji, biotynylowana przynęta związana z jej wewnątrzkomórkowymi partnerami jest ściągana w dół za pomocą awidyny lub pochodnych awidyny sprzężonych z kulkami podporowymi. Następnie, po umyciu, elucji i analizie, wykrywane są interakcje przynęta-białko poprzez elektroforezę denaturacyjną, a następnie Western blot. Jednym z problemów tej techniki jest to, że interakcje między białkiem będącym przedmiotem zainteresowania a jego wewnątrzkomórkowymi partnerami zachodzą poza kontekstem komórkowym. Jest to szczególnie ważne w przypadku interakcji zaangażowanych w szlaki transdukcji sygnału, ponieważ zachodzą one w określonych lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, są przejściowe i zwykle są przeprowadzane przez niezbyt obfite białka. Dlatego w lizatach komórkowych interakcje te mogą być maskowane przez inne, bardziej obfite białka lub białka, które zwykle nie znajdują się w bliskiej odległości.
Peptydy penetrujące komórki (CPP) to krótkie peptydy (≤40 aminokwasów), składające się głównie z aminokwasów kationowych, które są zdolne do transportu szerokiej gamy cząsteczek do prawie każdej komórki3. Ładunki takie jak białka, plazmidowe DNA, siRNA, wirusy, środki obrazujące i różne nanocząstki zostały sprzężone z CPP i skutecznie zinternalizowane4,5. Ze względu na tę zdolność transportową są one również znane jako domeny transdukcji białek (PTD), sekwencje translokacji błony (MTS) i peptydy trojańskie. Wśród CPP, peptyd TAT z białka transaktywatora HIV TAT6 jest jednym z najszerzej przebadanych 7,8,9. TAT jest nonapeptydem, który zawiera 6 reszt argininy i 2 lizyny, w związku z czym jest wysoce kationowy. Badania substytucji wykazały, że dodatni ładunek netto TAT jest niezbędny do oddziaływań elektrostatycznych z błonami plazmatycznymi komórek eukariotycznych i jego późniejszej internalizacji10. Podobnie jak inne CPP, dodatnio naładowany TAT silnie wiąże się elektrostatycznie z różnymi ujemnie naładowanymi gatunkami obecnymi na zewnątrzkomórkowej powierzchni błon komórkowych, w tym lipidowymi grupami głowy, glikoproteinami i proteoglikanami3,10. Bioaktywne ładunki transportowane przez TAT stają się natychmiast wolne w cytozolu, aby dotrzeć do swoich wewnątrzkomórkowych partnerów.
Tutaj prezentujemy metodę, która łączy CPP TAT z biotyną do badania interakcji wewnątrzkomórkowych. Celem jest zaprojektowanie przynęt penetrujących komórki poprzez fuzję docelowej biomolekuły z TAT i biotyną. Główną zaletą tej propozycji jest to, że interakcje między przynętą a jej partnerami będą odbywać się w jej kontekście komórkowym. Aby pokazać skuteczność tej metody, użyliśmy jako przynęty małej sekwencji białka Cx43, które według doniesień oddziałuje wewnątrzkomórkowo z protoonkogenem c-Src11,12,13. Cx43 jest integralnym białkiem błonowym, które ulega szerokiej ekspresji w astrocytach14i jest regulowane w dół w glejakach o wysokim stopniu złośliwości, najczęstszym złośliwym nowotworze ośrodkowego układu nerwowego15,16,17,18. Wcześniej wykazano, że region Cx43, który oddziałuje z c-Src (aminokwasy 266-283 w ludzkim Cx43; Pubmed: P17302) sprzężony z TAT (TAT-Cx43266-283) hamuje aktywność onkogenną komórek glejaka c-Srcin i komórek macierzystych glejaka (GSC)19,20,21. Aby zaprojektować przynętę wewnątrzkomórkową, Cx43266-283 został połączony z TAT na końcu N (TAT-Cx43266-283) i z biotyną na końcu C (TAT-Cx43266-283-B). Strategia ta została z powodzeniem zastosowana w linii komórkowej C6 glejaka szczura w celu identyfikacji c-Src, c-końcowej kinazy Src (CSK) oraz homologu fosfatazy i tensyny (PTEN) jako wewnątrzkomórkowych partnerów tego regionu Cx4320. W tym miejscu opisujemy tę metodę, testując jej skuteczność w ludzkich GSC, które są bardzo istotne w terapii glejaka, ale znacznie trudniejsze do transfekcji niż komórki glejaka bez łodygi.

