Biotynylowane peptydy penetrujące komórki do badania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie interakcji białko-białko w kontekście wewnątrzkomórkowym. Osiąga się to dzięki systemowi pull-down biotyny-awidyny w połączeniu z sekwencjami samopenetrującymi, umożliwiającymi inkubację w sekwencji docelowej z żywymi komórkami. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji komórkowej, takie jak szybkie i dynamiczne interakcje między biomolekułami w celu uzyskania określonych sygnałów.

Główną zaletą tej techniki jest to, że interakcje molekularne zachodzą w kontekście wewnątrzkomórkowym. W tym badaniu umieść ludzkie komórki macierzyste glejaka G166 lub GSC w czterech kolbach o powierzchni 150 centymetrów kwadratowych, jak opisano w protokole tekstowym. Przetwarzaj komórki po osiągnięciu konfluencji.

Kiedy pięć milionów komórek G166 zostanie posianych w kolbie o powierzchni 150 centymetrów kwadratowych, są one przetwarzane dwa dni po posiewaniu. Obracać fiolki zawierające liofilizowane, biotynylowane peptydy penetrujące komórki pod ciśnieniem 8, 200 g przez 30 sekund, aby uniknąć pozostawienia części proszku na pokrywce. Dołącz kontrolowany BCPP, aby upewnić się, że znalezione interakcje są specyficzne dla sekwencji docelowej.

Następnie rozpuścić BCPP w odpowiednim pożywce hodowlanej w roztworze podstawowym wskazanym przez producenta. Aby otrzymać roztwór podstawowy dwóch miligramów na mililitr BCPP do leczenia GSC, dodać 0,5 mililitra pożywki hodowlanej GSC do jednej fiolki zawierającej jeden miligram BCPP. Wirować fiolki i upewnić się, że peptyd jest dobrze rozpuszczony.

Przygotuj co najmniej 12 probówek o pojemności 1,5 mililitra na każdy warunek w teście pull-down, który ma zostać przeprowadzony. Zaznacz pierwsze trzy probówki na warunek. Będą miały całkowitą objętość lizatów komórkowych.

Następnie zaznacz literę A na trzech rurkach na warunek. Probówki te będą zawierały pierwsze supernatanty uzyskane po lizie i odwirowaniu lizatów komórkowych. Następnie zaznacz B na trzech probówkach na warunek.

Probówki te będą miały małą porcję pierwszych supernatantów do próbek western blot. Na koniec zaznacz C na trzech probówkach na warunek. Probówki te będą zawierały supernatanty otrzymane po pull-down za pomocą NeutrAvidin.

Po zasysaniu pożywki hodowlanej z komórek, zastąpić odpowiednią objętością świeżej pożywki wymaganą do inkubacji BCPP w najmniejszej możliwej objętości pożywki zgodnie z czasem inkubacji. Bardzo ważne jest, aby w każdym przypadku podłoże całkowicie pokrywało całą powierzchnię kolby. Dodać objętość roztworu podstawowego BCPP do kultur komórkowych, aby osiągnąć stężenie, które okazało się skuteczne.

Dlatego dodaj 92,8 mikrolitrów dwóch miligramów na mililitr TAT-connexin 43 266-283 biotyny na mililitr pożywki hodowlanej. Umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 30 minut, aby upewnić się, że zachodzą interakcje między BCPP a jego wewnątrzkomórkowymi partnerami. Aby przeprowadzić ekstrakcję białka, najpierw całkowicie zaaspiruj pożywkę hodowlaną, a następnie bardzo ostrożnie umyj komórki 10 mililitrami lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem na 150 centymetrów, aby uniknąć samooderwania.

Aby uzyskać lizat komórkowy, dodaj trzy mililitry buforu do lizy na kolbę o powierzchni 150 centymetrów kwadratowych i dokładnie zeskrob powierzchnię za pomocą skrobaka do komórek. Przechylenie kolby pod kątem około 45 stopni ułatwi zebranie lizatów komórkowych do odpowiednich probówek. Wlej jeden mililitr lizatu komórkowego na probówkę do trzech 1,5 mililitrowych probówek oznaczonych według warunku.