<table><tbody><tr><td>G166 Linia GSC</td><td>BioRep</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RHB-A pożywka dla komórek macierzystych</td><td>Takara</td><td>Y40001</td><td></td></tr><tr><td>Laminin Mouse</td><td>Protein Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>23017-015</td><td>10 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>B-27 Suplement bez surowicy (50X)</td><td>Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>17504-044</td><td>Suplement 2%</td></tr><tr><td>N-2 (100x)</td><td>Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>17502-048</td><td>1%</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki b-FGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-18B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>PBS pH 7,4: W wodzie dejonizowanej, 136 mM NaCl ; 2,7 mM KCl; 7,8 mM Na2HPO4&middot; 2H2O ; 1,7 mM KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10 podłoże do kriokonserwacji</td><td>StemCell Technologies</td><td>7930</td><td></td></tr><tr><td>TAT</td><td>GenScript-Wykonane</td><td></td> <td>na zamówienie</td></tr><tr><td>TAT-B</td><td>GenScript-Wykonane</td><td></td> <td>na zamówienie</td></tr><tr><td>TAT-Cx43266-283</td><td>GenScript</td> <td>-</td> <td>Wykonane na zamówienie</td></tr><tr><td>TAT-Cx43266-283-B</td><td>GenScript-Wykonane</td><td></td> <td>na zamówienie</td></tr><tr>sondy molekularne<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td><td>Molekularne, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>A1275737</td><td>1/20</td></tr><tr><td>Monoklonalne i alfa;-tubulinowe przeciwciało myszy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td>1/500</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindolowe (DAPI)</td><td>Sondy molekularne, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>1,25 mg/ml</td></tr><tr><td>Pierce&trade; NeutrAvidin&handel; Agaroza</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>29200</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy białek: 5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2% (w/v) SDS, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy Zestaw koktajlowy III. Bez EDTA</td><td>Calbiochem, Bionova</td><td>539134</td><td>1/100 (v/v)</td></tr><tr><td>Fluorek sodu</td><td>PanReac AppliChem</td><td>141675</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>Ortowanadan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td>0,1 mM</td></tr><tr><td>Bufor Laemmli: (4x: 0,18 M Tris-HCl pH 6,8; 5 M glicerol; 3,7 % (w/v) SDS; 0,6 M &beta;-merkaptoetanol lub 9 mM DTT; 0,04% (v/v) błękit bromofenolowy (BB) .</td><td></td><td></td><td>1X</td></tr><tr><td>Xcell 4 SureLock Midi-Cell System do elektroforezy</td> Life <td>Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>WR0100</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex Bis-Tris Midi-Gels 4-12%</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>WG1402box</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>NP0001</td><td>1X</td></tr><tr><td>Bufor transferowy NuPAGE 20x</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>NP0006</td><td>1X</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 NC Regular Stacks (membrany nitrocelulozowe)</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>IB23001</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Dry Blotting System - Urządzenie do transferu żelu</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>IB21001</td><td></td></tr><tr><td>10% roztwór Pąsek S (0,1% Pąsek (w/v) w 5% kwasie octowym (v/v)) w wodzie</td><td>Sigma</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>FAK poliklonalne przeciwciało królika</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>AHO0502</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Src poliklonalne przeciwciało królicze</td><td>Sygnalizacja komórkowa (WERFEN)</td><td>2108S</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Csk poliklonalne przeciwciało królika</td><td>Sygnalizacja komórkowa (WERFEN)</td><td>4980</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Poliklonalne mysie przeciwciało PTEN</td><td>Sygnalizacja komórkowa (WERFEN)</td><td>9552</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Poliklonalne przeciwciało królika Caveolin-1</td><td>Abcam</td><td>ab2910</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie IgG-HRP</td><td>Quimigen, Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-2005</td><td>1/5000</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG-HRP</td><td>Quimigen, Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2030</td><td>1/5000</td></tr><tr><td>Odczynnik Western Blotting Luminol</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2048</td><td></td></tr><tr><td>Src poliklonalne przeciwciało królika</td><td>Sygnalizacja komórkowa (WERFEN)</td><td>2108S</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Roztwór przeciwciała: PBS, 10% FBS, 0,1 M lizyna, 0,02% azydek</td><td></td><td></td><td></td>sodu</tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozia anty-mysia IgG</td><td>Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>A11029</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Streptawidyna sprzężona z Cy2</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-220-089</td><td>1/500</td></tr><tr><td>System luminescencji MicroChemi</td><td>Systemy</td><td></td><td></td>bioobrazowania DNA</tr><tr><td>Zestaw do apoptozy martwych komórek z aneksyną V Alexa Fluor&reg; 488 i Sondy molekularne z jodkiem propidium (PI)</td><td>, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>V13241</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Odczynnik przeciwblaknięcia SlowFade Gold</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>Bromek tetrazolowy błękitu tiazolowego (MTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek do spektroskopii UV, >=99.8% (GC)</td><td>Honeywell</td><td>41641-1L</td><td></td></tr><tr><td>Appliskan 2001</td><td>Thermo Electron Corporation, Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biotynylowane peptydy penetrujące komórki do badania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko, który opiera się na szeroko stosowanym systemie ściągania biotyny i awidyny. Przedstawiona modyfikacja obejmuje połączenie tej techniki z sekwencjami penetrującymi komórki. Proponujemy zaprojektowanie przynęt penetrujących komórki, które mogą być inkubowane z żywymi komórkami zamiast lizatów komórkowych, a zatem znalezione interakcje będą odzwierciedlać te, które zachodzą w kontekście wewnątrzkomórkowym. Connexin43 (Cx43), białko, które tworzy kanały połączeń szczelinowych i półkanały, jest regulowane w dół w glejakach o wysokim stopniu złośliwości. Region Cx43 obejmujący aminokwasy 266-283 jest odpowiedzialny za hamowanie aktywności onkogennej c-Src w komórkach glejaka. Tutaj używamy TAT jako sekwencji penetrującej komórkę, biotyny jako znacznika ściągającego i regionu Cx43 składającego się między aminokwasami 266-283 jako celu, aby znaleźć interakcje wewnątrzkomórkowe w trudnych do transfekcji ludzkich komórkach macierzystych glejaka. Jednym z ograniczeń proponowanej metody jest to, że cząsteczka użyta jako przynęta może nie złożyć się prawidłowo, a w konsekwencji stwierdzone interakcje nie mogą być powiązane z efektem. Jednak metoda ta może być szczególnie interesująca w przypadku interakcji związanych ze szlakami transdukcji sygnału, ponieważ są one zwykle przeprowadzane przez wewnętrznie nieuporządkowane regiony, a zatem nie wymagają uporządkowanego fałdowania. Ponadto jedną z zalet proponowanej metody jest to, że można łatwo zbadać znaczenie każdej pozostałości dla interakcji. Jest to system modułowy; W związku z tym można zastosować inne sekwencje penetrujące komórkę, inne znaczniki i inne cele wewnątrzkomórkowe. Wreszcie, zakres tego protokołu wykracza daleko poza interakcję białko-białko, ponieważ system ten może być stosowany do innych bioaktywnych ładunków, takich jak sekwencje RNA, nanocząstki, wirusy lub dowolna cząsteczka, która może być transdukowana sekwencjami penetrującymi komórki i łączona w znaczniki ściągane w dół w celu zbadania ich wewnątrzkomórkowego mechanizmu działania.