W celu ściągania należy odwirować probówki o pojemności 1,5 mililitra pod ciśnieniem 11 000 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatanty do nowych probówek oznaczonych A. Przenieść podwielokrotność supernatantu na warunek do różnych probówek oznaczonych B. Następnie dodać 16,6 mikrolitrów 4x buforu Laemmliego na 50 mikrolitrów lizatu i zamrozić w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie bardzo dobrze homogenizuj agarozę NeutrAwidyny poprzez delikatne potrząsanie.

Odetnij końcówki końcówek pipet, aby zwiększyć ich średnicę i poprawić pipetowanie kulek. Następnie dodaj 50 mikrolitrów agarozy NeutrAvidin na mililitr lizatu komórkowego w probówkach A. Inkubuj lizaty komórkowe w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, bardzo delikatnie potrząsając, aby umożliwić NeutrAvidin interakcję z BCPP związanymi z ich wewnątrzkomórkowymi partnerami.

Następnie odwirować w temperaturze 3000 g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zebrać kompleks NeutrAwidyny z białkami. Ostrożnie usunąć supernatanty i przenieść je do czystych probówek oznaczonych C. Zachowaj je do użycia na wypadek, gdyby ściąganie się nie powiodło. Aby przepłukać kompleks NeutrAwidin białkami, dodaj świeży bufor do lizy do granulek probówek A.

Ponownie zawiesić osad przez odwrócenie i powtórzyć wirowanie. Powtórz to pranie jeszcze pięć razy. Wszystkie te supernatanty można odrzucić.

Następnie dodaj 40 mikrolitrów 2x buforu Laemmli na 1,5 mililitrową probówkę do granulek otrzymanych ze 150 centymetrów kwadratowych kolb zlewających się komórek. Następnie eluuj w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby zdysocjować interakcje między białkami. Po elucji wirować przez 30 sekund w temperaturze 8, 200 razy g, aby osadzać kulki NeutrAvidin.

Przenieś supernatanty zawierające zdysocjowane białka z końcówkami kapilarnymi do nowych probówek oznaczonych D. Te supernatanty są teraz gotowe do umieszczenia w Western blot zgodnie z opisem w protokole tekstowym lub mogą być zamrożone w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Pokazano tutaj obrazy immunocytochemiczne pokazujące, że fuzja biotyny z TAT-connexin 43 266-283 nie modyfikuje wpływu peptydu penetrującego komórki na morfologię komórek macierzystych glejaka. Analiza MTT GSC leczonego BCPP lub CPP pokazuje, że fuzja biotyny z TAT-koneksyną 43 266-283 nie modyfikuje antyproliferacyjnego działania TAT-koneksyny 43 266-283 na GSC.

Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki pull-down BCPP, po którym następuje western blot. Western blot pokazuje, że białka opisane jako oddziałujące z TAT, na przykład Cav-1, pojawiają się w obu stanach. Białka opisane jako oddziałujące z Cx43, na przykład c-Src i PTEN, pojawiają się tuż po pull-down TAT-connexin 43 266-283, podczas gdy białka, które nie oddziałują bezpośrednio z Cx43 lub TAT, nie są obecne, na przykład FAK.

Obrazy z mikroskopii konfokalnej potwierdzają wewnątrzkomórkowe interakcje stwierdzone z BCPPs. Obrazy pokazują wewnątrzkomórkową kolokalizację TAT-connexin 43 266-283 z c-Src w pobliżu błony plazmatycznej w G166 GSC. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby potwierdzić temperaturę odczynników i wirówki, a także zbieg komórek przed dodaniem peptydów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać wewnątrzkomórkowe interakcje białko-białko za pomocą biotynylowanych peptydów penetrujących komórki. Po opracowaniu technika ta toruje drogę dla badań w dziedzinie sygnalizacji komórkowej w celu zbadania wewnątrzkomórkowych mechanizmów molekularnych i ich specyficznych dla linii szlaków w komórkach hodowlanych, kulturach organotypowych, a nawet modelach in vivo.

Po tej procedurze inne bioaktywne ładunki, takie jak sekwencje RNA, nanocząstki, wirusy lub inne cząsteczki, które mogą być transfuzjowane peptydami penetrującymi komórki i łączone w celu ściągania TAT, mogą być wykorzystane do badania ich wewnątrzkomórkowego mechanizmu działania. Chociaż w tym protokole nie ma żadnych wyjątkowo niebezpiecznych materiałów, nie zapomnij nosić rękawiczek i fartucha laboratoryjnego podczas wykonywania tej procedury.