Przed zastosowaniem BCPP do badania oddziaływań wewnątrzkomórkowych kluczowe jest porównanie efektów BCPP i CPP w celu walidacji wyników uzyskanych za pomocą BCPP. W związku z tym, aby zbadać, czy włączenie biotyny modyfikuje aktywność sekwencji docelowej, przeanalizowano najpierw wpływ TAT-Cx4326-283-B w porównaniu z TAT-Cx4326-283 na morfologię GSCs G166. W tym celu przeprowadzono analizy immunofluorescencyjne dwóch białek cytoszkieletu, F-aktyny i α-tubuliny, po 24 h traktowania. Rycina 1 pokazuje, że GSCs G16 w obecności 50 µM TAT-Cx4326-283 lub TAT-Cx4326-283-B przyjmują bardziej zaokrąglony kształt w porównaniu do wydłużonych i rozległych wypustek komórkowych widocznych w kontrolach (TAT lub TAT-B). W rzeczywistości Rycina 1b pokazuje, że filamenty aktynowe są w większości zorganizowane w sieci aktynowe, gdy komórki były traktowane TAT-Cx4326-283 lub TAT-Cx4326-283-B, podczas gdy w komórkach kontrolnych (traktowanych TAT lub TAT-B) tworzą one więcej pęczków aktynowych25. W przeciwieństwie do tego, rozkład α-tubuliny nie różni się między poszczególnymi warunkami. Wyniki te wykazały, że obecność biotyny nie zmodyfikowała wpływu sekwencji docelowej na morfologię GSCs G16. W poprzednich badaniach20,21 wykazano, że TAT-Cx4326-283 redukuje proliferację GSCs G16. W niniejszym badaniu sprawdzono, czy TAT-Cx4326-283-B wykazuje taki sam wpływ na wzrost jak TAT-Cx43266-283. W tym celu przeanalizowano proliferację GSCs G16 za pomocą testu MTT po 72 h traktowania. Test MTT jest kolorymetryczną metodą oceny aktywności metabolicznej komórek. MTT jest metabolizowane przez enzymy NAD(P)H oksydoreduktazy w mitochondriach, co odzwierciedla liczbę żyjących komórek. Rycina 2 pokazuje, że redukcja żywotności komórek GSCs G166 nie różni się istotnie w przypadku traktowania komórek 50 µM TAT-Cx4326-283 lub 50 µM TAT-Cx43266-283-B. Rzeczywiście, oba związki istotnie zmniejszyły proliferację GSCs G16 w porównaniu z kontrolą, TAT lub TAT-B.
Po potwierdzeniu, że efekt naszej sekwencji docelowej w GSC G16 (TAT-Cx4326-283) nie uległ zmianie po wprowadzeniu biotyny na C-końcu (TAT-Cx4326-283-B), zbadaliśmy wewnątrzkomórkowe partnery tej sekwencji zgodnie z protokołem opisanym w niniejszej pracy (Rysunek 3). Ponieważ kawiole są zaangażowane w mechanizm internalizacji TAT26, przeanalizowano obecność kaweoliny-1 (Cav-1) w próbkach po pull-downie. Analiza Western blot (Rysunek 4) wykazała, że TAT-B oraz TAT-Cx4326-283-B oddziałują z Cav-1. Jednak zdolność TAT-Cx4326-283-B do rekrutacji c-Src, PTEN i CSK jest silniejsza niż w przypadku TAT-B. Kinaza adhezji ogniskowej (FAK) jest substratem c-Src, którego nie wykazano w interakcji z Cx43. Rzeczywiście, FAK nie wykazał żadnej istotnej interakcji ani z TAT-B, ani z TAT-Cx4326-283-B.
Aby potwierdzić interakcję między TAT-Cx4326-283-B a c-Src, komórki G16 GSCs inkubowano z 50 µM TAT-Cx43266-283-B przez 30 min, a ich lokalizację śledzono za pomocą fluorescencyjnej streptawidyny przy użyciu mikroskopii konfokalnej (Rycina 5). Wyniki wykazały, że wewnątrzkomórkowa dystrybucja TAT-Cx4326-283-B znajduje się blisko błony plazmatycznej (wykazanej poprzez barwienie fosfatydyloseryną) i pokrywa się z lokalizacją c-Src. W rzeczywistości analizy kolokalizacji ujawniły punkty kolokalizacji (kolor biały) między TAT-Cx4326-283-B a c-Src na obrazie złożonym. W konsekwencji badania z użyciem mikroskopii konfokalnej potwierdzają wyniki uzyskane za pomocą protokołu pull-down BCPP opisanego w niniejszej pracy.

<img alt="Schemat mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający barwienie F-aktyny i $\alpha$-tubuliny oraz lokalizację białek w komórkach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Wpływ BCPP i CPP na morfologię GSC. 
Komórki G16 GSCs wysiano przy niskiej gęstości (2 x 104 komórki / cm2) a po 24 h inkubowano je z 50 µM kontrola CPP (TAT), kontrola BCPP (TAT-B), traktowanie CPP (TAT-Cx43)266-283) lub traktowanie BCPP (TAT-Cx43266-283-B). a) Immunobarwienie na F-aktynę (czerwony), $\alpha$-tubulinę (zielony) oraz obraz złożony z DAPI tego samego pola, przedstawiające morfologię GSCs G16. Paski skali = 50 µmb) Immunobarwienie F-aktyny wykazujące różną dystrybucję F-aktyny w GSC G16 po 24-godzinnej inkubacji z 50 µM kontrolę CPP (TAT) lub kontrolę BCPP (TAT-B) w porównaniu z 50 µM leczenie CPP (TAT-Cx43)266-283) lub BCPP (TAT-Cx43266-283-B). Słupki = 10 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy testu MTT; porównanie żywotności komórek, grupy badawcze: kontrolna, warianty TAT; dane o absorbancji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Wpływ BCPP i CPP na żywotność GSC. 
Komórki GSCs linii G16 wysiano w gęstości 50 komórek/cm²2 w 24-dołkowych płytkach wielodołkowych i inkubowano z 50 µM peptydy kontrolne, CPP (TAT) lub BCPP (TAT-B), lub 50 µM peptydy terapeutyczne, CPP (TAT-Cx43)266-283) lub BCPP (TAT-Cx43266-283-B). Żywotność komórek analizowano za pomocą testu MTT po 72 h. Wyniki przedstawiono jako absorbancję w teście MTT i stanowią one średnią ± b.s.e. z co najmniej 3 doświadczeń (++ p˂0,01 względem kontroli; ** p˂0,01, *** p˂0,01 względem TAT lub TAT-B; jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA z testem post-hoc Tukeya). Należy zauważyć, że nie stwierdzono istotnych różnic między wpływem CPP a BCPP. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat doświadczalny lizy komórek; ekstrakcja DNA za pomocą wirówki, pipetowania, przygotowanie do elektroforezy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Schemat protokołu. 
Krok po kroku przedstawiono graficznie procedurę opisaną w sekcji „Protokół”, od inkubacji BCPPs aż do uzyskania eluowanych BCPPs oraz ich białek interakcyjnych. 1) Inkubować komórki hodowlane z BCPPs w pożądanym stężeniu przez wymagany czas. 2) Podczas inkubacji BCPPs są internalizowane i wchodzą w interakcje ze swoimi wewnątrzkomórkowymi partnerami. 3) Przemyć komórki trzy razy w lodzie lodowatym PBS. 4) Zlizować komórki w celu ekstrakcji białek. 5) Przenieść lizaty komórkowe do probówek. 6) Wirować przy 100 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C7) Przenieść nadnadlewa do nowych probówek (A), a niewielką alikwot lizatów zachować w probówce (B) w celu ich dalszego przetwarzania jako standardowych próbek do analizy Western blot. 8) Resuspendować kulki NeutrAvidin Agarose i dodać 50 µL do każdej probówki A za pomocą odciętego końcówki pipety. 9) Inkubować z delikatnym wstrząsaniem przez 12 h w temperaturze 4 °C aby umożliwić oddziaływanie kulek agarozowych NeutrAvidin z BCPP i ich partnerami. 10) Wirować przez 1 min w temperaturze 30 x g aby odwirować kuleczki z przywiązanymi do nich biotynjlowanymi przynętami oraz związanymi z nimi białkami oddziałującymi. 1) Przenieść nadsączniki do nowych probówek (C) i zachować je na wypadek konieczności powtórzenia procedury pull-down. 12) Przemyć osad pięć razy świeżym buforem do lizy, resuspender poprzez odwracanie probówek i wirować przez 1 min w 30 x g i odrzucić supernatant. 13) Ostrożnie usunąć cały supernatant. 14) Dodać pożądaną objętość buforu Laemmli 4x i eluować białka w 100 °C przez 5 min. 15) Wirować przy 8200 x g przez 30 s, aby odwirować kuleczki. 16) Przenieść eluowane białka znajdujące się w supernatancie za pomocą końcówek kapilarnych do nowych probówek (D). 17) Nanieść na żele do analizy Western blot. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza ekspresji białek, wyniki Western blot, FAK, c-Src, Csk, PTEN, Cav-1, prążki masy cząsteczkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4: Badanie oddziaływań wewnątrzkomórkowych TAT-Cx43266-283Poziom białka -B w GSC G16 wyznaczony za pomocą metody pull-down z następującym rozszczepieniem białek metodą Western blot. 
Komórki G16 GSCs inkubowano z 50 µM TAT-B lub TAT-Cx43266-283-B. Po 30 min utrwalono lizę komórek oraz TAT-B lub TAT-Cx43266-283B przyłączone do ich wewnątrzkomórkowych partnerów wyprecypowano za pomocą kulek z NeutrAvidyną. Eluowane białka naniesiono i poddano analizie metodą Western blot w celu zbadania poziomu FAK, c-Src, CSK, PTEN oraz Cav-1. Należy zauważyć, że Cav-1 wchodzi w interakcje zarówno z TAT-B, jak i z TAT-Cx43.266-283-B, c-Src, PTEN oraz CSK oddziałują preferencyjnie z TAT-Cx43266-283-B i FAK nie wykazały żadnej interakcji z TAT-B ani TAT-Cx43266-283-B. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Obrazy immunofluorescencyjne oddziaływań białkowych; przedstawiające TAT-Cx43, c-Src, fosfatydyloserynę." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5: Potwierdzenie TAT-Cx43266-283-B oddziaływania wewnątrzkomórkowe w GSC G16 za pomocą mikroskopii konfokalnej. 
Komórki GSCs G16 inkubowano z 50 µM TAT-Cx43266-283-B. Po 30 min. komórki utrwalono i poddano dalszej obróbce w celu lokalizacji TAT-Cx43266-283-B z Cy2-streptawidyną (zielony), c-Src metodą immunofluorescencji (czerwony) i fosfatydyloseryna z anneksyną V (niebieski). Zauważalne są punkty kolokalizacji (biały) pomiędzy TAT-Cx43266-283-B oraz c-Src znajdują się blisko błony plazmatycznej na zdjęciach z nałożeniem obrazów. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

To jest protokół do badania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko oparty na systemie pull-down biotyna-awidyna z nowością łączenia sekwencji penetrujących komórki. Główną zaletą jest to, że sekwencja docelowa jest inkubowana z żywymi komórkami, a nie z lizatami komórkowymi, a zatem interakcje będą zachodzić w kontekście komórkowym.

Biotynylowane peptydy penetrujące komórki do badania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie interakcji białko-białko w kontekście wewnątrzkomórkowym. Osiąga się to dzięki systemowi pull-down biotyny-awidyny w połączeniu z sekwencjami samopenetrującymi, umożliwiającymi inkubację w sekwencji docelowej z żywymi komórkami. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji komórkowej, takie jak szybkie i dynamiczne interakcje między biomolekułami w celu uzyskania określonych sygnałów.Główną zaletą tej techniki jest to, że interakcje molekularne zachodzą w kontekście wewnątrzkomórkowym. W tym badaniu umieść ludzkie komórki macierzyste glejaka G166 lub GSC w czterech kolbach o powierzchni 150 centymetrów kwadratowych, jak opisano w protokole tekstowym. Przetwarzaj komórki po osiągnięciu konfluencji.Kiedy pięć milionów komórek G166 zostanie posianych w kolbie o powierzchni 150 centymetrów kwadratowych, są one przetwarzane dwa dni po posiewaniu. Obracać fiolki zawierające liofilizowane, biotynylowane peptydy penetrujące komórki pod ciśnieniem 8, 200 g przez 30 sekund, aby uniknąć pozostawienia części proszku na pokrywce. Dołącz kontrolowany BCPP, aby upewnić się, że znalezione interakcje są specyficzne dla sekwencji docelowej.Następnie rozpuścić BCPP w odpowiednim pożywce hodowlanej w roztworze podstawowym wskazanym przez producenta. Aby otrzymać roztwór podstawowy dwóch miligramów na mililitr BCPP do leczenia GSC, dodać 0,5 mililitra pożywki hodowlanej GSC do jednej fiolki zawierającej jeden miligram BCPP. Wirować fiolki i upewnić się, że peptyd jest dobrze rozpuszczony.Przygotuj co najmniej 12 probówek o pojemności 1,5 mililitra na każdy warunek w teście pull-down, który ma zostać przeprowadzony. Zaznacz pierwsze trzy probówki na warunek. Będą miały całkowitą objętość lizatów komórkowych.Następnie zaznacz literę A na trzech rurkach na warunek. Probówki te będą zawierały pierwsze supernatanty uzyskane po lizie i odwirowaniu lizatów komórkowych. Następnie zaznacz B na trzech probówkach na warunek.Probówki te będą miały małą porcję pierwszych supernatantów do próbek western blot. Na koniec zaznacz C na trzech probówkach na warunek. Probówki te będą zawierały supernatanty otrzymane po pull-down za pomocą NeutrAvidin.Po zasysaniu pożywki hodowlanej z komórek, zastąpić odpowiednią objętością świeżej pożywki wymaganą do inkubacji BCPP w najmniejszej możliwej objętości pożywki zgodnie z czasem inkubacji. Bardzo ważne jest, aby w każdym przypadku podłoże całkowicie pokrywało całą powierzchnię kolby. Dodać objętość roztworu podstawowego BCPP do kultur komórkowych, aby osiągnąć stężenie, które okazało się skuteczne.Dlatego dodaj 92,8 mikrolitrów dwóch miligramów na mililitr TAT-connexin 43 266-283 biotyny na mililitr pożywki hodowlanej. Umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 30 minut, aby upewnić się, że zachodzą interakcje między BCPP a jego wewnątrzkomórkowymi partnerami. Aby przeprowadzić ekstrakcję białka, najpierw całkowicie zaaspiruj pożywkę hodowlaną, a następnie bardzo ostrożnie umyj komórki 10 mililitrami lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem na 150 centymetrów, aby uniknąć samooderwania.Aby uzyskać lizat komórkowy, dodaj trzy mililitry buforu do lizy na kolbę o powierzchni 150 centymetrów kwadratowych i dokładnie zeskrob powierzchnię za pomocą skrobaka do komórek. Przechylenie kolby pod kątem około 45 stopni ułatwi zebranie lizatów komórkowych do odpowiednich probówek. Wlej jeden mililitr lizatu komórkowego na probówkę do trzech 1,5 mililitrowych probówek oznaczonych według warunku.W celu ściągania należy odwirować probówki o pojemności 1,5 mililitra pod ciśnieniem 11 000 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatanty do nowych probówek oznaczonych A. Przenieść podwielokrotność supernatantu na warunek do różnych probówek oznaczonych B. Następnie dodać 16,6 mikrolitrów 4x buforu Laemmliego na 50 mikrolitrów lizatu i zamrozić w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie bardzo dobrze homogenizuj agarozę NeutrAwidyny poprzez delikatne potrząsanie.Odetnij końcówki końcówek pipet, aby zwiększyć ich średnicę i poprawić pipetowanie kulek. Następnie dodaj 50 mikrolitrów agarozy NeutrAvidin na mililitr lizatu komórkowego w probówkach A. Inkubuj lizaty komórkowe w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, bardzo delikatnie potrząsając, aby umożliwić NeutrAvidin interakcję z BCPP związanymi z ich wewnątrzkomórkowymi partnerami.Następnie odwirować w temperaturze 3000 g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zebrać kompleks NeutrAwidyny z białkami. Ostrożnie usunąć supernatanty i przenieść je do czystych probówek oznaczonych C. Zachowaj je do użycia na wypadek, gdyby ściąganie się nie powiodło. Aby przepłukać kompleks NeutrAwidin białkami, dodaj świeży bufor do lizy do granulek probówek A.Ponownie zawiesić osad przez odwrócenie i powtórzyć wirowanie. Powtórz to pranie jeszcze pięć razy. Wszystkie te supernatanty można odrzucić.Następnie dodaj 40 mikrolitrów 2x buforu Laemmli na 1,5 mililitrową probówkę do granulek otrzymanych ze 150 centymetrów kwadratowych kolb zlewających się komórek. Następnie eluuj w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby zdysocjować interakcje między białkami. Po elucji wirować przez 30 sekund w temperaturze 8, 200 razy g, aby osadzać kulki NeutrAvidin.Przenieś supernatanty zawierające zdysocjowane białka z końcówkami kapilarnymi do nowych probówek oznaczonych D. Te supernatanty są teraz gotowe do umieszczenia w Western blot zgodnie z opisem w protokole tekstowym lub mogą być zamrożone w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Pokazano tutaj obrazy immunocytochemiczne pokazujące, że fuzja biotyny z TAT-connexin 43 266-283 nie modyfikuje wpływu peptydu penetrującego komórki na morfologię komórek macierzystych glejaka. Analiza MTT GSC leczonego BCPP lub CPP pokazuje, że fuzja biotyny z TAT-koneksyną 43 266-283 nie modyfikuje antyproliferacyjnego działania TAT-koneksyny 43 266-283 na GSC.Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki pull-down BCPP, po którym następuje western blot. Western blot pokazuje, że białka opisane jako oddziałujące z TAT, na przykład Cav-1, pojawiają się w obu stanach. Białka opisane jako oddziałujące z Cx43, na przykład c-Src i PTEN, pojawiają się tuż po pull-down TAT-connexin 43 266-283, podczas gdy białka, które nie oddziałują bezpośrednio z Cx43 lub TAT, nie są obecne, na przykład FAK.Obrazy z mikroskopii konfokalnej potwierdzają wewnątrzkomórkowe interakcje stwierdzone z BCPPs. Obrazy pokazują wewnątrzkomórkową kolokalizację TAT-connexin 43 266-283 z c-Src w pobliżu błony plazmatycznej w G166 GSC. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby potwierdzić temperaturę odczynników i wirówki, a także zbieg komórek przed dodaniem peptydów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać wewnątrzkomórkowe interakcje białko-białko za pomocą biotynylowanych peptydów penetrujących komórki. Po opracowaniu technika ta toruje drogę dla badań w dziedzinie sygnalizacji komórkowej w celu zbadania wewnątrzkomórkowych mechanizmów molekularnych i ich specyficznych dla linii szlaków w komórkach hodowlanych, kulturach organotypowych, a nawet modelach in vivo.Po tej procedurze inne bioaktywne ładunki, takie jak sekwencje RNA, nanocząstki, wirusy lub inne cząsteczki, które mogą być transfuzjowane peptydami penetrującymi komórki i łączone w celu ściągania TAT, mogą być wykorzystane do badania ich wewnątrzkomórkowego mechanizmu działania. Chociaż w tym protokole nie ma żadnych wyjątkowo niebezpiecznych materiałów, nie zapomnij nosić rękawiczek i fartucha laboratoryjnego podczas wykonywania tej procedury.

biotinylated-cell-penetrating-peptides-to-study-intracellular-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy materiał wideo przedstawia eksperymenty wraz z późniejszą analizą oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem powierzchni mikrowzorowanych. Podejście to umożliwia wykrywanie oddziaływań białkowych w żywych komórkach, łącząc wysoką przepustowość z możliwością uzyskania informacji ilościowych.

In-vivo detekcja oddziaływań białko-białko na powierzchniach mikrowzorowanych

Ten film demonstruje technikę, która wykorzystuje biotynylowane peptydy penetrujące komórki do wykrywania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko. Peptydy penetrujące komórki ułatwiają sprzężonemu peptydowi wnikanie do komórki i specyficzne wiązanie się z oddziałującymi z nią białkami. Biotyna, po związaniu się z awidyną, umożliwia oczyszczenie kompleksu białek oddziałujących z lizatu komórkowego.

Biotynylowana sonda peptydowa penetrująca komórki do wykrywania interakcji białko-białko

Ten film demonstruje metodę oceny internalizacji docelowego białka w astrocytach korowych myszy za pomocą biotynylacji, a następnie lizy komórek, ekstrakcji białka na bazie streptawidyny, denaturacji i analizy Western blot w celu potwierdzenia udanej internalizacji.

Ocena internalizacji docelowych białek powierzchniowych za pomocą pochodnej biotyny

Badanie przesiewowe macierzy peptydowej to wysokoprzepustowy test do identyfikacji miejsc interakcji białko-białko. Pozwala to na mapowanie wielu interakcji białka docelowego i może służyć jako metoda identyfikacji miejsc dla inhibitorów, które celują w białko. Tutaj opisujemy protokół badania przesiewowego i analizy macierzy peptydowych.

Identyfikacja miejsc interakcji białko-białko za pomocą macierzy peptydowych

Opisujemy metodę generowania indukowalnych stabilnych linii komórkowych oznaczonych znacznikami lokalizacji i powinowactwa (LAP) do badania funkcji białek, czasoprzestrzennej lokalizacji subkomórkowej i sieci interakcji białko-białko.

Indukowalne, stabilne linie komórkowe znakowane na LAP do badania funkcji białek, lokalizacji czasoprzestrzennej i sieci interakcji białek

Udostępniamy krok po kroku protokół dla split-BioID, testu komplementacji fragmentów białek opartego na technice znakowania zbliżeniowego BioID. Aktywowany w wyniku interakcji dwóch podanych białek, umożliwia analizę proteomiczną zależnych od kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym. Metoda jest prosta, opłacalna i wymaga jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Split-BioID — Analiza proteomiczna specyficznych dla kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym

Ten protokół skupia się na identyfikacji białek, które wiążą się z fosforanami inozytolu lub fosfonozytydami. Wykorzystuje chromatografię powinowactwa z biotynylowanymi fosforanami inozytolu lub fosfoinozytydami, które są unieruchamiane przez streptawidynę do agarozy lub kulek magnetycznych. Fosforan inozytolu lub białka wiążące fosfoinozytol są identyfikowane za pomocą Western blot lub spektrometrii mas.

Identyfikacja białek oddziałujących z fosforanem inozytolu lub fosfoinozytylem za pomocą chromatografii powinowactwa sprzężonej ze spektrometrią Western Blot lub spektrometrią mas

Test wycieku fluorescencji to prosta metoda, która umożliwia badanie interakcji peptyd/błona, aby zrozumieć ich udział w kilku procesach biologicznych, a zwłaszcza zdolność peptydów penetrujących komórki do zakłócania dwuwarstwowych fosfolipidów podczas bezpośredniego procesu translokacji komórkowej.

Test przecieku fluorescencyjnego w celu zbadania destabilizacji błony przez peptyd penetrujący komórkę

Wykazano, że wiele wewnętrznie nieuporządkowanych białek uczestniczy w tworzeniu wysoce dynamicznych kondensatów biomolekularnych, co jest ważne dla wielu procesów komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy opartą na obrazowaniu pojedynczych cząsteczek metodę ilościowego określania dynamiki, za pomocą której białka oddziałują ze sobą w kondensatach biomolekularnych w żywych komórkach.

Jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych

W protokole przedstawiono metodę kowalencyjnego przyłączania biotyny do białek in vivo w oparciu o ich bliskość do ligazy biotyny połączonej z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Modyfikacja ta pozwala na selektywne wzbogacanie białek za pomocą kulek streptawidyny, zgodnie z potrzebami w badaniach interakcji białkowych.

In vivo (in vivo ) Biotynylacja zbliżeniowa w badaniach interakcji białkowych w Pantofelku czworobocznym

Poznaj metodę badania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko z wykorzystaniem biotynylowanych peptydów penetrujących komórki w ludzkich komórkach macierzystych glejaka G166. Technika ta umożliwia analizę dynamicznych szlaków sygnałowych w żywych komórkach.

Biotynylowane peptydy penetrujące komórki do badania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko

Przeglądaj więcej filmów